Summary
通过毛细管区电泳-电喷雾-串联质谱 (CZE-proteoforms), 描述了蛋白质样品中的分离、鉴定和表征的详细协议。该协议可用于简单蛋白样品中 proteoforms 的高分辨率表征和复杂蛋白质组样本中 proteoforms 的大尺度鉴定。
Abstract
毛细管区电泳-电喷雾电离-串联质谱 (CZE) 已被公认为自上而下蛋白质组学的有用工具, 旨在表征复杂蛋白质组中的 proteoforms。然而, CZE 在大范围自上而下蛋白质组学中的应用由于 CZE 的样品加载能力低, 分离窗口狭窄而受阻。在这里, 使用 CZE 的协议描述了一个微升的样品加载量和一个90分钟的分离窗口, 用于大规模自上而下的蛋白质组学。CZE 平台基于线性聚丙烯酰胺 (LPA) 涂层分离毛细管, 具有极低的电渗流, 一种基于动态 pH 结的在线样品浓缩方法, 具有高效率的蛋白质堆积,电动力学泵鞘流 CE 接口具有极高的灵敏度, 以及具有高质量分辨率和扫描速度的离子阱质谱仪。该平台可用于简单完整蛋白样品的高分辨率表征和各种复杂蛋白质组中 proteoforms 的大尺度表征。例如, 我们演示了一种高效分离标准蛋白混合物和使用该平台对许多杂质进行高度灵敏检测的方法。作为另一个例子, 这个平台可以产生超过 500 proteoform 和190蛋白质鉴定从大肠杆菌蛋白质组在一个单一的 CZE ms/ms 运行。
Introduction
自上而下的蛋白质组学 (TDP) 的目的是大规模表征 proteoforms 内的蛋白质。TDP 依赖于在电喷雾电离-串联质谱 (ESI ms/ms) 分析之前, 由于蛋白质组1、2 的高复杂性和大浓度动态范围而对完整蛋白进行有效液相分离 ,3,4,5。毛细管区电泳 (CZE) 是一种强大的技术, 以分离生物分子的大小-电荷比6。CZE 是相对简单的, 只需要一个开放管状熔融石英毛细管, 背景电解质 () 和电源。完整的蛋白质样品可以通过压力或电压加载到毛细管中, 并通过浸泡毛细管两端并施加高电压来启动分离。CZE 可接近超高分离效率 (> 100万个理论板), 用于分离生物分子7。CZE 的灵敏度比广泛使用的反相液相色谱 (RPLC)-ms 对完整蛋白8的分析有了极大的提高。虽然 CZE 对大规模自上而下蛋白质组学有很大的潜力, 但它在蛋白质组学中的广泛应用受到了一些问题的阻碍, 包括低采样量和窄分离窗口。CZE 中典型的样品加载量约为总毛细管体积的 1%, 通常对应于小于 100 nL9、10、11。由于强电渗流 (EOF)9、10, CZE 的分离窗口通常小于30分钟。这些问题限制了 CZE (ms), 用于识别来自复杂蛋白质组的大量 proteoforms 和低丰 proteoforms。
通过在线样品浓度法 (例如固相微萃取 [固相微萃取]12、13、场增强样品堆积 (CZE)9 , 提高了样品加载量。,11,14、动态 pH 结15、16、17、18)。和动态 ph 结比固相微萃取简单, 只需要在电导率和 pH 值之间有显著差异的样品缓冲液。在取样区域和毛细管中的的小区之间的边界上, 该样品缓冲液的电导率要低得多。动态 pH 结使用一个基本的样品塞 (例如, 50 毫米碳酸氢钠, ph 8) 和酸盐 (例如, 5% [v-/v] 醋酸, pH 2.4) 在样品插头的两侧。在毛细管的注射端施加高正压时, 会发生基本样品塞的滴定, 在进行 CZE 分离之前将分析物集中在紧密的插头上。最近, Sun 集团系统地比较了在完整的蛋白质在线堆叠的承认和动态 ph 结, 表明动态 ph 结可以产生更好的性能比坦白的在线浓度完整的蛋白质时样品注射量为总毛细管体积19的25%。
中立涂层分离毛细血管 (例如, 线性聚丙烯酰胺 [LPA]) 已被用于减少毛细管中的 EOF, 减慢 CZE 分离和扩大分离窗口20,21。最近, Dovichi 集团开发了一个简单的程序, 在毛细血管内壁上制备稳定的 LPA 涂层, 利用过硫酸铵 (ap) 作为引发剂和温度 (50 摄氏度) 自由基生产和聚合22.最近, Sun 集团采用了 LPA 涂层分离毛细管和动态 pH 结方法 CZE 分离完整的蛋白质, 达到微升的样品加载量和90分钟的分离窗口19。这个 CZE 系统打开门使用 CZE ms/ms 的大规模自上而下的蛋白质组学。
CZE 需要一个高度健壮和敏感的接口, 以耦合 CZE 到 MS。三 ce ms 接口在 ce 的历史中得到了很好的开发和商业化, 它们是共轴鞘流接口23, sheathless 接口使用多孔尖端作为 ESI 发射器24, 以及电动力学泵送护套流量接口25,26。电动力学泵鞘-流界面 CZE-ms 已达到低 zeptomole 肽检测限制9, 超过1万肽鉴定 (IDs) 从 HeLa 细胞蛋白质组在单一运行14, 快速表征完整的蛋白质11, 和高度稳定和可重现的生物分子分析26。最近, 采用 LPA 包覆分离毛细管、动态 pH 结法和电动力学泵鞘流界面, 用于大肠埃希氏杆菌 (大肠杆菌) 蛋白质组 19 的大尺度上向下蛋白分析 ,27。CZE 平台通过与尺寸排除色谱 (SEC)-RPLC 分馏27的耦合, 在单个运行19和近 6000 proteoform id 中接近 500 proteoform id。结果清楚地显示了 CZE 对大范围自上而下蛋白质组学的能力。
本文介绍了一种用于大规模自上而下蛋白质组学的 CZE/ms 的详细过程。CZE 系统采用了 LPA 涂层毛细管, 以减少毛细管中的 EOF, 动态 pH 结方法的蛋白质在线浓度, 电动力学泵鞘流接口 CZE 耦合到 MS, orbitrap 质量用于采集蛋白质的 ms 和 ms/ms 光谱的光谱仪, 以及通过数据库搜索 Proteoform ID 的 TopPIC (自上而下的质谱 Proteoform 识别和表征) 软件。
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Protocol
1. 分离毛细管内壁上的 LPA 涂层的制备
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毛细管的预处理
- 冲洗熔融石英毛细管 (长度为120厘米, 内径为50µm [内径], 360 µm 外径 [外径]), 连续500µL 1 m 氢氧化钠, 去离子水, 1 m 盐酸, 去离子水, 和 LC MS 级甲醇使用注射器泵。
- 用氮气 (10 psi, ≥ 12 h) 干燥毛细管, 用注射器泵在甲醇中填充 50% (v/v) 3-(氧硅) 丙基丙烯酸酯。用硅胶密封毛细管两端, 并在室温下孵育至少24小时。
注意: 在这一步中, 毛细管的内壁是官能化的 C = c. 更长的孵育结果在更好的毛细管涂层由于更完整的反应。 - 从两端用劈裂的石头切成一小部分 (约5毫米) 的毛细管。使用注射器泵冲洗毛细管与甲醇 (500 µL), 以清洁未反应试剂。用氮气干燥毛细管 (10 psi, ≥12 h)。
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LPA 涂料的制备
注: 本程序是基于朱等。22 , 稍加修改。- 准备丙烯酰胺溶液 (40 毫克丙烯酰胺在1毫升水) 和过硫酸铵 (ap) 解决方案 (5% [瓦特/v] 在水中)。
- 将 ap 溶液的 2-3 µL 添加到丙烯酰胺溶液的500µL, 将混合物涡旋, 并用氮气将其加气5分钟, 以除去溶液中的氧气。
- 使用真空将混合物装入预处理毛细管中, 用硅胶将毛细管两端密封, 并在50摄氏度的水浴中孵育40分钟。
- 用劈裂石从两端去除毛细管的一小部分 (约5毫米)。使用注射器泵将未反应溶液用水 (200 µL) 推出毛细管。
注: 确保从毛细管中挤出的聚合物是琼脂糖凝胶状的一致性。更长的孵育步骤 (高达 ~ 45-50 分钟) 可以产生更好的毛细管涂层。随着反应时间的延长, 毛细管可能会堵塞, 需要高压才能将聚合物与水一起推出。HPLC 泵可用于此目的。
2. 用氢氟酸蚀刻毛细管
注意: 在处理氢氟酸 (HF) 溶液时, 请使用适当的安全程序。所有与 HF 相关的操作都需要在化学引擎盖中完成。在与 HF 相关的操作之前, 请确保2.5% 葡萄糖酸钙凝胶可用于暴露的情况。双手套是必需的, 一个典型的丁腈橡胶手套里面和一个沉重的氯丁橡胶手套外面。穿上实验室大衣和化学安全护目镜。在 HF 操作后, 将液体和固体危险废物分开。在废料回收之前, 必须立即用高浓度氢氧化钠溶液对液态 HF 废料进行中和。固体 HF 废料需要暂时储存在一个塑料容器内, 里面衬有两个厚塑料一加仑密封袋和一个盖子。固体和液体废料必须正确标记。
- 使用柔和的火焰 (例如, 口袋打火机) 将毛细管的一部分烧掉, 将聚酰亚胺外层涂层 (长度1厘米) 从毛细管一端的4厘米左右移开。将聚酰亚胺涂层完全清除, 轻轻擦拭毛细管的烧焦部分。
注意: 继续小心, 因为没有聚酰亚胺涂层的毛细管部分将是有点脆弱。 - 在200µL 管的末端钻一个小孔, 其大小与毛细管外径相同, 以便在螺纹穿过此孔后充分握住毛细管。将靠近烧伤部位的毛细管末端穿过孔, 直到燃烧的部分在管子中。
注: 建议测试孔的大小与毛细管的末端远离烧伤部分, 以确保正确的大小, 因为毛细管的烧伤部分是脆弱的。 - 将150µL 的 hf (48%-51% 溶液在水中) 添加到200µL 管, 这样 HF 溶液就会在毛细管的烧焦部分的一半左右。室温下在 HF 溶液中孵育毛细管 90-100 分钟。
注意: 建议在试管的盖子上创建另一个孔, 在孵育过程中, 使用一些小物体 (例如小吸管尖端) 来保持管。移液头可用于刺穿泡沫或反应室可以悬挂的其他固体平台, 创造一个安全的环境。将纸巾放在含 HF 的管子下面, 并按照适当的步骤进行泄漏。 - 从管子中取出毛细管, 用去离子水清洗外部, 去除任何残余的 HF。
注: 确保在烧伤部位最窄部分的毛细管外径现在小于100µm, 因为它应该是。 - 使用劈裂石在最窄的部分中间切割毛细管的蚀刻部分, 在一端的外径处产生小于100µm 的分离毛细管。切断毛细管的非蚀刻末端, 以获得一个1米的分离毛细管。
注: 根据制度规定的协议处理 HF 废弃物。
3. 样品的制备
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标准蛋白混合物的制备
- 制备含有细胞色素 c (细胞) 的标准蛋白混合物. c, 12 kDa, 0.1 毫克/毫升), 溶菌酶 (14.3 kDa, 0.1 毫克/毫升), β-酪蛋白 (24 kDa, 0.4 毫克/毫升), 肌红蛋白 (16.9 kDa, 0.1 毫克/毫升), 碳酸酸酐 (CA, 29 kDa, 0.5 毫克/毫升), 和牛血清白蛋白 (BSA, 66.5 kDa, 1.0 毫克/毫升) 在 LC-MS 级水作为一个股票解决方案。
注: 该库存解决方案可以按, 存储在-80 摄氏度, 供使用。 - 将库存溶液稀释10倍, 用50毫米碳酸氢铵溶液 (pH 8.0) 在 LC ms 级水中进行 CZE 分析。
注: 在使用膜过滤器 (例如, 0.2 µm 的纤维素硝酸盐膜和直径为50毫米) 之前, 请过滤碳酸氢铵溶液。
- 制备含有细胞色素 c (细胞) 的标准蛋白混合物. c, 12 kDa, 0.1 毫克/毫升), 溶菌酶 (14.3 kDa, 0.1 毫克/毫升), β-酪蛋白 (24 kDa, 0.4 毫克/毫升), 肌红蛋白 (16.9 kDa, 0.1 毫克/毫升), 碳酸酸酐 (CA, 29 kDa, 0.5 毫克/毫升), 和牛血清白蛋白 (BSA, 66.5 kDa, 1.0 毫克/毫升) 在 LC-MS 级水作为一个股票解决方案。
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大肠杆菌样品的制备
- 在 LB 培养基中培养大肠杆菌(K-12 MG1655) 细胞, 在37摄氏度时摇动 225 rpm, 直到 OD600 值接近0.7。通过离心 (3283 x g, 10 分钟) 收集大肠杆菌细胞, 并用磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 多次洗涤, 去除培养基。
- 将含有 8 M 尿素、蛋白酶抑制剂和 100 mM 碳酸氢钠 (pH 8.0) 和 ultrasonicate 的裂解缓冲液中的大肠杆菌细胞悬浮在冰上15分钟, 使用带有杯角的超声波细胞干扰者来完成细胞裂解。
- 将占空比 (%)设置为 50, 并将输出控制设置为 7, 用于超声波单元干扰者。
- 将裂解液离心 1.8万 x g , 10 分钟. 收集上清并丢弃颗粒。使用二辛可宁酸 (BCA) 测定法对上清液的小等分进行蛋白质浓度测量。
注: 裂解液至少需要稀释三倍, 以降低尿素浓度低于3米, 以便与 BCA 检测相兼容。BCA 检测是根据制造商的程序进行的。 - 将1毫克大肠杆菌蛋白与冷丙酮混合, 体积比为 1:4, 使混合物在-20 摄氏度过夜沉淀蛋白质。
注: 在化学罩中使用丙酮进行所有实验。 - 向下旋转沉淀的蛋白质 (1.2万 x g, 5 分钟) 并除去上清液。再次用冷丙酮洗涤颗粒 (与以前相同), 再向下旋转。
- 取出上清液, 使颗粒在化学罩中干燥几分钟。
注意: 不要没有蛋白颗粒。 - 将沉淀的大肠杆菌蛋白 (1 毫克) 溶于200µL 的8米尿素中, 100 毫米碳酸氢铵 (pH 8.0)。
- 变性、减少和烷基化油样品。
- 在37摄氏度孵育样品30分钟, 变性蛋白质。
- 通过在样品中加入2µL 1 M DTT 溶液 (在 100 mM 碳酸氢铵中), 并在37摄氏度下孵育30分钟, 以 dithiothreitol (dtt) 减少。
- 烷基化油蛋白质与 iodoacetamide (iaa) 通过添加6µL 1 M IAA 溶液 (在100毫米碳酸氢钠) 到样品和孵化样品20分钟在室温下在黑暗中。
- 通过添加2µL 1 M dtt 溶液, 在室温下孵育5分钟, 以 dtt 淬火多余的 IAA。用甲酸 (FA) 酸化样品以获得 1% (/v) 的最终 FA 浓度。
注: 减少和烷基化是为了帮助蛋白质的展开, 以促进下游破碎。这些步骤将失去二硫债券的信息。如果目标是研究蛋白质上的二硫键, 避免这些步骤。切记要处理化学引擎盖中的所有浓缩酸溶液。
- 淡化样品使用 C4 疏水阀柱 (例如, 4 毫米的内径, 10 毫米的长度, 用 HPLC 系统包装 3-µm 颗粒, 具有300的孔隙)。使用 254 nm 波长的 UV 检测器进行检测。
- 将流动相流量设置为1毫升/分钟. 通过用 80% (v/v) 乙腈 (华置)、0.1% fa 在水中10分钟和平衡 (2% (v/v) 华置、0.1% FA 在水中冲洗10分钟) 来激活该列。
- 将 500-µg 蛋白装入柱和淡化, 用 2% (伏/伏) 华置, 0.1% FA 在水中10分钟, 以1毫升/分钟的流速进行冲洗。
- 洗脱的蛋白质与 80% (v/v) 华置, 0.1% FA 在水中3分钟, 在1毫升/分钟的流速。收集洗脱液和 lyophilize 它与真空浓缩器。
注: C4 疏水阀柱可用于淡化大量蛋白质, 但由于可能的样本损失而不是低微克的蛋白质。对于有限的蛋白质材料, 请考虑使用 C4 培养基的移液头来进行蛋白质脱盐。冻干样品时, 注意不要没有蛋白质。
- 溶解500µg 的蛋白质 (假设样品制备过程中没有样品损失) 在250µL 50 毫米碳酸氢铵 (pH 8.0) 为 CZE-MS 实验。
4. CZE/ms 系统的设置和样品分析
- CZE 系统的设置
- 在 LC MS 级水中制备含有5% 或 10% (v/v) 乙酸 (pH ~ 2.4 或 ~ 2.2) 的。将1.5 毫升的 CZE 放入一个与自动进样器的缓冲托盘匹配的小瓶中。
注意: 每星期做新鲜的, 并改变在小瓶中的小溶液每天, 以避免任何污染。 - 将样品溶液 (5-200 µL) 添加到插入管中, 并将插入管放入样品瓶中, thatmatches 与 CZE 自动进样器的样品托盘一起使用。
- 将样品、CZE 和分离毛细管加载到自动进样管中。
注意: 本协议中使用的语言最准确地反映了一个特定的自动进样程序的使用 (见材料表), 但这些原则可应用于其他 autosamplers。- 在 CZE 自动进样的手动控制页面中选择样本负载。将该小瓶装入自动进样器的缓冲盘中, 注意其在缓冲盘中的位置。将样品瓶装入自动进样器的样品盘中, 注意其在样品托盘中的位置。
注意: 仪器可在手动控制中操作, 方法是在主仪器页面上点击设备监视器的图片, 然后在直接控制下选择手动。 - 使用毛细管的非蚀刻末端将分离毛细管加载到 CZE 自动进样器中。使用手动控制将自动进样器置于对准位置。将毛细管的非蚀刻端螺纹插入一个孔, 用于保持分离毛细管, 直至其无法进一步物理螺纹。
注: 在这种情况下, 毛细管末端几乎与电极末端的高度相同, 样品瓶中至少需要50µL 样品, 以确保毛细管末端在注射过程中浸入样品中。如果样品体积低 (即5 µL), 则需要根据步骤4.1 中所述调整毛细管的注射端高度. 3.2. 1。- 如果样品体积低于50µL (即5 µL), 请调整毛细管注射端的高度。使用手动控制将自动进样器切换到待机状态。在系统中输入样品位置并将毛细管移动到样品上。将毛细管的注射端进一步向下推至样品瓶的底部。
注意: 在这种情况下, 样品注射可以用小瓶中仅有5µL 的样品进行。
- 如果样品体积低于50µL (即5 µL), 请调整毛细管注射端的高度。使用手动控制将自动进样器切换到待机状态。在系统中输入样品位置并将毛细管移动到样品上。将毛细管的注射端进一步向下推至样品瓶的底部。
- 继续使用手动控制, 用20分钟冲洗毛细管, 使用 20 psi 的压力。
- 在 CZE 自动进样的手动控制页面中选择样本负载。将该小瓶装入自动进样器的缓冲盘中, 注意其在缓冲盘中的位置。将样品瓶装入自动进样器的样品盘中, 注意其在样品托盘中的位置。
- 在 LC MS 级水中制备含有5% 或 10% (v/v) 乙酸 (pH ~ 2.4 或 ~ 2.2) 的。将1.5 毫升的 CZE 放入一个与自动进样器的缓冲托盘匹配的小瓶中。
- CZE 接口的设置
- 将硼硅酸盐玻璃毛细管 (外径为1毫米, 内径为0.75 毫米, 10 厘米长) 放入两个电喷雾发射器中, 外径为 20-40 µm 口
注: 将电喷雾发射器的长度保持为 4-5 cm, 必要时将其切割成劈裂石。将所有玻璃废料处理在锐化容器中。获得20到40µm 提示的设置如下所示。将热量设置为 498, 拉动至 5, 速度为 10, 延迟至 150, 压力为200。使用前, 用显微镜检查发射器的尺寸。必要时略微调整参数。 - 在质谱仪前面安装商用电动力学泵送鞘流接口 (见材料表)。将含 10% (a/v) 甲醇和 0.2% (a/v) FA 的缓冲液填充在 LC MS 级水中。
- 通过使用注射器手动按压护套缓冲液, 在接口中冲洗T 。通过套管管将电喷雾发射器的 1 mm 外径末端螺纹, 并通过接头将发射器与T的一个端口连接起来。只需用注射器手动冲洗T , 即可用护套缓冲液填充发射器。
- 通过接口随附的相机的帮助, 调整发射器孔口与质谱仪入口之间的距离至 ~ 2 mm。在用于电喷雾的护套缓冲瓶上应用2至 2.2 kV 电压。调整喷雾电压以达到稳定的电喷雾。
注意: 如果未观察到电喷雾或不稳定的喷雾, 请检查接口以确保发射器、 t和用于连接护套缓冲瓶和T的油管中没有大气泡。通过与发射器的 1 mm 外径进行比较, 可以粗略估计发射器孔口与质谱仪入口之间的距离。喷雾电压取决于发射器的尺寸。对于20至40µm 发射器, 2-2.2 kV 是足够好的。切记在使用高电压时务必小心。 - 关闭喷雾电压, 并轻轻将分离毛细管的蚀刻末端穿过T进入发射器, 直至其无法进一步推进。在此过程中, 在毛细管的注射端应用低压 (即5 psi), 确保毛细管中没有气泡。
注: 毛细管通过套筒管和管件连接到T 。通过相机的帮助, 在500µm 内调节毛细管在发射器蚀刻末端的位置。通过与发射器的 1 mm 外径进行比较, 可以粗略估计距离。 - 在毛细管的注射端停止低压。用护套缓冲液将发射器冲洗一点。再次, 应用 2-2.2 kV 的喷雾电压来测试喷雾。
- 将硼硅酸盐玻璃毛细管 (外径为1毫米, 内径为0.75 毫米, 10 厘米长) 放入两个电喷雾发射器中, 外径为 20-40 µm 口
- 用于数据采集的样品注射、分离、毛细管冲洗和触发的 CZE 方法的建立
- 在主仪表屏幕上的 "文件" 下拉菜单中选择 "新建方法" 以启动新方法。
- 选择进口作为 SV/EV,托盘作为样品,压力为 5 psi, KV为 0, 和持续时间为样品注射的九十五年代。
注: 样品通过施加压力注入毛细管。使用泊肃叶法, 可以根据压力和注射时间计算样品注射量。例如, 95 s 采样注入的 5 psi 对应于 1 m 长分离毛细管 (50-µm id) 的约 500 nL 样品加载量。 - 选择 CZE 分离的参数, 并设置触发数据采集的参数。
- 将进口作为 InV,托盘作为缓冲器,压力为 0 psi, KV为 30,持续时间为 4200 s, 用于分离标准蛋白混合物样品。将入口设置为 InV,托盘为缓冲器,压力为 0 psi, KV为 20,持续时间为 6600 s, 用于分离大肠杆菌蛋白质组样本。
注: 用于分离的电压可根据样品复杂度进行调整。对于简单的蛋白质样品, 30 kV 可用于加速分析。对于复杂样品, 20 kV 用于减慢分离速度, 并获得更多 proteoform id 的 ms/ms 频谱。 - 设置在定时事件下触发数据采集的参数。将时间设置为 0.0, 并在步骤1中键入为中继1以激活;将时间设置为 1.0, 并在步骤2中键入为中继1以停用。
- 将进口作为 InV,托盘作为缓冲器,压力为 0 psi, KV为 30,持续时间为 4200 s, 用于分离标准蛋白混合物样品。将入口设置为 InV,托盘为缓冲器,压力为 0 psi, KV为 20,持续时间为 6600 s, 用于分离大肠杆菌蛋白质组样本。
- 选择进口作为 InV,托盘作为缓冲,压力为 10 psi, KV为 30, 和持续时间为600s 毛细管冲洗。
- 保存 CZE 和 ms/ms 实验的方法文件。
- ms 和 ms/ms 的设置
- 使用四极离子阱质谱仪为完整的蛋白质分析设置 ms 和 ms/ms 参数 (见材料表)。
注: 采用正离子模式和更高能量碰撞解离 (HCD) 进行碎片化。- 调整调谐文件设置: 打开完整的蛋白质模式并使用0.2 的陷印压力。将离子转移毛细管温度设置为320摄氏度, s 透镜 RF 电平设为55。
- 生成 ms 和 ms/ms 方法文件。
- 对于完整的 MS, 将把数设置为 3, 分辨率为 24万 (在m/z 200), 自动增益控制 (AGC) 目标值为 1E6, 最大注入时间为 50 MS, 扫描范围为 600-2000米/z。
- 对于 ms/ms, 在全 MS 频谱中对八个最强离子使用数据相关采集 (DDA)。将隔离窗口设置为 4米/z , 将归一化碰撞能量 (NCE) 设为20%。将把数设置为 1, 分辨率为 12万 (在m/z 200), AGC 目标值为 1E5, 最大注入时间为 200 ms。
- 将触发碎片的强度阈值设置为 1E5, 并将具有高于5的电荷状态的离子设置为碎片隔离。打开 "排除同位素" 并将动态排除设置为三十年代。
注意: ms/ms 的把数可以增加到3。在这种情况下, 可以使用 Top3 DDA 方法以缩短周期时间。
- 在 CE 自动进样和质谱仪之间建立有线连接, 实现数据采集的自动化触发。将导线的一端连接到继电器1触点 a和继电器1触点 B在 CE 自动进样装置背面。连接线的另一端开始在-和开始在 +在质量光谱仪的一侧。
- 使用四极离子阱质谱仪为完整的蛋白质分析设置 ms 和 ms/ms 参数 (见材料表)。
- CZE/ms 样品的实验与分析
- 应用 30 kV 使用 CE 手动控制在样品注射端和 2-2.2 kV 在鞘缓冲液瓶使用外部电源测试分离毛细管和电喷雾。
注: 在这种情况下, 分离电流约为 8-9 µA, 如果 5% (a/v) 乙酸被用作。 - 通过选择一个新序列, 在质谱仪计算机上设置数据采集序列。
- 选择 "未知" 作为示例类型并指定文件名和路径。指示用于仪表方法下每个样本运行的 MS 方法。
注意: 由于有单独的计算机来控制 CE 自动进样, 因此不需要在此处指定样品位置。
- 选择 "未知" 作为示例类型并指定文件名和路径。指示用于仪表方法下每个样本运行的 MS 方法。
- 在 CE 计算机上设置 CZE 分离序列, 以指示缓冲区位置、采样位置和 CZE 方法。要启动新序列, 请在主仪表页上的分析下拉菜单下选择序列。
- 首先通过选择运行序列(或运行单个运行的示例), 在质谱仪计算机上启动数据采集方法。然后, 在 ce 自动进样机计算机上启动 ce 序列。
注: 在样品注入后, 当分离电压开启时, 将从 CE 自动进样仪向质谱计发送信号, 以触发数据采集。由于动态 pH 结样品堆积, 分离电流将在分离过程中开始减少。然后, 电流逐渐恢复。
- 应用 30 kV 使用 CE 手动控制在样品注射端和 2-2.2 kV 在鞘缓冲液瓶使用外部电源测试分离毛细管和电喷雾。
5. 使用 TopPIC 软件对收集的原始文件进行数据库搜索
- 将. raw 文件 (包括 ms 和 ms/ms 数据) 从质谱计算机传输到专用于数据库搜索的计算机。
注意: 这些. raw 文件可能很大, 需要强大的计算机才能达到快速数据库搜索。 - 将 ProteoWizard 和 TopPIC 套件下载到专门用于数据库搜索的计算机上。
注意: ProteoWizard 和 TopPIC 套件是开源软件, 可以在线找到 (ProteoWizard: http://proteowizard.sourceforge.net;TopPIC 套房: http://proteomics.informatics.iupui.e.,u/software/toppic/)。UniProt 数据库用于数据库搜索, 并可在 UniProt 网站上找到。 - 将. raw 文件转换为. mzML 文件, msconvert 是 ProteoWizard28中的 MS 文件格式转换工具。在 msconvert (MSConvertGUI.exe) 的 GUI 中, 单击按钮浏览并选择要转换的. raw 文件。选择 mzML 作为输出格式, 并将所有其他选项保留为默认值。单击 GUI 右下角的 "开始" 按钮。
- 使用 TopPIC 套件29中的 TopFD 工具将. mzML 文件转换为. msalign 文件。
- 在 TopFD (topfd_gui) 的 GUI 中, 单击按钮文件, 然后选择在上一步中创建的. mzML 文件。保留参数的默认值, 然后单击 GUI 右下角的 "开始" 按钮。
注: TopFD 将前兆和片段同位素簇转换为单同位素质量, 并通过将前体同位素簇与类似的单同位素质量和接近的迁移时间相结合, 确定 MS1 数据中可能的 proteoform 特征。将从 TopFD 生成三个文件, 包括 ms1. msalign 文件、ms2. msalign 文件和. 功能文件。ms1. msalign 和 ms2 msalign 文件分别包含通过单同位素和 ms/ms 频谱。. 功能文件包含可能的 proteoform 功能。
- 在 TopFD (topfd_gui) 的 GUI 中, 单击按钮文件, 然后选择在上一步中创建的. mzML 文件。保留参数的默认值, 然后单击 GUI 右下角的 "开始" 按钮。
- 在 TopPIC 套件30中使用 TopPIC (版本 1.1.3) 执行数据库搜索。
- 在 TopPIC GUI (toppic_gui) 中, 单击数据库文件并选择适当的数据库进行搜索。
- 单击频谱文件并选择在步骤5.4.1 中生成的 ms2 msalign 文件作为输入。选择MS1 功能文件, 然后选择在步骤5.4.1 中生成的. 功能文件。
- 设置半胱氨酸 carbamidomethylation (C57) 作为一个固定的修改由于 IAA 处理。
注意: 文本文件也可以通过文本编辑器的各种固定修改创建。然后, 可以通过使用 TopPIC GUI 中的 "固定修改" 旁边的 "文件" 按钮来选择文本文件。 - 选择 "诱饵数据库" 功能, 在 "截止设置" 下, 在 "频谱级别" 旁边的下拉菜单中选择 " FDR (错误发现率)"。将 FDR 设置为 0.01, 在频谱级别和0.05 在 proteoform 级别。
注意: TopPIC 提供了用于筛选结果的多个选项: 频谱级别 fdr、proteoform 级别 fdr 或两者兼而有之。根据目标诱饵方法31评估 FDR。 - 保留生成函数未选中, 并将错误容差 (ppm)设置为15。
- 在 "高级参数" 下, 为下拉菜单中的最大质量偏移量选择2。将未知修改的最大质量偏移量 (da)设置为 500 da. 将所有其他参数保留为默认值, 然后单击 GUI 右下角的 "开始" 按钮。
注意: TopPIC 软件生成两个生成的文本文件。带有后缀的文件。OUTPUT_TABLE 包含已识别的 proteoform 频谱匹配项 (PrSMs) 和带有后缀的列表。FORM_OUTPUT_TABLE 包含已标识 proteoforms 的列表。对于每个 PrSM, 该软件提供有关匹配、观察到的碎片模式、匹配的片段离子以及检测到的质量变化的一般信息。
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Representative Results
图 1显示了在实验中使用的基于动态 pH 结的 CZE 系统的示意图。在基本缓冲液中, 样品的长插头被注射到带有酸性物质的 LPA 涂层分离毛细管中。在应用高电压 I 和 II 后, 样品区中的分析物将通过动态 pH 结法集中。为了评估 CZE 系统的性能, 通常分析标准蛋白混合物 (细胞色素 c、溶菌酶、β酪蛋白、肌红蛋白、钙和 BSA)。标准蛋白混合物的代表电泳图谱如图 2A所示。标准蛋白混合物通常至少在重复运行, 以评估分离效率和系统的重现性。分离效率可以用一些蛋白质的理论板块的数量来评估, 如图 2B所示。蛋白质强度和迁移时间的相对标准偏差可以评估重现性。图 3a显示了以动态 pH 结为基础的 CZE (ms) 分析的大肠杆菌蛋白样品电泳图谱的放大视图。如果用四极离子阱质谱仪对1µg大肠杆菌蛋白进行分析, 则规范化水平 (NL) 蛋白强度应在 108的范围内。电泳图谱的放大视图可用于评估系统的分离窗口。在这种情况下, 分离窗口是 80-90 分钟.图 3B显示了一个示例 PrSM, 包括一般对应的 proteoform 信息、蛋白质序列、观察到的碎片模式和修改。非常低的 E 值 (2.11E-48) 和频谱 FDR (0) 建议 proteoform ID 的高可信度。大量匹配的片段离子 (60) 进一步表明 ID 的高可信度。观察到的碎片模式表明, proteoform 的碎片是高效覆盖 proteoform 的总站和中间部分。通过数据库搜索确定了三种氨基酸 (MTM) 的 n-末端裂解。
图 1:图基于动态 pH 结的 CZE 系统.样品溶于50毫米碳酸氢铵, pH 8。5% 或 10% (v-/v) 乙酸, pH 值 ~ 2.4 或 ~ 2.2。1米的 LPA 涂层毛细管用于分离。采用电动力学泵鞘流接口, 将 CZE 与 MS 进行耦合。采用四极离子阱质谱仪。高压 i (高压 i) 由集成到 CE 自动进样器中的电源提供, 用于分离。高压 ii (HV ii) 由单独的电喷雾电源提供。质谱仪接地。发射器孔口与质谱仪入口之间的距离约为 2 mm。发射器中蚀刻毛细管末端与发射体孔口之间的距离小于500µm。电喷雾发射器孔的尺寸为 20-40 µm.请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 2: 以动态 pH 结为基础的 CZE 分析标准蛋白质混合物的数据.(A) 此面板显示基准峰值电泳图谱。(B) 此面板显示三种蛋白质的理论板块 (N) 的数量。样品注射量为 500 nL。高压 i 为 30 kv 分离, 高压 II 为 2.2 kv 电喷雾。5% (v-/v) 乙酸, pH 2.4。该样品是在50毫米碳酸氢钠 (pH 8), 包含细胞色素 c (0.01 毫克/毫升), 溶菌酶 (0.01 毫克/毫升), β酪蛋白 (0.04 毫克/毫升), 肌红蛋白 (0.01 毫克/毫升), 碳酸酐酶 (CA, 0.05 毫克/毫升), 和牛血清白蛋白 (BSA, 0.1 毫克/毫升)。未获得标准蛋白混合物样品的 ms/ms 谱。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 3: 以动态 pH 结为基础的 CZE-ms proteomeanalyzed大肠杆菌的数据.(A) 此面板显示了大肠杆菌蛋白样本的基于峰值电泳图谱的放大视图。(B) 本小组展示了通过 TopPIC 数据库搜索获得的 MS/ms 光谱 PrSM 的例子。介绍了一般对应的 proteoform 信息、蛋白质序列、观察到的碎片模式和修改方法。如果需要, 还可以查看单个 PrSM 中的匹配片段离子。高压 i 为 20 kv 分离, 高压 II 为 2.2 kv 电喷雾。10% (v-/v) 乙酸, pH 值为2.2。样品为50毫米碳酸氢铵 (pH 8), 蛋白质浓度为2毫克/毫升。样品注射量为 500 nL。利用 top8 DDA 方法获取数据。请点击这里查看这个数字的更大版本.
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Discussion
在这里, 我们提供了一个详细的协议, 使用 CZE 的高分辨率表征 proteoforms 在简单的蛋白质样本和大规模鉴定 proteoforms 在复杂的蛋白质组样品。图 1显示了 CZE-ESI/ms 系统的示意图。协议中有四关键步骤。首先, 在分离毛细管的内壁上制备高质量的 LPA 涂层非常重要。用 LPA 包覆分离毛细管可以减少毛细管中的 EOF, 拓宽 CZE 的分离窗, 减少其内壁19的蛋白质吸附。通过在毛细管中填充丙烯酰胺 (单体) 和过硫酸铵 (聚合引发剂), 然后通过将毛细管加热到水浴中, 来进行 LPA 涂层的聚合反应, 以触发反应22。水浴的时间是至关重要的。反应时间过短将导致不完全反应和涂层不良。我们通常允许反应贫弱50分钟, 允许反应进行更长的时间, 以更好的涂层。随着反应周期的延长, 毛细管可能会被堵塞, 而 HPLC 泵可能需要用于在毛细管中用水推出聚合物。根据文献资料和我们的经验22, 一个 LPA 涂层毛细管可以连续使用大约一周。
第二个关键步骤是耦合 CZE 到 MS 与电动力学泵送鞘流 CE-ms 接口25,26。ESI 发射器中分离毛细管末端与发射口孔之间的距离会显著影响 CZE 的灵敏度, 较短的距离会产生较高的灵敏度25。分离毛细管的末端需要用 HF 蚀刻, 以将其外径从360µm 降低到小于100µm, 从而使毛细管末端被推离发射口。发射口和质谱仪入口之间的距离经过优化, 达到最佳灵敏度和良好的稳定性26。我们通常保持距离约2毫米。
第三个关键步骤是基于动态 pH 结的在线样品堆叠19的 CZE 和 ms/ms 分析。样品缓冲液和水样的 pH 值需要显著不同, 以确保有效的样品堆积。样品中的蛋白质浓度需要适当。如果蛋白质浓度过高, 在样品堆积过程中, 蛋白质可以在毛细管中沉淀。用于图 2和3的样本的蛋白质浓度可被视为典型示例。最后一个关键步骤是使用 TopPIC proteoform id30进行数据库搜索。在使用 TopPIC 进行数据库搜索之前, 文件转换需要多个步骤。正确的 FDR 过滤器是必要的, 以确保确定的 proteoforms 的质量。我们通常使用1% 频谱级别的 FDR 来筛选数据库搜索结果。我们注意到, 自上而下的蛋白质组学倡议是一个非常好的资源, 自上而下的蛋白质组学方法和数据分析软件32,33。
我们必须注意到, 协议的某些部分可能需要稍加修改, 可能需要进行一些故障排除。用于制备 LPA 涂层的水浴中的聚合时间在不同的实验室可能有所不同。由于不同实验室的温度不同, 分离毛细管的 HF 蚀刻时间可能需要稍加修改。在设置 CE MS 接口时, 确保电喷雾在将分离毛细管线程化到电喷雾发射器之前保持稳定。如果没有发现电喷雾或不稳定的喷雾, 检查接口, 以确保没有大气泡在发射器, T, 或在管道, 用于连接鞘缓冲瓶和T。此外, 发射器孔和质谱仪入口之间的距离会影响电喷雾的稳定性, 通常约为 2 mm。电喷雾电压也会影响喷雾稳定性。对于20至40µm 发射器, 2-2.2 kV 通常是足够好的。如前段所述, 样品中的蛋白质浓度需要适当。如果蛋白质浓度过高, 在样品堆积过程中, 蛋白质可以在毛细管中沉淀。注意 CE 自动进样机计算机上的当前配置文件。如果在 CZE 运行的最开始时电流为零, 则意味着在样品注射步骤中, 将空气塞注入毛细管中。确保小瓶中样品的体积足够大。如果电流在开始时是正常的, 在运行过程中突然变零, 通常意味着蛋白质浓度过高。
基于此协议的 CZE ms/ms 可实现简单蛋白质样本的高分辨率表征和复杂蛋白质组的大规模自上而下蛋白质组学。作为一个例子, CZE 接近高分辨率表征的标准蛋白质混合物含有六蛋白质19。如图 2所示, CZE 清楚地分离了六种蛋白质, 具有很高的分离效率, 揭示了三形式的β酪蛋白, 并检测出许多杂质。作为另一个例子, 单次 CZE 可重复从大肠杆菌蛋白质组中获得超过 500 proteoform id 和190个蛋白质 id, 仅使用1µg 的大肠杆菌蛋白, 1% 频谱级别的 FDR19。与以前的单次 CZE ms 研究相比, CZE (ms) 的 proteoform id 从复杂蛋白质组中的数量提高了至少三倍。如图 3A所示, CZE/ms 同时达到 500 nL 样品加载量和90分钟分离窗口, 用于分析大肠杆菌蛋白质组19。TopPIC 软件可以提供有关已识别 proteoforms 的全面信息 (图 3B)。CZE 系统为蛋白质组学界提供了一种用于大规模和高分辨率自上而下蛋白质组学的有用工具。
CZE 对深层自上而下蛋白质组学仍有一些局限性。虽然我们证明 CZE 可以在单次运行中从大肠杆菌蛋白质组中获得超过500proteoform 的 id, 但单次 CZE ms/ms 的 proteoform id 数量仅为最先进的 RPLC ms/ms34的大约 50%, 35。在本协议中, 只有 HCD 用于蛋白质碎片, 从而导致识别 proteoforms 的碎片覆盖率有限。可以对 CZE 协议进行一些改进, 以提高单次 CZE ms/ms proteoform id 的数量和质量。首先, 增加分离毛细管的长度应提供更广泛的分离窗口, 从而导致更多的 proteoform id。其次, 使用具有更高分辨率的质谱仪、更快的扫描速率和多种破碎方法 (例如HCD、36电子转移离解 [ETD]、37和紫外光解 [UVPD]38) 肯定会提高 proteoform id 的数量和已识别 proteoforms 的碎片覆盖率。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢 Heedeok 在密歇根州立大学化学系的小组, 为实验提供大肠杆菌细胞. 作者感谢全国普通医学研究院、国立卫生研究院 (NIH) 通过授予 R01GM118470 (向 x. 刘) 和授予 R01GM125991 (对 l. 孙和 x. 刘) 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fused silica capillary | Polymicro Technologies | 1068150017 | 50 µm i.d. 360 µm o.d. |
| Sodium hydroxide pellets | Macron Fine Chemicals | 7708-10 | Corrosive |
| LC-MS grade water | Fisher Scientific | W6-1 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | SA48-1 | Corrosive |
| Methanol | Fisher Scientific | A456-4 | Toxic, Health Hazard |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma-Aldrich | M6514 | Moisture and heat sensitive |
| Hydrofluoric acid | Acros Organics | 423805000 | Highy toxic |
| Acrylamide | Acros Organics | 164855000 | Toxic, health hazard |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | Health hazard, Oxidizer |
| lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| Cytochrome C | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| Myoglobin | Sigma-Aldrich | M1882 | |
| ß-casein | Sgma-Aldrich | C6905 | |
| Carbonic anhydrase | Sigma-Aldrich | C3934 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Urea | Alfa Aesar | 36428-36 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | Health Hazard |
| Iodoacetamide | Fisher Scientific | AC122270250 | Health Hazard |
| Formic Acid | Fisher Scientific | A117-50 | Corrosive, Health Hazard |
| C4 trap column | Sepax Technologies | 110043-4001C | 3 µm particles, 300 Å pores, 4.0 mm i.d. 10 mm long |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A998SK-4 | Toxic, Oxidizer |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 1066-33-7 | |
| Nalgene rapid-flow filters | Thermo Scientific | 126-0020 | 0.2 µm CN membrane, and 50 mm diameter |
| E. coli cells | K-12 MG1655 | ||
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| BCA assay | Thermo Scientific | 23250 | |
| Acetone | Fisher Scientific | A11-1 | |
| HPLC system for protein desalting | Agilient | 1260 Infinity II | |
| Acetic Acid | Fisher Scientific | A38-212 | |
| CE autosampler | CMP Scientific | ECE-001 | |
| Electro-kinetically pumped sheath flow interface | CMP Scientific | ||
| Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| Sutter flaming/brown micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Ultrasonic cell disruptor for cell lysis | Branson | 101063196 | Model S-250A |
| Vaccum concentrator | Thermo Fisher Scientific | SPD131DDA-115 |
References
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