Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Grootschalige topdown Proteomics met behulp van capillaire Zone elektroforese Tandem massaspectrometrie

Published: October 24, 2018 doi: 10.3791/58644
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 2,3, 1
1Department of Chemistry, Michigan State University, 2Department of BioHealth Informatics, Indiana University-Purdue University Indianapolis, 3Center for Computational Biology and Bioinformatics, Indiana University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Een gedetailleerd protocol wordt beschreven voor de scheiding, identificatie en karakterisering van proteoforms in EiwitSteekproeven met behulp van capillaire zone elektroforese-electrospray ionisatie-tandem massaspectrometrie (CZE-ESI-MS/MS). Het protocol kan worden gebruikt voor de hoge-resolutie karakterisatie van proteoforms in simple EiwitSteekproeven en de grootschalige identificatie van proteoforms in complexe Proteoom monsters.

Abstract

Capillaire zone elektroforese-electrospray ionisatie-tandem massaspectrometrie (CZE-ESI-MS/MS) is erkend als een nuttig hulpmiddel voor proteomics van de top-down dat gericht is op het karakteriseren van proteoforms in complexe proteomes. Echter, de toepassing van CZE-MS/MS voor grootschalige topdown proteomics heeft gehinderd door de lage monster-laadvermogen en smalle scheiding venster voor CZE. Een protocol wordt hier beschreven met behulp van CZE-MS/MS met een microliter-schaal monster-laadvolume en een scheiding van de 90-min venster voor grootschalige topdown proteomics. De CZE-MS/MS platform is gebaseerd op een lineaire polyacrylamide (LPA)-gecoate scheiding capillaire met extreem lage electroosmotic flow, een dynamische pH junction-gebaseerde online monster concentratie methode met een hoge efficiëntie voor eiwit stapelen, een Electro-kinetisch gepompt schede stroom CE-MS interface met extreem hoge gevoeligheid en een ion trap massaspectrometer met hoge resolutie massa en scansnelheid. Het platform kan worden gebruikt voor de hoge-resolutie karakterisering van eenvoudige intact EiwitSteekproeven en de grootschalige karakterisatie van proteoforms in diverse complexe proteomes. Als voorbeeld, wordt een zeer efficiënte scheiding van een mengsel van standaard eiwit en een zeer gevoelige detectie van veel onzuiverheden met behulp van het platform gedemonstreerd. Als een ander voorbeeld, dit platform kan produceren meer dan 500 proteoform en 190 eiwit identificaties van een Escherichia coli -Proteoom bij een enkele CZE-MS/MS uitvoeren.

Introduction

Topdown proteomics (TDP) streeft naar de grootschalige karakterisatie van proteoforms binnen een Proteoom. TDP hangt af van de effectieve scheiding van vloeistof-fase van intacte eiwitten vóór electrospray ionisatie-tandem massaspectrometrie (ESI-MS/MS) analyse als gevolg van de hoge complexiteit en dynamisch bereik van de hoge concentratie van de Proteoom1,2 ,3,4,5. Capillaire zone elektroforese (CZE) is een krachtige techniek voor de scheiding van biomoleculen, op basis van hun grootte-naar-charge ratio's6. CZE is relatief eenvoudig, waarbij alleen een open tubular-gesmolten siliciumdioxide capillaire, een achtergrond elektrolyt (BGE), en een voeding. Een steekproef van intacte eiwitten in het capillair met behulp van druk of spanning kan worden geladen en scheiding wordt geïnitieerd door de beide uiteinden van het capillair in de BGE onder te dompelen en het toepassen van een hoogspanning. CZE ultra-hoge scheidingsrendement kunt benaderen (> 1 miljoen theoretische schotels) voor de scheiding van biomoleculen7. CZE-MS heeft een drastisch hogere gevoeligheid dan gebruikte reversed-phase vloeistofchromatografie (RPLC)-MS voor de analyse van intacte eiwitten8. Hoewel CZE-MS een groot potentieel voor grootschalige topdown proteomics heeft, heeft de brede toepassing ervan in proteomics is belemmerd door verschillende problemen, waaronder een lage monster-laadvermogen en de smalle scheiding venster. Het typische monster laden volume in CZE is ongeveer 1% van het totale capillaire volume, dat normaalgesproken overeenkomt met minder dan 100 nL9,10,11. Het venster van de scheiding van CZE is meestal minder dan 30 min als gevolg van de sterke electroosmotic stroom (EOF)9,10. Deze kwesties beperken de CZE-MS/MS voor de identificatie van een groot aantal proteoforms en lage overvloedige proteoforms van een complexe Proteoom.

Veel moeite heeft gedaan om te verbeteren het monster volume van CZE via online monster concentratie-methoden (bijvoorbeeld, solid-phase microextraction [SPME]12,13, veld versterkte monster stapelen [FESS]9 laden , 11 , 14, en dynamische pH junction15,16,17,18). FESS en dynamische pH junction zijn eenvoudiger dan SPME, alleen vereisen een significant verschil tussen de monster-buffer en de BGE in geleidbaarheid en de pH. FESS maakt gebruik van een monster buffer met een veel lagere geleidendheid dan de BGE, wat leidt tot een stapeling van analyten op de grens tussen het monster en de BGE zone in het capillair. Dynamische pH junction maakt gebruik van een fundamentele monster plug (b.v., 50 mM Ammoniumbicarbonaat, pH 8) en een zuur BGE (bijvoorbeeld5% [v/v]-azijnzuur, pH 2.4) aan beide zijden van de stekker van de steekproef. Op verzoek van een hoge positieve spanning aan het einde van de injectie van het capillair titratie van de stekker van de fundamentele monster treedt op, richten de analyten in een strakke plug voor het ondergaan van een scheiding van CZE. Onlangs, de zon groep systematisch t.o.v. FESS en dynamische pH junction voor de online stapeling van intacte eiwitten, aan te tonen dat dynamische pH junction kon produceren veel betere prestaties dan FESS voor de online concentratie van proteïnen toe intact wanneer Het monstervolume injectie was 25% van de totale capillaire volume19.

Neutraal gecoate scheiding haarvaten (bijvoorbeeldlineaire polyacrylamide [LPA]) zijn tewerkgesteld om het EOF in het capillair, vertragen de CZE scheiding en verbreding van de scheiding venster20,21. Onlangs, de Dovichi-groep ontwikkeld een eenvoudige procedure voor de bereiding van stabiele LPA coating op de binnenwand van de haarvaten, gebruik makend van ammoniumnitraat persulfate (APS) als de initiatiefnemer en de temperatuur (50 ° C) voor de productie van vrije radicalen en polymerisatie22 . Zeer onlangs heeft werkzaam de Sun group de capillaire LPA beklede scheiding en de dynamische pH junction methode voor de CZE scheiding van intacte eiwitten, bereiken een microliter-schaal monster laden volume en een scheiding van de 90-min venster19. Dit systeem van CZE opent de deur voor het gebruik van CZE-MS/MS voor grootschalige topdown proteomics.

CZE-MS vereist een zeer robuuste en gevoelige interface aan paar CZE aan MS. Drie CE-MS interfaces zijn goed ontwikkeld en gecommercialiseerd in de geschiedenis van CE-MS, en ze zijn de co-axiale schede-flow interface23, de sheathless-interface met behulp van een poreuze tip als de ESI emitter24, en de electro-kinetisch gepompt schede flow interface25,26. De electro-kinetisch gepompt schede-stroom-interface-gebaseerde CZE-MS/MS heeft een lage zeptomole peptide detectie limiet9bereikt, meer dan 10.000 peptide identificaties (IDs) van de HeLa cellen Proteoom in één lopen14, een snelle karakterisering van intacte eiwitten11, en zeer stabiel en reproduceerbare analyses van biomoleculen26. Onlangs, het capillair LPA beklede scheiding, de dynamische pH junction methode en de electro-kinetisch gepompt schede stroom interface werden gebruikt voor grootschalige topdown proteomics van een proteoom van Escherichia coli (E. coli)19 ,27. De CZE-MS/MS platform benaderd meer dan 500 proteoform-id's in één19 en bijna 6.000 proteoform IDs via koppeling met grootte-uitsluiting chromatography (SEC)-RPLC fractionering27. De resultaten tonen duidelijk de mogelijkheden van CZE-MS/MS voor grootschalige topdown proteomics.

Hierin wordt een gedetailleerde procedure van het gebruik van CZE-MS/MS voor grootschalige topdown proteomics beschreven. De CZE-MS/MS-systeem maakt gebruik van het LPA beklede capillair om het EOF in het capillair, de dynamische pH junction methode voor de online concentratie van eiwitten, de electro-kinetisch gepompt schede stroom interface voor het koppelen van CZE aan MS, een orbitrap massa spectrometer voor het verzamelen van MS en MS/MS-spectra van eiwitten, en een tof (TOP-Down Mass Spectrometry-Based Proteoform identificatie en karakterisering) software voor proteoform ID via database zoeken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. bereiding van LPA Coating op de binnenwand van het capillair scheiding

  1. Voorbehandeling van het capillair
    1. Spoel een gesmolten siliciumdioxide capillair (120 cm in lengte, 50 µm in binnendiameter [id], 360 µm in buitendiameter [od]) achtereenvolgens met 500 µL van 1 M natronloog, gedeïoniseerd water, 1 M zoutzuur, gedeïoniseerd water en LC-MS rang methanol met behulp van een spuitpomp.
    2. Droog het capillair met stikstofgas (10 psi, ≥ 12 h) en vul het capillair met 50% (v/v) 3-(trimethoxysilyl) propyl methacrylaat in methanol met behulp van een spuitpomp. Beide uiteinden van het capillair met silica rubber afdichting en na het bebroeden bij kamertemperatuur gedurende ten minste 24 uur.
      Opmerking: Tijdens deze stap, de binnenwand van het capillair is matiemaatschappij met C = C. Longer incubatie resulteert in betere capillaire coating als gevolg van een meer volledige reactie.
    3. Snij een klein gedeelte (~ 5 mm) van het capillair aan beide uiteinden met een verbrijzelen steen. Spoel het capillair met methanol (500 µL) met behulp van een spuitpomp om schoon te maken de spoorverontreiniging reagentia. Droog het capillair met stikstofgas (10 psi, ≥12 h).
  2. Voorbereiding van de coating van het LPA
    Opmerking: Deze procedure is gebaseerd op Zhu et al. 22 met kleine wijzigingen.
    1. Het bereiden van een oplossing van acrylamide (40 mg van acrylamide in 1 mL water) en ammonium persulfate (APS) oplossing (5% [w/v] in water).
    2. 2-3 µL van de APS-oplossing toevoegen aan 500 µL van de oplossing van acrylamide, vortex het mengsel en ontgas het met stikstofgas voor 5 min voor het verwijderen van de zuurstof in de oplossing.
    3. Laden van het mengsel in het pretreated capillair met behulp van een vacuüm zegel van beide uiteinden van het capillair met silica rubber en Incubeer het in een waterbad bij 50 ° C voor 40 min.
    4. Een klein gedeelte (~ 5 mm) van het capillair uit beide uiteinden met een verbrijzelen steen verwijderen. Duw de spoorverontreiniging oplossing uit het capillair met water (200 µL), met behulp van de-spuitpomp.
      Opmerking: Zorg ervoor het polymeer verdrongen van het capillair is een agarose gel-achtige consistentie. Een langere incubatietijd stap (tot ~ 45-50 min) kan resulteren in een betere capillaire coating. Met langere reactie periodes, kan de capillaire worden geblokkeerd en hogedruk is verplicht tot het uitduwen van het polymeer met water. Een HPLC-pomp kan worden gebruikt voor dit doel.

2. de etsen van het capillair met vloeizuur

Let op: Gebruik juiste veiligheidsprocedures tijdens het verwerken van waterstoffluoride (HF) oplossingen. Alle HF-gerelateerde bewerkingen moeten worden gedaan in een chemische kap. Voor HF-gerelateerde handelingen, door ervoor te zorgen dat 2,5% calcium gluconaat gel beschikbaar voor gebruik in het geval van blootstelling is. Dubbele handschoenen zijn vereist, een typische nitril handschoen binnen en een zware neopreen handschoen buiten. Een laboratoriumjas en chemische veiligheidsbril dragen. Na de HF-behandelingen, vloeibare en vaste afvalstoffen gescheiden houden. Het vloeibare afvalstoffen van de HF moet onmiddellijk worden geneutraliseerd met een hoge concentratie natriumhydroxide-oplossing voor tijdelijke opslag voor afval ophalen. De HF-afval moet worden tijdelijk opgeslagen in een plastic container dat is bekleed met twee dikke plastic één-gallon Ziploc zakken en een deksel. Zowel de vaste en vloeibare afvalstoffen moet correct worden weergegeven.

  1. Een deel van het capillair met een zachte vlam branden (bijvoorbeeldzakaansteker) te verwijderen van de polyimide buitenste-coating (1 cm in lengte) ongeveer 4 cm afstand van één uiteinde van het capillair. Voorzichtig schoon het verbrande deel van het capillair door af te vegen als u wilt de polyimide coating volledig te verwijderen.
    Opmerking: Behoedzaam, als het deel van het capillair zonder de polyimide coating een beetje fragiel worden zal.
  2. Boor een klein gaatje aan het einde van een 200-µL buis rond dezelfde grootte als de capillaire buitendiameter aan het capillair voldoende op zijn plaats houden zodra het is schroefdraad door dit gat. Rijg het einde van het capillair die ligt het verbrande gedeelte door het gat, totdat het verbrande gedeelte in de buis.
    Opmerking: Het wordt aanbevolen om te testen van de grootte van het gat met het einde van het capillair uit de buurt van de verbrande gedeelte om ervoor te zorgen de juiste grootte, zoals het verbrande deel van het capillair kwetsbaar is.
  3. ~ 150 µL van HF (48-51% oplossing in water) aan de buis 200-µL toevoegen, zodat de HF-oplossing ongeveer halverwege de verbrande deel van het capillair is. Incubeer het capillair in de HF-oplossing bij kamertemperatuur voor 90-100 min.
    Opmerking: Het wordt aanbevolen dat een ander gat in het deksel van de buis is gemaakt en sommige kleine object (bijvoorbeeld, een kleine pipet tip) wordt gebruikt voor de buis ophouden terwijl de incubatie plaatsvindt. Het uiteinde van de pipet kan worden gebruikt om het doorprikken schuim of sommige andere stevige basis waaruit de reactie kamer hangen kan, het creëren van een veilige omgeving. Plaats van de papieren handdoeken onder de buis met HF en volgen van de juiste procedures in geval van een lekkage.
  4. Het capillair verwijderen uit de buis en spoel de buitenkant met gedeïoniseerd water te verwijderen van alle resterende HF.
    Opmerking: Zorg ervoor dat de buitendiameter van het capillair in het smalste gedeelte van de verbrande deel nu kleiner dan 100 µm, is zo hoort het ook.
  5. Snijd de geëtste deel van het capillair in het midden van het smalste gedeelte met behulp van een verbrijzelen steen tot een scheiding capillair met minder dan 100 µm in od aan het ene uiteinde. Snijd de niet-geëtste einde van het capillair om een 1-m scheiding capillaire.
    Opmerking: De verwijdering van HF afval volgens het institutioneel voorgeschreven protocol.

3. bereiding van de monsters

  1. Voorbereiding van een standaard eiwit mix
    1. Bereiden een mengsel van de standaard eiwit met cytochroom c (Cyto.c, 12 kDa, 0,1 mg/mL), lysozym (14.3 kDa, 0,1 mg/mL), β-caseïne (24 kDa, 0.4 mg/mL), myoglobine (16.9 kDa, 0,1 mg/mL), koolzuur anhydrase (CA, 29 kDa, 0,5 mg/mL) en bovien serumalbumine (BSA, 66.5 kDa 1.0 mg/mL) in LC-MS rang water als een stamoplossing.
      Opmerking: De stockoplossing kunnen aliquoted en opgeslagen bij-80 ° C voor gebruik.
    2. Verdun de stockoplossing met een factor 10 met een 50 mM Ammoniumbicarbonaat-oplossing (pH 8.0) in LC-MS rang water voor CZE-MS-analyse.
      Opmerking: Filter de Ammoniumbicarbonaat-oplossing voor gebruik met een membraanfilter (b.v., 0,2 µm van cellulosenitraat membraan en 50 mm diameter).
  2. Voorbereiding van een monster van E. coli
    1. Cultuur E. coli (K-12 MG1655) cellen in LB medium bij 37 ° C terwijl het schudden bij 225 t/min, totdat de waarde OD600 0,7 benaderingen. Verzamelen van E. coli cellen viacentrifugeren (3,283 x g, 10 min) en was ze meerdere keren met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) te verwijderen van het medium.
    2. Opschorten van de cellen van E. coli in de lysis-buffermengsel met 8 M ureum, proteaseinhibitors en 100 mM Ammoniumbicarbonaat (pH 8.0) en ultrasonicate op het ijs gedurende 15 minuten met behulp van een ultrasoon cel disruptor met een kopje hoorn voor volledige cellysis.
      1. De Duty Cycle (%) ingesteld op 50 en de Output controle tot en met 7 voor de ultrasone cel disruptor.
    3. Centrifugeer het lysate bij 18.000 x g gedurende 10 min. verzamelen het supernatant en gooi de pellet. Gebruik een kleine hoeveelheid van het supernatant voor meting van de concentratie van het eiwit met de bepaling van bicinchoninic zuur (BCA).
      Opmerking: De lysate moet ten minste met een factor drie om de ureum concentratie lager dan 3 M zodat het compatibel is met de BCA bepaling worden verdund. De BCA-test is uitgevoerd op basis van de procedure van de fabrikant.
    4. Meng 1 mg van E. coli eiwitten met koude aceton met een volumeverhouding van 1:4 en houd het mengsel bij-20 ° C's nachts te precipiteren van de eiwitten.
      Opmerking: Alle experimenten met behulp van aceton in een chemische kap uitvoeren
    5. Spin down neergeslagen eiwitten (12.000 x g, 5 min) en verwijder de bovendrijvende substantie. Wassen van de pellet met koude aceton weer (hetzelfde volume als voorheen) en weer naar beneden draaien.
    6. Verwijder het supernatant en toestaan dat de pellet te drogen in de chemische kap voor een paar minuten.
      Opmerking: Niet de overdry van de eiwit-pellet.
    7. Los van de neergeslagen eiwitten (1 mg) van E. coli in 200 µL van 8 M ureum in 100 mM Ammoniumbicarbonaat (pH 8.0).
    8. Denatureren, verminderen en het alkylate van het monster.
      1. Incubeer het monster bij 37 ° C gedurende 30 minuten te denatureren van de proteïnen.
      2. Verminderen met dithiothreitol (DTT) door toevoeging van 2 µL van 1 M DTT oplossing (in 100 mM Ammoniumbicarbonaat) in het monster en het monster bij 37 ° C gedurende 30 minuten aan het broeden.
      3. Alkylate van de eiwitten met iodoacetamide (IAA) door 6 µL van 1 M IAA oplossing (in 100 mM Ammoniumbicarbonaat) toe te voegen aan het monster en Incubeer het monster gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
      4. Doven de overtollige IAA met DTT door toevoeging van 2 µL van DTT-oplossing van 1 M en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Breng het monster met mierenzuur (FA) om een eindconcentratie van de FA van 1% (v/v).
        Opmerking: Vermindering en alkylatie worden uitgevoerd om te helpen de ontplooiing van de eiwitten voor downstream fragmentatie. Die stappen verliest de informatie van disulfide bindingen. Als het doel is het bestuderen van de disulfide bindingen op de eiwitten, voorkomen deze stappen. Vergeet niet om alle geconcentreerde zure oplossingen in een chemische kap.
    9. Desalt van het monster met behulp van een C4 val kolom (bijvoorbeeld4 mm van i.d., 10 mm in lengte, vol met 3-µm deeltjes met 300-Å poriën) met een HPLC-systeem. Gebruik van een UV-detector met een golflengte van 254 nm voor detectie.
      1. Het debiet van de mobiele fase ingesteld op 1 mL/min. activeren de kolom door te spoelen het met 80% (v/v) acetonitril (ACN), 0,1% FA in water gedurende 10 min, en equilibreer door het spoelen met 2% (v/v) ACN, 0,1% FA in water gedurende 10 minuten.
      2. Laden van 500-µg eiwitten op de kolom en desalt door te spoelen ze met 2% (v/v) ACN, 0,1% FA in water gedurende 10 minuten op een 1 mL/min debiet.
      3. Elueer de eiwitten met 80% (v/v) ACN, 0,1% FA in water gedurende 3 minuten op een 1 mL/min debiet. Verzamelen van het eluaat en het lyophilize met een vacuüm concentrator.
        Opmerking: De C4 val kolom kan worden gebruikt om het desalt van grote hoeveelheden eiwitten, maar niet laag microgram eiwitten als gevolg van mogelijke monster verlies. Voor beperkt eiwit materialen, kunt u overwegen Pipetteer tips met C4 media voor het ontzouten van eiwit. Wees voorzichtig niet te overdry van de eiwitten, wanneer het monster lyofilisering.
    10. Los de 500 µg van eiwitten (ervan uitgaande dat geen monster verlies tijdens de bereiding van de monsters) in 250 µL van 50 mM Ammoniumbicarbonaat (pH 8.0) voor CZE-MS experimenten.

4. opzet van het systeem van CZE-MS/MS en de analyseresultaten van de monsters

  1. Opzet van het systeem van CZE
    1. Bereiden van een BGE die 5% of 10% (v/v) azijnzuur bevatten (pH ~2.4 of ~ 2.2) in LC-MS rang water. ~1.5 mL van de BGE gestoken door een BGE flacon die met de buffer-lade van de CZE autosampler overeenkomt.
      Opmerking: Pas vers BGE elke week en verandering de BGE-oplossing in de flacon elke dag voor elke besmetting te voorkomen.
    2. Een oplossing van het monster (5-200 µL) toevoegen aan een buis invoegen en zet de buis invoegen in een monster flacon thatmatches met de monster-lade van de CZE autosampler.
    3. Het monster, de BGE en de capillaire scheiding in de CZE autosampler laden.
      Opmerking: De taal die wordt gebruikt in dit protocol meest nauwkeurig weerspiegelt het gebruik van één bepaalde autosampler (Zie Tabel of Materials), maar de beginselen kunnen worden toegepast op andere autosamplers.
      1. Selecteer monster laden op de pagina van de handmatige bediening van de CZE autosampler. Laad de BGE flacon in de lade van de buffer van de autosampler, vaststellend van haar positie in de lade van de buffer. Laad de monster-flacon in de lade van de steekproef van de autosampler, vaststellend van haar positie in de lade van de steekproef.
        Opmerking: Het instrument kan worden bediend in handmatige bediening door te klikken op de foto van het instrument voor Apparaat Monitor op de belangrijkste instrument pagina en selecteert u handmatige onder Directe controle.
      2. Laad het capillair scheiding in de CZE autosampler, met behulp van de niet-geëtste einde van het capillair. Breng de autosampler de positie van de uitlijning met behulp van handmatige bediening. Draad van niet-geëtste ultimo het capillair in een gat dat wordt gebruikt om de scheiding capillaire totdat het kan niet fysiek worden schroefdraad verder.
        Opmerking: In dit geval het einde van het capillair is bijna op dezelfde hoogte als het einde van de elektrode, en ten minste 50 µL van het monster is verplicht in de steekproef flesje om ervoor te zorgen dat het einde van het capillair is ondergedompeld in de steekproef tijdens de injectie. Als het monstervolume is laag (dat wil zeggen, 5 µL), de hoogte van het einde van de injectie van de capillaire behoeften worden aangepast zoals beschreven in stap 4.1.3.2.1.
        1. De hoogte van het einde van de injectie van het capillair aangepast indien het monstervolume lager ligt dan 50 µL (dat wil zeggen, 5 µL). De autosampler overschakelen naar stand-by met behulp van handmatige bediening. Typ de positie van de steekproef in het systeem en het verplaatsen van het capillair aan het monster. Sluit het uiteinde van de injectie van het capillair verder neer aan reach de onderkant van de monster-flacon.
          Opmerking: In dit geval de injectie van de steekproef kan worden uitgevoerd met een steekproef van slechts 5 µL in het flesje.
      3. Blijven gebruiken de handbediening, spoel het capillair met de BGE gedurende 20 minuten, met een druk van 20 psi.
  2. Opzet van de interface van CZE-MS
    1. Trek een capillaire borosilicaatglas (1 mm od, 0,75 mm in i.d., 10 cm lang) in twee electrospray vervuilers met een opening van 20-40 µm in od
      Opmerking: Houd de lengte van de emitter electrospray als 4-5 cm en snijd het met een verbrijzelen steen indien nodig. Beschikken over alle glas afval in een container slijpsel. De instellingen om 20 tot 40 µm tips zijn als volgt. De warmte 498, de aantrekkingskracht tot en met 5, de snelheid tot 10, de vertraging ingesteld op 150 en de druk tot 200. Controleer de grootte van de stralers met een Microscoop vóór gebruik. Pas de parameters iets indien nodig.
    2. Mount een commerciële electro-kinetisch gepompt schede stroom interface aan de voorzijde van de massaspectrometer (Zie Tabel van materialen). Vul het reservoir van de buffer schede met een buffer met 10% (v/v) methanol en 0.2% (v/v) FA in LC-MS rang water.
    3. Spoel de T in de interface met de schede buffer via druk handmatig vereffenen met een spuit. Rijg 1-mm-od ultimo een emitter electrospray via een mouw-tubing en verbinden van de emitter met één poort van de Tvia een fitting. Gewoon spoelen de T handmatig opnieuw met een spuit te vullen de emitter met de buffer van de schede.
    4. Pas de afstand tussen de opening van de emitter en de ingang van de massaspectrometer tot ~ 2 mm met behulp van de camera die bij de interface geleverd. Een 2 - tot 2.2-kV spanning aan de schede buffer flacon voor electrospray toepassen. De spray de kruisspanning om het bereiken van een stabiele electrospray.
      Opmerking: Als geen electrospray of een unstable electrospray wordt waargenomen, controleert u de interface om te controleren of er zijn geen grote luchtbellen in de emitter, de Ten in de leidingen die gebruikt voor het aansluiten van de schede buffer flacon en de T. De afstand tussen de opening van de emitter en de massaspectrometer ingang kan grofweg worden geschat door het te vergelijken met de 1-mm od van de emitter. De spanning van de spray is afhankelijk van de grootte van de emitter. Voor 20 tot 40 µm vervuilers is 2-2.2 kV goed genoeg. Vergeet niet om altijd voorzichtig bij het gebruik van hoge spanningen.
    5. Uitschakelen van de spanning van de spray en zachtjes draad de geëtste einde van de scheiding capillaire via de T in de emitter totdat het verder niet kan worden geduwd. Een lage druk (dat wil zeggen, 5 psi) aan het einde van de injectie van het capillair gelden tijdens dit proces om ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen in het capillair zijn.
      Opmerking: Het capillair is verbonden met de T via een mouw-buizen en een montage. Pas de positie van de geëtste einde van het capillair in de emitter met behulp van de camera binnen 500 µm. De afstand kan grofweg worden geschat door het te vergelijken met de 1-mm od van de emitter.
    6. Stop de lage druk aan het einde van de injectie van het capillair. Spoel de emitter een beetje met de buffer van de schede. Nogmaals, toepassing 2-2.2 kV van spray spanning om te testen de spray.
  3. Opzet van een CZE methode voor monster injectie, scheiding, capillaire spoelen, en het genereren van de massaspectrometer voor data-acquisitie
    1. Selecteer nieuwe methode onder het bestand drop-down menu op het scherm van de belangrijkste instrument om te starten van een nieuwe methode.
    2. Selecteer inlaat als SV/EV lade als monster, Druk als 5 psi, KV als 0, en duur als 95 s voor de injectie van een monster.
      Opmerking: Het monster wordt geïnjecteerd in de capillaire via druk uit te oefenen. Het monstervolume injectie kan worden berekend op basis van de druk en de injectie tijd met behulp van Poiseuille de wet. Bijvoorbeeld 5 psi voor de injectie van een monster van het 95-s komt overeen met ongeveer 500 nL van monster-laadvolume voor een 1-meter lange scheiding capillaire (50-µm i.d.).
    3. Selecteer de parameters voor de scheiding van CZE en instellen van parameters voor het genereren van de data-acquisitie.
      1. Op het inlaat als InV lade als Buffer, Druk 0 psi, KV 30 en duur als 4.200 s voor de scheiding van de standaard eiwitSteekproef mengsel. Op het inlaat als InV lade als Buffer, Druk 0 psi, KV 20 en duur als 6,600 s voor de scheiding van de E. coli Proteoom monster.
        Opmerking: De spanning die de scheiding aangevraagd kan worden aangepast op basis van de complexiteit van de steekproef. Voor eenvoudige EiwitSteekproeven, 30 kV kan worden toegepast om een versnelling van de analyse. Voor complexe monsters, 20 kV wordt toegepast om te vertragen van de scheiding en het verwerven van meer MS/MS-spectra voor proteoform IDs.
      2. Stel de parameters voor het genereren van de data-acquisitie onder Getimede evenementen. Instellen tijd (s) als 0,0 en Type als Relay 1 voor activeren in stap 1; Instellen tijd (s) als 1.0 en Type als Relay 1 voor Deactivate in stap 2.
    4. Selecteer inlaat als InV lade als Buffer, Druk als 10 psi, KV als 30 en duur als 600 s voor capillaire spoelen.
    5. Sla de bestanden van de methode voor de CZE-MS en MS/MS experimenten.
  4. Opzet van de MS en MS/MS
    1. Instellen van de parameters van het MS en MS/MS voor intact eiwit analyse met behulp van een vierpolige-ion trap massaspectrometer (Zie Tabel van materialen).
      Opmerking: Het positieve ion modus en hogere energie collisional dissociatie (HCD) voor versnippering werkzaam zijn.
      1. Aanpassen van de instellingen van bestand met melodie: Intact eiwit-modus inschakelen en gebruiken van een overlapping druk van 0,2. Stel de ion-overdracht capillaire temperatuur tot 320 ° C en de s-lens RF niveau tot en met 55.
      2. Bouwen van het MS en MS/MS methode-bestand.
        1. Voor volledige MS, stelt u de aantal microscans tot en met 3, de resolutie van 240.000 (in m/z 200), de streefwaarde van de automatische gain control (AGC) op 1E6, de tijd van de maximale injectie om 50 ms en het scanbereik tot 600-2000 m/z.
      3. Voor MS/MS, gebruikt u gegevens-afhankelijke acquisition (DDA) voor de acht meest intense ionen in een volledig spectrum van MS. Stel de isolatie-venster met 4 m/z en de genormaliseerde collisional energie (NCE) tot 20%. Het aantal microscans op 1, de resolutie 120.000 (in m/z 200), de AGC-streefwaarde te 1E5 en de maximale injectie tijd om 200 ms instellen.
      4. Stelt de drempel van de intensiteit voor het genereren van fragmentatie naar 1E5 en de ionen met een lading staat hoger dan 5 worden geïsoleerd voor versnippering. Zet het uitsluiten van isotopen en selecteer de dynamische uitsluiting tot 30 s.
        Opmerking: Het aantal microscans voor MS/MS kan worden verhoogd tot 3. In dit geval kan een Top3 DDA-methode worden gebruikt om de termijnen van de cyclus.
    2. Een bekabelde verbinding instellen tussen de CE autosampler en de massaspectrometer voor het automatisch genereren van de data-acquisitie. Sluit één uiteinde van een draad aan de estafette 1 Contact A en Relay-1 Contact B op de achterkant van de CE-autosampler. Sluit het andere uiteinde van de draad te Starten In - en starten + aan de zijkant van de massaspectrometer.
  5. CZE-MS/MS experiment en analyse van de monsters
    1. Toepassen van 30 kV met behulp van de handmatige bediening van CE aan het eind van de injectie monster en 2-2.2 kV op de schede buffer flacon met behulp van de externe voeding de scheiding capillaire en electrospray testen.
      Opmerking: De huidige, scheiding is in dit geval rond 8-9 µA als 5% (v/v) azijnzuur wordt gebruikt als de BGE.
    2. Een reeks overname gegevens op de computer massaspectrometer instellen door het selecteren van een nieuwe reeks.
      1. Selecteer onbekend als het monster type en geef een bestandsnaam en een pad. Geven aan de MS-methode moet worden gebruikt voor elk monster uitgevoerd onder Instrument methode.
        Opmerking: Aangezien er een aparte computer voor het beheersen van de CE-autosampler, betreffendedepositie monster hoeft niet te worden opgegeven.
    3. Een reeks van CZE scheiding op de CE-computer instellen om aan te geven van de positie van de buffer, monster positie en de CZE-methode. Om te beginnen een nieuwe reeks, selecteer volgorde onder het analyse drop-down menu op de pagina van het belangrijkste instrument.
    4. De methode voor de overname van gegevens op de computer massaspectrometer eerst starten door het selecteren van de reeks (of uitvoeren van de steekproef van enkele punten). Start vervolgens de CE-reeks op de CE autosampler computer.
      NOTITIE: Wanneer de spanning van de scheiding ingeschakeld na de injectie van het monster is, een signaal wordt verzonden uit de CE autosampler naar de massaspectrometer voor het genereren van de data-acquisitie. De huidige scheiding zal dalen in het begin tijdens de scheiding te wijten aan de dynamische pH junction monster stapelen. Vervolgens herstelt de huidige geleidelijk.

5. database zoek van de verzamelde Raw-bestanden met de tof Software

  1. Overdracht van de .raw-bestanden, met inbegrip van de gegevens van MS en MS/MS, uit de massaspectrometer-computer naar een computer die is gewijd aan database zoeken.
    Opmerking: Deze .raw-bestanden kunnen groot en een krachtige computer nodig om te komen tot een snelle database zoeken.
  2. Download ProteoWizard en tof suite op de computer die is gewijd aan database zoeken.
    Opmerking: ProteoWizard en tof suite zijn open-source software en kan online worden gevonden (ProteoWizard: http://proteowizard.sourceforge.net; Tof suite: http://proteomics.informatics.iupui.e.,u/software/toppic/). UniProt databases zijn gebruikt voor database zoekopdrachten en kunnen worden gevonden op de website UniProt.
  3. De .raw-bestanden converteren naar .mzML bestanden met msconvert, een MS bestand formaat conversietool in ProteoWizard28. In de GUI van msconvert (MSConvertGUI.exe), klik op de knop Bladeren en selecteer het .raw-bestand worden omgezet. Selecteer mzML als de outputformaat en houden van alle andere opties op hun standaardwaarden. Klik op de knop Start aan de onderkant rechts van de GUI.
  4. De .mzML-bestanden converteren naar .msalign bestanden met het hulpprogramma TopFD in tof suite29.
    1. In de GUI van TopFD (topfd_gui.exe), klik op de knop bestand en selecteer het .mzML-bestand gemaakt in de vorige stap. Om de standaardwaarden van de parameters en klik vervolgens op de knop Start aan de onderkant rechts van de GUI.
      Opmerking: TopFD voorloper en fragment isotopische clusters omgezet in exacte massa en identificeert mogelijk proteoform functies in MS1 gegevens door het combineren van voorloper isotopische clusters met soortgelijke exacte massa en nauwe migratie tijden. Drie bestanden zal worden gegenereerd op basis van TopFD, met inbegrip van een ms1.msalign-bestand, een bestand ms2.msalign en een .feature-bestand. De bestanden ms1.msalign en ms2.msalign bevatten respectievelijk deconvoluted exacte massa's van MS1 en MS/MS-spectra. Het bestand .feature bevat mogelijk proteoform functies.
  5. Een zoekopdracht database met tof (versie 1.1.3) in tof suite30.
    1. In de tof GUI (toppic_gui.exe), klik op databasebestand en selecteer een geschikte databank voor het zoeken.
    2. Klik op Spectrum bestand en selecteer het ms2.msalign-bestand gegenereerd in stap 5.4.1 als invoer. Selecteer de MS1 functie bestand en kies het .feature bestand gegenereerd in stap 5.4.1.
    3. Cysteïne carbamidomethylation (C57) instellen als een vaste wijziging als gevolg van de behandeling van de IAA.
      Opmerking: Een tekstbestand kan ook worden gemaakt, met verschillende vaste wijzigingen door een tekst-editor. Vervolgens kan het tekstbestand worden geselecteerd met behulp van de knop bestand naast vaste wijzigingen in de tof GUI.
    4. Selecteer de functie lokvogel database en schakel onder cutoff instellingen FDR (valse ontdekking tarief) in het drop-down menu naast Spectrum niveau. Stel de FDR op 0,01 op het niveau van het spectrum en 0,05 op het niveau van de proteoform.
      Opmerking: Tof biedt meerdere opties voor het filteren van de resultaten: spectrum-niveau FDR, proteoform-niveau FDR, of beide. De FDR is geëvalueerd op basis van de doel-lokvogel benadering31.
    5. Laten genereren functie uitgeschakeld en stel de fout-tolerantie (ppm) tot en met 15.
    6. Schakel onder Geavanceerde Parameters, 2 voor het maximum aantal massale verschuivingen in het drop-down menu. Instellen van de maximale massa verschuiven (Da) van onbekende wijzigingen tot 500 Da. laat alle andere parameters op hun standaardwaarden en klik op de knop Start in de rechteronderhoek van de GUI.
      Opmerking: De tof software genereert twee resulterende tekstbestanden. Het bestand met het achtervoegsel. OUTPUT_TABLE bevat de lijst van geïdentificeerde proteoform-spectrum wedstrijden (PrSMs), en de transactie met een achtervoegsel. FORM_OUTPUT_TABLE bevat de lijst van geïdentificeerde proteoforms. Voor elke PrSM, de software biedt algemene informatie over de wedstrijd, de versnippering van de waargenomen patroon, gecompenseerde fragment ionen en gedetecteerde massa verschuift.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figuur 1 toont een van de dynamische pH junction-gebaseerde CZE-ESI-MS systeem dat wordt gebruikt in het experiment. Een lange stekker van het monster in een fundamentele buffer wordt geïnjecteerd in een LPA beklede scheiding capillaire gevuld met een zuur BGE. Na het toepassen van hoge spanningen zal I en II, de analyten in de zone van het monster worden geconcentreerd via de dynamische pH junction methode. Om te beoordelen van de prestaties van het systeem van CZE-MS, wordt meestal een standaard eiwit mix (cytochroom c, lysozym, β-caseïne, myoglobine, CA en BSA) geanalyseerd. De representatieve electropherogram voor de standaard eiwit mengsel wordt weergegeven in Figuur 2. Het standaard eiwit mengsel draait meestal ten minste in tweevoud ter evaluatie van de scheidend vermogen en de reproduceerbaarheid van het systeem. Het scheidend vermogen kan worden geëvalueerd met het aantal theoretische schotels van bepaalde eiwitten, zoals weergegeven in Figuur 2B. De reproduceerbaarheid kan worden geëvalueerd door de relatieve standaardafwijkingen van eiwit intensiteit en migratie tijd. Figuur 3 A toont een ingezoomd-in-beeld van een electropherogram van de E. coli eiwitSteekproef geanalyseerd door de dynamische pH junction-gebaseerde CZE-MS/MS. De genormaliseerde-niveau (NL) eiwit intensiteit moet op de schaal van 108 als 1 µg van E. coli eiwitten worden geladen voor de analyse met een vierpolige ion trap massaspectrometer. Een weergave in-of uitgezoomd-in van de electropherogram kan worden gebruikt om te beoordelen van het venster van de scheiding van het systeem. In dit geval wordt in het venster van de scheiding is 80-90 min. Figuur 3B ziet u een voorbeeld PrSM, met inbegrip van de bijbehorende proteoform algemeneinformatie, eiwit sequentie waargenomen fragmentatie patroon en wijzigingen. De zeer lage E-Value (2.11E-48) en spectrale FDR (0) suggereren het hoge vertrouwen van de proteoform-ID. Het hoge aantal overeenkomende fragment ionen (60) verder geeft aan het hoge vertrouwen van de ID. De versnippering van de waargenomen patroon blijkt dat de versnippering van de proteoform zeer efficiënt voor de termini en het middelste deel van de proteoform. Het N-terminaal splijten van drie aminozuren (MTM) wordt bepaald door de database zoeken.

Figure 1
Figuur 1 : Diagram van het dynamische pH junction-gebaseerde CZE-ESI-MS systeem. Het monster wordt opgelost in 50 mM Ammoniumbicarbonaat, pH 8. De BGE is 5% of 10% (v/v) azijnzuur, pH ~2.4 of ~ 2.2. Een 1-m LPA beklede capillair wordt gebruikt voor de scheiding. Een electro-kinetisch gepompt schede stroom interface wordt gebruikt voor het koppelen van CZE aan MS. Een vierpolige ion trap massaspectrometer wordt gebruikt. De hoge spanning ik (HV ik) wordt verzorgd door de voeding die is geïntegreerd in de CE autosampler voor scheiding. Hoogspanning II (HV II) is voorzien van een aparte stroomtoevoer electrospray. De massa spectrometer is geworteld. De afstand tussen de opening van de emitter en de ingang van de massaspectrometer is ~ 2 mm. De afstand tussen het einde van de geëtste viscometerbuizen in de emitter en de opening van de emitter is minder dan 500 µm. De grootte van de opening van de emitter electrospray is 20-40 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 : Gegevens uit een mengsel van de standaard eiwit geanalyseerd door de dynamische pH junction-gebaseerde CZE-MS. (A) dit paneel toont een electropherogram van de hoofdpiek. (B) dit paneel toont het aantal theoretische schotels (N) van drie eiwitten. Het monstervolume injectie was 500 nL. HV ik was 30 kV voor scheiding en HV II was 2.2 kV voor electrospray. De BGE was 5% (v/v) azijnzuur, pH 2.4. Het monster was in 50 mM Ammoniumbicarbonaat (pH 8) en bevat cytochroom c (0,01 mg/mL), lysozym (0,01 mg/mL), β-caseïne (0,04 mg/mL), myoglobine (0,01 mg/mL), koolzuur anhydrase (CA, 0,05 mg/mL) en bovien serumalbumine (BSA, 0,1 mg/mL). Geen MS/MS-spectra werden verworven voor de standaard eiwitSteekproef mengsel. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 : Gegevens van de E.coli -proteomeanalyzed door de dynamische pH junction-gebaseerde CZE-MS/MS. (A) deze weergave toont een ingezoomd-in deelvenster van de electropherogram op basis van de piek van de E. coli eiwitSteekproef. (B) dit paneel toont een voorbeeld die prsm geïdentificeerd door de tof database opzoeking van de verworven MS/MS-spectra. De algemene informatie voor het bijbehorende proteoform, eiwit sequentie, waargenomen patroon van fragmentatie, en wijzigingen worden gepresenteerd. De gecompenseerde fragment ionen van individuele PrSM kunnen ook worden bekeken indien nodig. HV ik was 20 kV voor scheiding en HV II was 2.2 kV voor electrospray. De BGE was 10% (v/v) azijnzuur, pH ~ 2.2. Het monster was in 50 mM Ammoniumbicarbonaat (pH 8) en de eiwitconcentratie 2 mg/mL. Het monstervolume injectie was 500 nL. Een top8 DDA methode werd gebruikt om de gegevens te vergaren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor het gebruik van CZE-MS/MS voor de hoge-resolutie karakterisatie van proteoforms in simple EiwitSteekproeven en voor de grootschalige identificatie van proteoforms in complexe Proteoom monsters. Een diagram van de CZE-ESI-MS/MS-systeem is afgebeeld in Figuur 1. Er zijn vier belangrijke stappen in het protocol. Ten eerste, de voorbereiding van hoogwaardige LPA coating op de binnenwand van de capillaire scheiding is uiterst belangrijk. Een capillaire LPA beklede scheiding kan verminderen van het EOF in het capillair verbreden van het venster van de scheiding van CZE en eiwit adsorptie aan de binnenwand19verminderen. De polymerisatie-reactie om de LPA coating is uitgevoerd via vullen het capillair met een mengsel van acrylamide (monomeer) en ammonium persulfate (polymerisatie-initiator), gevolgd door verwarming van het capillair in een waterbad te leiden tot de reactie22. Het is van cruciaal belang dat de timing in het waterbad. Te korte reactie tijd zal leiden tot een onvolledige reactie en arme coating. Wij graag de reactie op architectengroep tot 50 minuten, waardoor de reactie om door te gaan voor een langere periode voor een betere coating. Met langere reactie periodes, kan de capillaire worden geblokkeerd en een HPLC pump zou moeten worden gebruikt voor het uitduwen van het polymeer binnenkant van het capillair met water. Één LPA beklede capillair voortdurend inzetbaar voor ongeveer een week, gebaseerd op de gegevens van de literatuur en onze ervaring-22.

De tweede cruciale stap is CZE koppeling naar MS met de electro-kinetisch gepompt schede stroom CE-MS interface25,26. De afstand tussen het einde van de scheiding in de ESI emitter capillaire en de emitter opening is van invloed op de gevoeligheid van CZE-MS aanzienlijk, en een kortere afstand produceert een hogere gevoeligheid25. Het einde van de capillaire scheiding moet worden geëtst met HF, te verminderen de buitendiameter van 360 µm tot minder dan 100 µm, waardoor het einde van het capillair te dicht bij de opening van de emitter worden geduwd. De afstand tussen de opening van de emitter en massaspectrometer ingang is geoptimaliseerd voor het bereiken van de beste gevoeligheid en een goede stabiliteit26. Wij houden meestal de afstand ongeveer 2 mm.

De derde cruciale stap is de CZE-MS en MS/MS analyse met het stapelen van dynamische pH junction-gebaseerde online monster19. De pH van de buffer van de steekproef en de BGE moeten beduidend verschillend om ervoor te zorgen efficiënte monster stapelen. De eiwitconcentratie in de steekproef moet zinvol zijn. Als de eiwitconcentratie te hoog is, kunnen de eiwitten in het capillair tijdens monster stapelen worden neergeslagen. De concentraties van de eiwitten van de monsters gebruikt voor figuren 2 en 3 kunnen worden beschouwd als typische voorbeelden. De laatste belangrijke stap is de database zoeken met tof proteoform IDs30. Meerdere stappen zijn nodig voor bestandsconversies voordat de database opzoeking met tof kan worden uitgevoerd. Een goede filter van de FDR is noodzakelijk om de kwaliteit van de geïdentificeerde proteoforms. Wij gebruiken meestal een 1% spectrum-niveau FDR voor het filteren van de zoekresultaten van de database. Wij stellen vast dat het initiatief van bovenaf proteomics een zeer goede bron voor top-down proteomics methoden en data analyse software32,33 is.

We moeten constateren dat sommige delen van het protocol wellicht enigszins worden gewijzigd en sommige probleemoplossing verlangd worden kan. De tijd van de polymerisatie in het waterbad voor de voorbereiding van de LPA coating kan variëren bij verschillende labs. De tijd voor HF etsen van de capillaire scheiding wellicht enigszins worden gewijzigd als gevolg van een verschillende temperatuur in verschillende laboratoria. Bij het instellen van de interface van de CE-MS, zorg ervoor dat de electrospray stabiel is voordat het capillair scheiding in de emitter electrospray threading. Als geen electrospray of een unstable electrospray wordt waargenomen, controleert u de interface om te controleren of er zijn geen grote luchtbellen in de emitter, in de Tof in de leidingen die gebruikt voor het aansluiten van de schede buffer flacon en de T. Bovendien, de afstand tussen de opening van de emitter en de massaspectrometer ingang kan invloed hebben op de stabiliteit van de electrospray en is meestal ongeveer 2 mm. De electrospray spanning kan ook invloed op de stabiliteit van de spray. Voor 20 tot 40 µm vervuilers is 2-2.2 kV meestal goed genoeg. Zoals beschreven in de vorige alinea, moet de eiwitconcentratie van het monster nodig. Als de eiwitconcentratie te hoog is, kunnen de eiwitten in het capillair tijdens monster stapelen worden neergeslagen. Aandacht besteden aan het huidige profiel op de computer van de autosampler CE. Als de huidige nul aan het begin van de run CZE is, betekent dit dat een stekker van de lucht wordt geïnjecteerd in het capillair tijdens de steekproef injectie stap. Zorg ervoor dat het volume van het monster in de flacon is groot genoeg. Als de huidige normaal aan het begin is en plotseling op nul tijdens de run, betekent dit meestal dat de eiwitconcentratie te hoog is.

CZE-MS/MS op basis van dit protocol kan de high-resolution karakterisering van simple EiwitSteekproeven en de grootschalige topdown proteomics van complexe proteomes. Als voorbeeld benaderde de CZE-MS de high-resolution karakterisering van een mengsel van de standaard eiwit dat bevat zes eiwitten19. Zoals blijkt uit Figuur 2, de CZE-MS duidelijk gescheiden van de zes eiwitten met een hoge scheidingsrendement onthuld drie vormen van β-caseïne en ontdekt veel onzuiverheden. Een ander voorbeeld: single-shot CZE-MS/MS reproducibly leverde meer dan 500 proteoform-id's en 190 eiwit-id's van de E. coli Proteoom, slechts 1 µg van E. coli eiwitten met een 1% spectrum-niveau FDR19. De CZE-MS/MS verbeterd het aantal proteoform-id's van een complexe Proteoom door ten minste drie keer, met vorige single-shot CZE-MS/MS studies vergeleken. Zoals blijkt uit Figuur 3A, bereikt de CZE-MS/MS gelijktijdig een 500-nL-monster-laadvolume en een scheiding van de 90-min venster voor de analyse van de E. coli Proteoom19. De tof software bieden uitgebreide informatie over de geïdentificeerde proteoforms (Figuur 3B). De CZE-MS/MS-systeem biedt de proteomics Gemeenschap met een nuttig instrument voor grootschalige en hoge resolutie topdown proteomics.

CZE-MS/MS heeft nog steeds enkele beperkingen voor diep topdown proteomics. Hoewel we aangetoond dat de CZE-MS/MS over 500proteoform id's uit het proteoom van E. coli in een enkele run bereiken kunnen, is het aantal proteoform-id's uit single-shot CZE-MS/MS slechts ongeveer 50% van die van state-of-the-art RPLC-MS/MS34, 35. In dit protocol wordt alleen HCD gebruikt voor eiwit fragmentatie, wat leidt tot versnippering van de beperkte dekkingen van geïdentificeerde proteoforms. Verschillende verbeteringen kunnen worden gemaakt bij het protocol van CZE-MS/MS ter verbetering van zowel het aantal en de kwaliteit van de proteoform-id's uit single-shot CZE-MS/MS. Verhoging van de lengte van de capillaire scheiding dient eerst een grotere scheiding venster, wat leidt tot meer proteoform IDs. Ten tweede, een massaspectrometer met een veel hogere oplossend vermogen, sneller scannen tarief, en meerdere fragmentatie-methoden (bijvoorbeeld, HCD,36 elektron overdracht dissociatie [ETD],37 en ultraviolet fotolyse [UVPD]38 ) zal zeker verbeteren van zowel het aantal proteoform IDs en de dekkingen van de versnippering van de geïdentificeerde proteoforms.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Heedeok Hong de groep op de afdeling scheikunde, Michigan State University, bedanken de auteurs voor het vriendelijk het verstrekken van de Escherichia coli cellen voor de experimenten. De auteurs bedanken voor de ondersteuning van het National Institute of General Medical Sciences, de National Institutes of Health (NIH) door middel van Grant R01GM118470 (voor X. Liu) en Grant R01GM125991 (L. zon en X. Liu).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fused silica capillary Polymicro Technologies 1068150017 50 µm i.d. 360 µm o.d.
Sodium hydroxide pellets Macron Fine Chemicals 7708-10 Corrosive
LC-MS grade water Fisher Scientific W6-1
Hydrochloric acid Fisher Scientific SA48-1 Corrosive
Methanol Fisher Scientific A456-4 Toxic, Health Hazard
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate Sigma-Aldrich M6514 Moisture and heat sensitive
Hydrofluoric acid Acros Organics 423805000 Highy toxic
Acrylamide Acros Organics 164855000 Toxic, health hazard
Ammonium persulfate Sigma-Aldrich A3678 Health hazard, Oxidizer
lysozyme Sigma-Aldrich L6876
Cytochrome C Sigma-Aldrich C7752
Myoglobin Sigma-Aldrich M1882
ß-casein Sgma-Aldrich C6905
Carbonic anhydrase Sigma-Aldrich C3934
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A2153
Urea Alfa Aesar 36428-36
DL-Dithiothreitol Sigma-Aldrich D0632 Health Hazard
Iodoacetamide Fisher Scientific AC122270250 Health Hazard
Formic Acid Fisher Scientific A117-50 Corrosive, Health Hazard
C4 trap column Sepax Technologies 110043-4001C 3 µm particles, 300 Å pores, 4.0 mm i.d. 10 mm long
Acetonitrile Fisher Scientific A998SK-4 Toxic, Oxidizer
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich 1066-33-7
Nalgene rapid-flow filters Thermo Scientific 126-0020 0.2 µm CN membrane, and 50 mm diameter
E. coli cells K-12 MG1655
Dulbecco's phosphate-buffered saline Sigma-Aldrich D8537
BCA assay Thermo Scientific 23250
Acetone Fisher Scientific A11-1
HPLC system for protein desalting Agilient 1260 Infinity II
Acetic Acid Fisher Scientific A38-212
CE autosampler CMP Scientific ECE-001
Electro-kinetically pumped sheath flow interface CMP Scientific
Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer Thermo Fisher Scientific
Sutter flaming/brown micropipette puller Sutter Instruments P-1000
Ultrasonic cell disruptor for cell lysis Branson 101063196 Model S-250A
Vaccum concentrator Thermo Fisher Scientific SPD131DDA-115

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aebersold, R., et al. How many proteoforms are there. Nature Chemical Biology. 14 (3), 206-214 (2018).
  2. Tran, J. C., et al. Mapping intact protein isoforms in discovery mode using top-down proteomics. Nature. 480 (7376), 254-258 (2011).
  3. Catherman, A. D., et al. Large-scale Top-down Proteomics of the Human Proteome: Membrane Proteins, Mitochondria, and Senescence. Molecular and Cellular Proteomics. 12 (12), 3465-3473 (2013).
  4. Cai, W., et al. Top-Down Proteomics of Large Proteins up to 223 kDa Enabled by Serial Size Exclusion Chromatography Strategy. Analytical Chemistry. 89 (10), 5467-5475 (2017).
  5. Toby, T. K., Fornelli, L., Kelleher, N. L. Progress in Top-Down Proteomics and the Analysis of Proteoforms. Annual Review of Analytical Chemistry. 9 (1), 499-519 (2016).
  6. Jorgenson, J. W., Lukacs, K. D. Capillary Zone Electrophoresis. Science. 222 (4621), 266-272 (1983).
  7. Keithley, R. B. Capillary electrophoresis with three-color fluorescence detection for the analysis of glycosphingolipid metabolism. Analyst. 138 (1), 164-170 (2013).
  8. Han, X., et al. In-Line Separation by Capillary Electrophoresis Prior to Analysis by Top-Down Mass Spectrometry Enables Sensitive Characterization of Protein Complexes. Journal of Proteome Research. 13 (12), 6078-6086 (2014).
  9. Sun, L., Zhu, G., Zhao, Y., Yan, X., Mou, S., Dovichi, N. J. Ultrasensitive and Fast Bottom-up Analysis of Femtogram Amounts of Complex Proteome Digests. Angewandte Chemie International Edition. 52 (51), 13661-13664 (2013).
  10. Choi, S. B., Lombard-Banek, C., Muñoz-LLancao, P., Manzini, M. C., Nemes, P. Enhanced Peptide Detection Toward Single-Neuron Proteomics by Reversed-Phase Fractionation Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (5), 913-922 (2018).
  11. Sun, L., Knierman, M. D., Zhu, G., Dovichi, N. J. Fast Top-Down Intact Protein Characterization with Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 85 (12), 5989-5995 (2013).
  12. Wang, Y., Fonslow, B. R., Wong, C. C., Nakorchevsky, A., Yates, J. R. Improving the comprehensiveness and sensitivity of sheathless capillary electrophoresis-tandem mass spectrometry for proteomic analysis. Analytical Chemistry. 84 (20), 8505-8513 (2012).
  13. Zhang, Z., Yan, X., Sun, L., Zhu, G., Dovichi, N. J. Detachable strong cation exchange monolith, integrated with capillary zone electrophoresis and coupled with pH gradient elution, produces improved sensitivity and numbers of peptide identifications during bottom-up analysis of complex proteomes. Analytical Chemistry. 87 (8), 4572-4577 (2015).
  14. Sun, L., et al. Over 10,000 peptide identifications from the HeLa proteome by using single-shot capillary zone electrophoresis combined with tandem mass spectrometry. Angewandte Chemie International Edition in English. 53 (50), 13931-13933 (2014).
  15. Aebersold, R., Morrison, H. D. Analysis of dilute peptide samples by capillary zone electrophoresis. Journal of Chromatography. 516 (1), 79-88 (1990).
  16. Britz-McKibbin, P., Chen, D. D. Y. Selective Focusing of Catecholamines and Weakly Acidic Compounds by Capillary Electrophoresis Using a Dynamic pH Junction. Analytical Chemistry. 72 (6), 1242-1252 (2000).
  17. Zhao, Y., Sun, L., Zhu, G., Dovichi, N. J. Coupling Capillary Zone Electrophoresis to a Q Exactive HF Mass Spectrometer for Top-down Proteomics: 580 Proteoform Identifications from Yeast. Journal of Proteome Research. 15 (10), 3679-3685 (2016).
  18. Zhu, G., Sun, L., Yan, X., Dovichi, N. J. Bottom-Up Proteomics of Escherichia coli. Using Dynamic pH Junction Preconcentration and Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization-Tandem Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (13), 6331-6336 (2014).
  19. Lubeckyj, R. A., McCool, E. N., Shen, X., Kou, Q., Liu, X., Sun, L. Single-Shot Top-Down Proteomics with Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization-Tandem Mass Spectrometry for Identification of Nearly 600 Escherichia coli Proteoforms. Analytical Chemistry. 89 (22), 12059-12067 (2017).
  20. Busnel, J. M. High capacity capillary electrophoresis-electrospray ionization mass spectrometry: coupling a porous sheathless interface with transient-isotachophoresis. Analytical Chemistry. 82 (22), 9476-9483 (2010).
  21. Zhang, Z., Peuchen, E. H., Dovichi, N. J. Surface-Confined Aqueous Reversible Addition-Fragmentation Chain Transfer (SCARAFT) Polymerization Method for Preparation of Coated Capillary Leads to over 10 000 Peptides Identified from 25 ng HeLa Digest by Using Capillary Zone Electrophoresis-Tandem Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 89 (12), 6774-6780 (2017).
  22. Zhu, G., Sun, L., Dovichi, N. J. Thermally-initiated free radical polymerization for reproducible production of stable linear polyacrylamide coated capillaries, and their application to proteomic analysis using capillary zone electrophoresis-mass spectrometry. Talanta. 146, 839-843 (2016).
  23. Smith, R. D., Barinaga, C. J., Udseth, H. R. Improved Electrospray Ionization Interface for Capillary Zone Electrophoresis-Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 60 (16), 1948-1952 (1988).
  24. Moini, M. Simplifying CE-MS Operation. 2. Interfacing Low-Flow Separation Techniques to Mass Spectrometry Using a Porous Tip. Analytical Chemistry. 79 (11), 4241-4246 (2007).
  25. Wojcik, R., Dada, O. O., Sadilek, M., Dovichi, N. J. Simplified capillary electrophoresis nanospray sheath-flow interface for high efficiency and sensitive peptide analysis. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 24 (17), 2554-2560 (2010).
  26. Sun, L., Zhu, G., Zhang, Z., Mou, S., Dovichi, N. J. Third-Generation Electrokinetically Pumped Sheath-Flow Nanospray Interface with Improved Stability and Sensitivity for Automated Capillary Zone Electrophoresis-Mass Spectrometry Analysis of Complex Proteome Digests. Journal of Proteome Research. 14 (5), 2312-2321 (2015).
  27. McCool, E. N., et al. Deep Top-Down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis-Tandem Mass Spectrometry: Identification of 5700 Proteoforms from the Eschericia coli Proteome. Analytical Chemistry. 90 (9), 5529-5533 (2018).
  28. Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development. Bioinformatics. 24 (21), 2534-2536 (2008).
  29. TopPIC Suite. , Available from: http://proteomics.informatics.iupui.edu/software/topfd/ (2017).
  30. Kou, Q., Xun, L., Liu, X. TopPIC : a software tool for top-down mass spectrometry-based proteoform identification and characterization. Bioinformatics. 32 (22), 3495-3497 (2016).
  31. Elias, J. E., Gygi, S. P. Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry. Nature Methods. 4 (3), 207-214 (2007).
  32. Methods - Consortium for Top Down Proteomics. , Available from: http://www.topdownproteomics.org/resources/methods/ (2018).
  33. Software - Consortium for Top Down Proteomics. , Available from: http://www.topdownproteomics.org/resources/software/ (2018).
  34. Ansong, C., et al. Top-down proteomics reveals a unique protein S-thiolation switch in Salmonella Typhimurium in response to infection-like conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10153-10158 (2013).
  35. Shen, Y., et al. High-resolution ultrahigh-pressure long column reversed-phase liquid chromatography for top-down proteomics. Journal of Chromatography A. 1498, 99-110 (2017).
  36. Olsen, J. V., Macek, B., Lange, O., Makarov, A., Horning, S., Mann, M. Higher-energy C-trap dissociation for peptide modification analysis. Nature Methods. 4 (9), 709-712 (2007).
  37. Syka, J. E., Coon, J. J., Schroeder, M. J., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. Peptide and protein sequence analysis by electron transfer dissociation mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (26), 9528-9533 (2004).
  38. Shaw, J. B., et al. Complete Protein Characterization Using Top-Down Mass Spectrometry and Ultraviolet Photodissociation. Journal of the American Chemical Society. 135 (34), 12646-12651 (2013).

Tags

Chemie kwestie 140 Top-down proteomics capillaire zone elektroforese electrospray ionisatie Spectrometrie van de massa van het tandem proteoform Escherichia coli
Grootschalige topdown Proteomics met behulp van capillaire Zone elektroforese Tandem massaspectrometrie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McCool, E. N., Lubeckyj, R., Shen,… More

McCool, E. N., Lubeckyj, R., Shen, X., Kou, Q., Liu, X., Sun, L. Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (140), e58644, doi:10.3791/58644 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter