Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Automatiserad beteendevetenskaplig analys av stor C. elegans populationer med ett brett fält-of-view spårning plattform

doi: 10.3791/58643 Published: November 28, 2018

Summary

Vi beskriver protokoll för att använda den breda fält-of-view nematoder spårning plattform (WF-NTP), vilket möjliggör hög genomströmning fenotypisk karakterisering av stora populationer av Caenorhabditis elegans. Dessa protokoll kan användas för att karaktärisera subtila beteendeförändringar i mutant stammar eller som svar på farmakologisk behandling i en mycket skalbar mode.

Abstract

Caenorhabditis elegans är en väl etablerad djurmodell i biomedicinsk forskning, allmänt sysselsatt inom funktionell genomik och åldrande studier. För att bedöma de hälso- och fitness av djuren under studien, åberopat en typiskt motilitet utläsningar, såsom mätning av antalet kropp kurvor eller hastigheten. Dessa mätningar innebära brukar manuella räknar, vilket gör det svårt att få bra statistisk signifikans, som tid och arbete begränsningar ofta begränsa antalet djur i varje experiment till 25 eller mindre. Eftersom hög statistisk effekt är nödvändigt att erhålla reproducerbara resultat och begränsa falska positiva och negativa resultat när svaga fenotypisk effekter undersöks, det nyligen har man gjort ansträngningar att utveckla automatiserade protokoll fokuserat på att öka den känslighet för motilitet detektering och flera parametriska beteendemässiga profilering. För att fördjupa detektionsgränsen till den nivå som behövs för att fånga de små fenotypiska förändringar som är ofta avgörande för genetiska studier och läkemedelsutveckling, beskriver vi här en teknisk utveckling som gör att studien av upp till 5 000 enskilda djur samtidigt ökar den statistiska styrkan av mätningar av 1.000-faldig jämfört cirka med manuella analyser och 100-fold jämfört ca med andra tillgängliga automatiserade metoder.

Introduction

Ungefär ett halvt sekel sedan, Sydney Brenner introducerade Caenorhabditis elegans (C. elegans) som modellsystem studera utvecklingen och neurobiologi, som denna lilla (1 mm i längd), transparent nematoder mask är lätt att manipulera genetiskt och upprätthålla i laboratoriet1. Idag används C. elegans att studera en mängd biologiska processer inklusive apoptos, cellsignalering, typ av cellcykeln, genreglering, metabolism, och åldrande2. Dessutom mobilnät och vävnad komplexitet, protein uttrycksmönster och bevarande av sjukdom vägar mellan C. elegans och högre organismer (80% av masken gener har en mänsklig orthologue), länkad med enkelheten och kostnadseffektiviteten för odling, gör det en effektiv i vivo modellorganism mottagliga för hög genomströmning genetiska3,4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 och drog14,15,16 filmvisningar. Av alla dessa skäl, har C. elegans varit anställd för karakterisering av normala och sjukdomsrelaterade molekylära vägar; i fältet för neurodegeneration, exempelvis har det aktiverat utforskandet av effekterna av åldrande på protein aggregering3,4,7,15,17, 18, och karakterisering av initiativtagare och hämmare av protein aggregering3,4,5,6,7,14, 18.

Den kondition av maskar, som är en viktig beteendemässiga parameter definieras i denna typ av studie, kan mätas manuellt i en mängd olika sätt, såsom genom att räkna antalet kropp kurvor per minut (BPM)4,6, 19, eller genom att mäta hastigheten på rörelse20,21,22, samt genom att mäta den genomsnittliga livslängden och priser av förlamning. Även om manuella mätningar av kroppen böjar och rörelsens hastighet har lett till många viktiga insikter i olika molekylära vägar och mekanismer3,4,14,19, 20,23, manuella analyser förblir för närvarande låg genomströmning, mycket arbetsintensiva och tidskrävande samtidigt som det är benägna att fel och människors fördomar. Dessa frågor presenterar betydande utmaningar i insamlingen av uppgifter med tillräcklig statistisk effekt att skilja subtila beteendeförändringar. Denna begränsning är särskilt relevant för drug screening som behandlingar med potentiella drog molekyler leder ofta till små fenotypiska förändringar24, därför kräver studier av stort antal djur för att erhålla reproducerbara resultat. För att illustrera denna punkt, har nyligen genomförda studier visat att en hög effekt för upptäckt (POD) är nödvändigt att definiera med tillförsikt några betydande förändringar i beteende och begränsa falskt positiva resultat25. Detta har resulterat i en stark motivation i C. elegans gemenskapen att ersätta manuell räknar med reproducerbara, automatiserad, tid - och kostnads - effective mätningar. För att möta denna efterfrågan, har flera laboratorier nyligen utvecklat metoder för högkänsliga mätningar och korrekt mask spårning av större antal maskar22,26,27,28 ,29,30,31,32,33.

För att expandera ytterligare processen för automation till de stora kohorterna av djur behövs för statistiskt signifikant mätningar, har vi nyligen utvecklat ett brett fält-of-view Nematoden spårning plattform (WF-NTP)15,34 ,35,36, vilket möjliggör samtidig undersökning av flera fenotypiska utläsningar på mycket stora mask populationer, en nyckelfaktor i statistiskt relevanta fenotypiska upptäckt25. Inte bara kan WF-NTP för närvarande övervaka upp till 5 000 djur parallellt, men fenotypiska avläsning även omfatta flera parametrar, inklusive hastighet och amplitud av kroppen böjar, hastigheten, andelen av befolkningen som är förlamad, och den storleken på djuren. Det går därför lätt att skärm tusentals av maskar parallellt och att kombinera olika avläsning till kartan beteende för att skapa en flerdimensionell fingeravtryck36. Den associerade programvaran med öppen källkod är skrivet i Python, som också krävs för att använda det och är helt anpassningsbara. Ett grafiskt användargränssnitt (GUI) som också möjliggör användare att anta denna teknik.

Här presenterar vi en serie av protokoll som illustrerar några av de potentiella tillämpningarna av WF-NTP. I synnerhet vi diskutera administrationen av föreningar, alltifrån små molekyler till protein therapeutics, och beskriva hur man skärmen deras effekter direkt över stora populationer av maskar, således effektivt ta bort behovet av att prova på små delpopulationer. Användning av WF-NTP för sådant ändamål har redan medfört betydande fördelar i förfaranden som syftar till att utforma drug discovery program för Alzheimers sjukdom (AD)15,34,35 och Parkinsons sjukdom (PD)18 med hjälp av in vivo-data för bedömning av terapeutisk kandidater35,37.

Protocol

1. beredning av material för C. elegans protokoll

  1. För att förbereda en 10 x M9 buffertlösning, tillsätt 30 g monobasiskt kaliumfosfat, 60 g dibasiskt natriumfosfat och 50 g natriumklorid en 1 L autoklaverbart flaskan.
    1. Lägg till 1 L av renat vatten och autoklavera vid ca 121 ° C under 15 minuter.
    2. Späd 10 gånger i renat vatten och autoklavera vid ca 121 ° C under 15 minuter.
    3. När svalnat, tillsätt 1 mL av en lösning av 1 M magnesiumsulfat.
      Obs: Endast 1 x M9 (M9) bör användas för mask hantering i följande steg.
  2. För att förbereda nematoder odlingsmedium (Rich-NGM), blanda 2,7 g natriumklorid, 15,75 g agar, 5.75 g kasein, 900 mL renat vatten och autoklav vid 121 ° C i 15 min.
    1. Överföra Rich-NGM mediet till en värmande ugn (ca. 70 ° C) om den inte används omedelbart; Rich-NGM kan hållas smält vid ca 70 ° C i upp till 12 h innan det blir oanvändbart.
    2. Rich-NGM blanda, tillsätt 900 µL av en lösning av 1 M kalciumklorid, 900 µL av en lösning av 1 M magnesiumsulfat och 900 µL av en lösning av 5 mg/mL kolesterol i absolut etanol.
      Obs: Kolesterol kräver inte autoklavering före användning.
    3. För att förbereda de experimentella plattor som upprätthåller befolkningens ålder synkron, tillsätt 92 µL 5-fluoro-2'-deoxiuridin (FUDR) vid 812 µM till 900 mL Rich-NGM.
      Obs: FUDR är både giftig och cancerframkallande, så det är viktigt att bära nitrilhandskar Förutom lab rockar och skyddsglasögon. Tillåt inte avfall att ange allmänna avfall strömma och avyttra genom förbränning med en efterbrännkammare.
    4. Häll 20 mL av Ånghärdad Rich-NGM i en 9 cm steril petriskål att generera en tillväxtplattan (Rich-NGM plattan). Häll 15 mL av Ånghärdad Rich-NGM i en 9 cm steril petriskål att göra en motilitet plåt (Mot plattan). Häll 20 mL av Rich-NGM med FUDR i en 9 cm steril petriskål att generera en FUDR plattan.
      Obs: Låg agar volymen av Mot plattan underlättar kameran fokusera och mask spårning (se punkt 3.2.5).
  3. Förbereda OP50 Escherichia coli stam, genom autoklavering 1 L LB buljong vid 121 ° C i 15 min och Inokulera med förrätt kultur när svalnat.
    1. Låt den bakteriella kulturen att växa över natten vid 37 ° C och sterilisera röret som ska användas för centrifugering.
    2. Överför bakterierna till sterila rör och centrifugera vid 4.600 x g i 15 min.
    3. Dekantera supernatanten och med sterilt vatten, avbryta i 10% av den ursprungliga volymen att skapa 10 x (10 gånger koncentrerade) OP50 lager.
    4. Späd ut 15 mL 10 x OP50 beståndet till 150 mL att generera 1 x OP50, med sterilt vatten, innan de används till utsäde Rich-NGM plattor. De återstående 10 x lösning till utsäde FUDR plattor.
      Obs: Mot plattorna förblir unseeded och kommer att användas endast i bild förvärv steg.
  4. Att frö plattor med bakterier, segregera Rich-NGM och FUDR plattor.
    1. Under sterila förhållanden och tillsätt 350 µL av 1 x OP50 till Rich-NGM tallrikar och fördela jämnt.
      Obs: Sprid inte på kanten av plattan som maskar kommer krypa upp sidorna av plattan och dö.
    2. Under sterila förhållanden och tillsätt 350 µL 10 x OP50 till FUDR tallrikar och fördela jämnt.
    3. Låt plattorna torka och inkubera vid 20 ° C under 2 d före användning.

2. beredning av C. elegans för användning med WF-NTP

  1. Bibehålla C. elegans på Rich-NGM tallrikar eller genom att överföra en liten mängd agar som innehåller maskar med framsidan nedåt på ett nytt bakteriell skikt. Upprätthålla de C. elegans stammarna på detta sätt innan de experimentella protokoll.
  2. Med överlämnande-tekniken (se steg 2.1), utsäde 20 plattor av varje stam med välnärda, blandad Stadium maskar och tillåta dem att växa för 2 d vid 20 ° C.
  3. Tvätta bort 5 plattor som innehåller maskar med 15 mL M9 och pool i en 15 mL tub. Upprepa för alla 20 plattor för varje stam.
  4. Centrifugera maskar vid 2000 x g i 2 min, avlägsna supernatanten och avbryta i 2 mL M9 lösning.
  5. Förbereda 10 mL blekning lösning genom att blanda 13% natriumhypoklorit och 4 M natriumhydroxid i förhållandet 3:2 vol/vol.
    Obs: Denna lösning kräver inte autoklavering. Både komponenter och den resulterande lösningen är frätande och ska hanteras med omsorg med handskar i Nitril. Natriumhydroxid är milt frätande på glas och bör förvaras i plastbehållare.
  6. Tillsätt 1 mL blekning lösning till varje centrifugrör och skaka kraftigt i ca 3,5 min eller tills nagelbanden är helt upplöst.
  7. Under sterila förhållanden och späd proven till 15 mL M9 och centrifugera vid 2000 x g för 2 min. avlägsna supernatanten och suspendera i 15 mL M9 lösning.
  8. Upprepa steg 2,7 6 gånger, tills endast mask ägg kvar, och lösningen inte längre har en lukt av klor.
  9. Centrifugera proverna vid 2000 x g i 2 min, avlägsna supernatanten och avbryta i 2 mL M9 lösning.
  10. Under sterila förhållanden och Använd en steril glas pipetten att överföra 2 mL av M9 innehållande ägg i varje brunn 12-väl vävnadsodling platta och inkubera vid 20 ° C under minst 16 h.
    Obs: Använda separata plattor för varje stam för att förhindra korskontaminering. Överlåtande steget från Centrifugera rören till flera wells hjälper att undvika mask kvävning.
  11. Överföra de maskar som kläckts över natten från de 12 brunnar i 15 mL centrifugrör. Ta 3 droppar 5 µL mask lösning och räkna antalet maskar närvarande vid första larvstadium (L1).
  12. Beräkna antalet maskar per µL lösning.
  13. Utsäde L1 maskar på Rich-NGM pläterar på 3.000 maskar per platta och tillåta dem att växa för 2 dagar vid 20 ° C, tills de når sista larvstadium (L4) etappen.

3. allmänna WF-NTP-protokollet

  1. Lägg till 2,2 mL av varje läkemedel som är sammansatta i lämplig koncentration (sådan som 25 eller 10 mM för droger som squalamine18 och bexaroten15, respektive) till 6 FUDR plattor och låt torka under sterila förhållanden för varje önskad mask stam.
    Obs: Detta steg upprepas för varje förening under granskning, för varje koncentration och varje lösningsmedel används.
    1. Tvätta maskar av 5 Rich-NGM plattor beredd vid steg 2.13 med 15 mL M9 buffert och överföra maskar till ett centrifugrör.
    2. Centrifugera vid 2000 x g i 2 min, ta bort supernatanten och upphäva 3 ml M9. Ta 3 droppar 5 µL av M9 lösningen innehållande maskar och räkna antalet maskar närvarande vid den sista larvstadium L4.
    3. Beräkna antalet maskar per µL av M9 buffert.
  2. Utsäde 700 L4 larver på 6 i torr FUDR plattorna som innehåller en viss förening, upprepa för varje koncentration av varje förening och låt torka under sterila förhållanden.
    1. Inkubera maskar vid 24 ° C från L4 för dessa stammar där masken förlamningen framkallas endast genom att höja temperaturen, till exempel AD stam38. Räkna dagen efter den L4 larvstadium som D0 av vuxenlivet.
  3. Slå på scenbelysningen för tracker.
    1. Rengör glaset scenen med 70% etanol och säkerställa att inga synliga rester kvar, sedan ta bort linsskyddet. Ren objektivets imaging använder en air duster. Kontrollera att kameran är korrekt ansluten och installerat och börja spela in med programvaran image capture.
    2. Justera kamerainställningar för att spela in 20 bildrutor/s, med mono 16 inspelning parametrar installationen. spela in 1.200 ramar, Spara i MJPEG format på en 95% komprimering. Använd en tom 9 cm petriskål för att säkerställa att scenen är inställd på rätt höjd och vid behov justera.
      Obs: Se till att kanterna på plattan syns i inspelningen eftersom detta gör att 'hålla-dead' algoritmen fungerar korrekt (figur 1a).
    3. Under sterila förhållanden och ta 2 plattor tidigare beredd på steg 3,2 med samma villkor och 1 Mot screening plattan som bereddes i steg 1.2.4. Lägga till 3 mL av M9 lösningen Mot plattan. Använda andra 2 mL M9 att tvätta 1/3 av ytan av 2 plattor beredd vid steg 3,2 på Mot plattan.
    4. Placera Mot plattan innehållande cirka 5 mL M9 lösningen och cirka 600 maskar på tracker scenen. Fokusera kameran med en enskild mask och börja inspelningen.
    5. När inspelningen är klar, kasta Mot plattan med maskar; Markera FUDR plattorna som används en gång och returnera den till inkubatorn.
    6. Upprepa steg 3.3.3 till 3.3.5 för varje experimentella villkor.
    7. Upprepa steg 3.3.3 till 3.3.6 för varje tidpunkt vuxen livslängd.
      Obs: Undersökningsförfaranden som kan utföras när som helst av maskens vuxen livslängd (ca. 3 veckor). Dessa protokoll underlätta screening upp till 9 tidpunkter; författarna rekommenderar screening varje 2 dagar från dag 1 i vuxen ålder.

4. optimering för diskreta dosstudier

  1. Förbereda maskar genom att upprepa steg 3.1.1 till 3.1.3.
    1. Utsäde ca. 1000 L4 maskar på 5 FUDR plattor. Inkubera plattorna vid 24 ° C tills D3 i vuxen ålder, för experiment med AD38 maskar.
  2. Med steril glas pipett överföring maskar beredd under sterila förhållanden från plattan till en 15 mL centrifugrör, Centrifugera vid 2000 x g i 2 min och avlägsna supernatanten.
    1. Avbryta lösningen av maskar i 1 mL av M9 buffert. Överför maskar i en mikrocentrifug rör, Centrifugera vid 300 x g under 2 minuter, och avlägsna supernatanten.
  3. För protein transduktion, tillsätt 40 µL av transfection leverans reagens och 20 µL av infödda protein på önskad koncentration (vanligtvis 40 µM) och odla i rumstemperatur i 30 min.
    1. Under sterila förhållanden och Använd en steril glas pipetten för att överföra maskar från steg 4.2.1 i en mikrocentrifug rör innehållande inkapslade protein för att ge en total volym på 1060 µL. plats rör horisontellt och skaka på 60 rpm i en 24 ° C skakar inkubator för 8 h.
  4. Under sterila förhållanden och tillsätt 4 mL M9 lösning till en Mot plattan och överföra ett mikrocentrifug rör av maskar plus drog på Mot plattan.
    1. Ställa in tracker genom att upprepa steg 3.3 till 3.3.2.
    2. Under sterila förhållanden och tillsätt 4 mL M9 lösning till en Mot plattan och överföra ett mikrocentrifug rör av maskar plus drog på Mot plattan.
    3. Placera Mot plattan på tracker scenen, fokuserar kameran på en enskild mask och börja inspelningen. När du är klar, etikett Mot plattan och ställ åt sidan.
    4. Upprepa steg 4.4.1 och 4.4.3 för alla prover.
    5. Med glas pipett överföra maskar under sterila förhållanden från Mot plattan till en 15 mL centrifugrör, Centrifugera vid 2000 x g i 2 min. ta bort supernatanten, överföring pelleten på en FUDR plattan och låt torka under sterila förhållanden.
    6. Upprepa steg 4.4.5 för alla prover.
  5. Inkubera maskar vid 24 ° C tills D6 i vuxen ålder.
    Obs: Flera antikropp inkubationer är också möjliga.
  6. Tillsätt 3 mL M9 bufferten till Mot plattan och Använd 2 mL M9 lösning för att tvätta alla maskar från en FUDR plattan på Mot plattan.
    1. Ställa in tracker genom att upprepa steg 3.3 till 3.3.2.
    2. Placera Mot plattan på tracker scenen, fokusera kameran som behövs och börja inspelningen. När inspelningen är klar, kassera Mot plattan eller återställa det för ytterligare screening om så önskas.
    3. Upprepa steg 4,6 till 4.6.2 för alla prover.

5. analysera videodata

  1. Efter att förvärva videor, Välj parametrarna i programvaran GUI (figur 2) för dataanalys.
    1. Ladda enstaka eller flera videoklipp via funktionen webbsökning . Välj en utdatamapp för destination. Säkerställa att 600 till 1 200 ramar används för en 30 s analys.
      Obs: Alla intervall av bildrutor kan analyseras.
    2. Infoga en pixel att mm omvandlingsfaktor som kommer att vara 0,029 för imaging en 9 cm petriskålar med full upplösning. Välj spårning algoritmen 'hålla döda'.
      Obs: Omvandlingsfaktorn beror på synfältet används. Z-omforma algoritm kan också användas som ett alternativ.
    3. Fyll i parametrarna i avsnittet identifiera (figur 2): Z använda bilder = 100, Z stoppning = 3, Std pixlar = 54, tröskelvärde = 9, öppning = 1, utgående = 2. Justera filtrering parametrar till Minimum storlek = 20, maximal storlek = 180, maskliknande = 0,94.
    4. Finjustera parametrarna bilda banor : Maximalt avstånd flytta = 10; Minsta längd = 150, minne = 10.
    5. Ange parametrar för böjar och hastighet . Använd 1,8 för böj tröskel, 0 för Minimum böjaroch 150 för ramar att uppskatta hastighet.
    6. Tune döda masken statistik. Använda 5.0 för maximal beat per minut och 1,0 för maximal hastighet.
    7. Välj utdatamappen. Ange antalet bildrutor som utdata till 50. Ange teckenstorlek till 10.
      Obs: Du kan också välja en eller flera regioner av intresse (ROIs).
  2. Testa parametrarna med hjälp av funktionen exempel . Utgång till exempel bilder och kontrollera att maskar är synliga i hela 8 tröskelvärde stegen (figur 1).
  3. Använd funktionen starta jobbet .
  4. Analysera resultatet textfiler genom att kombinera de enskilda resultaten för hela datamängden. Använd Export till tsv funktion i GUI.
    Obs: Alternativt kan enskilda mätvärden av maskar också övervägas för befolkningsstudier.
    1. Analysera data med en statistiskt programpaket.

Representative Results

Förenklar drift och multiparametric analys och hög genomströmning av illustrerade WF-NTP-protokollet (siffrorna 1 och 2) gör det möjligt att fastställa mycket små förändringar i masken beteende på ett mycket exakt sätt. Imaging plattformen bygger på skräddarsydd opto-mekanik, och den kan monteras med hjälp av en 6 MP svartvit kamera kombinerat med 16 mm brännvidd för högupplösta för 1'' sensor, upplyst med en 8'' av 8'' vit bakgrundsbelysning (se Tabell för material ”och också referera36 för ytterligare detaljer). Associerade WF-NTP programvaran är skrivet i Python och har utvecklats för att köras på Windows-plattformar. Det körs på en anpassad dator med 3.00 GHz octa-core-processor och 64 GB av minne (RAM). Programvaran var också avsedd att parallellisera arbete och video analys baserat på RAM och CPU av datorn; dvs, en maskin med en lägre beräkning makt kommer att resultera i mindre videor parallellt. Den setup som vi använder för närvarande är optimerad för att köra upp till ca. 16 videor parallellt och kan utföra en analys av ca. 100 videor över natten. Dessutom tillåter den hög detaljnivån av anpassning i GUI av WF-NTP stor kontroll av kvaliteten på bildanalys. GUI kan användas för att direkt ladda upp stora datamängder i parallell eller enskilda videor; specifika bildrutor kan också väljas för detaljerad sub analys, tillsammans med en pixel omvandlingsfaktor som kan användas för att uppskatta beteendemässiga mätvärden. En av de två olika spårning algoritmerna (håll döda och Z-transformen) kan väljas beroende på om användaren vill överväga förlamade djur i analysen. Parametern tröskelvärde kan vara trimmad med detta med video och experimentell kvalitet. Öppnande och avslutande parametrar tillåter användaren att ta bort buller och fortsätta att genomföra funktionen tröskelvärde. Skeletonizing algoritmen erbjuder en alternativ metod för analys. De objektet storlek cut-off (filtrering) tillhandahåller ett ytterligare filter för bakgrundsljud och parametern maskliknande tillåter användaren att överväga maskar endast objekt med en elliptiskt form, därav särskiljande från andra objekt som kan ha samma pixelstorlek maskar. Efter dessa tröskelvärde operationer, alla de resulterande märkta regionerna kan identifieras som enskilda maskar och positionerna för dessa regioner lagras sedan för varje ram för efterföljande analys och spårning. Excentriciteten av varje spårad mask används för att uppskatta mask mätvärden såsom omfattningen av masken bockning (BPM) som en funktion av tiden. Användarna får också välja antalet ramar som används för att hålla en mask i minnet av programvaran efter kollisioner, och antalet pixlar som en mask kan flytta mellan ramar kan också ställas in för att skilja djuren från buller. Alternativet minsta spår längd tillåter användaren att kassera maskar som har spårats för endast ett fåtal bildrutor. Andra viktiga parametrar, såsom böjar och hastighet, tillåter användaren att välja graden av bockning krävs för att räknas som en kropp böj och antalet ramar som anses behövas för att beräkna hastigheten på djuren. Cut-off parametrar kan justeras ytterligare för införande av förlamade djur. Utdata visas automatiskt i resultatet filer. Dessa värden betraktas som övre gränser för utvärdering av fraktionen av förlamade djur. Användaren kan också välja ett eller flera områden av intresse. Den här funktionen är särskilt användbart för att analysera subpopulations av maskar och utdata sorteras automatiskt i resultatfilerna. Alternativet tillåter användaren att Välj utdatamappen och antalet spårning ramar som kommer att produceras för den. Olika verktygsuppsättningar kan också användas för ytterligare analys av data, såsom verktyget tomt bana som visar enskilda mask spår och verktyget fingeravtryck som tillåter användaren att skapa fingeravtryck kartor.

Denna metod gör det möjligt för nya metoder antas, inte bara för biologiska studier av C. elegans men också för farmakologiska och medicinska forskningsändamål, såsom hög genomströmning screening av genetiska modifieringar och läkemedelsbehandlingar. Vi har illustrerat denna potential genom att beskriva karakterisering av fenotyperna för stora befolkningsstudier (N > 1000) av olika mask modeller av neurodegenerativ sjukdom (frontotemporal demens (FTD)39, Parkinsons sjukdom (PD)7 , Alzheimers sjukdom (AD)16,40, och amyotrofisk lateralskleros (ALS)19 (figur 3a) och karakterisera effekten av potentiella terapeutiska molekyler mask modeller av PD18 och AD 15,12 (figur 3b). Två små molekyler, squalamine18 och bexaroten15, administrerades vid koncentrationer upp till 25 µM till PD (figur 3b) och 10 µM till AD38 (figur 3b) maskar, respektive. Båda föreningarna visade tydligt dosberoende effekter över spänna av koncentrationer testats. Vi har visat att denna höga noggrannhet i mätningarna uppnås genom att öka antalet maskar som kan analyseras jämfört med traditionella metoder (figur 3 c). Vi illustrerat vikten av urvalets storlek (figur 3 c) i molekylär screening samt liksom karakterisering av muterade stammar. Temperaturhöjningen från 20 ° C leder till ungefär hälften av AD maskar blir förlamad efter 3 dagar av vuxenlivet. Worm populationer screenades under olika förhållanden, t.ex., när maskar över uttrycker 42-rester form av amyloid-beta peptiden (Aβ1-42) (AD maskar) utsattes för subtila temperaturvariationer (figur 3 c, vänster ”panel), när Aβ1-42 uttrycktes i alla nervceller (figur 3 c, centrala panelen) eller när AD maskar utsattes för bexaroten (figur 3 c, högra panelen). Worms analyserades också från små ROIs slumpmässigt utvalda från hela synfältet av de videor som förvärvats med WF-NTP (N < 50, gula staplar) belyser jämförelsen av motiliteten av dessa maskar med den genomsnittliga motiliteten av hela masken befolkningen (N < 1000). I alla paneler, skillnaden mätt på hela masken befolkningen verkar vara statistiskt signifikant med p ≤ 0,0001 (*).

WF-NTP-protokollet som beskrivs här kan även samtidig inspelning av flera parametrar (figur 1b) att stödja, på ett optimalt sätt, både intern validering och utvecklingen av ett omfattande fingeravtryck av en rad olika förhållanden i förhållande till ett kontrollprov, möjliggör meningsfulla jämförelser över flera studier. Denna multi parametrisk metod innefattar samtidig analys av flera behavioral funktioner, inklusive bockning frekvens, hastighet, förlamning hastigheten, storlek, böj amplitud och böj deplacement36. Detta tillåter tusentals djur övervakas i detalj och på en mycket hög känslighet och statistisk signifikans och ger möjligheter för stora populationer studier. Proceduren spårning har också fördelen att förlamning studier som ska genomföras i parallell med andra beteendemässiga mätningar, en nyckelfunktion i molekylär screening studier.

De resultat som har uppnåtts hittills i AD15,34,35 och PD18 läkemedelsutveckling visar vikten av bred field-of-view datainsamling att kraftigt öka antalet djur som kan vara övervakas i en enda experiment, avsevärt minska de experimentella fel och kraftigt förbättra statistiska giltigheten av studierna. Baserat på dessa resultat, räknar vi med att WF-NTP-protokollet, som vi gjorde lätt tillgängliga för gemenskapens36, avsevärt kommer att utöka användningen av C. elegans.

Figure 1
Figur 1: WF-NTP analys steg och exempel på ett fingeravtryck. (en) 1. Originalvideon. 2. bakgrundsbild. 3. bakgrund subtraheras bild. 4-6. tröskelvärde steg. 7-9. enda märkning av maskar. (b) flera fenotyper redovisas med ett fingeravtryck för vildtyp maskar och mask modeller av PD och AD. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: grafiskt användargränssnitt (GUI) av WF-NTP. Specifika videoklipp och markerade bildrutor kan väljas i GUI för analys och en pixel konverteringsfaktor kan infogas, varefter analysen utförs med en av de två givna spårning algoritmerna. Det är möjligt att välja graden av bockning nödvändigt att räkna som en kropp böj samt antalet ramar som behövs för att beräkna hastigheten på djuren. Kropp kurvor och hastighet tröskelvärden kan avgöra den förlamade mask statistiken. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: exempel på tillämpningar som möjliggörs av WF-NTP metoden. (en) tillämpning av WF-NTP i stora befolkningsstudier (N > 1 000) av BPM mätningar för C. elegans modeller av en rad neurodegenerativa sjukdomar inklusive FTD, PD, AD, och ALS. (b) tillämpning av WF-NTP i läkemedelsutveckling. (c) betydelsen av befolkningsstudier i temperatur känslighet, drogen effekt och mutant stam karakterisering. Fenotyper av subpopulationer N < 50 (gula staplar) jämförs med dem av hela masken befolkningen (N < 1000). Felstaplar visar standardavvikelsen för medelvärdet (SEM). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

På grund av den snabba expansionen av tekniker inom optisk vetenskaper är det nu möjligt att kravet på automatiserade metoder i C. elegans studier i väsentligen nya sätt. Som ett resultat, ett antal digital tracking plattformar20,41,42,43,44,45,46 har utformats och förfogande över de senaste åren för att ersätta manuell räkning av parametrar såsom hastighet rörlighet, bockning frekvens, förlamning hastigheten, samt mer komplexa former av beteenden såsom omega svängar och livslängd mätningar. Den senaste automatiserade plattformar har kraftigt förbättrat reproducerbarhet och känsligheten hos C. elegans studier41 och högkvalitativ data på små kohorter eller ens enskilda djur. Vi beslutade att förlänga automatisering av analysen av masken beteende till gör det också möjligt att utvärdera fenotyperna av kohorter av tusentals djur parallellt. Den största fördelen med metoden att studera mask kohorter är att det tillåter för redovisning för hög inneboende variabilityen av masken beteende24 och det faktum att drogen behandlingsstudier ofta leda till subtila fenotypiska variationer, som är svåra att detektera med tillräcklig statistisk signifikans när du använder en liten grupp av djur. En hög effekt för upptäckt (POD) är verkligen nödvändigt att upptäcka med förtroende någon betydande variation i beteende och begränsa falskt positiva resultat25.

Här har vi beskrivit en rad protokoll baserat på en nyligen rapporterade automatiserad screeningmetod för C. elegans, brett fält-of-view Nematoden spårning plattform (WF-NTP)36. Protokollet beskrivs här är uppdelad i 5 delar. Delarna 1 och 2 beskriver utarbetandet av stora mask populationer. Kritiska steg är sterilitet av arbetsförhållandena och beredning av reagens och plattor behövs för att köra experiment. Vi noterar att, på grund av ökad genomströmning som tillhandahålls av detta protokoll jämfört med andra screening metoder36, det kräver också ökade kvantiteter av reagenser. Denna faktor måste noga övervägas i experimentell design. Vi noterar också att steget blekning är kritisk och måste testas i förväg som ett stort antal ägg och friska larver är nödvändiga för att köra dessa experiment. Del 3 av detta protokoll Detaljer hur man levererar droger i solid media och skärmen mask populationer. Vi noterar att denna del av protokollet är starkt beroende av antalet droger och läkemedelskoncentrationen att testas av användaren parallellt. Den komplett automatiseringen av screeningen och snabb datainsamling skifta det begränsande steget från beteendevetenskaplig observation till REAGENSBEREDNING och tillväxt och synkronisering av stora mask populationer. De viktigaste stegen under beteendemässiga screening är tidpunkterna för inspelningen och någon mask hantering steg (t.ex., överföring av maskar från NGM plattorna till spårning plattform). Protokollet beskrivs här är ett exempel som utformats till skärmen maskar för upp till 9 dagar under vuxen livslängd; dock kan detta protokoll enkelt anpassas till skärmen så många tidpunkter som användaren önskar, t.ex., 18 dagar36. Del 4 sedan illustrerar tillämpningen av protokollet att leverera proteinmolekyler (t.ex. antikroppar och molekylär chaperones) i C. elegansoch visar hur protokollet illustreras i delarna 1-3 kan enkelt anpassas, beroende på önskad ansökan. Vi visar hur detta förfarande kan utökas inte bara till leverans av narkotika-liknande molekyler men också för administrationen av molekylär chaperones eller antikroppar37. De första fyra stegen (delar) utförs under sterila förhållanden, om inte annat anges. Alla likvida komponenterna bör Ånghärdad före användning och inkubationsstegen bör utföras vid 70% relativ luftfuktighet. I del 5 beskriver vi hur du använder programpaketet som tillhandahålls i kombination med spårning scenen. Denna programvara har varit anpassade utformade för analys av WF-NTP data relaterade till uppförandet av stora mask populationer. Vi föreslår att användaren följer de riktlinjer som fastställs i del 5 för dataanalys; dessa parametrar är dock beroende på särdragen i det inspelade videor (dvs, fps, synfält, upplösning, antal förvärvade ramar). Till exempel funktion i GUI har utformats för att underlätta utvärderingen av korrekta parametrar före analysen.

Dessa serier av protokoll gör det möjligt att analysera fenotyperna av stora populationer av C. elegans (för närvarande upp till 5 000 enskilda maskar parallellt) effektivt, minska artefakter på grund av det inneboende variabilitet av beteendet hos djuren , i samförstånd med förundersökningar om identifiering krävs för att uppnå statistisk signifikans för studier av C. elegans25. Plattformen använder ett system av högupplösta kameror, kan spela in bilder av stora mängder djur med hög hastighet, medan du spelar samtidigt in flera stora kohorter. Hög prestanda och hög genomströmning av WF-NTP-protokollet gör det möjligt att fastställa mycket små förändringar i masken beteende på ett mycket exakt sätt. Denna metod kan därför nya infallsvinklar anses inte bara för att studera biologi C. elegans, men dessutom för farmakologiska och medicinsk forskning, såsom hög genomströmning screening av genetiska modifieringar och drog behandlingar. Detta förfarande har också fördelen att förlamning studier som ska genomföras i parallell med andra beteendemässiga mätningar, en nyckelfunktion i molekylär screening studier.

De resultat som har uppnåtts hittills i drug discovery program AD15,34,35 och PD18 visar vikten av bred field-of-view datainsamling för att avsevärt öka den antal djur som kan övervakas i en enda experiment, vilket avsevärt minskar de experimentella fel och kraftigt förbättra statistiska giltigheten av studier. Den nuvarande metoden som beskrivs i detta protokoll har fokuserat på utmaningar inom läkemedelsutveckling, vi hoppas att metoden allmänt antas i gemenskapen och att dess tillämpning kommer att utvidgas till komplexa genetiska och beteendemässiga studier och utöka antalet fenotyper som för närvarande kan detekteras.

Disclosures

Författarna förklarar att det inte finns några intressekonflikter.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av centrum för Skellefteåsjukan sjukdomar (CMD). FAA stöds av en Senior Research Fellowship award från Alzheimers Society, UK (Grant nummer 317, AS-SF-16-003). C. elegans stammar erhölls från de Caenorhabditis elegans genetiska centrum (CGC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Consumable reagents
monobasic potassium phosphate Sigma Aldrich P0662
dibasic sodium phosphate Sigma Aldrich S3264
sodium chloride Sigma Aldrich 13422
magnesium sulphate Sigma Aldrich M7506
Agar Sigma Aldrich A1296
Difco casein digest Scientific Laboratory Supplies 211610
calcium chloride dihydrate Sigma Aldrich C3881
cholesterol Acros 110190250
absolute ethanol Vwr 20821.33
5-Fluoro-2'-deoxyuridine 98% Alfa Aesar L16497.ME
LB medium capsules MP biomedicals 3002-031
13% sodium hypochlorite Acros Organics AC219255000
Sodium hydroxide Fisher Chemical S/4880/53
Name Company Catalog Number Comments
Strains
E. coli strain OP50 Supplied by CGC Op50 E coli strain
C. elegans strain wild type Supplied by CGC N2 C. elegans strain
C. elegans strain AD Supplied by CGC GMC101 C. elegans strain
C. elegans strain PD Supplied by CGC NL5901 C. elegans strain
C. elegans strain ALS Supplied by CGC AM725 C. elegans strain
C. elegans strain Tau Supplied by CGC BR5485 C. elegans strain
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Tactrol 2 Autoclave Priorclave
9 cm sterile Petri dishes Fisher Scientific 11309283
2 L erlenmeyer flasks Scientific Laboratory Supplies FLA4036
Nalgene 1 L Centrifuge pots Fisher Scientific 3120-1000
RC5C plus floor mounted centrifuge Sorvall 9900884
15 mL centrifuge tubes Fisher Scientific 05-539-12
Heraeus Multifuge X3R Thermofisher scientific 75004515
Inoculating Spreaders Fisher Scientific 11821741
M4 multipette Eppendorf 4982000012
P1000 pipette Eppendorf Research Plus
P200 pipette Eppendorf Research Plus 3123000055
P10 pipette Eppendorf Research Plus 3123000020
1,000 μL low retention tips Sarstedt
300 μL low retention tips Sarstedt 70.765.105
10 μL low retention tips Sarstedt 70.1130.105
pipeteboy 2 VWR 612-0927
50 mL serological pipette Appleton Woods CC117
25 mL serological pipette Appleton Woods CC216
10 mL serological pipette Appleton Woods CC214
glass pipette 270 mm Fisherbrand FB50255 Camera for videos recording
pulsin Polyplus Transfection 501-04 Transduction reagent
Multitron Standard shaking incubator Infors HT INFO28573
air duster Office Depot 1511631
Name Company Catalog Number Comments
WF-NTP Tracker Components and Image Capture Software
8'' by 8'' Backlight Edmond Optics 88-508 Tracker component
16 mm FL high resolution lens for 1'' sensor Edmond Optics 86-571 Tracker component
6 Mpx camera Edmond Optics 33540 Tracker component
FlyCapture Software PointGrey SDK v2.12 Image capture software
WF-NTP Software Cambridge Enterprise v1.0 Image analysis software
Office Package Microsoft Office 365 Statistical analysis software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, (1), 71-94 (1974).
  2. Kaletta, T., Hengartner, M. O. Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism. Nature Reviews Drug Discovery. 5, (5), 387-399 (2006).
  3. Nollen, E. A. A., et al. Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 101, (17), 6403-6408 (2004).
  4. Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 99, (16), 10417-10422 (2002).
  5. Van der Goot, A. T., et al. Delaying aging and the aging-associated decline in protein homeostasis by inhibition of tryptophan degradation. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the USA. 109, (37), 14912-14917 (2012).
  6. Van Ham, T. J., et al. Identification of MOAG-4/SERF as a regulator of age-related proteotoxicity. Cell. 142, (4), 601-612 (2010).
  7. Van Ham, T. J., et al. C. elegans model identifies genetic modifiers of α-synuclein inclusion formation during aging. PLoS Genetics. 4, (3), e1000027 (2008).
  8. Hamilton, B., et al. A systematic RNAi screen for longevity genes in C. elegans. Genes & Development. 19, (13), 1544-1555 (2005).
  9. Sarin, S., Prabhu, S., O'Meara, M. M., Pe'er, I., Hobert, O. Caenorhabditis elegans mutant allele identification by whole-genome sequencing. Nature Methods. 5, (10), 865-867 (2008).
  10. Kim, Y., Sun, H. Functional genomic approach to identify novel genes involved in the regulation of oxidative stress resistance and animal lifespan. Aging Cell. 6, (4), 489-503 (2007).
  11. Dillin, A., et al. Rates of Behavior and Aging Specified by Mitochondrial Function During Development. Science. 298, (5602), 2398-2401 (2002).
  12. Lee, S. S., Kennedy, S., Tolonen, A. C., Ruvkun, G. DAF-16 target genes that control C. elegans life-span and metabolism. Science. 300, (5619), 644-647 (2003).
  13. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nature Reviews. Genetics. 3, (5), 356-369 (2002).
  14. Alavez, S., Vantipalli, M. C., Zucker, D. J. S., Klang, I. M., Lithgow, G. J. Amyloid-binding compounds maintain protein homeostasis during ageing and extend lifespan. Nature. 472, (7342), 226-229 (2012).
  15. Habchi, J., et al. An anticancer drug suppresses the primary nucleation reaction that initiates the production of the toxic A 42 aggregates linked with Alzheimers disease. Science Advances. 2, (2), e1501244 (2016).
  16. Wu, Y., et al. Amyloid- -Induced pathological behaviors are suppressed by ginkgo biloba extract EGb 761 and ginkgolides in transgenic caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience. 26, (50), 13102-13113 (2006).
  17. Link, C. D. Expression of human beta-amyloid peptide in transgenic Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 92, (20), 9368-9372 (1995).
  18. Perni, M., et al. A natural product inhibits the initiation of a-synuclein aggregation and suppresses its toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the USA. 114, (6), E1009-E1017 (2017).
  19. Gidalevitz, T., Krupinski, T., Garcia, S., Morimoto, R. I. Destabilizing protein polymorphisms in the genetic background direct phenotypic expression of mutant SOD1 toxicity. PLoS Genetics. 5, (3), e1000399 (2009).
  20. Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans. Journal of visualized experiments. (95), 52321 (2015).
  21. Machino, K., Link, C. D., Wang, S., Murakami, H., Murakami, S. A semi-automated motion-tracking analysis of locomotion speed in the C. elegans transgenics overexpressing beta-amyloid in neurons. Frontiers in Genetics. 5, 202 (2014).
  22. Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nature Methods. 8, (7), 592-598 (2011).
  23. Van der Goot, A. T., Nollen, E. A. A. Tryptophan metabolism: entering the field of aging and age-related pathologies. Trends in Molecular Medicine. 19, (6), 336-344 (2013).
  24. Lublin, A. L., Link, C. D. Alzheimer's disease drug discovery: in vivo screening using Caenorhabditis elegans as a model for β-amyloid peptide-induced toxicity. Drug Discovery Today: Technologies. 10, (1), e115-e119 (2013).
  25. Petrascheck, M., Miller, D. L. Computational analysis of lifespan experiment reproducibility. Frontiers in genetics. 8, (JUN), 92 (2017).
  26. Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E. X., Schafer, W. R. A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes. Nature Methods. 10, (9), 877-879 (2013).
  27. Wang, S. J., Wang, Z. -W. Track-a-worm, an open-source system for quantitative assessment of C. elegans locomotory and bending behavior. PLoS ONE. 8, (7), e69653 (2013).
  28. Faumont, S., et al. An image-free opto-mechanical system for creating virtual environments and imaging neuronal activity in freely moving Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. 6, (9), e24666 (2011).
  29. Tsibidis, G. D., Tavernarakis, N. Nemo: a computational tool for analyzing nematode locomotion. BMC Neuroscience. 8, 86 (2007).
  30. Stirman, J. N., et al. Real-time multimodal optical control of neurons and muscles in freely behaving Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 8, (2), 153-158 (2011).
  31. Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. T. Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 8, (2), 147-152 (2011).
  32. Restif, C., et al. CeleST: computer vision software for quantitative analysis of C. elegans swim behavior reveals novel features of locomotion. PLoS Computational Biology. 10, (7), e1003702 (2014).
  33. Ramot, D., Johnson, B. E., Berry, T. L., Carnell, L., Goodman, M. B. The Parallel Worm Tracker: a platform for measuring average speed and drug-induced paralysis in nematodes. PLoS ONE. 3, (5), e2208 (2008).
  34. Habchi, J., et al. Systematic development of small molecules to inhibit specific microscopic steps of Aβ42 aggregation in Alzheimer's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 114, (2), E200-E208 (2017).
  35. Aprile, F. A., et al. Selective targeting of primary and secondary nucleation pathways in Aβ42 aggregation using a rational antibody scanning method. Science Advances. 3, (6), e1700488 (2017).
  36. Perni, M., et al. Massively parallel C. elegans tracking provides multi-dimensional fingerprints for phenotypic discovery. Journal of neuroscience. 306, 57-67 (2018).
  37. Perni, M., et al. Delivery of Native Proteins into C. elegans Using a Transduction Protocol Based on Lipid Vesicles. Scientific Reports. 7, (1), 7380 (2017).
  38. McColl, G., et al. Utility of an improved model of amyloid-beta (Aβ₋) toxicity in Caenorhabditis elegans for drug screening for Alzheimer's disease. Molecular Neurodegeneration. 7, (1), 7380 (2012).
  39. Fatouros, C., et al. Inhibition of tau aggregation in a novel Caenorhabditis elegans model of tauopathy mitigates proteotoxicity. Human Molecular Genetics. 21, (16), 3587-3603 (2012).
  40. Fay, D. S., Fluet, A., Johnson, C. J., Link, C. D. In vivo aggregation of β-Amyloid peptide variants. Journal of Neurochemistry. 71, (4), 1616-1625 (1998).
  41. Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. 1-17 (2012).
  42. Hardaker, L. A., Singer, E., Kerr, R., Zhou, G. T., Schafer, W. R. Serotonin modulates locomotory behavior and coordinates egg-laying and movement in Caenorhabditis elegans. Journal of Neurobiology. 49, (4), 303-313 (2001).
  43. Tsechpenakis, G., Bianchi, L., Metaxas, D., Driscoll, M. A novel computational approach for simultaneous tracking and feature extraction of C. elegans populations in fluid environments. IEEE Transactions on Bio-medical Engineering. 55, (5), 1539-1549 (2008).
  44. Buckingham, S. D., Sattelle, D. B. Fast, automated measurement of nematode swimming (thrashing) without morphometry. BMC Neuroscience. 10, 84 (2009).
  45. Feng, Z., Cronin, C. J., Wittig, J. H., Sternberg, P. W., Schafer, W. R. An imaging system for standardized quantitative analysis of C. elegans behavior. BMC Bioinformatics. 5, 115 (2004).
  46. Stroustrup, N., et al. The caenorhabditis elegans lifespan machine. Nature Methods. 10, (7), 665-670 (2013).
Automatiserad beteendevetenskaplig analys av stor <em>C. elegans</em> populationer med ett brett fält-of-view spårning plattform
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Perni, M., Casford, S., Aprile, F. A., Nollen, E. A., Knowles, T. P. J., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform. J. Vis. Exp. (141), e58643, doi:10.3791/58643 (2018).More

Perni, M., Casford, S., Aprile, F. A., Nollen, E. A., Knowles, T. P. J., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform. J. Vis. Exp. (141), e58643, doi:10.3791/58643 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter