Vi beskriver protokoll för att använda den breda fält-of-view nematoder spårning plattform (WF-NTP), vilket möjliggör hög genomströmning fenotypisk karakterisering av stora populationer av Caenorhabditis elegans. Dessa protokoll kan användas för att karaktärisera subtila beteendeförändringar i mutant stammar eller som svar på farmakologisk behandling i en mycket skalbar mode.
Caenorhabditis elegans är en väl etablerad djurmodell i biomedicinsk forskning, allmänt sysselsatt inom funktionell genomik och åldrande studier. För att bedöma de hälso- och fitness av djuren under studien, åberopat en typiskt motilitet utläsningar, såsom mätning av antalet kropp kurvor eller hastigheten. Dessa mätningar innebära brukar manuella räknar, vilket gör det svårt att få bra statistisk signifikans, som tid och arbete begränsningar ofta begränsa antalet djur i varje experiment till 25 eller mindre. Eftersom hög statistisk effekt är nödvändigt att erhålla reproducerbara resultat och begränsa falska positiva och negativa resultat när svaga fenotypisk effekter undersöks, det nyligen har man gjort ansträngningar att utveckla automatiserade protokoll fokuserat på att öka den känslighet för motilitet detektering och flera parametriska beteendemässiga profilering. För att fördjupa detektionsgränsen till den nivå som behövs för att fånga de små fenotypiska förändringar som är ofta avgörande för genetiska studier och läkemedelsutveckling, beskriver vi här en teknisk utveckling som gör att studien av upp till 5 000 enskilda djur samtidigt ökar den statistiska styrkan av mätningar av 1.000-faldig jämfört cirka med manuella analyser och 100-fold jämfört ca med andra tillgängliga automatiserade metoder.
Ungefär ett halvt sekel sedan, Sydney Brenner introducerade Caenorhabditis elegans (C. elegans) som modellsystem studera utvecklingen och neurobiologi, som denna lilla (1 mm i längd), transparent nematoder mask är lätt att manipulera genetiskt och upprätthålla i laboratoriet1. Idag används C. elegans att studera en mängd biologiska processer inklusive apoptos, cellsignalering, typ av cellcykeln, genreglering, metabolism, och åldrande2. Dessutom mobilnät och vävnad komplexitet, protein uttrycksmönster och bevarande av sjukdom vägar mellan C. elegans och högre organismer (80% av masken gener har en mänsklig orthologue), länkad med enkelheten och kostnadseffektiviteten för odling, gör det en effektiv i vivo modellorganism mottagliga för hög genomströmning genetiska3,4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 och drog14,15,16 filmvisningar. Av alla dessa skäl, har C. elegans varit anställd för karakterisering av normala och sjukdomsrelaterade molekylära vägar; i fältet för neurodegeneration, exempelvis har det aktiverat utforskandet av effekterna av åldrande på protein aggregering3,4,7,15,17, 18, och karakterisering av initiativtagare och hämmare av protein aggregering3,4,5,6,7,14, 18.
Den kondition av maskar, som är en viktig beteendemässiga parameter definieras i denna typ av studie, kan mätas manuellt i en mängd olika sätt, såsom genom att räkna antalet kropp kurvor per minut (BPM)4,6, 19, eller genom att mäta hastigheten på rörelse20,21,22, samt genom att mäta den genomsnittliga livslängden och priser av förlamning. Även om manuella mätningar av kroppen böjar och rörelsens hastighet har lett till många viktiga insikter i olika molekylära vägar och mekanismer3,4,14,19, 20,23, manuella analyser förblir för närvarande låg genomströmning, mycket arbetsintensiva och tidskrävande samtidigt som det är benägna att fel och människors fördomar. Dessa frågor presenterar betydande utmaningar i insamlingen av uppgifter med tillräcklig statistisk effekt att skilja subtila beteendeförändringar. Denna begränsning är särskilt relevant för drug screening som behandlingar med potentiella drog molekyler leder ofta till små fenotypiska förändringar24, därför kräver studier av stort antal djur för att erhålla reproducerbara resultat. För att illustrera denna punkt, har nyligen genomförda studier visat att en hög effekt för upptäckt (POD) är nödvändigt att definiera med tillförsikt några betydande förändringar i beteende och begränsa falskt positiva resultat25. Detta har resulterat i en stark motivation i C. elegans gemenskapen att ersätta manuell räknar med reproducerbara, automatiserad, tid – och kostnads – effective mätningar. För att möta denna efterfrågan, har flera laboratorier nyligen utvecklat metoder för högkänsliga mätningar och korrekt mask spårning av större antal maskar22,26,27,28 ,29,30,31,32,33.
För att expandera ytterligare processen för automation till de stora kohorterna av djur behövs för statistiskt signifikant mätningar, har vi nyligen utvecklat ett brett fält-of-view Nematoden spårning plattform (WF-NTP)15,34 ,35,36, vilket möjliggör samtidig undersökning av flera fenotypiska utläsningar på mycket stora mask populationer, en nyckelfaktor i statistiskt relevanta fenotypiska upptäckt25. Inte bara kan WF-NTP för närvarande övervaka upp till 5 000 djur parallellt, men fenotypiska avläsning även omfatta flera parametrar, inklusive hastighet och amplitud av kroppen böjar, hastigheten, andelen av befolkningen som är förlamad, och den storleken på djuren. Det går därför lätt att skärm tusentals av maskar parallellt och att kombinera olika avläsning till kartan beteende för att skapa en flerdimensionell fingeravtryck36. Den associerade programvaran med öppen källkod är skrivet i Python, som också krävs för att använda det och är helt anpassningsbara. Ett grafiskt användargränssnitt (GUI) som också möjliggör användare att anta denna teknik.
Här presenterar vi en serie av protokoll som illustrerar några av de potentiella tillämpningarna av WF-NTP. I synnerhet vi diskutera administrationen av föreningar, alltifrån små molekyler till protein therapeutics, och beskriva hur man skärmen deras effekter direkt över stora populationer av maskar, således effektivt ta bort behovet av att prova på små delpopulationer. Användning av WF-NTP för sådant ändamål har redan medfört betydande fördelar i förfaranden som syftar till att utforma drug discovery program för Alzheimers sjukdom (AD)15,34,35 och Parkinsons sjukdom (PD)18 med hjälp av in vivo-data för bedömning av terapeutisk kandidater35,37.
På grund av den snabba expansionen av tekniker inom optisk vetenskaper är det nu möjligt att kravet på automatiserade metoder i C. elegans studier i väsentligen nya sätt. Som ett resultat, ett antal digital tracking plattformar20,41,42,43,44,45,46 har utformats och förfogande över de senaste åren för att ersätta manuell räkning av parametrar såsom hastighet rörlighet, bockning frekvens, förlamning hastigheten, samt mer komplexa former av beteenden såsom omega svängar och livslängd mätningar. Den senaste automatiserade plattformar har kraftigt förbättrat reproducerbarhet och känsligheten hos C. elegans studier41 och högkvalitativ data på små kohorter eller ens enskilda djur. Vi beslutade att förlänga automatisering av analysen av masken beteende till gör det också möjligt att utvärdera fenotyperna av kohorter av tusentals djur parallellt. Den största fördelen med metoden att studera mask kohorter är att det tillåter för redovisning för hög inneboende variabilityen av masken beteende24 och det faktum att drogen behandlingsstudier ofta leda till subtila fenotypiska variationer, som är svåra att detektera med tillräcklig statistisk signifikans när du använder en liten grupp av djur. En hög effekt för upptäckt (POD) är verkligen nödvändigt att upptäcka med förtroende någon betydande variation i beteende och begränsa falskt positiva resultat25.
Här har vi beskrivit en rad protokoll baserat på en nyligen rapporterade automatiserad screeningmetod för C. elegans, brett fält-of-view Nematoden spårning plattform (WF-NTP)36. Protokollet beskrivs här är uppdelad i 5 delar. Delarna 1 och 2 beskriver utarbetandet av stora mask populationer. Kritiska steg är sterilitet av arbetsförhållandena och beredning av reagens och plattor behövs för att köra experiment. Vi noterar att, på grund av ökad genomströmning som tillhandahålls av detta protokoll jämfört med andra screening metoder36, det kräver också ökade kvantiteter av reagenser. Denna faktor måste noga övervägas i experimentell design. Vi noterar också att steget blekning är kritisk och måste testas i förväg som ett stort antal ägg och friska larver är nödvändiga för att köra dessa experiment. Del 3 av detta protokoll Detaljer hur man levererar droger i solid media och skärmen mask populationer. Vi noterar att denna del av protokollet är starkt beroende av antalet droger och läkemedelskoncentrationen att testas av användaren parallellt. Den komplett automatiseringen av screeningen och snabb datainsamling skifta det begränsande steget från beteendevetenskaplig observation till REAGENSBEREDNING och tillväxt och synkronisering av stora mask populationer. De viktigaste stegen under beteendemässiga screening är tidpunkterna för inspelningen och någon mask hantering steg (t.ex., överföring av maskar från NGM plattorna till spårning plattform). Protokollet beskrivs här är ett exempel som utformats till skärmen maskar för upp till 9 dagar under vuxen livslängd; dock kan detta protokoll enkelt anpassas till skärmen så många tidpunkter som användaren önskar, t.ex., 18 dagar36. Del 4 sedan illustrerar tillämpningen av protokollet att leverera proteinmolekyler (t.ex. antikroppar och molekylär chaperones) i C. elegansoch visar hur protokollet illustreras i delarna 1-3 kan enkelt anpassas, beroende på önskad ansökan. Vi visar hur detta förfarande kan utökas inte bara till leverans av narkotika-liknande molekyler men också för administrationen av molekylär chaperones eller antikroppar37. De första fyra stegen (delar) utförs under sterila förhållanden, om inte annat anges. Alla likvida komponenterna bör Ånghärdad före användning och inkubationsstegen bör utföras vid 70% relativ luftfuktighet. I del 5 beskriver vi hur du använder programpaketet som tillhandahålls i kombination med spårning scenen. Denna programvara har varit anpassade utformade för analys av WF-NTP data relaterade till uppförandet av stora mask populationer. Vi föreslår att användaren följer de riktlinjer som fastställs i del 5 för dataanalys; dessa parametrar är dock beroende på särdragen i det inspelade videor (dvs, fps, synfält, upplösning, antal förvärvade ramar). Till exempel funktion i GUI har utformats för att underlätta utvärderingen av korrekta parametrar före analysen.
Dessa serier av protokoll gör det möjligt att analysera fenotyperna av stora populationer av C. elegans (för närvarande upp till 5 000 enskilda maskar parallellt) effektivt, minska artefakter på grund av det inneboende variabilitet av beteendet hos djuren , i samförstånd med förundersökningar om identifiering krävs för att uppnå statistisk signifikans för studier av C. elegans25. Plattformen använder ett system av högupplösta kameror, kan spela in bilder av stora mängder djur med hög hastighet, medan du spelar samtidigt in flera stora kohorter. Hög prestanda och hög genomströmning av WF-NTP-protokollet gör det möjligt att fastställa mycket små förändringar i masken beteende på ett mycket exakt sätt. Denna metod kan därför nya infallsvinklar anses inte bara för att studera biologi C. elegans, men dessutom för farmakologiska och medicinsk forskning, såsom hög genomströmning screening av genetiska modifieringar och drog behandlingar. Detta förfarande har också fördelen att förlamning studier som ska genomföras i parallell med andra beteendemässiga mätningar, en nyckelfunktion i molekylär screening studier.
De resultat som har uppnåtts hittills i drug discovery program AD15,34,35 och PD18 visar vikten av bred field-of-view datainsamling för att avsevärt öka den antal djur som kan övervakas i en enda experiment, vilket avsevärt minskar de experimentella fel och kraftigt förbättra statistiska giltigheten av studier. Den nuvarande metoden som beskrivs i detta protokoll har fokuserat på utmaningar inom läkemedelsutveckling, vi hoppas att metoden allmänt antas i gemenskapen och att dess tillämpning kommer att utvidgas till komplexa genetiska och beteendemässiga studier och utöka antalet fenotyper som för närvarande kan detekteras.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av centrum för Skellefteåsjukan sjukdomar (CMD). FAA stöds av en Senior Research Fellowship award från Alzheimers Society, UK (Grant nummer 317, AS-SF-16-003). C. elegans stammar erhölls från de Caenorhabditis elegans genetiska centrum (CGC).
Consumable reagents | |||
monobasic potassium phosphate | Sigma Aldrich | P0662 | |
dibasic sodium phosphate | Sigma Aldrich | S3264 | |
sodium chloride | Sigma Aldrich | 13422 | |
magnesium sulphate | Sigma Aldrich | M7506 | |
Agar | Sigma Aldrich | A1296 | |
Difco casein digest | Scientific Laboratory Supplies | 211610 | |
calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C3881 | |
cholesterol | Acros | 110190250 | |
absolute ethanol | Vwr | 20821.33 | |
5-Fluoro-2'-deoxyuridine 98% | Alfa Aesar | L16497.ME | |
LB medium capsules | MP biomedicals | 3002-031 | |
13% sodium hypochlorite | Acros Organics | AC219255000 | |
Sodium hydroxide | Fisher Chemical | S/4880/53 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Strains | |||
E coli strain OP50 | Supplied by CGC | Op50 | E coli strain |
C. elegans strain wild type | Supplied by CGC | N2 | C. elegans strain |
C. elegans strain AD | Supplied by CGC | GMC101 | C. elegans strain |
C. elegans strain PD | Supplied by CGC | NL5901 | C. elegans strain |
C. elegans strain ALS | Supplied by CGC | AM725 | C. elegans strain |
C. elegans strain Tau | Supplied by CGC | BR5485 | C. elegans strain |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Tactrol 2 Autoclave | Priorclave | ||
9 cm sterile petri dishes. | Fisher Scientific | 11309283 | |
2 L erlenmeyer flasks | Scientific Laboratory Supplies | FLA4036 | |
Nalgene 1 L Centrifuge pots | Fisher Scientific | 3120-1000 | |
RC5C plus floor mounted centrifuge | Sorvall | 9900884 | |
15 mL centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
Heraeus Multifuge X3R | Thermofisher scientific | 75004515 | |
Inoculating Spreaders | Fisher Scientific | 11821741 | |
M4 multipette | Eppendorf | 4982000012 | |
P1000 pipette | Eppendorf Research Plus | ||
P200 pipette | Eppendorf Research Plus | 3123000055 | |
P10 pipette | Eppendorf Research Plus | 3123000020 | |
1000 μL low retention tips | Sarstedt | ||
300 μL low retention tips | Sarstedt | 70.765.105 | |
10 μL low retention tips | Sarstedt | 70.1130.105 | |
pipeteboy 2 | VWR | 612-0927 | |
50 mL serological pipette | Appleton Woods | CC117 | |
25 mL serological pipette | Appleton Woods | CC216 | |
10 mL serological pipette | Appleton Woods | CC214 | |
glass pipette 270 mm | Fisherbrand | FB50255 | Camera for videos recording |
pulsin | Polyplus Transfection | 501-04 | Transduction reagent |
Multitron Standard shaking incubator | Infors HT | INFO28573 | |
air duster | Office Depot | 1511631 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
WF-NTP Tracker Components and Image Capture Software | |||
8'' by 8'' Backlight | Edmond Optics | 88-508 | Tracker component |
16 mm FL high resolution lens for 1'' sensor | Edmond Optics | 86-571 | Tracker component |
6 Mpx camera | Edmond Optics | 33540 | Tracker component |
FlyCapture Software | PointGrey | SDK v2.12 | Image capture software |
WF-NTP Software | Cambridge Enterprise | v1.0 | Image analysis software |
Office Package | Microsoft | Office 365 | Statistical analysis software |