Summary
כאן אנו מתארים שיטה להערכת ביטוי ריאות miRNAs זה הם חזו להסדיר גנים דלקתיים שימוש בעכברים נחשפים האוזון או סינון אוויר בשלבים שונים של ייחום.
Abstract
פרופיל MicroRNA (miRNA) הפך לעניין חוקרים עובדים בתחומים שונים מחקר בביולוגיה ורפואה. מחקרים הנוכחי מראים התחלה מבטיחה בעתיד הכרוכים miRNAs באבחון, טיפול של מחלות ריאה. . כאן, אנחנו להגדיר עבור miRNA פרופיל כדי למדוד את השפע היחסי של קבוצת miRNAs חזה להסדיר גנים דלקתיים רקמת הריאה של מודל העכבר דלקת דרכי הנשימה אוזון-induced פרוטוקול. כי הוכח כי במחזור רמות הורמון המין יכול להשפיע ברגולציה של הריאה מולדת חסינות אצל נקבות, מטרת שיטה זו היא לתאר את miRNA דלקתיות של פרופיל פרוטוקול בעכברים נקבה, אם לוקחים בחשבון את ייחום שלב של כל בעל חיים בזמן החשיפה האוזון. אנו הכתובת גם גישות ביואינפורמטיקה ישים miRNA של גילוי ושל יעד שיטות זיהוי באמצעות limma, תוכנה R/Bioconductor, ו אנליזה פונקציונלית תוכנה כדי להבין את ההקשר הביולוגי ואת מסלולים הקשורים ביטוי דיפרנציאלי miRNA.
Introduction
Rna (miRNAs) הם קצרים (19-25 נוקלאוטידים), המתרחשים באופן טבעי, ללא קידוד RNA מולקולות. רצפים של miRNAs הם אבולוציונית והתפאורה על פני מינים, רומז על חשיבות miRNAs בוויסות פונקציות פיזיולוגיים1. יצירת פרופיל ביטוי microRNA הוכח להיות מועיל לזיהוי miRNAs חשובים בוויסות מגוון רחב של תהליכים, כולל את התגובה החיסונית, התמיינות תאים, תהליכים פיתוחיים אפופטוזיס2. לאחרונה, miRNAs זוהו לשימוש שלהם פוטנציאל אבחון המחלה הרפוי. עבור החוקרים ללמוד מנגנונים של הכונה, מדידה miRNA ביטוי יכול להאיר את מערכות ברמת מודלים של תהליכים רגולטוריים, במיוחד כאשר miRNA המידע יאוחד עם פרופיל ה-mRNA, אחרים נתונים הגנום בקנה מידה3. מצד שני, miRNAs יש גם הוכח להיות יציבים יותר mRNAs במגוון סוגי הדגימה, גם הם מדידה עם רגישות גדולה יותר מאשר חלבונים4. זה הוביל עניין רב בהתפתחות miRNAs כמו סמנים ביולוגיים עבור יישומים אבחון מולקולרי שונים ומגוונים, לרבות מחלות ריאה.
הריאות, miRNAs משחק תפקידים חשובים תהליכים התפתחותיים, שמירה על הומאוסטזיס. יתר על כן, ביטוי לא תקין שלהם נמצא קשור פיתוח, ההתקדמות של מחלות שונות5. מחלות ריאה דלקתיות הנגרמת על ידי זיהום אוויר הוכיחה ביתר חומרה והפרוגנוזה עניים אצל נקבות, המציין הורמוני, את ייחום יכול לווסת את הריאה מולדת חסינות miRNA הבעה בתגובה אתגרים סביבתיים 6. ב פרוטוקול זה, אנו משתמשים באוזון חשיפה, המהווה מרכיב עיקרי של זיהום אוויר, לזירוז צורה של דלקת ריאות בעכברים הנשית המתרחשת בהעדר חסינות מסתגלת. באמצעות אוזון, אנחנו נמצאים גרימת הפיתוח של hyperresponsiveness דרכי הנשימה המשויך נזק תאי אפיתל דרכי הנשימה, עלייה נויטרופילים, מתווכים דלקתיים ב איירווייז proximal7. כיום, ישנם לא פרוטוקולים היטב תיאר לאפיין ולנתח miRNAs מעבר ייחום בעכברים החשופים האוזון.
להלן, אנו מתארים שיטה פשוטה כדי לזהות ייחום שלבים וביטוי miRNA ברקמת הריאה של עכברים הנשי נחשפים האוזון. אנו הכתובת גם גישות ביואינפורמטיקה יעיל זיהוי גילוי של היעד miRNA, עם דגש על ביולוגיה חישובית. אנחנו מנתחים את הנתונים microarray באמצעות limma, יש תוכנה R/Bioconductor אשר מספק פתרון משולב עבור ניתוח נתונים ניסויים של ביטוי גנים8. ניתוח של נתונים מערך ה-PCR limma יש יתרון מבחינת צריכת חשמל על הליכים לפי מבחן t כאשר באמצעות מספר קטן של מערכים/דוגמאות כדי להשוות את הביטוי. כדי להבין את ההקשר הביולוגי של תוצאות הביטוי miRNA, אז השתמשנו בתוכנה אנליזה פונקציונלית. על מנת להבין את מנגנוני ויסות שינויים תעתיק לחזות תוצאות סביר, התוכנה משלב miRNA-ביטוי datasets וידע הספרות9. זהו יתרון בהשוואה עם התוכנה פשוט תחפש העשרה סטטיסטי ב חופפים סטים של miRNAs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של פן סטייט.
1. הערכה של השלב ייחום
- כמו שצריך לרסן נקבה העכבר C57BL/6 (בן 8 – 9 שבועות) באמצעות העכבר ביד אחת איפוק בטכניקה המתוארת et al. Machholz10.
- למלא את פיפטה פלסטיק סטרילית עם 10 μL של מים אולטרא טהורים.
- להציג את קצה פיפטה פלסטיק לתוך הנרתיק.
- לשטוף בעדינות את הנוזל 4 – 5 פעמים כדי לאסוף את הדגימה.
- מקם את הסומק הסופי המכיל נוזל הנרתיק על משטח זכוכית.
- לבחון את הסומק הנרתיק מוכתם תחת מיקרוסקופ אור עם יעד 20 x.
הערה: בעלי חיים שאינם מציגים מחזורים סדירים עקב pseudopregnancy או סיבות אחרות צריך להיות נכללו בניסוי. מומלץ לבצע הפרשות מהנרתיק מדי יום לפחות שלושה מחזורים רצופים לאשר לאחר תקופת היובש.
2. חשיפה אוזון
- מקום מקסימלית של עכברים 4 שני מיכלי זכוכית 1.2 L עם חוט רשת שינוי העפעפיים, ומים ad libitum.
- הכניסו אחד מיכל הזכוכית החדר האוזון והשני בבית הבליעה חשיפה אוויר מסונן.
- התאם את ריכוז האוזון רמות האוזון 2 ppm ולפקח באופן קבוע.
הערה: המנגנון האוזון מספק של זרימת האוויר מווסתת (> 30 אוויר שינויים/h) עם מבוקר טמפרטורה (25 ° C), לחות יחסית (50%). המערכת יוצרת האוזון על ידי פריקה חשמל ozonizer, אשר תחת פיקוח, נשלט על-ידי מנתח של האוזון סגול ובקרי זרימת מסה, כפי שתואר לעיל11. - הסר את מיכלי זכוכית לאחר 3 שעות של חשיפה אוויר מסונן/אוזון. להחזיר לבעלי חיים בכלוב עם מצעי מיטה, מזון ומים ad libitum.
3. ריאות אוסף
- 4 שעות לאחר החשיפה, עזים ומתנגד חיות עם זריקה בקרום הבטן של קטמין/חריגות השירותים הווטרינריים קוקטייל (90 מ"ג/ק"ג קטמין, חריגות השירותים הווטרינריים 10 מ"ג/ק"ג).
הערה: כדי לוודא רמה נאותה של הרדמה, בדוק העכבר על הדוושה, לכל הרוחות רפלקס (הבוהן המשרד צביטה) ולהתאים ההרדמה כנדרש. - הרטיבו את העור עכבר עם 70% אתנול.
- עושים חתך קו האמצע 2 ס מ באמצעות מספריים הפעלה של פינצטה כירורגית כדי לחשוף את הווריד הנבוב.
- להקריב עכברים על ידי חיתוך של הנבוב העליון של אבי העורקים. אם יש צורך, מכניס מחט מד 21 G הווריד הנבוב מעל הורידים כליות לאסוף דם לפני דימום למוות. לחלופין, לאסוף דם באמצעות ניקוב הלב בעקבות פרוטוקולים סטנדרטיים.
- השתמש מספריים כירורגיים כדי לפתוח את חלל הבטן ולהסיר את העור/אפר שרירים, ופונה כלפי מעלה הצלעות.
- השתמש מספריים כירורגיים כדי לנקב את הסרעפת.
הערה: הריאות תתמוטט מן הסרעפת. - גזור משם צלעות באמצעות מספריים כירורגיים לחשוף את הלב והריאות.
- באמצעות מלקחיים, קח של mL 1.5 ללא RNase צינור microcentrifuge, לתוכה חנקן נוזלי למלא את הצינורית.
הערה: השתמש משקפי מגן וכפפות מגן כדי להתמודד עם חנקן נוזלי. - להסיר את הריאות, למקם אותם לתוך נטולת RNase microcentrifuge 1.5 mL הצינורות מלאים בחנקן נוזלי snap-הקפאת הרקמה, המתן מספר שניות עד שהנוזל מתאדה.
- סגור את המכסה צינור ולאחסן את הרקמה ב-80 מעלות צלזיוס עד השימוש.
4. רנ א הכנה
- Pulverize כל הריאות באמצעות הכותש מפלדת רקמות.
הערה: מרסס הרקמה צריך להציב בו חנקן נוזלי לפני השימוש. לנקות את מרסס אחרי כל שימוש RNAse פתרון. - לפצל את הריאות השמיד, למקם את 1.5 mL שני צינורות (חצי ריאות כל).
- להוסיף 500 µL של guanidinium thiocyanate למחזור מדגם ולערבב. Homogenize כל דגימה באמצעות 18 גרם, 21 G ו- 23 גרם מחטים, בהתאמה.
הערה: דוגמאות יכול להיות מתובל 5.6 x 108 עותקים של קטן RNA ספייק-in פקד (מזן שונה) לפני שתמשיך עם מיצוי. - להוסיף 500 µL של אתנול כל דגימה של מערבולת 15 s.
- טען התערובת בעמודה ספין אוסף שפופרת, צנטריפוגה ב 12,000 x g עבור מינימלית 1 למחוק את הזרימה דרך.
-
עבור DNase אני טיפול (בעמודה);
- להוסיף 400 µL של RNA שטיפת מאגר, צנטריפוגה x 12,000 g עבור 1 דקות.
- בצינור נטולת RNase, להוסיף 5 µL של DNase ו- 75 µL 1 x DNA עיכול מאגר ומערבבים. להוסיף את התערובת ישירות אל המטריקס עמודה.
- דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
- µL 400 של RNA פתרון prewash להוסיף העמודה ואת צנטריפוגה ב 12,000 x g עבור 1 מינימלית להשליך הזרימה דרך, חזור על שלב זה.
- להוסיף 700 µL RNA שטיפת מאגר לעמודה וזורקים צנטריפוגה ב 12,000 x g עבור 1 מינימלית של הזרימה דרך.
- צנטריפוגה ב x 12,000 g למשך 2 דקות להסיר את מאגר הנותרים. להעביר את העמודה לתוך שפופרת נטול RNase.
- כדי elute RNA, להוסיף µL 35 DNase/RNase ללא מים ישירות אל העמודה מטריקס ואל צנטריפוגה ב 12,000 x g 1.5 דקות.
- למדוד את הריכוז RNA (260 ננומטר) וטוהר באמצעות ספקטרופוטומטרים. בצע את ההוראות כדי לבצע RNA כימות במדגם µL 1.5 aliquot. בלנק הכלי עם מים DNase/RNase ללא משמש • תנאי.
הערה: יחס 260/280 של ~2.0 מקובל בדרך כלל בתור "טהור" עבור ה-RNA. ריכוז ה-RNA אופיינית בדרך כלל נע בין 750 ו- 2,500 ng/µL. - חנות ב-80 מעלות צלזיוס.
5. miRNA פרופיל
-
רטרו-לתמלל RNAs קטנות, השתמש 200 ng של RNA הכולל.
- מכינים את תערובת התגובה הפוכה-תמלול על קרח (הנפח הכולל לפי התגובה הוא 20 µL). עבור כל תגובה, להוסיף 4 µL של 5 x מאגר, 2 µL של 10 x נוקלאוטידים לערבב, 2 µL של רוורס טרנסקריפטאז ו 2 µL של מים נטולי RNase. מערבבים את כל הרכיבים ו aliquot ב 600 µL נטולת RNAse צינורות פלסטיק (10 µL של תערובת לכל תגובה).
הערה: המיקס מאסטר הפוכה-תמלול מכיל את כל הרכיבים הדרושים עבור הראשון-strand cDNA סינתזה מלבד תבנית הרנ א.
הערה: חישוב נפח עודף (10%) בעת הכנת המיקס מאסטר. - להוסיף את תבנית ה-RNA (200 ng ב- 10 µL) על כל שפופרת המכילה תערובת בסיס הפוכה-תמלול. מיקס, צנטריפוגה 15 s ב 1,000 x g, ולאחסן אותם על קרח עד הצבת thermocycler או גוש יבש.
- תקופת דגירה של 60 דקות ב 37 º C.
- תקופת דגירה של 5 דקות ב 95 ° C ומניחים הצינורות על קרח.
- לדלל את cDNA על-ידי הוספת 200 µL של מים נטולי RNase כל תגובה הפוכה-תמלול 20 µL.
- מכינים את תערובת התגובה הפוכה-תמלול על קרח (הנפח הכולל לפי התגובה הוא 20 µL). עבור כל תגובה, להוסיף 4 µL של 5 x מאגר, 2 µL של 10 x נוקלאוטידים לערבב, 2 µL של רוורס טרנסקריפטאז ו 2 µL של מים נטולי RNase. מערבבים את כל הרכיבים ו aliquot ב 600 µL נטולת RNAse צינורות פלסטיק (10 µL של תערובת לכל תגובה).
-
לבצע PCR בזמן אמת באמצעות העכבר תגובה דלקתית, מחלת חיסון עצמי miRNA מערך ה-PCR.
- להכין תערובת התגובה (הנפח הכולל 1100 µL): עבור כל תגובה, להוסיף µL 550 של מיקס מאסטר x PCR 2, µL 110 של 10 x מיקס פריימר אוניברסלי, 340 µL של מים נטולי RNase ו µL 340 של תבנית cDNA (מדולל התגובה מ שלב 5.1.5).
- להוסיף 10 µL של התגובה לערבב כל טוב של miRNA טעון מראש מערך ה-PCR באמצעות של pipettor רב-ערוצי.
- חותם miRNA את מערך ה-PCR צלחת עם סרט דביק אופטי.
- Centrifuge את הצלחת. בשביל 1 דקות ב- 1,000 x g בטמפרטורת החדר כדי להסיר בועות.
- תוכנית הצנטרפוגה בזמן אמת, PCR שלב ההפעלה הראשונית למשך 15 דקות ב 95 מעלות צלזיוס, דנטורציה המכיל אופניים 3-צעד עבור 15 s ב 94 ° C, חישול ב-30 s 55 ° C, ואת סיומת עבור 30 s-70 ° C 40 מחזורי מספר.
הערה: רכיבה על אופניים בצע היצרן תנאים ההוראות כדי להתקין את הצנטרפוגה בזמן אמת. בצע את שלב עקומת דיסוציאציה מובנה בתוכנה הצנטרפוגה בזמן אמת. - לבצע ניתוח נתונים.
6. ניתוח נתונים
- לחלץ ערכים Ct מהתוכנה PCR בזמן אמת עבור כל דגימה לתוך תוכנה לניתוח.
הערה: סי. טי הערך של 34 נחשבת הפסקת. אם הדגימות מכילים ספייק-אין שליטה (למשל, צ'ל-מיר-39), לנרמל Ct ערכים לדקר בשליטה עבור כל דגימה. ערכי הסף ייתכן שיהיה עליך להגדיר ידנית. ערכים של תוכנית בסיסית נקבעות באופן אוטומטי. - לנרמל Ct ערכי ה-Ct הממוצע של פקדים משק miRNA 6: SNORD61, SNORD68, SNORD72, SNORD95, SNORD96A, RNU6-2, באמצעות המשוואה הבאה:
ΔCt = (Ct_Target − Ct_housekeeping) - עבור קיפול לשנות חישובים, לחשב ערכים ΔΔCt באמצעות מדגם ספציפי של הפקד, באמצעות משוואת ביטוי יחסי12:
ביטוי יחסי miRNA:
2-∆∆Ct, לאן - ∆∆Ct =-[מבחן ∆Ct - בקרת ∆Ct]
הערה: שינוי קיפול של 200 נחשבת הפסקת. - ייצוא קיפול לשנות ערכים הביטוי כדי לבצע ניתוח סטטיסטי על R באמצעות חבילת limma Bioconductor8.
- תיקון להשוואות מרובות באמצעות שיטת בנימיני-הוכברג13.
הערה: עותק של קובץ ה-script R הינה זמינה במלון: http://psilveyra.github.io/silveyralab/. Datasets ניתחו נתונים הינם גם זמינים Omnibus ביטוי גנים תחת מספר GSE111667, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE111667.
7. נתוני ניתוח: אנליזה פונקציונלית תוכנה
- לארגן את הנתונים (dataset). כוללים miRNAs עם ביטוי בהתאמה יומן יחסי שלהם ערכי-p. ראה טבלה 1 לעיצוב ערכת נתונים ספציפיים.
- אנליזה פונקציונלית פתוח התוכנה (גירסה 01-10).
- להעלות את ערכת הנתונים באמצעות התבנית הבאה: תבנית הקובץ: "תבנית גמישה", כותרת העמודה מכיל: "כן", בחר סוג מזהה: "miRBase (בוגר)", מערך פלטפורמה המשמשים לניסויים: לבחור את פלטפורמת מערך.
הערה: תבניות קבצים הם. txt (בטאבים קבצי טקסט),. xls (excel קבצים), ו- .diff (קבצי. cuffdiff). - בחרו "תצפיות להסיק", ודא קבוצה ניסיונית תיוג נכון.
- ללכת ערכת נתונים 'סיכום' כדי לתקן את הסכום הכולל של miRNAs והן לא ממופים.
-
לחץ על הכפתור "חדש" בחלק העליון השמאלי של התוכנית. בחר "מסנן היעד MicroRNA חדש" ולהעלות microRNA dataset.
- הגדר מקור: TarBase, תחכום מומחים ממצאים, miRecords.
- להגדיר ביטחון: השפעול שנצפו או גבוהה (חזה).
- בחר "הוסף עמודות" כדי לכלול מגוון רחב של מידע ביולוגי על המטרות כגון מין, מחלות, רקמות, מסלולים ועוד.
- כדי להתמקד במטרות שהשתנו ביטוי בניסוי, בחר "הוסף / להחליף את ה-mRNA הנתונים (dataset)". כדי לאתר מיקרו Rna עם רמות ביטוי זהה או שונה לצפות בקבצים יש להשתמש בתוכנת עריכה התומכת בפורמט "ביטוי זיווג".
הערה: הניתוח מסנן תספק microRNA שמות, סמלים, מטרות ה-mRNA, המקור זה מתאר את היחסים יעד, ואת רמת הביטחון של קשר הגומלין החזוי (איור 2).
- לחץ על "הוסף כדי שלי מסלול" לשלוח את ערכת הנתונים המסוננים בד מסלול ולחקור קשרים ביולוגיים נוספים.
- השתמש מעצב נתיב כדי ליצור מודל פרסום באיכות של תופעות microRNA.
-
אפשרות חלופית היא ליצור ניתוח הליבה.
- עבור סוג ניתוח הליבה, בחר "ביטוי ניתוח".
- עבור סוג מדידה, בחר "Expr יומן יחס".
- ניתוח מסנן תקציר: לשקול רק מולקולות ו/או מערכות יחסים בו: (מינים = עכבר) AND (ביטחון = השפעול שנצפו) AND (מקורות נתונים = "תחכום מומחה ממצאים", "ההמצאה ExpertAssist ממצאים", "miRecords", "TarBase", או " TargetScan האדם").
- בחר על קיצוץ של ערך-p = 0.05.
- הפעל את הניתוח.
הערה: הדיווח יכלול: מסלולים הקנוני, הניתוח ווסתי במעלה הזרם, מחלות ופונקציות, הרגולטור אפקטים, רשתות, מולקולות ועוד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
סוגי תאים שונים שנצפתה מריחות משמשים לזיהוי השלב ייחום העכבר (איור 1). אלו מזוהים על ידי תא מורפולוגיה. במהלך proestrus, תאים הם באופן כמעט בלעדי אשכולות של צורת עגול, בנוי היטב nucleated לתאי האפיתל (איור 1 א'). כאשר העכבר נמצא בשלב ייחום, תאים הם cornified לתאי האפיתל הקשקש, נוכח בצפיפות אשכולות (איור 1B). במהלך metestrus, תאי אפיתל cornified ואת אורך חייהם נראים (איור 1C). ב diestrus, לויקוציטים (כדוריות קטנות) הם בדרך כלל נפוץ יותר (איור 1D).
אנחנו מופק RNA ארבע הריאות העכבר בעקבות פרוטוקול שתואר קודם לכן. ריכוזי חומצת גרעין (ng / µL) נע בין 1197.9 ל- 2178.1 עם ממוצע של 1583.1 ± 215 (טבלה 1). ממוצע A260/A280 יחס נע מ 2.010 כדי 2.020 עם ממוצע של 2.016 ± 0.002. מצד שני, היחס A260/A230 נצפתה oscillated בין 2.139 לבין 2.223 עם ממוצע של 2.179 ± 0.018.
בטבלה 2 מראה תוצאות ביטוי דיפרנציאלי שהושג עם limma -R. אנחנו מחושב העליון miRNAs ביטוי באופן שונה בין עכברים נחשפים האוזון או סינון אוויר proestrus (באמצעות toptable את הפקודה)14. העמודה הראשונה נותן את הערך של השינוי מקפלים קיפול log2 בביטוי miRNA בין אוזון וחיות אוויר מסונן חשוף. ה-t עמודה מייצגת את t-סטטיסטיקת מתון לחשב עבור כל miRNA להשוואה. עמודות p.value adj.p.value מייצגים p-הערכים המשויכים עבור כל השוואה לפני ואחרי ההתאמה בדיקות מרובות, בהתאמה. התאמת להשוואות מרובות נעשה בשיטה בנימיני, של הוכברג כדי לקבוע את שיעור הגילוי שווא15. עמודה B מייצג היומן-הסיכויים זה miRNA באופן שונה הביע8.
ביצענו את miRNA היעד מסנן הליבה וניתוח הכולל ניתוח נתיב העשרה. לאחר העלאת רשימת 14 miRNAswith היחס יומן ביטוי משמעותי בעלת ערך-p, כולן היו ממופה באמצעות מסנן היעד miRNA (טבלה 3). התוצאות היו מסונן, מיון כדי להגיע מסלולים מסוימים, במקרה זה "הסלולר התגובה החיסונית". הניתוח הליבה סיפק מידע על מסלולים הקנוני, מחלות, פונקציה, הרגולטורים, רשתות (טבלה 4). התוכנה אנליזה פונקציונלית הפיק ניתוח רשת המציג את הקשר בין miRNAs את עניין מולקולות אחרות (איור 3).
איור 1: זיהוי של ייחום שלבים. (א) Proestrus (תאי אפיתל nucleated בעיקר); ייחום (B) (בעיקר anucleated cornified תאים); (ג) metestrus (שלושת סוגי תאים); diestrus (ד) 2 (רוב לויקוציטים). סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. הגדלה = 20 x. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: אנליזה פונקציונלית התוכנה נציג תוצאות: מסנן היעד miRNA. פרופיל מקיף של miRNAs בשלבים שונים של ייחום. לאחר ביצוע סינון miRNA, התוכנה מספקת רשימת גנים ותרכובות מעורבים ב מחלות פנוטיפים אחרים, אשר יכול להיות סינון ומיון כדי להגיע מסלולים מסוימים, במקרה זה "התגובה החיסונית סלולרי". אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: תוצאות נציג של תוכנות אנליזה פונקציונלית: רשתות. השוואה של רשתות מושפע על ידי חשיפה אוויר או האוזון מסוננים אצל נקבות בשלבים שונים של ייחום. דיאגרמה של רשתות ביולוגיות המשויך miRNAs בריאות של עכברים הנשי נחשפים אוויר מסונן לעומת האוזון proestrus (א) או שלבים הלא-proestrus (B). דמות זו שונתה פואנטס et al.6. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| מזהה | חומצת גרעין (ng/µL) | A260/A280 | A260/A230 |
| דוגמה 1 | 1197.930 | 2.015 | 2.192 |
| דוגמה 2 | 1355.703 | 2.018 | 2.223 |
| דוגמה 3 | 2178.104 | 2.020 | 2.163 |
| דוגמה 4 | 1600.837 | 2.010 | 2.139 |
| ממוצע | 1583.144 ± 215 | 2.016 ± 0.002 | 2.179 ± 0.018 |
טבלה 1: דוגמה של RNA ריכוזים, ספיגת יחס-260, 230 ו- 280 nm של רקמת הריאה מטוהרים דגימות ארבעה עכברים. הריכוזים נמדדו עם ספקטרופוטומטרים.
| logFC | t | P.Value | שם תואר. P.Val | B | |
| יחידת ניהול זיכרון-מיר-694 | 1.492 | 4.071 | 0.000153 | 0.009514 | 0.759 |
| יחידת ניהול זיכרון-מיר-9-5 p | 0.836 | 3.916 | 0.000254 | 0.009514 | 0.289 |
| יחידת ניהול זיכרון-מיר-221-3 p | 0.385 | 3.106 | 0.003014 | 0.075361 | -1.982 |
| יחידת ניהול זיכרון-מיר - 181d - 5p | 0.597 | 2.891 | 0.005516 | 0.103424 | -2.526 |
| יחידת ניהול זיכרון-מיר-98-5 p | 0.558 | 2.699 | 0.009243 | 0.138649 | -2.987 |
| יחידת ניהול זיכרון-מיר-712-5 p | 0.667 | 2.563 | 0.013169 | 0.164609 | -3.299 |
| יחידת ניהול זיכרון-מיר-106a - 5p | -0.528 | -2.412 | 0.019278 | 0.206547 | -3.632 |
בטבלה 2: Limma ניתוח תוצאות עבור miRNAs ביטוי באופן שונה אצל נקבות שנחשפו אוזון לעומת . סינון אוויר בשלב proestrus.
| מזהה miRNAs | תצפית 1 | תצפית 1 | תצפית 2 | תצפית 2 |
| יחס Expr יומן | ערך P | יחס Expr יומן | ערך P | |
| יחידת ניהול זיכרון-מיר-694 | 1.492 | 0.000153 | 0.543319208 | 0.0021385 |
| יחידת ניהול זיכרון-מיר-9-5 p | 0.836 | 0.000254 | 0.677595421 | 0.004997439 |
| יחידת ניהול זיכרון-מיר-221-3 p | 0.385 | 0.003014 | ||
| יחידת ניהול זיכרון-מיר - 181d - 5p | 0.597 | 0.005516 | 0.342276659 | 0.106467657 |
| יחידת ניהול זיכרון-מיר-98-5 p | 0.558 | 0.009243 | 0.455392799 | 0.034724699 |
| יחידת ניהול זיכרון-מיר-712-5 p | 0.667 | 0.013169 | ||
| יחידת ניהול זיכרון-מיר-106a - 5p | -0.528 | 0.019278 |
טבלה 3: תבנית הדוגמה להעלאה התבוננות רב של נתונים (datasets) לתוכנות אנליזה פונקציונלית. ביטויים דיפרנציאלית ניסיוני מרובים ניתן לקבץ לגיליון בודד, נטען, תצפיות רבות לפי הצורך ניתן להוסיף. עמודות: 1) miRNAs מזהה; 2) תצפית 1: יומן Expr יחס; 3) תצפית 1: ערך P; 4) תצפית 2: יומן Expr יחס; 5) תצפית 2: ערך P.
| Non-proestrus | Proestrus | ||||
| א גנים ממוקד על ידי באופן שונה הביע miRNAs | |||||
| CAMK2N1 | PAFAH1B2 | SEC23A | ABCB9 | FGD4 | SLC25A27 |
| מכוניות | PDE4B | SNX5 | APOO | FRMD4B | SLC38A1 |
| CYP24A1 | PDE7A | SYT4 | ARHGEF38 | GPR137B | TMCC1 |
| DBF4 | PGM3 | THAP12 | מערבה... | HMBS | TRIM71 |
| HMGN2 | PNP | TMED7 | CASP3 | METAP1 | XKR8 |
| KMT5A | REV1 | TNFAIP2 | CCNJ | MITF | ZCCHC11 |
| LRRC17 | RPS19BP1 | TNFRSF10C | CMTR2 | MYC | ZIM3 |
| MDH2 | RRAD | TP53 | CNMD | RGMB | ZNF181 |
| MIS18A | SEC62 | UBE2V2 | DSCR8 | SLC14A1 | |
| ZNF420 | |||||
| B. הבדלים biofunctions ומחלות העליון | |||||
| מחלות והפרעות | ערך P | מחלות והפרעות | ערך P | ||
| מחלה דלקתית | 3.84E-02 - 3.84E-05 | פגיעה organismal, ליקויים | 4.96E-02 - 2.77E-14 | ||
| תגובה דלקתית | 3.84E-02 - 3.84E-05 | מחלות מערכת הרבייה | 2.15E-02 - 2.77E-14 | ||
| פגיעה organismal, ליקויים | 4.17E-02 - 4.17E-05 | סרטן | 4.96E-02 - 1.27E-10 | ||
| ג העליון פונקציות מולקולרית, תאית | |||||
| פונקציות מולקולרית, תאית | P ערך | פונקציות מולקולרית, תאית | P ערך | ||
| פיתוח סלולר | 2.05E-02 - 5.26E-07 | התנועה הסלולרית | 3.77E-02 - 4.47E-07 | ||
| פשרה הסלולר | 3.75E-04 - 3.75E-04 | מוות תאי והישרדות | 4.91E-02 - 5.61E-06 | ||
| מחזור התא | 2.62E-03 - 2.62E-03 | פיתוח סלולר | 4.97E-02 - 1.38E-06 | ||
| ד המובילים בפיתוח מערכת פיזיולוגית ותפקוד | |||||
| התפתחות ותפקוד | P ערך | התפתחות ותפקוד | P ערך | ||
| פיתוח organismal | 4.17E-02 - 1.31E-03 | התפתחות עוברית | 3.30E-02 - 2.12E-05 | ||
| התפתחות עוברית | 1.29E-02 - 1.29E-02 | התפתחות רקמת חיבור ותפקוד | 1.79E-02 - 6.10E-05 | ||
| התפתחות רקמת חיבור ותפקוד | 1.93E-02 - 1.93E-02 | מורפולוגיה של רקמות | 7.88E-05 - 7.88E-05 | ||
| אי העליון הקשורים פונקציות רשת | |||||
| הקשורים פונקציות רשת | הציון | הקשורים פונקציות רשת | הציון | ||
| פיתוח סלולר, מחלה דלקתית, תגובה דלקתית | פגיעה organismal וסרטן מומים, מחלות מערכת הרבייה, | ||||
| 6 | 19 | ||||
בטבלה 4: אנליזה פונקציונלית תוכנה סיכום של נקבות נחשפים האוזון בשאינם-proestrus לעומת proestrus בשלבים. אנליזה פונקציונלית התוכנה מאפשרת הניתוח של מסלולים הקנוני העליון, הרגולטורים במעלה הזרם, מחלות & פונקציות, פונקציות העליון, הרגולטור אפקט רשתות ועוד. טבלה זו שונתה פואנטס et al.6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרופיל MicroRNA היא טכניקה יתרון לאבחון המחלה והן מכניסטית מחקר. כתב יד זה, הגדרנו פרוטוקול להעריך את הביטוי של miRNAs זה הם חזו להסדיר גנים דלקתיים בריאות של עכברים הנשי נחשפים האוזון בשלבים שונים ייחום. שיטות לקביעת ייחום, כגון שיטת זיהוי חזותי, כבר מתואר16. עם זאת, אלה מסתמכים על מדידות חד פעמי, ולכן לא אמינים. כדי לזהות במדויק בכל שלבי ייחום הנקבות זה מחזור באופן קבוע, מומלץ השיטה המתוארת כאן. בנוסף, פרוטוקול פשוט זה יכול לשמש גם כדי להעריך באופן עקיף יומי תנודות הורמונליות בעכברים. כדי למנוע הפעלה של תגובות דלקתיות לא רצויות עקב גירוי נרתיקי, דגימה צריך להתבצע רק פעם אחת ביום. בגלל השתנות אורך מחזור, השפעות דיור, חשוב לבצע את הפרוטוקול שלושה מחזורים מלאה לפני השימוש בבעלי חיים בניסוי בהתחשב השלב במחזור.
על החילוץ מוצלחת של RNA של רקמת הריאה, שגרת מדויק הוא קריטי. פרוטוקול זה מתאר שיטה יום אחד כדי לבודד RNA של רקמת הריאה המניבה RNA באיכות גבוהה. שינויים בפרוטוקול של היצרן נדרשו ביעילות לחלץ RNA מהריאות. הוספנו שלב צנטריפוגה נוספים לאחר תוספת של המאגר לשטוף כדי להסיר כמה שיותר מאגר ככל האפשר. אנחנו גם eluted RNA עם µL 35 DNase/RNase ללא מים, צריך שתוציאו את העמודה עבור 1.5 דקות להבטיח רמות ריכוז גבוה. מצלמות-דיגיטליות תוצאות אישר את האפקטיביות של פרוטוקול החילוץ שלנו ה-RNA. היחס של ספיגת-260 ו 280 ננומטר (יחס A260/280) משמש לעתים קרובות כדי להעריך את הטוהר של RNA ההכנות. ספיגת המרבי עבור חומצות גרעין הוא 260 ו 280 ננומטר, בהתאמה. זה מקובל "טהור" כמו של RNA אם היחס הוא 2.0 כ17. כמו כן, עבור היחס ספיגת זיהום A260/A230, הערכים טוהר הם בטווח של 2.0 – 2.218. במחקר זה, היחסים A260/A280 ו- A260/A230 הממוצע שנצפו היו ± ± 0.002 ו 2.179 2.016 0.018, בהתאמה (טבלה 1). לכן, פרוטוקול החילוץ שלנו RNA היה מוצלח. יתרון נוסף של פרוטוקול המשמש הוא התוספת של הטיפול DNAse. זה חשוב למנוע זיהום הדנ א19. מגבלה של פרוטוקול זה בידוד ה-RNA הוא השימוש של עמודות טיהור להשליך פסולת באמצעות משקעים באמצעות אלכוהול כי יש שרידים ריאות עלול להכשיל את הקרום חלקית או לחלוטין, וכתוצאה מכך תשואות נמוכות. גם אם הצעד המגון לא מתבצעת בזהירות, כמויות גדולות של הריאה RNA ניתן בקלות לאיבוד או השפיל. אם התשואות RNA נמוכים מתקבלים, RNA יכול להיות מטוהר מחדש, eluted באמצעי אחסון קטן יותר. לחלופין, RNA יכול להיות זירז לילה הבאים שפורסמו פרוטוקולים20.
טכנולוגיות Microarray המוחל miRNA פרופיל הם כלים המבטיחים בתחומי מחקר רבים. במחקר שלנו, השתמשנו PCR מערכים, המספקים את היתרון של סף גילוי גבוה יותר, ואסטרטגיות נורמליזציה גילוי של miRNAs ביטוי באופן שונה לעומת טכנולוגיות אחרות כגון miRNA המבוסס על בדיקה מערכים21. מגבלה של פרוטוקול זה הוא כי הוא דורש סכום מינימלי של החל חומר RNA, ואת הזמינות של קבוצות ספציפיות של צבעי יסוד miRNAs עניין, לעומת טכניקות טיפול נוספות זמינות RNAseq. יתרון נוסף של מערכים מבוססי ה-PCR היא האפשרות של שימוש גנים התייחסות הלא-miRNA עבור qPCR נורמליזציה (כגון קטן RNAs nucleolar או SNORDs) כדי לחשב ביטוי דיפרנציאלי miRNAs. לבסוף, השימוש PCR במערכים מספק מספר אפשרויות עבור ניתוח נתונים, החל כלים מקוונים הניתנים על ידי היצרנים, לשיטות קונבנציונליות כדי לזהות ביטוי דיפרנציאלי למרות PCR בזמן אמת. ניתוח סטטיסטי עם limma נוח עבור מיקרו-מערכים והן מערכים מבוססי ה-PCR ומשתמש אמפירי Bayes מונחית f- statisitcs22. כאן, אנו מראים כי הן p- וערכי q-(מותאם עבור בדיקות מרובות) ניתן להשיג עם toptable הפקודה התאמת הסף שיעור גילוי שקר, זיהוי באופן שונה הביע miRNAs.
אנליזה פונקציונלית תוכנה הוא יישום מבוסס-אינטרנט עבור ניתוח נתונים בהקשר מסלול. התוכנה נותנת חוקרים יכולות חיפוש רב עוצמה שיכול לעזור ערכות נתונים מסגרת או מטרות ספציפיות בהקשר, בתוך תמונה גדולה יותר חשיבות ביולוגית. אמנם סביבת תוכנה גמישה לסוגים שונים של ניתוח (קרי, גליקומיקס, SNPs פרוטאומיקס, microRNA, טוקסיקולוגיה, וכו '), מטרתנו כאן היא כדי להדגיש היבטים של ניתוח miRNA. לאחר העלאת רשימת miRNAs 14 עם ביטוי משמעותי יומן-יחסי ו p-ערכים, כל מופו על ידי התוכנה. ביצענו miRNA היעד מסנן וממשקי הניתוח, כולל ניתוח נתיב העשרה. עם זאת, ניתוח כזה שקול גנים אשר miRNAs 14 הם חזו את המטרה, לא את miRNAs עצמם. המקטע תוצאות רשימות פלטים כגון: מסלולים הקנוני, מחלות, פונקציה, גנים ממוקד על ידי miRNAs ביטוי באופן שונה, פיתוח מערכות פיזיולוגיות, הרגולטורים ורשתות (טבלה 4). הפריט החזותי מסלול מוצג תחת הכרטיסייה רשת, שבו מוצגים miRNAs ומולקולות כצמתים לחיץ המקושרות עם מידע קשור הגן עניין (איור 3). יתרון של התוכנה אנליזה פונקציונלית היא ממצאים הקשורים miRNA באיכות גבוהה, כולל אינטראקציות השפעול המאומת והן החזוי. אנליזה פונקציונלית תוכנת מסדי הנתונים כוללים: microRNA השפעול המאומת-mRNA אינטראקציות מסדי נתונים23,24, microRNA החזוי-mRNA מסד אינטראקציה עם אינטראקציות נמוך-ביטחון נשלל (למשל, יעד סריקה)25האדם השפעול מאומתים, עכברוש, ואת העכבר microRNA-mRNA אינטראקציות מסדי נתונים (לדוגמה, miRecords)26, הממצאים בספרות (למשל, הקשורות microRNA ממצאים באופן ידני מספר פעמים מן הספרות שפורסמו על ידי מומחים מדעיים). מחקרים אחרים להשוות את יעילות ושימושיות של ושפור לנתח מסלולים הקשורים miRNA ביטוי לאשר את האפקטיביות של תוכנה זו27. באופן כללי, חישובית שיטות חסכונית, פחות זמן רב, הניתנים לאימות בקלות על ידי שיטות מולקולריות. עם צמיחה מתמדת, הצטברות של נתונים הביו-רפואית, ביואינפורמטיקה שיטות יהפכו יותר ויותר חזק על גילוי בתיווך miRNA מנגנונים של תהליכים ביולוגיים ומחלות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי יש להם אין אינטרסים מתחרים.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי מענקים NIH K01HL133520 (PS) ו K12HD055882 (PS). המחברים מודים ד ר ג'ואנה Floros על הסיוע עם האוזון חשיפה ניסויים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | 000664 | 8 weeks old |
| UltraPure Water | Thermo Fisher Scientific | 10813012 | |
| Sterile plastic pipette | Fisher Scientific | 13-711-25 | Capacity: 1.7 mL |
| Frosted Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 2951TS | |
| Light microscope | Microscope World | MW3-H5 | 10x and 20x objective |
| Ketathesia- Ketamine HCl Injection USP | Henry Schein Animal Health | 55853 | 90 mg/kg. Controlled drug. |
| Xylazine Sterile Solution | Lloyd Laboratories | 139-236 | 10 mg/kg. Controlled Drug. |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | Dilute to 70% ethanol with water. |
| 21 G gauge needle | BD Biosciences | 305165 | |
| Syringe | Fisher Scientific | 329654 | 1 mL |
| Operating Scissors | World Precision Instruments | 501221, 504613 | 14 cm, Sharp/Blunt, Curved and 9 cm, Straight, Fine Sharp Tip |
| Tweezer Kit | World Precision Instruments | 504616 | |
| Spectrum Bessman Tissue Pulverizers | Fisher Scientific | 08-418-1 | Capacity: 10 to 50 mg |
| RNase-free Microfuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | AM12400 | 1.5 mL |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| Direct-zol RNA MiniPrep Plus | Zymo Research | R2071 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | |
| Mouse Inflammatory Response & Autoimmunity miRNA PCR Array | Qiagen | MIMM-105Z | |
| Thin-walled, DNase-free, RNase-free PCR tubes | Thermo Fisher Scientific | AM12225 | for 20 μL reactions |
| miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control | Qiagen | 219610 | |
| Microsoft Excel | Microsoft Corporation | https://office.microsoft.com/excel/ | |
| Ingenuity Pathway Analysis | Qiagen | https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/ | |
| R Software | The R Foundation | https://www.r-project.org/ | |
| Thermal cycler or chilling/heating block | General Lab Supplier | ||
| Microcentrifuge | General Lab Supplier | ||
| Real-time PCR cycler | General Lab Supplier | ||
| Multichannel pipettor | General Lab Supplier | ||
| RNA wash buffer | Zymo Research | R1003-3-48 | 48 mL |
| DNA digestion buffer | Zymo Research | E1010-1-4 | 4 mL |
| RNA pre-wash buffer | Zymo Research | R1020-2-25 | 25 mL |
| Ultraviolet ozone analyzer | Teledyne API | Model T400 | http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400 |
| Mass flow controllers | Sierra Instruments Inc | Flobox 951/954 | http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html |
References
- Rebane, A., Akdis, C. A. MicroRNAs: Essential players in the regulation of inflammation. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (1), 15-26 (2013).
- Cannell, I. G., Kong, Y. W., Bushell, M. How do microRNAs regulate gene expression? Biochemical Society Transactions. 36 (Pt 6), 1224-1231 (2008).
- Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nature Reviews Genetics. 13 (5), 358-369 (2012).
- Mi, S., Zhang, J., Zhang, W., Huang, R. S. Circulating microRNAs as biomarkers for inflammatory diseases. Microrna. 2 (1), 63-71 (2013).
- Sessa, R., Hata, A. Role of microRNAs in lung development and pulmonary diseases. Pulmonary Circulation. 3 (2), 315-328 (2013).
- Fuentes, N., Roy, A., Mishra, V., Cabello, N., Silveyra, P. Sex-specific microRNA expression networks in an acute mouse model of ozone-induced lung inflammation. Biology of Sex Differences. 9 (1), 18 (2018).
- Aris, R. M., et al. Ozone-induced airway inflammation in human subjects as determined by airway lavage and biopsy. American Review of Respiratory Disease. 148 (5), 1363-1372 (1993).
- Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Research. 43 (7), e47 (2015).
- Krämer, A., Green, J., Pollard, J., Tugendreich, S. Causal analysis approaches in Ingenuity Pathway Analysis. Bioinformatics. 30 (4), 523-530 (2014).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).
- Umstead, T. M., Phelps, D. S., Wang, G., Floros, J., Tarkington, B. K. In vitro exposure of proteins to ozone. Toxicology Mechanisms and Methods. 12 (1), 1-16 (2002).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Phipson, B., Lee, S., Majewski, I. J., Alexander, W. S., Smyth, G. K. Robust hyperparameter estimation protects against hypervariable genes and improves power to detect differential expression. Annals of Applied Statistics. 10 (2), 946-963 (2016).
- Smyth, G. K., et al. Linear Models for Microarray and RNA-Seq Data User's Guide. Bioconductor. , (2002).
- Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing. Journal of the Royal Statistical Society. Series B (Methodological). 57 (1), 289-300 (1995).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. Public Library of Science ONE. 7 (4), e35538 (2012).
- Alves, M. G., et al. Comparison of RNA Extraction Methods for Molecular Analysis of Oral Cytology. Acta Stomatologica Croatica. 50 (2), 108-115 (2016).
- Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity. Biotechniques. 22 (3), 478-481 (1997).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
- Walker, S. E., Lorsch, J.
- Git, A., et al. Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression. RNA. 16 (5), 991-1006 (2010).
- Smyth, G. K. Limma: linear models for microarray data. Bioinformatics and Computational Biology Solutions Using R and Bioconductor. , 397-420 (2005).
- Griffiths-Jones, S. miRBase: the microRNA sequence database. Methods Mol Biol. 342, 129-138 (2006).
- Sethupathy, P., Corda, B., Hatzigeorgiou, A. TarBase: A comprehensive database of experimentally supported animal microRNA targets. RNA. 12 (2), 192-197 (2006).
- Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs. eLife. 4, e05005 (2015).
- Xiao, F., Zuo, Z., Cai, G., Kang, S., Gao, X., Li, T. miRecords: an integrated resource for microRNA-target interactions. Nucleic Acids Res. 37, D105-D110 (2009).
- Mullany, L. E., Wolff, R. K., Slattery, M. L. Effectiveness and Usability of Bioinformatics Tools to Analyze Pathways Associated with miRNA Expression. Cancer Informatics. 14, 121-130 (2015).
