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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

在暴露于臭氧的小鼠的弹性周期中的肺微 rna 分析

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58664
Automatic Translation
1, 1,2
1Pulmonary, Immunology and Physiology Laboratory, Department of Pediatrics, Pennsylvania State University College of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Pennsylvania State University College of Medicine

Summary

在这里, 我们描述了一种方法来评估肺部表达 mirna, 预测调节炎症基因使用小鼠暴露在臭氧或过滤空气在不同阶段的雌周期。

Abstract

微 rna (mirna) 分析已成为研究人员对生物学和医学研究领域的兴趣。目前的研究表明, 在肺部疾病的诊断和护理中使用 mirna 是一个有希望的前景。在这里, 我们定义了一个 mirna 分析的协议, 以测量一组 mirna 的相对丰度, 预测从一个臭氧引起的气道炎症小鼠模型调节肺组织中的炎症基因。因为已经证明, 循环性激素水平会影响女性肺先天免疫的调节, 这种方法的目的是描述在雌性小鼠体内的炎症性 mirna 特征分析协议, 同时考虑到发情周期在臭氧暴露时, 每种动物的阶段。我们还讨论了适用于 mirna 发现的生物信息学方法, 并使用limma、r/bit导体软件和功能分析软件进行目标识别, 以了解与之相关的生物背景和途径。差异 mirna 表达。

Introduction

微 rna (mirna) 是短的 (19 到25个核苷酸), 自然存在的, 非编码 rna 分子。mirna 的序列在物种间是进化守变的, 这表明 mirna 在调节生理功能方面的重要性1。微 rna 表达谱已被证明有助于识别在调节各种过程中非常重要的 mirna, 包括免疫反应、细胞分化、发育过程和凋亡2。最近, mirna 因其在疾病诊断和治疗中的潜在用途而被认为是公认的。对于研究基因调控机制的研究人员来说, 测量 mirna 表达可以启发系统级调控过程模型, 特别是当 mirna 信息与 mrna 特征分析和其他基因组规模数据合并时3。另一方面, mirna 在一系列标本类型中也被证明比 mirna 更稳定, 并且也比蛋白质4具有更大的灵敏度。这引起了人们对 mirna 作为包括肺部疾病在内的各种分子诊断应用的生物标志物的开发的极大兴趣。

在肺中, mirna 在发育过程中起着重要作用, 维持稳态。此外, 它们的异常表达与各种肺病的发展和进展有关5。空气污染引起的炎症性肺病在女性中表现出更大的严重程度和更差的预后, 这表明激素和雌激素循环可以调节肺先天免疫和 mirna 的表达, 以应对环境挑战6. 在本议定书中, 我们利用臭氧接触----空气污染的一个主要组成部分----在没有适应性免疫力的情况下, 在雌性小鼠中诱发某种形式的肺部炎症。通过使用臭氧, 我们正在诱导气道高反应性的发展, 这与气道上皮细胞损伤和增加中性粒细胞和炎症介质在近端气道 7.目前, 还没有描述良好的协议来描述和分析整个有光泽的周期的 mirna 暴露在臭氧暴露的小鼠。

下面, 我们描述了一个简单的方法来识别有偏离周期阶段和 mirna 表达的女性小鼠的肺组织暴露臭氧。我们还讨论了 mirna 发现和目标识别的有效生物信息学方法, 重点是计算生物学。我们使用limma分析微阵列数据, limma 是一个 r/bicom导体软件, 它为分析基因表达实验8中的数据提供了一个集成的解决方案.在使用少量 arrays2 样本比较表达时, 对limma pcr 阵列数据的分析在功率优于基于 t 检验的程序方面具有优势。为了理解 mirna 表达结果的生物学背景, 我们使用了功能分析软件。为了了解调节转录变化的机制并预测可能的结果, 该软件结合了 mirna 表达集和文献9中的知识。与只在与 mirna 集合重叠的情况下寻求统计丰富的软件相比, 这是一个优势。

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Protocol

这里描述的所有方法都得到了宾州立大学动物护理和使用机构委员会 (iacuc) 的批准。

1. 对激烈循环阶段的评估

  1. 使用 machholz 等人描述的单手小鼠约束技术, 适当约束雌性 c57bl6 小鼠 (8-9周大).
  2. 用10μl 的超纯水填充无菌塑料移液器。
  3. 将塑料移液器的尖端引入阴道。
  4. 轻轻冲洗液体4-5 以收集样品。
  5. 将含有阴道液的最后冲洗放在玻璃滑梯上。
  6. 观察未染色的阴道冲洗在光显微镜下与20x 的目标。
    请注意:由于伪随机或其他原因而不显示正常周期的动物需要排除在实验之外。建议每天进行阴道分泌物至少连续三个周期, 以确认环度。

2. 接触臭氧

  1. 将最多4只小鼠放入两个 1.2 l 玻璃容器中, 容器配有金属网盖和水。
  2. 将一个玻璃容器放在臭氧室中, 另一个放在过滤后的空气暴露室中。
  3. 将臭氧浓度调整为 2 ppm, 并定期监测臭氧水平。
    请注意:臭氧装置提供调节气流 (和 gt;30 空气变化), 可控制温度 (25°c) 和相对湿度 (50%)。如上文所述, 该系统通过放电臭氧发生器产生臭氧, 该臭氧片由紫外线臭氧分析仪和质量流量控制器进行监测和控制。
  4. 在经过3年的空气暴露后取出玻璃容器。将动物送回笼子里, 放上床上用品、食物和水。

3. 肺收集

  1. 接触4小时后, 麻醉动物, 在腹腔内注射酮胺/木糖鸡尾酒 (90 mg/kg 氯胺酮, 10 mg/kg xylazine)。
    请注意:为了确认适当的麻醉水平, 检查鼠标是否有踏板反射 (坚定的脚趾捏), 并根据需要调整麻醉。
  2. 用70% 的乙醇使老鼠皮肤变湿。
  3. 用手术剪刀和手术推拿器做一个2厘米的中线切口, 以暴露静脉。
  4. 通过静脉静脉和主动脉的横断来牺牲小鼠。如果需要, 在肾静脉上方的静脉中插入 21 g 规格针, 以便在失血过多前收集血液。或者, 按照标准协议, 通过心脏穿刺采集血液。
  5. 使用手术剪刀切开腹腔, 切除皮肤上肌肉, 向上移动到肋骨。
  6. 使用手术剪刀刺穿横隔膜。
    请注意:肺会从隔膜上塌陷。
  7. 用手术剪刀切除胸腔, 露出心脏和肺。
  8. 使用钳子, 取一个 1.5 ml 无 rnase 的微离心管, 并将其浸入液氮中, 以填充管。
    请注意:使用护目镜和防护手套处理液氮。
  9. 取出肺部, 将其放入不含 rnase 的微离心机 1.5 ml 管中, 其中装有液氮, 可对组织进行冷冻, 并等待几秒钟, 直到液体蒸发。
  10. 关闭管盖, 并将组织存放在-80°c, 直到使用。

4. rna 制备

  1. 使用不锈钢组织粉碎机使整个肺部粉碎。
    请注意:组织粉碎机在使用前需要放置在液氮中。每次使用 rnase 解决方案后, 请清洁粉碎机。
  2. 将粉碎的肺分裂成两个 1.5 ml 管 (每个半肺)。
  3. 在每个样品管中加入500μl 的硫氰酸酯, 并进行混合。 每个样品分别使用 18 g、21 g 和 23 g 针进行同质化。
    请注意:在进行提取之前, 可以用 5.6 x 10 8份小 rna 尖峰控制 (来自不同物种) 的样本进行激增。
  4. 在每个样品和涡旋中加入500μl 乙醇, 时间为15秒。
  5. 将混合物装入收集管中的旋转柱中, 离心机以 12, 000 x g的速度装载1分钟。
  6. 用于 dnase i 治疗 (列内);
    1. 在 12, 000 x g 处加入 400μl rna 洗涤缓冲液和离心机, 每次1分钟。
    2. 在无 rnase 的试管中, 加入5μl 的 dnase i 和75μl 的 1x dna 消化缓冲液并混合。将混合直接添加到列矩阵中。
    3. 在室温下孵化15分钟。
  7. 在色谱柱和离心机中加入400μl 的 rna 预冲洗液, 以 12, 000 x 克的速度, 持续 1分钟. 丢弃流经并重复此步骤。
  8. 在色谱柱和离心机中加入 700μl rna 洗涤缓冲液, 每次 12, 000 x克, 1分钟。
  9. 离心以 12, 000 x g的速度进行2分钟的离心, 以去除剩余的缓冲液。将柱转移到无 rnase 的管中。
  10. 为了清除 rna, 将35微米的 dnasis\ 无 rnase 水直接添加到色谱柱基质中, 离心机以 12, 000 x克的速度, 以1.5 分钟的速度。
  11. 使用分光光度计测量总 rna 浓度 (260 纳米) 和纯度。按照说明在1.5μl 样本中进行 rna 定量。用用于洗脱的 dnasise/rnase 水将仪器空白。
    请注意:26/280 的 ~ 2.0 比一般被接受为 rna 的 "纯"。典型的 rna 浓度通常在750到 2, 500 ng/μl 之间。
  12. 存放在-80°c。

5. mirna 分析

  1. 要回顾性转录小 rna, 请使用总 rna 的200纳。
    1. 在冰上制备逆转录化反应混合物 (每次反应的总体积为 20μl)。对于每个反应, 加入4μl 的5倍缓冲液、2μl 的10倍核苷酸混合物、2μl 的逆转录酶和2μl 的无 rnase 水。将所有组分和等位物混合在600μl 无 rnain 塑料管中 (每次反应为10μl 的混合)。
      请注意:逆转录酶主组合包含第一链 cdna 合成所需的所有成分, 模板 rna 除外。
      请注意:在准备主混音时计算多余的体积 (10%)。
    2. 在每个含有逆转录化大师混合物的试管中加入模板 rna (200 纳克 (10μl)。在 1, 000 x 克的情况下混合离心器 15秒, 并将其储存在冰上, 直到放置在热囊或干块中。
    3. 在37°c 下孵化60分钟。
    4. 在95°c 下孵化 5分钟, 并将管子放在冰上。
    5. 在每20μl 逆转录酶反应中加入200μl 的无 rnase 水, 稀释 cdna。
  2. 利用小鼠炎症反应和自体免疫 mirna pcr 阵列进行实时 pcr。
    1. 准备反应混合物 (总体积 1100μl): 对于每个反应, 添加550μl 的 2x pcr 主混合, 110μl 的10倍通用底漆混合, 340μl 的无 rnase 水, 和340μl 模板 cdna (从步骤5.1.5 稀释的反应)。
    2. 使用多通道移液器将10μl 的反应混合物添加到预装 mirna pcr 阵列的每一口井中。
    3. 用光学胶粘膜密封 mirna pcr 阵列板。
    4. 在室温下以 1, 000 x克的温度离心板 1分钟, 以去除气泡。
    5. 在95°c 下编程实时循环器, pcr 初始激活步骤 15分钟, 在94°c 下包含变性15秒的3步循环, 在55°c 下退火 30秒, 在70°c 下延长 30秒, 用于40个循环数。
      请注意:按照制造商的循环条件说明设置实时循环器。执行实时循环软件中内置的离解曲线步骤。
    6. 执行数据分析。

6. 数据分析

  1. 从实时 pcr 软件中提取每个样本的 ct 值到分析软件中。
    请注意:ct 值34被视为截止值。如果样本包含尖峰控制 (例如, cel-mir-39), 则将 ct 值归一化到每个样本的控制尖峰。可能需要手动设置阈值。基线值将自动设置。
  2. 将 ct 值归化为 6个 mirna 内部管理控制的平均 ct: snord61、snord68、snord72、snord95、snord96a、rnu6-2, 使用以下公式:
    ct = (ct _ target-ct _ 家政)
  3. 对于折叠变化计算, 使用特定样本作为控件, 使用相对表达式方程12计算 ct 值:
    mirna 的相对表达:
    2-ct, 其中-ct =-[ct 测试-ct 控制]
    请注意:折叠变化200被认为是截止。
  4. 在生物导体8中, 用石灰体包对 r 进行统计分析。
  5. 正确使用 benjamini-hochberg 方法13进行多次比较。
    请注意: r 脚本的副本可在 http://psilveyra.github.io/silveyralab/. 数据集和分析数据也可在 gse111667 号下的基因表达综合。

7. 数据分析: 功能分析软件

  1. 排列数据集。包含带有各自表达式日志比率和 p 值的 mirna。有关特定数据集格式, 请参阅表 1 。
  2. 打开功能分析软件 (版本 01-10)。
  3. 使用以下格式上传数据集: "灵活格式"、包含列标题: "是"、选择标识符类型: "mirbase (成熟)"、用于实验的阵列平台: 选择阵列平台。
    请注意:接受的文件格式是. txt (选项卡分隔的文本文件)、. xls (excel 文件) 和. diff (袖口文件)。
  4. 选择 "输入观察" 并验证实验组标记是否正确。
  5. 转到 "数据集摘要" 以修改映射和未映射的 mirna 的总量。
  6. 点击程序左上角的 "新" 按钮。选择 "新的微 rna 目标筛选器" 并上传微 rna 数据集。
    1. 将来源设置为: tarbase, 创新专家发现, miRecords。
    2. 将置信度设置为: 实验观察或高 (预测)。
    3. 选择 "添加列" 以包括有关目标的各种生物信息, 如物种、疾病、组织、路径等。
    4. 要关注实验中表达式已更改的目标, 请选择 "添加/替换 mrna 数据集"。使用 "表达式配对" 定位具有相同或不同表达级别的微 rna。
      请注意:过滤分析将提供微 rna 名称和符号、mrna 靶标、描述目标关系的源以及预测关系的置信度 (图 2)。
  7. 单击 "添加到我的路径" 将筛选的数据集发送到路径画布, 并探索更多的生物关系。
  8. 使用路径设计器创建微 rna 效果的发布质量模型。
  9. 另一种选择是创建核心分析。
    1. 对于核心分析类型, 选择 "表达式分析"。
    2. 对于测量类型, 请选择 "扩展日志比率"。
    3. 分析筛选器摘要: 仅考虑分子和/或关系, 其中: (物种 = 鼠标) 和 (信心 = 实验观察) 和 (数据源 = "天才专家发现", "inity 专家协助发现", "miRecords 记录", "tarbase", or "targetscan 人 ")。
    4. 选择 p 值 = 0.05 的截止时间。
    5. 运行分析。
      请注意:该报告将包括: 规范途径, 上游调节器分析, 疾病和功能, 调节器效应, 网络, 分子和更多。

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Representative Results

在涂片中观察到的不同细胞类型用于识别小鼠的有嗅觉周期阶段 (图 1)。这些都是通过细胞形态来识别的。在前体过程中, 细胞几乎完全是圆形、形成良好的有核上皮细胞 (图 1a)。当小鼠处于雌激素阶段时, 细胞是有组织的鳞状上皮细胞, 存在于密集的集群中 (图 1 b)。在流星层, 有组织的上皮细胞和多态核白细胞被看到 (图 1c)。在双星中, 白细胞 (小细胞) 通常更为普遍 (图 1d)。

我们按照前面描述的协议从四个老鼠肺部提取 rna。核酸浓度 (ng/μl) 在1971年至21.8.1 之间, 平均为 153.1±215 (表 1)。平均 a260a280 比从2.010 到2.010 波动, 平均为2.016±0.002。另一方面, 观测到的 a260a230 比率在2.139 和2.139 之间振荡, 平均值为2.177±0.018。

表 2显示了用r 上的 limma得到的微分表达式结果。我们计算了暴露在臭氧或暴露在前列腺中的过滤空气中的小鼠之间最大的差异表达 mirna (使用命令可顶部)14。第一列给出了臭氧和过滤后的空气暴露动物之间 mirna 表达的 log2 倍变化的值。列 t 表示在比较中为每个 mirna 计算的适度 t 统计。列 p. 值和 adj.p.value 分别表示多个测试调整之前和之后的每次比较的关联 p 值。利用 benjamini 和 hochberg 的方法对错误发现率15进行了多次比较调整。列 b 表示 mirna 不同表达的对数赔率为8。

我们进行了 mirna 靶向过滤和核心分析, 其中包括浓缩途径分析。上传了14个带有显著表达记录比和 p 值的 mirnasa 列表后, 所有这些都是由 mirna 目标滤波器绘制的 (表 3)。结果被过滤和排序, 以获得某些途径, 在这种情况下, "细胞免疫反应"。核心分析提供了有关规范路径、疾病和功能、调节器和网络的信息 (表 4)。功能分析软件产生了一个网络分析, 显示了感兴趣的 mirna 与其他分子之间的关系 (图 3)。

Figure 1
图 1: 有光泽的周期阶段的标识.(a) 前雌激素 (主要是有核的上皮细胞);(b) 发情 (主要是无核的有组织细胞);(c) 流星 (所有三种类型的细胞);和 (d) 地系 2 (大多数白细胞)。刻度杆 = 100μm. 放大倍率 = 20x。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 功能分析软件代表性结果: mirna 目标滤波器.在有光泽的周期的不同阶段的 mirna 的综合轮廓。执行 mirna 过滤后, 该软件提供了与疾病和其他表型相关的基因和化合物的详细列表, 这些基因和化合物可以进行过滤和排序, 以获得某些途径, 在这种情况下是 "细胞免疫反应"。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 功能分析软件代表性结果: 网络.比较在有月经周期的不同阶段受过滤空气或女性臭氧接触影响的网络。暴露在过滤空气中的雌性小鼠肺部与非雌激素 (a) 或非雌激素期臭氧相关的生物网络图 (b)。fuentes 等人对这一数字作了修改。请点击这里查看此图的较大版本.

Id 核酸 (ngμl) a260/a280 A260/A230
样品1 1197.930 2.015 2.192
样本2 1355703 2.03 18 2.223
样本3 2178. 104 2.02 2.163
样品4 1600.837 2.05 2.139
平均 1583.144±215 2.016±0.002 2.177±0.06 18

表 1: 来自四只小鼠纯化肺组织样本的 rna 浓度和吸收率在260、230和280纳米的示例.用分光光度计测定了浓度。

logfc t p. value "" "" "" ""p. val B
mmu-mrir-694 1.492 4.071 0.000153 0.009514 0.759
mmu-miR--5p 0.836 3.916 0.000254 0.009514 0.289
mmu-mrir-222-3p 0.385 3.106 0.003014 0.075361 -1.982
mmu-mr-181d-5p 0.597 2.8 91 0.005516 0.103424 -2.526
mmu-mrir-98-5p 0.558 2.699 0.009243 0.138649 -2.987
mmu-mrir-712-5p 0.667 2.5 63 0.013169 0.164609 -3.299
mmu-mir-106a-5p -0.528 -2.412 0.019278 0.206547 -3.632

表 2:利马在暴露于臭氧的女性中不同表达 mirna 的分析结果vs. 在前置阶段过滤过的空气.

mirna id 意见1 意见1 意见2 意见2
expr 日志比率 p 值 expr 日志比率 p 值
mmu-mrir-694 1.492 0.000153 0.543319208 0.0021385
mmu-miR--5p 0.836 0.000254 0.677595421 0.004 4997439
mmu-mrir-222-3p 0.385 0.003014
mmu-mr-181d-5p 0.597 0.005516 0.34 2276659 0.106467657
mmu-mrir-98-5p 0.558 0.009243 0.455392799 0.034724699
mmu-mrir-712-5p 0.667 0.013169
mmu-mir-106a-5p -0.528 0.019278

表 3: 将数据集上载到功能分析软件的示例格式.可以将多个实验差分表达式分组到一个电子表格中并上载, 并可根据需要添加尽可能多的观察结果。列: 1) mirna id;2) 观察 1: 库分比率;3) 观察1:p 值;4) 观察 2: 库分比率;5) 观察2:p 值。

非突出症 普罗埃斯特鲁斯
a. 不同表达的 mirna 所针对的基因
camk2n1 pafah1b2 sec23a abcb9 fgd4 slc25a27
汽车 pde4b snx5 apoo frmd4b slc388a1
CYP24A1 pde7a syt4 arhgef38 gpr137b tmcc1
dbf4 pgm3 泰国12 aven hmbs trim71
hmgn2 Pnp tmed7 cpp3 metap1 xkr8
kmt5a rev1 ttfaip2 ccnj mitf zcchc11
lrrc17 rps19bp1 tnfrsf10c cmtr2 myc zim3
mdh2 rrad tp53 cnmd rgmb znf181
mis18a sec62 ube2v2 dscr8 slc14a1
znf420
b. 主要疾病和生物功能的差异
疾病和疾病 p值 疾病和疾病 p值
炎症性疾病 3.84 e-02-3.84 e-05 组织损伤和异常 4.96e-02-2.777-14
炎症反应 3.84 e-02-3.84 e-05 生殖系统疾病 2.15 e-02-2. 777-14
组织损伤和异常 4.17 e-02-4.17 e-05 癌症 4.96e-02-1.27 e-10
c. 顶级分子和细胞功能
分子和细胞功能 p价值 分子和细胞功能 p价值
蜂窝发育 2.05 e-02-5.26 e-07 蜂窝运动 3.77e-02-4-47e-07
蜂窝妥协 3.75 e-04-3.75 e-04 细胞死亡和生存 4.91 e-02-5.61 e-06
细胞周期 2.62 e-03-2.62 e-03 蜂窝发育 4.97 e-02-1.38 e-06
d. 顶级生理系统的发展和功能
开发和功能 p价值 开发和功能 p价值
有机发育 4.17 e-02-1.31 e-03 胚胎发育 3.30 e-02-2.12 e-05
胚胎发育 1.29 e-02-1.29 e-02 结缔组织发育和功能 1.79 e-02-6.10 e-05
结缔组织发育和功能 1.93 e-02-1.93 e-02 组织形态 7.88 e-05-7.88 e-05
e. 顶级相关网络功能
关联的网络功能 得分 关联的网络功能 得分
细胞发育、炎症性疾病、炎症反应 器官损伤和异常、生殖系统疾病、癌症
6 19

表 4: 功能分析软件非雌激素与非雌部的女性接触臭氧的摘要。功能分析软件允许分析顶级规范路径、上游调节器、疾病 & 功能、顶级功能、调节器效应网络等。该表格已从 fuentes 等人6人处修改。

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Discussion

微 rna 分析是疾病诊断和机械研究的有利技术。在这篇手稿中, 我们定义了一个评估 mirna 表达的协议, 预测它将调节在不同发情周期阶段暴露在臭氧下的雌性小鼠肺部的炎症基因。介绍了对强度周期的测定方法, 如视觉检测方法, 共16种.但是, 这些数据依赖于一次性测量, 因此是不可靠的。为了准确地识别女性定期周期中的所有有缺陷的周期阶段, 建议采用此处描述的方法。此外, 这个简单的协议也可以用来间接估计小鼠的每日荷尔蒙波动。为了避免由于阴道刺激而激活不必要的炎症反应, 每天只需进行一次取样。由于循环长度的变化和外壳的影响, 在考虑循环阶段的实验中使用动物之前, 对两到三个完整的周期执行协议是很重要的。

为了成功地从肺组织中提取 rna, 准确的手术至关重要。该协议描述了一种从产生高质量 rna 的肺组织中分离 rna 的一天方法。需要修改制造商的协议, 以有效地从肺部提取 rna。我们添加了一个额外的离心步骤后, 添加洗涤缓冲液, 以去除尽可能多的缓冲液。我们还用35μl 的 dnasise/rnase 水洗脱 rna, 将色谱柱离心1.5 分钟, 以确保高浓度水平。光谱仪的结果证实了我们的 rna 提取协议的有效性。吸收率在260和280纳米 (a260/280 之比) 经常被用来评估 rna 制剂的纯度。核酸的最大吸收率分别为260纳米和280纳米。如果这一比例约为 2.017,则被接受为 rna 的 "纯"。同样, 对于 a26/a230 污染吸收率, 纯度值在 2.0–2.218 之间。在本研究中, 观察到的平均 a260a280 和 a260a230 比率分别为2.016±0.002 和 2.177±0.018 (表 1)。因此, 我们的 rna 提取协议是成功的。所使用的协议的另一个优点是增加了 dnasse 处理。这对于避免基因组-dna 污染非常重要。这种 rna 分离协议的一个局限性是使用净化柱通过使用酒精沉淀来丢弃废物, 因为一些肺碎片可能会部分或完全阻碍膜, 从而导致产量低。另外, 如果不仔细地进行同质化步骤, 大量的肺 rna 很容易丢失或降解。如果获得较低的 rna 产量, rna 可以被重新纯化, 并在较小的体积中洗脱。或者, rna 可以在公布的协议20后在一夜之间沉淀。

微阵列技术应用于 mirna 分析是许多研究领域中很有前途的工具。在我们的研究中, 我们使用了 pcr 阵列, 它提供了更高的检测阈值的优势, 并为检测差异表达的 mirna 与其他技术 (如基于原的 mirna 阵列21) 提供了归一化策略。该协议的一个局限性是, 它需要最低数量的启动 rna 材料, 以及特定的引物集的可用性的 mirna 感兴趣, 而不是其他可用的技术, 如 rnaseq。基于 pcr 的阵列的另一个优点是选择使用非 mirna 参考基因进行 qpcr 归一化 (如小核子核 rna 或 snords) 来计算 mirna 的微分表达式。最后, 使用 pcr 阵列为数据分析提供了多种选择, 从制造商提供的在线工具到通过实时 pcr 检测差异表达的常规方法。利用 limma进行统计分析, 既方便了微阵列, 又方便了基于 pcr 的阵列, 并采用经验贝叶斯主持了-statisitcs22。在这里, 我们表明, p 值和 q 值 (调整为多个测试) 都可以通过命令上对调整错误发现率阈值和识别差异表达的 mirna 来获得。

功能分析软件是基于 web 的路径环境下数据分析的应用。该软件为研究人员提供了强大的搜索能力, 可以帮助他们在更大的生物意义图景下, 在上下文中构建数据集或特定目标。尽管软件环境对不同类型的分析 (即代谢组学、snps、蛋白质组学、微 rna、毒理学等) 具有灵活性, 但我们在这里的目标是突出 mirna 分析的各个方面。在上传了14个具有显著表达式对数比率和 p 值的 mirna 列表后, 所有这些都被软件映射。我们进行了 mirna 靶向过滤和核分析, 其中包括富集途径分析。然而, 这些分析考虑的是 14个 mirna 被预测为目标的基因, 而不是 mirna 本身。结果部分列出了输出, 如: 规范途径、疾病和功能、不同表达 mirna 所针对的基因、生理系统发育、调节剂和网络 (表 4)。路径可视化显示在网络选项卡下, 其中 mirna 和分子显示为可点击节点, 这些节点与与感兴趣的基因相关的信息相关联 (图 3)。功能分析软件的优点是高质量的 mirna 相关的发现, 包括实验验证和预测的交互。功能分析软件数据库包括: 实验验证的微 rna-mrna 相互作用数据库23,24, 预测的微 rna-mrna 相互作用数据库与低置信度相互作用排除在外 (例如,目标扫描)25, 实验验证人类、大鼠和小鼠微 rna-mrna 相互作用数据库 (例如, mi学l)26和文献发现 (例如,手动从已发表的文献中管理与微 rna 相关的发现)由科学专家)。其他比较生物信息学工具的有效性和可用性来分析与 mirna 表达相关的途径的研究证实了该软件的有效性。总体而言, 计算方法具有成本效益, 耗时较少, 并且可以很容易地通过分子方法进行验证。随着生物医学数据的不断增长和积累, 生物信息学方法将在发现 mirna 介导的生物和疾病过程机制方面变得越来越强大。

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Disclosures

提交人声明, 他们没有相互竞争的利益。

Acknowledgments

这项研究得到了 nih k01hl133520 (ps) 和 k12hd055882 (ps) 的资助。作者感谢乔安娜·弗洛罗斯博士在臭氧暴露实验方面的帮助。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J mice The Jackson Laboratory 000664 8 weeks old
UltraPure Water Thermo Fisher Scientific 10813012
Sterile plastic pipette Fisher Scientific 13-711-25 Capacity: 1.7 mL
Frosted Microscope Slides Thermo Fisher Scientific 2951TS
Light microscope Microscope World MW3-H5 10x and 20x objective
Ketathesia- Ketamine HCl Injection USP Henry Schein Animal Health 55853 90 mg/kg. Controlled drug.
Xylazine Sterile Solution Lloyd Laboratories 139-236 10 mg/kg. Controlled Drug.
Ethanol Fisher Scientific BP2818100 Dilute to 70% ethanol with water.
21 G gauge needle BD Biosciences 305165
Syringe Fisher Scientific 329654 1 mL
Operating Scissors World Precision Instruments 501221, 504613 14 cm, Sharp/Blunt, Curved and 9 cm, Straight, Fine Sharp Tip
Tweezer Kit World Precision Instruments 504616
Spectrum Bessman Tissue Pulverizers Fisher Scientific 08-418-1 Capacity: 10 to 50 mg
RNase-free Microfuge Tubes Thermo Fisher Scientific AM12400 1.5 mL
TRIzol Reagent Thermo Fisher Scientific 15596026
Direct-zol RNA MiniPrep Plus Zymo Research R2071
NanoDrop Thermo Fisher Scientific ND-ONE-W
miScript II RT kit Qiagen 218161
Mouse Inflammatory Response & Autoimmunity miRNA PCR Array Qiagen MIMM-105Z
Thin-walled, DNase-free, RNase-free PCR tubes Thermo Fisher Scientific AM12225 for 20 μL reactions
miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control Qiagen 219610
Microsoft Excel Microsoft Corporation https://office.microsoft.com/excel/
Ingenuity Pathway Analysis Qiagen https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/
R Software The R Foundation https://www.r-project.org/
Thermal cycler or chilling/heating block General Lab Supplier
Microcentrifuge General Lab Supplier
Real-time PCR cycler General Lab Supplier
Multichannel pipettor General Lab Supplier
RNA wash buffer Zymo Research R1003-3-48 48 mL
DNA digestion buffer Zymo Research E1010-1-4 4 mL
RNA pre-wash buffer Zymo Research R1020-2-25 25 mL
Ultraviolet ozone analyzer Teledyne API Model T400 http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400
Mass flow controllers Sierra Instruments Inc Flobox 951/954 http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html

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References

  1. Rebane, A., Akdis, C. A. MicroRNAs: Essential players in the regulation of inflammation. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (1), 15-26 (2013).
  2. Cannell, I. G., Kong, Y. W., Bushell, M. How do microRNAs regulate gene expression? Biochemical Society Transactions. 36 (Pt 6), 1224-1231 (2008).
  3. Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nature Reviews Genetics. 13 (5), 358-369 (2012).
  4. Mi, S., Zhang, J., Zhang, W., Huang, R. S. Circulating microRNAs as biomarkers for inflammatory diseases. Microrna. 2 (1), 63-71 (2013).
  5. Sessa, R., Hata, A. Role of microRNAs in lung development and pulmonary diseases. Pulmonary Circulation. 3 (2), 315-328 (2013).
  6. Fuentes, N., Roy, A., Mishra, V., Cabello, N., Silveyra, P. Sex-specific microRNA expression networks in an acute mouse model of ozone-induced lung inflammation. Biology of Sex Differences. 9 (1), 18 (2018).
  7. Aris, R. M., et al. Ozone-induced airway inflammation in human subjects as determined by airway lavage and biopsy. American Review of Respiratory Disease. 148 (5), 1363-1372 (1993).
  8. Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Research. 43 (7), e47 (2015).
  9. Krämer, A., Green, J., Pollard, J., Tugendreich, S. Causal analysis approaches in Ingenuity Pathway Analysis. Bioinformatics. 30 (4), 523-530 (2014).
  10. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).
  11. Umstead, T. M., Phelps, D. S., Wang, G., Floros, J., Tarkington, B. K. In vitro exposure of proteins to ozone. Toxicology Mechanisms and Methods. 12 (1), 1-16 (2002).
  12. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  13. Phipson, B., Lee, S., Majewski, I. J., Alexander, W. S., Smyth, G. K. Robust hyperparameter estimation protects against hypervariable genes and improves power to detect differential expression. Annals of Applied Statistics. 10 (2), 946-963 (2016).
  14. Smyth, G. K., et al. Linear Models for Microarray and RNA-Seq Data User's Guide. Bioconductor. , (2002).
  15. Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing. Journal of the Royal Statistical Society. Series B (Methodological). 57 (1), 289-300 (1995).
  16. Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. Public Library of Science ONE. 7 (4), e35538 (2012).
  17. Alves, M. G., et al. Comparison of RNA Extraction Methods for Molecular Analysis of Oral Cytology. Acta Stomatologica Croatica. 50 (2), 108-115 (2016).
  18. Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity. Biotechniques. 22 (3), 478-481 (1997).
  19. Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
  20. Walker, S. E., Lorsch, J. RNA purification- precipitation methods. Methods in Enzymology. 530, 337-343 (2013).
  21. Git, A., et al. Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression. RNA. 16 (5), 991-1006 (2010).
  22. Smyth, G. K. Limma: linear models for microarray data. Bioinformatics and Computational Biology Solutions Using R and Bioconductor. , 397-420 (2005).
  23. Griffiths-Jones, S. miRBase: the microRNA sequence database. Methods Mol Biol. 342, 129-138 (2006).
  24. Sethupathy, P., Corda, B., Hatzigeorgiou, A. TarBase: A comprehensive database of experimentally supported animal microRNA targets. RNA. 12 (2), 192-197 (2006).
  25. Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs. eLife. 4, e05005 (2015).
  26. Xiao, F., Zuo, Z., Cai, G., Kang, S., Gao, X., Li, T. miRecords: an integrated resource for microRNA-target interactions. Nucleic Acids Res. 37, D105-D110 (2009).
  27. Mullany, L. E., Wolff, R. K., Slattery, M. L. Effectiveness and Usability of Bioinformatics Tools to Analyze Pathways Associated with miRNA Expression. Cancer Informatics. 14, 121-130 (2015).

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免疫学与感染 第143期 空气污染 肺红核细胞 支气管肺泡灌洗 肺部炎症 性激素 pcr 阵列 有雌激素循环 阴道涂片
在暴露于臭氧的小鼠的弹性周期中的肺微 rna 分析
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Fuentes, N., Silveyra, P. Lung… More

Fuentes, N., Silveyra, P. Lung microRNA Profiling Across the Estrous Cycle in Ozone-exposed Mice. J. Vis. Exp. (143), e58664, doi:10.3791/58664 (2019).

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