Protéomique de haut vers le bas à grande échelle à l’aide de l’électrophorèse de Zone capillaire Tandem Mass Spectrometry
Summary
Un protocole détaillé est décrit pour la séparation, l’identification et la caractérisation des proteoforms dans des échantillons de protéine à l’aide de la zone capillaire électrophorèse-electrospray ionisation-spectrométrie de masse (CZE-ESI-MS/MS). Le protocole peut être utilisé pour la caractérisation à haute résolution des proteoforms dans des échantillons de protéine simple et l’identification à grande échelle des proteoforms dans des échantillons de protéome complexe.
Abstract
Zone de capillarité électrophorèse-electrospray ionisation-spectrométrie de masse (CZE-ESI-MS/MS) a été reconnue comme un outil utile pour la protéomique de haut en bas qui a pour but de caractériser proteoforms dans protéomes complexes. Toutefois, l’application de CZE-MS/MS pour la protéomique de haut vers le bas à grande échelle ont été entravés par la faible capacité de chargement d’échantillon et étroite fenêtre de séparation de CZE. Ici, un protocole est décrit à l’aide de CZE-MS/MS avec un volume de chargement d’échantillon de microlitre-échelle et une fenêtre de 90 min de séparation pour la protéomique à grande échelle de haut en bas. La plate-forme CZE-MS/MS est basée sur un linéaire polyacrylamide (LPA)-enduite séparation capillaire avec électroosmotique extrêmement faible, une méthode de concentration dynamique échantillon en ligne basé sur la jonction-pH avec un rendement élevé pour le gerbage de protéine, une Electro-cinétiquement pompé gaine flux CE-MS interface avec la sensibilité extrêmement élevée et un spectromètre de masse de piège à ions à haute résolution de masse et la vitesse de numérisation. La plate-forme peut être utilisée pour la caractérisation à haute résolution des échantillons simple protéine intacte et la caractérisation à grande échelle des proteoforms dans différents protéomes complexes. À titre d’exemple, une séparation très efficace d’un mélange de protéines standard et une détection très sensible de beaucoup d’impuretés à l’aide de la plate-forme sont démontrées. Comme autre exemple, cette plate-forme peut produire plus de 500 proteoform et exécutent 190 identifications de protéine d’un proteome de Escherichia coli dans un seul CZE-MS/MS.
Introduction
Protéomique de haut en bas (TDP) vise la caractérisation à grande échelle des proteoforms au sein d’un proteome. TDP s’appuie sur la séparation de phase liquide efficace des protéines intactes avant l’analyse par spectrométrie de masse en tandem d’ionisation (ESI-MS/MS) électrospray en raison de la grande complexité et plage dynamique importante concentration du protéome1,2 ,3,4,5. L’électrophorèse capillaire de zone (CZE) est une technique puissante pour la séparation des biomolécules basé sur leurs rapports taille-à-charge6. CZE est relativement simple, nécessitant uniquement un ouvert tubulaire fusionnés avec silice capillaire, un électrolyte de fond (BGE) et un bloc d’alimentation. Un échantillon de protéines intactes peut être chargé dans le capillaire à l’aide de pression ou la tension, et séparation est enclenchée en immergeant les deux extrémités du capillaire dans le BGE et en appliquant une tension élevée. CZE peut approcher l’efficacité de séparation très haute (> 1 million de plateaux théoriques) pour la séparation des biomolécules7. CZE-MS a une sensibilité considérablement plus élevée que couramment chromatographie à phase inversée (RPLC)-MS pour l’analyse des protéines intactes,8. Bien que CZE-MS a un grand potentiel pour la protéomique à grande échelle de haut en bas, sa large application en protéomique a été entravée par plusieurs questions, notamment une faible capacité de chargement d’échantillon et une fenêtre étroite de séparation. L’exemple typique chargement volume dans CZE est environ 1 % du volume total capillaire, qui correspond habituellement à moins de 100 nL9,10,11. La fenêtre de la séparation de CZE est habituellement moins de 30 min, en raison de la forte électro-osmotique écoulement (EEO)9,10. Ces problèmes limitent la CZE-MS/MS pour l’identification d’un grand nombre de proteoforms et faible proteoforms abondante d’un complex proteome.
Beaucoup d’efforts réalisé pour améliorer l’exemple chargement volume de CZE via en ligne échantillon concentration méthodes (par exemple, solid-phase microextraction [SPME]12,13, champ-enhanced échantillon empilement [coupé]9 , 11 , 14et dynamique pH jonction15,16,17,18). FASCE et jonction de pH dynamiques sont plus simples que SPME, ne nécessitant qu’une différence significative entre le tampon et la BGE conductivité et pH. FASCE emploie un tampon échantillon beaucoup plus faible conductivité que la BGE, conduisant à un empilement des analytes à la limite entre la zone de l’échantillon et la zone BGE dans le capillaire. Jonction de pH dynamique utilise une prise d’échantillon de base (par exemple, bicarbonate d’ammonium 50 mM, pH 8) et un acide BGE (par exemple, l’acide acétique 5 % [v/v], pH 2.4) des deux côtés de la prise d’échantillon. À la demande d’une haute tension positive à la fin de l’injection du capillaire, titrage de la prise de l’échantillon de base se produit, mise au point de l’analyser dans un bouchon étanche avant de subir une séparation CZE. Récemment, le groupe Sun systématiquement contre FESS et jonction de pH dynamique pour l’empilage en ligne de protéines intactes, démontrant que la jonction pH dynamique pourrait produire de bien meilleures performances que la fasce pour la concentration en ligne de protéines intactes lorsque volume d’injection de l’échantillon était de 25 % du volume capillaire total19.
Séparation neutre enduits capillaires (p. ex., polyacrylamide linéaire [APL]) ont été employés pour réduire les expressions du folklore dans le capillaire, ralentissant la séparation CZE et élargissant la séparation fenêtre20,21. Récemment, le groupe Dovichi mis au point une procédure simple pour la préparation de l’enduit APL stable sur la paroi des capillaires, utilisant le persulfate d’ammonium (APS) comme l’initiateur et de la température (50 ° C) pour la production de radicaux libres et de polymérisation22 . Très récemment, le groupe Sun employée la séparation LPA-enduit capillaire et la méthode de jonction pH dynamique pour la séparation de CZE des protéines intactes, pour atteindre un échantillon de microlitre-échelle de chargement volume et une fenêtre de séparation de 90 min19. Ce système CZE ouvre la porte à l’utilisation de CZE-MS/MS pour la protéomique à grande échelle de haut en bas.
CZE-MS nécessite une interface hautement robuste et sensible au couple CZE à MS. Trois interfaces de CE-MS ont été bien développé et commercialisé dans l’histoire de CE-MS, et ils sont la gaine co-axial-flow interface23, l’interface sheathless en utilisant un embout poreux comme les ESI émetteur24et l’electro-cinétique gaine pompé flow interface25,26. L’electro-cinétiquement pompé gaine-flux-basé sur l’interface CZE/SM a atteint un faible zeptomole peptide détection limite9, plus 10 000 identifications de peptide (ID) de la HeLa cellulaire proteome en un seul lancer14, une caractérisation rapide des protéines intactes,11et des analyses très stables et reproductibles de biomolécules26. Récemment, le capillaire de séparation LPA-enduit, la méthode de jonction pH dynamique et l’interface de flux gaine electro-cinétiquement pompé ont été utilisés pour la protéomique de haut vers le bas à grande échelle d’un proteome Escherichia coli (e.coli)19 ,,27. La plate-forme CZE-MS/MS s’est approché de plus de 500 proteoform ID en une seule course19 et presque 6 000 proteoform IDs par couplage avec la chromatographie d’exclusion stérique (SEC)-RPLC fractionnement27. Les résultats montrent clairement la capacité de CZE-MS/MS pour la protéomique à grande échelle de haut en bas.
Décrit dans les présentes, une procédure détaillée d’utilisation CZE-MS/MS pour la protéomique à grande échelle de haut en bas. Le système CZE-MS/MS emploie le capillaire LPA-enduit pour réduire les expressions du folklore dans le capillaire, la méthode de jonction pH dynamique pour la concentration en ligne de protéines, l’interface de débit de gaine electro-cinétiquement pompé pour coupler CZE à MS, un Orbitrap valant masse spectromètre pour la collection des spectres MS et MS/MS des protéines et un logiciel de TopPIC (TOP-Down Mass Spectrometry-Based Proteoform Identification et caractérisation) pour la recherche de la proteoform ID via base de données.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour utiliser CZE-MS/MS pour la caractérisation à haute résolution des proteoforms dans des échantillons de protéines simples et pour l’identification à grande échelle des proteoforms dans des échantillons de protéome complexe. Un diagramme du système CZE-ESI-MS/MS est illustré à la Figure 1. Il y a quatre étapes cruciales dans le protocole. Tout d’abord, la préparation d’une enduction LPA sur la paroi interne de la séparatio…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient groupe de Heedeok Hong à Michigan State University, département de chimie, de bien vouloir fournir les cellules d’Escherichia coli pour les expériences. Les auteurs remercient le soutien de la National Institute of General Medical Sciences, le National Institutes of Health (NIH) par Grant R01GM118470 (pour X. Liu) et Grant R01GM125991 (de L. soleil et X. Liu).
Materials
| Fused silica capillary | Polymicro Technologies | 1068150017 | 50 µm i.d. 360 µm o.d. |
| Sodium hydroxide pellets | Macron Fine Chemicals | 7708-10 | Corrosive |
| LC-MS grade water | Fisher Scientific | W6-1 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | SA48-1 | Corrosive |
| Methanol | Fisher Scientific | A456-4 | Toxic, Health Hazard |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma-Aldrich | M6514 | Moisture and heat sensitive |
| Hydrofluoric acid | Acros Organics | 423805000 | Highy toxic |
| Acrylamide | Acros Organics | 164855000 | Toxic, health hazard |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | Health hazard, Oxidizer |
| lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| Cytochrome C | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| Myoglobin | Sigma-Aldrich | M1882 | |
| ß-casein | Sgma-Aldrich | C6905 | |
| Carbonic anhydrase | Sigma-Aldrich | C3934 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Urea | Alfa Aesar | 36428-36 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | Health Hazard |
| Iodoacetamide | Fisher Scientific | AC122270250 | Health Hazard |
| Formic Acid | Fisher Scientific | A117-50 | Corrosive, Health Hazard |
| C4 trap column | Sepax Technologies | 110043-4001C | 3 µm particles, 300 Å pores, 4.0 mm i.d. 10 mm long |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A998SK-4 | Toxic, Oxidizer |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 1066-33-7 | |
| Nalgene rapid-flow filters | Thermo Scientific | 126-0020 | 0.2 µm CN membrane, and 50 mm diameter |
| E. coli cells | K-12 MG1655 | ||
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| BCA assay | Thermo Scientific | 23250 | |
| Acetone | Fisher Scientific | A11-1 | |
| HPLC system for protein desalting | Agilient | 1260 Infinity II | |
| Acetic Acid | Fisher Scientific | A38-212 | |
| CE autosampler | CMP Scientific | ECE-001 | |
| Electro-kinetically pumped sheath flow interface | CMP Scientific | ||
| Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| Sutter flaming/brown micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Ultrasonic cell disruptor for cell lysis | Branson | 101063196 | Model S-250A |
| Vaccum concentrator | Thermo Fisher Scientific | SPD131DDA-115 |
References
- Aebersold, R., et al. How many proteoforms are there. Nature Chemical Biology. 14 (3), 206-214 (2018).
- Tran, J. C., et al. Mapping intact protein isoforms in discovery mode using top-down proteomics. Nature. 480 (7376), 254-258 (2011).
- Catherman, A. D., et al. Large-scale Top-down Proteomics of the Human Proteome: Membrane Proteins, Mitochondria, and Senescence. Molecular and Cellular Proteomics. 12 (12), 3465-3473 (2013).
- Cai, W., et al. Top-Down Proteomics of Large Proteins up to 223 kDa Enabled by Serial Size Exclusion Chromatography Strategy. Analytical Chemistry. 89 (10), 5467-5475 (2017).
- Toby, T. K., Fornelli, L., Kelleher, N. L. Progress in Top-Down Proteomics and the Analysis of Proteoforms. Annual Review of Analytical Chemistry. 9 (1), 499-519 (2016).
- Jorgenson, J. W., Lukacs, K. D. Capillary Zone Electrophoresis. Science. 222 (4621), 266-272 (1983).
- Keithley, R. B. Capillary electrophoresis with three-color fluorescence detection for the analysis of glycosphingolipid metabolism. Analyst. 138 (1), 164-170 (2013).
- Han, X., et al. In-Line Separation by Capillary Electrophoresis Prior to Analysis by Top-Down Mass Spectrometry Enables Sensitive Characterization of Protein Complexes. Journal of Proteome Research. 13 (12), 6078-6086 (2014).
- Sun, L., Zhu, G., Zhao, Y., Yan, X., Mou, S., Dovichi, N. J. Ultrasensitive and Fast Bottom-up Analysis of Femtogram Amounts of Complex Proteome Digests. Angewandte Chemie International Edition. 52 (51), 13661-13664 (2013).
- Choi, S. B., Lombard-Banek, C., Muñoz-LLancao, P., Manzini, M. C., Nemes, P. Enhanced Peptide Detection Toward Single-Neuron Proteomics by Reversed-Phase Fractionation Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (5), 913-922 (2018).
- Sun, L., Knierman, M. D., Zhu, G., Dovichi, N. J. Fast Top-Down Intact Protein Characterization with Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 85 (12), 5989-5995 (2013).
- Wang, Y., Fonslow, B. R., Wong, C. C., Nakorchevsky, A., Yates, J. R. Improving the comprehensiveness and sensitivity of sheathless capillary electrophoresis-tandem mass spectrometry for proteomic analysis. Analytical Chemistry. 84 (20), 8505-8513 (2012).
- Zhang, Z., Yan, X., Sun, L., Zhu, G., Dovichi, N. J. Detachable strong cation exchange monolith, integrated with capillary zone electrophoresis and coupled with pH gradient elution, produces improved sensitivity and numbers of peptide identifications during bottom-up analysis of complex proteomes. Analytical Chemistry. 87 (8), 4572-4577 (2015).
- Sun, L., et al. Over 10,000 peptide identifications from the HeLa proteome by using single-shot capillary zone electrophoresis combined with tandem mass spectrometry. Angewandte Chemie International Edition in English. 53 (50), 13931-13933 (2014).
- Aebersold, R., Morrison, H. D. Analysis of dilute peptide samples by capillary zone electrophoresis. Journal of Chromatography. 516 (1), 79-88 (1990).
- Britz-McKibbin, P., Chen, D. D. Y. Selective Focusing of Catecholamines and Weakly Acidic Compounds by Capillary Electrophoresis Using a Dynamic pH Junction. Analytical Chemistry. 72 (6), 1242-1252 (2000).
- Zhao, Y., Sun, L., Zhu, G., Dovichi, N. J. Coupling Capillary Zone Electrophoresis to a Q Exactive HF Mass Spectrometer for Top-down Proteomics: 580 Proteoform Identifications from Yeast. Journal of Proteome Research. 15 (10), 3679-3685 (2016).
- Zhu, G., Sun, L., Yan, X., Dovichi, N. J. Bottom-Up Proteomics of Escherichia coli. Using Dynamic pH Junction Preconcentration and Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization-Tandem Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (13), 6331-6336 (2014).
- Lubeckyj, R. A., McCool, E. N., Shen, X., Kou, Q., Liu, X., Sun, L. Single-Shot Top-Down Proteomics with Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization-Tandem Mass Spectrometry for Identification of Nearly 600 Escherichia coli Proteoforms. Analytical Chemistry. 89 (22), 12059-12067 (2017).
- Busnel, J. M. High capacity capillary electrophoresis-electrospray ionization mass spectrometry: coupling a porous sheathless interface with transient-isotachophoresis. Analytical Chemistry. 82 (22), 9476-9483 (2010).
- Zhang, Z., Peuchen, E. H., Dovichi, N. J. Surface-Confined Aqueous Reversible Addition-Fragmentation Chain Transfer (SCARAFT) Polymerization Method for Preparation of Coated Capillary Leads to over 10 000 Peptides Identified from 25 ng HeLa Digest by Using Capillary Zone Electrophoresis-Tandem Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 89 (12), 6774-6780 (2017).
- Zhu, G., Sun, L., Dovichi, N. J. Thermally-initiated free radical polymerization for reproducible production of stable linear polyacrylamide coated capillaries, and their application to proteomic analysis using capillary zone electrophoresis-mass spectrometry. Talanta. 146, 839-843 (2016).
- Smith, R. D., Barinaga, C. J., Udseth, H. R. Improved Electrospray Ionization Interface for Capillary Zone Electrophoresis-Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 60 (16), 1948-1952 (1988).
- Moini, M. Simplifying CE-MS Operation. 2. Interfacing Low-Flow Separation Techniques to Mass Spectrometry Using a Porous Tip. Analytical Chemistry. 79 (11), 4241-4246 (2007).
- Wojcik, R., Dada, O. O., Sadilek, M., Dovichi, N. J. Simplified capillary electrophoresis nanospray sheath-flow interface for high efficiency and sensitive peptide analysis. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 24 (17), 2554-2560 (2010).
- Sun, L., Zhu, G., Zhang, Z., Mou, S., Dovichi, N. J. Third-Generation Electrokinetically Pumped Sheath-Flow Nanospray Interface with Improved Stability and Sensitivity for Automated Capillary Zone Electrophoresis-Mass Spectrometry Analysis of Complex Proteome Digests. Journal of Proteome Research. 14 (5), 2312-2321 (2015).
- McCool, E. N., et al. Deep Top-Down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis-Tandem Mass Spectrometry: Identification of 5700 Proteoforms from the Eschericia coli Proteome. Analytical Chemistry. 90 (9), 5529-5533 (2018).
- Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development. Bioinformatics. 24 (21), 2534-2536 (2008).
- Kou, Q., Xun, L., Liu, X. TopPIC : a software tool for top-down mass spectrometry-based proteoform identification and characterization. Bioinformatics. 32 (22), 3495-3497 (2016).
- Elias, J. E., Gygi, S. P. Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry. Nature Methods. 4 (3), 207-214 (2007).
- Ansong, C., et al. Top-down proteomics reveals a unique protein S-thiolation switch in Salmonella Typhimurium in response to infection-like conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10153-10158 (2013).
- Shen, Y., et al. High-resolution ultrahigh-pressure long column reversed-phase liquid chromatography for top-down proteomics. Journal of Chromatography A. 1498, 99-110 (2017).
- Olsen, J. V., Macek, B., Lange, O., Makarov, A., Horning, S., Mann, M. Higher-energy C-trap dissociation for peptide modification analysis. Nature Methods. 4 (9), 709-712 (2007).
- Syka, J. E., Coon, J. J., Schroeder, M. J., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. Peptide and protein sequence analysis by electron transfer dissociation mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (26), 9528-9533 (2004).
- Shaw, J. B., et al. Complete Protein Characterization Using Top-Down Mass Spectrometry and Ultraviolet Photodissociation. Journal of the American Chemical Society. 135 (34), 12646-12651 (2013).
