Summary

Protéomique de haut vers le bas à grande échelle à l’aide de l’électrophorèse de Zone capillaire Tandem Mass Spectrometry

Published: October 24, 2018
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Summary

Un protocole détaillé est décrit pour la séparation, l’identification et la caractérisation des proteoforms dans des échantillons de protéine à l’aide de la zone capillaire électrophorèse-electrospray ionisation-spectrométrie de masse (CZE-ESI-MS/MS). Le protocole peut être utilisé pour la caractérisation à haute résolution des proteoforms dans des échantillons de protéine simple et l’identification à grande échelle des proteoforms dans des échantillons de protéome complexe.

Abstract

Zone de capillarité électrophorèse-electrospray ionisation-spectrométrie de masse (CZE-ESI-MS/MS) a été reconnue comme un outil utile pour la protéomique de haut en bas qui a pour but de caractériser proteoforms dans protéomes complexes. Toutefois, l’application de CZE-MS/MS pour la protéomique de haut vers le bas à grande échelle ont été entravés par la faible capacité de chargement d’échantillon et étroite fenêtre de séparation de CZE. Ici, un protocole est décrit à l’aide de CZE-MS/MS avec un volume de chargement d’échantillon de microlitre-échelle et une fenêtre de 90 min de séparation pour la protéomique à grande échelle de haut en bas. La plate-forme CZE-MS/MS est basée sur un linéaire polyacrylamide (LPA)-enduite séparation capillaire avec électroosmotique extrêmement faible, une méthode de concentration dynamique échantillon en ligne basé sur la jonction-pH avec un rendement élevé pour le gerbage de protéine, une Electro-cinétiquement pompé gaine flux CE-MS interface avec la sensibilité extrêmement élevée et un spectromètre de masse de piège à ions à haute résolution de masse et la vitesse de numérisation. La plate-forme peut être utilisée pour la caractérisation à haute résolution des échantillons simple protéine intacte et la caractérisation à grande échelle des proteoforms dans différents protéomes complexes. À titre d’exemple, une séparation très efficace d’un mélange de protéines standard et une détection très sensible de beaucoup d’impuretés à l’aide de la plate-forme sont démontrées. Comme autre exemple, cette plate-forme peut produire plus de 500 proteoform et exécutent 190 identifications de protéine d’un proteome de Escherichia coli dans un seul CZE-MS/MS.

Introduction

Protéomique de haut en bas (TDP) vise la caractérisation à grande échelle des proteoforms au sein d’un proteome. TDP s’appuie sur la séparation de phase liquide efficace des protéines intactes avant l’analyse par spectrométrie de masse en tandem d’ionisation (ESI-MS/MS) électrospray en raison de la grande complexité et plage dynamique importante concentration du protéome1,2 ,3,4,5. L’électrophorèse capillaire de zone (CZE) est une technique puissante pour la séparation des biomolécules basé sur leurs rapports taille-à-charge6. CZE est relativement simple, nécessitant uniquement un ouvert tubulaire fusionnés avec silice capillaire, un électrolyte de fond (BGE) et un bloc d’alimentation. Un échantillon de protéines intactes peut être chargé dans le capillaire à l’aide de pression ou la tension, et séparation est enclenchée en immergeant les deux extrémités du capillaire dans le BGE et en appliquant une tension élevée. CZE peut approcher l’efficacité de séparation très haute (> 1 million de plateaux théoriques) pour la séparation des biomolécules7. CZE-MS a une sensibilité considérablement plus élevée que couramment chromatographie à phase inversée (RPLC)-MS pour l’analyse des protéines intactes,8. Bien que CZE-MS a un grand potentiel pour la protéomique à grande échelle de haut en bas, sa large application en protéomique a été entravée par plusieurs questions, notamment une faible capacité de chargement d’échantillon et une fenêtre étroite de séparation. L’exemple typique chargement volume dans CZE est environ 1 % du volume total capillaire, qui correspond habituellement à moins de 100 nL9,10,11. La fenêtre de la séparation de CZE est habituellement moins de 30 min, en raison de la forte électro-osmotique écoulement (EEO)9,10. Ces problèmes limitent la CZE-MS/MS pour l’identification d’un grand nombre de proteoforms et faible proteoforms abondante d’un complex proteome.

Beaucoup d’efforts réalisé pour améliorer l’exemple chargement volume de CZE via en ligne échantillon concentration méthodes (par exemple, solid-phase microextraction [SPME]12,13, champ-enhanced échantillon empilement [coupé]9 , 11 , 14et dynamique pH jonction15,16,17,18). FASCE et jonction de pH dynamiques sont plus simples que SPME, ne nécessitant qu’une différence significative entre le tampon et la BGE conductivité et pH. FASCE emploie un tampon échantillon beaucoup plus faible conductivité que la BGE, conduisant à un empilement des analytes à la limite entre la zone de l’échantillon et la zone BGE dans le capillaire. Jonction de pH dynamique utilise une prise d’échantillon de base (par exemple, bicarbonate d’ammonium 50 mM, pH 8) et un acide BGE (par exemple, l’acide acétique 5 % [v/v], pH 2.4) des deux côtés de la prise d’échantillon. À la demande d’une haute tension positive à la fin de l’injection du capillaire, titrage de la prise de l’échantillon de base se produit, mise au point de l’analyser dans un bouchon étanche avant de subir une séparation CZE. Récemment, le groupe Sun systématiquement contre FESS et jonction de pH dynamique pour l’empilage en ligne de protéines intactes, démontrant que la jonction pH dynamique pourrait produire de bien meilleures performances que la fasce pour la concentration en ligne de protéines intactes lorsque volume d’injection de l’échantillon était de 25 % du volume capillaire total19.

Séparation neutre enduits capillaires (p. ex., polyacrylamide linéaire [APL]) ont été employés pour réduire les expressions du folklore dans le capillaire, ralentissant la séparation CZE et élargissant la séparation fenêtre20,21. Récemment, le groupe Dovichi mis au point une procédure simple pour la préparation de l’enduit APL stable sur la paroi des capillaires, utilisant le persulfate d’ammonium (APS) comme l’initiateur et de la température (50 ° C) pour la production de radicaux libres et de polymérisation22 . Très récemment, le groupe Sun employée la séparation LPA-enduit capillaire et la méthode de jonction pH dynamique pour la séparation de CZE des protéines intactes, pour atteindre un échantillon de microlitre-échelle de chargement volume et une fenêtre de séparation de 90 min19. Ce système CZE ouvre la porte à l’utilisation de CZE-MS/MS pour la protéomique à grande échelle de haut en bas.

CZE-MS nécessite une interface hautement robuste et sensible au couple CZE à MS. Trois interfaces de CE-MS ont été bien développé et commercialisé dans l’histoire de CE-MS, et ils sont la gaine co-axial-flow interface23, l’interface sheathless en utilisant un embout poreux comme les ESI émetteur24et l’electro-cinétique gaine pompé flow interface25,26. L’electro-cinétiquement pompé gaine-flux-basé sur l’interface CZE/SM a atteint un faible zeptomole peptide détection limite9, plus 10 000 identifications de peptide (ID) de la HeLa cellulaire proteome en un seul lancer14, une caractérisation rapide des protéines intactes,11et des analyses très stables et reproductibles de biomolécules26. Récemment, le capillaire de séparation LPA-enduit, la méthode de jonction pH dynamique et l’interface de flux gaine electro-cinétiquement pompé ont été utilisés pour la protéomique de haut vers le bas à grande échelle d’un proteome Escherichia coli (e.coli)19 ,,27. La plate-forme CZE-MS/MS s’est approché de plus de 500 proteoform ID en une seule course19 et presque 6 000 proteoform IDs par couplage avec la chromatographie d’exclusion stérique (SEC)-RPLC fractionnement27. Les résultats montrent clairement la capacité de CZE-MS/MS pour la protéomique à grande échelle de haut en bas.

Décrit dans les présentes, une procédure détaillée d’utilisation CZE-MS/MS pour la protéomique à grande échelle de haut en bas. Le système CZE-MS/MS emploie le capillaire LPA-enduit pour réduire les expressions du folklore dans le capillaire, la méthode de jonction pH dynamique pour la concentration en ligne de protéines, l’interface de débit de gaine electro-cinétiquement pompé pour coupler CZE à MS, un Orbitrap valant masse spectromètre pour la collection des spectres MS et MS/MS des protéines et un logiciel de TopPIC (TOP-Down Mass Spectrometry-Based Proteoform Identification et caractérisation) pour la recherche de la proteoform ID via base de données.

Protocol

1. préparation du revêtement de l’APL sur la paroi interne du capillaire de séparation Prétraitement du capillaire Rincer successivement avec 500 µL de 1 M d’hydroxyde de sodium, eau déminéralisée, d’acide chlorhydrique 1 M, eau désionisée et SM-méthanol de qualité à l’aide d’une pompe à seringue dans un capillaire en silice fondue (120 cm de longueur, 50 µm de diamètre intérieur diamètre [interne] 360 µm de diamètre extérieur [OD]). Sécher …

Representative Results

La figure 1 montre un schéma de base de pH-jonction CZE-ESI-MS système dynamique utilisé dans l’expérience. Une longue prise de l’échantillon dans un tampon de base est injectée dans une séparation LPA-enduit capillaire remplie avec un acide BGE. Après avoir appliqué les hautes tensions I et II, l’analyser dans la zone de l’échantillon sera concentré via la méthode de jonction pH dynamique. Pour évaluer la performance du système…

Discussion

Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour utiliser CZE-MS/MS pour la caractérisation à haute résolution des proteoforms dans des échantillons de protéines simples et pour l’identification à grande échelle des proteoforms dans des échantillons de protéome complexe. Un diagramme du système CZE-ESI-MS/MS est illustré à la Figure 1. Il y a quatre étapes cruciales dans le protocole. Tout d’abord, la préparation d’une enduction LPA sur la paroi interne de la séparatio…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs remercient groupe de Heedeok Hong à Michigan State University, département de chimie, de bien vouloir fournir les cellules d’Escherichia coli pour les expériences. Les auteurs remercient le soutien de la National Institute of General Medical Sciences, le National Institutes of Health (NIH) par Grant R01GM118470 (pour X. Liu) et Grant R01GM125991 (de L. soleil et X. Liu).

Materials

Fused silica capillary Polymicro Technologies 1068150017 50 µm i.d. 360 µm o.d.
Sodium hydroxide pellets Macron Fine Chemicals 7708-10 Corrosive
LC-MS grade water Fisher Scientific W6-1
Hydrochloric acid Fisher Scientific SA48-1 Corrosive
Methanol Fisher Scientific A456-4 Toxic, Health Hazard
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate Sigma-Aldrich M6514 Moisture and heat sensitive
Hydrofluoric acid Acros Organics 423805000 Highy toxic
Acrylamide Acros Organics 164855000 Toxic, health hazard
Ammonium persulfate Sigma-Aldrich A3678 Health hazard, Oxidizer
lysozyme Sigma-Aldrich L6876
Cytochrome C Sigma-Aldrich C7752
Myoglobin Sigma-Aldrich M1882
ß-casein Sgma-Aldrich C6905
Carbonic anhydrase Sigma-Aldrich C3934
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A2153
Urea Alfa Aesar 36428-36
DL-Dithiothreitol Sigma-Aldrich D0632 Health Hazard
Iodoacetamide Fisher Scientific AC122270250 Health Hazard
Formic Acid Fisher Scientific A117-50 Corrosive, Health Hazard
C4 trap column Sepax Technologies 110043-4001C 3 µm particles, 300 Å pores, 4.0 mm i.d. 10 mm long
Acetonitrile Fisher Scientific A998SK-4 Toxic, Oxidizer
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich 1066-33-7
Nalgene rapid-flow filters Thermo Scientific 126-0020 0.2 µm CN membrane, and 50 mm diameter
E. coli cells K-12 MG1655
Dulbecco's phosphate-buffered saline Sigma-Aldrich D8537
BCA assay Thermo Scientific 23250
Acetone Fisher Scientific A11-1
HPLC system for protein desalting Agilient 1260 Infinity II
Acetic Acid Fisher Scientific A38-212
CE autosampler CMP Scientific ECE-001
Electro-kinetically pumped sheath flow interface CMP Scientific
Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer Thermo Fisher Scientific
Sutter flaming/brown micropipette puller Sutter Instruments P-1000
Ultrasonic cell disruptor for cell lysis Branson 101063196 Model S-250A
Vaccum concentrator Thermo Fisher Scientific SPD131DDA-115

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McCool, E. N., Lubeckyj, R., Shen, X., Kou, Q., Liu, X., Sun, L. Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (140), e58644, doi:10.3791/58644 (2018).

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