Summary
Aquí se describe un método para evaluar la expresión pulmonar de miRNAs que se predicen para regular genes inflamatorios utilizando ratones expuestos al ozono o aire filtrado en las diferentes etapas del ciclo estral.
Abstract
Perfiles de microARN (miARN) ha sido de interés para los investigadores que trabajan en diversas áreas de investigación de biología y medicina. Los estudios actuales muestran un promisorio futuro de miRNAs en el diagnóstico y cuidado de enfermedades pulmonares. Aquí, se define un protocolo para miRNA perfilado para medir la abundancia relativa de un grupo de miRNAs predicho para regular genes inflamatorios en el tejido pulmonar de un modelo de ratón de inflamación de las vías respiratorias inducida por ozono. Ya se ha demostrado que los niveles de hormonas sexuales circulantes pueden afectar la regulación de la inmunidad innata del pulmón en las mujeres, el propósito de este método es describir un inflamatorio miRNA perfiles de protocolo en los ratones hembra, teniendo en cuenta el ciclo estral etapa de cada animal en el momento de exposición al ozono. Nos dirigimos también a enfoques de la bioinformática aplicable a miRNA descubrimiento y objetivo de los métodos de identificación usando limma, un software de R/Bioconductor, y software de análisis funcional para comprender el contexto biológico y vías asociadas con expresión diferencial de miRNA.
Introduction
microRNAs (miRNAs) son cortos (19 a 25 nucleótidos), que ocurre naturalmente, no-codificación moléculas de ARN. Secuencias de miRNAs son evolutivas conservada entre especies, lo que sugiere la importancia de los miRNAs en la regulación de funciones fisiológicas1. perfiles de expresión de microRNA ha demostrado para ser útil para la identificación de miRNAs que son importantes en la regulación de una variedad de procesos, incluyendo la respuesta inmune, diferenciación celular, desarrollo y apoptosis2. Más recientemente, miRNAs han sido reconocidos por su uso potencial en el diagnóstico de la enfermedad y terapéutica. Para los investigadores estudiando mecanismos de regulación génica, medición de expresión de miRNA puede iluminar modelos de nivel de sistemas de procesos regulatorios, especialmente cuando miRNA información se combina con perfiles de mRNA y otros datos de genoma-escala3. Por otro lado, los miRNAs también han demostrado ser más estable que los mRNAs en una gama de tipos de muestra y también son mensurables con mayor sensibilidad a las proteínas4. Esto ha llevado a un interés considerable en el desarrollo de miRNAs como biomarcadores para diversas aplicaciones diagnóstico moleculares, incluyendo enfermedades pulmonares.
En el pulmón, los miRNAs desempeñan papeles importantes en procesos de desarrollo y el mantenimiento de la homeostasis. Por otra parte, su expresión anormal se ha asociado con el desarrollo y progresión de varias enfermedades pulmonares5. Neumopatía inflamatoria inducida por contaminación del aire ha demostrado mayor severidad y peor pronóstico en las mujeres, lo que indica que las hormonas y el ciclo estral pueden regular pulmón innata inmunidad y miRNA expresión en respuesta a retos ambientales 6. en el presente Protocolo, utilizamos la exposición al ozono, que es un componente importante de la contaminación atmosférica, para inducir una forma de inflamación del pulmón en ratones hembra que se produce en ausencia de inmunidad adaptativa. Mediante el uso de ozono, estamos induciendo el desarrollo de hipersensibilidad de las vías respiratorias que se asocia con daño a las células epiteliales de las vías respiratorias y un aumento de neutrófilos y mediadores inflamatorios en las vías respiratorias proximales7. Actualmente, no existen protocolos bien-descritos para caracterizar y analizar miRNAs en el ciclo estral en ratones expuestos al ozono.
A continuación, describimos un método simple para identificar las etapas del ciclo estral y la expresión de miRNA en el tejido de pulmón de ratones femeninos expuestos a ozono. También abordamos enfoques eficaces bioinformática a miRNA de descubrimiento y objetivo de identificación, con énfasis en biología computacional. Analizamos los datos de microarray utilizando limma, un software de R/Bioconductor que proporciona una solución integrada para el análisis de datos del gene expresión experimentos8. Análisis de datos de matriz PCR de limma tiene una ventaja en términos de poder sobre procedimientos de prueba t de base cuando se utiliza un número pequeño de muestras de matrices para comparar la expresión. Para comprender el contexto biológico de los resultados de expresión de miRNA, entonces utilizamos el software de análisis funcional. Para entender los mecanismos de regulación transcripcionales cambios y predecir resultados probables, el software combina conjuntos de datos de expresión de miRNA y el conocimiento de la literatura9. Esto es una ventaja en comparación con el software que sólo buscan enriquecimiento estadístico en superposición a conjuntos de miRNAs.
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Protocol
Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) de Penn State University.
1. evaluación de la fase del ciclo estral
- Frenar correctamente una hembra de ratón C57BL/6 (8-9 semanas) utilizando la técnica de sujeción con una sola mano ratón descrita en Machholz et al10.
- Llenar la pipeta plástica estéril con 10 μL de agua ultra pura.
- Introduzca la punta de la pipeta de plástico en la vagina.
- Suavemente Limpie el líquido de 4 a 5 veces para recolectar la muestra.
- Coloque el final flush que contiene fluido vaginal en un portaobjetos de vidrio.
- Observar la descarga vaginal sin manchas debajo de un microscopio óptico con un objetivo de 20 x.
Nota: Animales que no muestran ciclos regulares por seudoembarazo u otras causas deben ser excluidos con el experimento. Se recomienda realizar las secreciones vaginales diario durante al menos tres ciclos consecutivos confirmar la ciclicidad.
2. exposición al ozono
- Colocar un máximo de 4 ratones en dos recipientes de vidrio de 1,2 L con tapas de malla de alambre y agua ad libitum.
- Poner un recipiente de vidrio en la cámara de ozono y el otro en la sala de exposición de aire filtrado.
- Ajustar la concentración de ozono a los niveles de ozono de 2 ppm y monitor regularmente.
Nota: El aparato de ozono proporciona un flujo de aire regulado (> 30 cambios por hora del aire) con control temperatura (25 ° C) y humedad relativa (50%). El sistema genera ozono por un descarga eléctrica el ozonizador, que es supervisado y controlado por un analizador de ozono ULTRAVIOLETA y controladores de flujo másico, como se describió anteriormente11. - Eliminar envases de vidrio después de 3 horas de exposición al aire ozono/filtrada. Devolver los animales a la jaula con ropa de cama, comida y agua ad libitum.
3. pulmón colección
- 4 h después de la exposición, anestesiar animales con una inyección intraperitoneal de un ketamina/xilacina cóctel (90 mg/kg ketamina, 10 mg/kg xilacina).
Nota: Para confirmar un nivel adecuado de anestesia, compruebe el ratón para un pedal reflex (pellizco firme del dedo del pie) y ajustar la anestesia cuando sea necesario. - Humedezca la piel de ratón con etanol al 70%.
- Haga una incisión de línea media de 2 cm con un funcionamiento de la tijera y pinzas quirúrgicas para exponer la vena cava.
- Sacrificio de ratones por sección transversal de la vena cava y aorta. Si es necesario, introduzca una aguja de calibre 21 G en la vena cava por encima de las venas renales para recoger la sangre antes de exsanguination. Por otra parte, recoger la sangre mediante punción del corazón siguiendo protocolos estándar.
- Utilice una tijera quirúrgica para abrir la cavidad abdominal y retire la piel superior del músculo, moviéndose hacia arriba hacia las costillas.
- Usar una tijera quirúrgica para perforar el diafragma.
Nota: Los pulmones se derrumbará de diafragma. - Corte la caja torácica usando una tijera quirúrgica para exponer el corazón y los pulmones.
- Con unas pinzas, tomar una libre de Rnasa tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y sumergir en nitrógeno líquido para llenar el tubo.
Nota: Utilizar gafas y guantes protectores para manipular nitrógeno líquido. - Eliminar de los pulmones, colocarlos en tubos libres de Rnasa microcentrífuga 1.5ml, llenados de nitrógeno líquido a presión-congelar el tejido y esperar unos segundos hasta que se evapore el líquido.
- Cierre la tapa del tubo y almacenar el tejido a-80 ° C hasta su uso.
4. ARN preparación
- Pulverizar todo pulmones usando un pulverizador de acero inoxidable tejido.
Nota: El pulverizador de tejido debe colocarse en nitrógeno líquido antes de utilizarlo. Limpiar el pulverizador después de cada uso con solución de Rnasa. - Divide los pulmones pulverizados y coloque en dos tubos de 1,5 mL (medio pulmón).
- Añadir 500 μl de guanidinio tiocianato por el tubo de muestra y mezclar. Homogeneizar cada muestra usando 18 G, 21 G y agujas 23 G, respectivamente.
Nota: Muestras pueden ser enriquecidas con 5.6 x 108 copias de un pequeño RNA spike en el control (de una especie diferente) antes de proceder a la extracción. - Añadir 500 μl de etanol a cada muestra y agitar durante 15 s.
- Carga de la mezcla en una columna de spin en un tubo y centrifugar a 12.000 x g durante 1 minuto deseche el flujo a través.
-
Para DNase I tratamiento (en-columna);
- Añadir 400 μL de RNA Wash Buffer y centrifugar a 12.000 x g durante 1 minuto.
- En un tubo libre de Rnasa, añadir 5 μl de DNasa I y 75 μl de 1 x digestión de DNA tampón y mezclar. Agregue la mezcla directamente en la matriz de la columna.
- Incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos.
- Añadir 400 μL de solución especial para el prelavado de RNA a la columna y centrifugar a 12.000 x g durante 1 min descartar el flujo a través y repita este paso.
- Añadir 700 μl de tampón de lavado del RNA a la columna y centrifugar a 12.000 x g durante 1 minuto deseche el flujo a través.
- Centrifugar a 12.000 x g durante 2 min quitar el tampón restante. Transferir la columna en un tubo libre de Rnasa.
- Para eluir el RNA, añadir 35 μl de agua libre de DNasa/Rnasa directamente a la columna matriz y centrifugar a 12.000 x g durante 1,5 minutos.
- Medir la concentración de RNA total (260 nm) y pureza utilizando un espectrofotómetro. Siga las instrucciones para realizar la cuantificación de RNA en un 1,5 μl de muestra alícuota. En blanco el instrumento con agua libre de DNasa/Rnasa de elución.
Nota: Una relación 260/280 de ~2.0 está generalmente aceptada como "puro" para el ARN. Concentración típica de RNA generalmente oscila entre los 750 y 2.500 ng/μl. - Tienda a-80 ° C.
5. miRNA perfilado
-
Retro-transcribir pequeños RNAs, uso 200 ng de RNA total.
- Preparar la mezcla de reacción de transcripción inversa en el hielo (es el volumen total por reacción de 20 μl). Para cada reacción, añadir 4 μL de 5 x buffer, 2 μl de 10 x nucleótidos mezclan, 2 μl de transcriptasa reversa y 2 μl de agua libre de ARNasa. Mezclar todos los componentes y alícuota en 600 μl libre de Rnasa tubos de plástico (10 μl de la mezcla por reacción).
Nota: La mezcla principal reverso-transcripción contiene todos los componentes requeridos para síntesis de cDNA primera cadena excepto plantilla de RNA.
Nota: Calcular el volumen de exceso (10%) durante la preparación de la mezcla principal. - Añadir la plantilla de RNA (200 ng de 10 μl) a cada tubo conteniendo mezcla principal reverso-transcripción. Mezcle, centrifugue durante 15 s a 1.000 x gy guardarlos en hielo hasta colocar en termociclador o bloque seco.
- Incubar por 60 min a 37 ° C.
- Incubar por 5 min a 95 ° C y coloque los tubos en hielo.
- Diluir el cDNA mediante la adición de 200 μL de agua libre de ARNasa a cada reacción de la reverso-transcripción de 20 μl.
- Preparar la mezcla de reacción de transcripción inversa en el hielo (es el volumen total por reacción de 20 μl). Para cada reacción, añadir 4 μL de 5 x buffer, 2 μl de 10 x nucleótidos mezclan, 2 μl de transcriptasa reversa y 2 μl de agua libre de ARNasa. Mezclar todos los componentes y alícuota en 600 μl libre de Rnasa tubos de plástico (10 μl de la mezcla por reacción).
-
Realizar PCR en tiempo real usando el ratón respuesta inflamatoria y autoinmunidad miRNA Array PCR.
- Preparar una mezcla de reacción (volumen total 1100 μL): para cada reacción, añadir 550 μl de 2 x PCR master mix, 110 μl de 10 x mezcla de imprimación universal, 340 μl de agua libre de ARNasa y 340 μl de cDNA de plantilla (reacción diluido del paso 5.1.5).
- Añadir 10 μl de la mezcla de reacción en cada pocillo de la miRNA pre-cargado matriz de PCR utilizando una pipeta multicanal.
- Sello de miRNA placa matriz de PCR con la película adhesiva óptica.
- Centrifugar la placa durante 1 min a 1.000 x g a temperatura ambiente para eliminar burbujas.
- Programa el cycler en tiempo real, paso de activación inicial de PCR durante 15 min a 95 ° C, 3 pasos desnaturalización que contienen bicicleta por 15 s a 94 ° C, recocido de 30 s a 55 ° C y la extensión de 30 s a 70 ° C durante 40 ciclos de número.
Nota: Siga fabricante ciclismo condiciones instrucciones para configurar el cycler en tiempo real. Realizar el paso de la curva de disociación en el software de tiempo real cycler. - Realizar análisis de datos.
6. Análisis de datos
- Extraer valores de Ct de lo software PCR tiempo real para cada muestra en un software de análisis.
Nota: Valor de un TAC de 34 se considera como atajo. Si las muestras contienen punto de control (por ejemplo,, cel-mir-39), normalizar valores de Ct para el aumento de control para cada muestra. Valores umbral deben configurarse manualmente. Valores de referencia se establecen automáticamente. - Normalizar los valores de Ct para el Ct promedio de seis controles de limpieza de miRNA: SNORD61, SNORD68, SNORD72, SNORD95, SNORD96A, RNU6-2, utilizando la siguiente ecuación:
ΔCt = (Ct_Target − Ct_housekeeping) - Para pliegue cambiar cálculos, calcular los valores de ΔΔCt con una muestra específica como el control, utilizando la expresión relativa de ecuación12:
expresión relativa de miRNA:
2- ∆∆Ct, donde - ∆∆Ct =-[∆Ct prueba - control ∆Ct]
Nota: Un cambio doble de 200 se considera como atajo. - Doblez de exportación cambiar valores de expresión para realizar el análisis estadístico en R usando el paquete limma en Bioconductor8.
- Corregir para comparaciones múltiples mediante el método de Benjamini-Hochberg13.
Nota: Una copia de la escritura de R está disponible en: http://psilveyra.github.io/silveyralab/. Conjuntos de datos y analizados los datos también están disponibles en el ómnibus de la expresión de genes bajo número GSE111667, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE111667.
7. Análisis: Software de análisis funcional
- Organizar el conjunto de datos. Incluyen miRNAs con su respectiva expresión log cocientes y valores p. Vea la tabla 1 para el formato de conjunto de datos específico.
- Software de análisis funcional abierta (versión 01-10).
- Subir el conjunto de datos utilizando el siguiente formato: formato de archivo: "Formato Flexible", contiene el encabezado de columna: "Sí", seleccione el tipo de identificador: "miRBase (maduro)", plataforma de matriz usada para experimentos: elegir la plataforma de la matriz.
Nota: Acepta los formatos de archivos son txt (delimitado por tabulaciones archivos de texto), XLS (archivos excel) y .diff (archivos cuffdiff). - Seleccionar "Inferir observaciones" y verificar que el grupo experimental el etiquetado es correcto.
- Ir a "Resumen de conjunto de datos" para revisar la cantidad total de miRNAs asignados y no asignados.
-
Haga clic en el botón "nuevo" en la parte superior izquierda del programa. Seleccione "Nuevo MicroRNA objetivo filtro" y cargar un dataset de microARN.
- Establece la fuente en: TarBase, ingenio expertos resultados, miRecords.
- Establece confianza en: experimentalmente observada o alta (predicho).
- Seleccione "Agregar columnas" para incluir una variedad de información biológica acerca de los objetivos como especies, enfermedades, tejidos, vías y mucho más.
- Para centrarse en objetivos que han cambiado la expresión en el experimento, seleccione "añadir / reemplazar mRNA dataset". Usa "la Asociación de la expresión" para situar los microRNAs con los niveles de expresión de igual o diferente.
Nota: El análisis de filtro proporcionará microRNA nombres y símbolos, objetivos del mRNA, la fuente que describe la relación de destino y el nivel de confianza de la relación prevista (figura 2).
- Haga clic en "Añadir a mi camino" para enviar el conjunto de datos filtrado a un lienzo de camino y explorar relaciones biológicas más.
- Usar ruta Designer para crear un modelo de calidad de la publicación de efectos de microARN.
-
Una opción alternativa es hacer un análisis de la base.
- Tipo de análisis de base, seleccione "Análisis de la expresión".
- Tipo de medida, seleccione "Expr registro relación".
- Resumen de análisis de filtro: considera sólo moléculas o relaciones donde: (especie = ratón) y (confianza = observadas experimentalmente) y (fuentes de datos = "Ingenio experto los resultados", "Ingenio ExpertAssist hallazgos", "miRecords", "TarBase", o " TargetScan humanos").
- Seleccione un atajo de valor p = 0.05.
- Ejecutar el análisis.
Nota: El informe incluirá: vías canónicas, análisis de reguladores aguas arriba, enfermedades y funciones, de los efectos del regulador, redes, moléculas y más.
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Representative Results
Los diferentes tipos celulares observados en los frotis se utilizan para identificar la etapa del ciclo estral del ratón (figura 1). Estos están identificados por la morfología de la célula. Durante el proestro, las células son casi exclusivamente agrupaciones de células epiteliales nucleadas en forma de redondo, bien formadas (figura 1A). Cuando el ratón está en la etapa de estro, las células son células epiteliales squamous cornified, presentes en racimos densamente (figura 1B). Durante el metestro, ven cornified las células epiteliales y leucocitos polimorfonucleares (figura 1). En diestro, leucocitos (células pequeñas) son generalmente más frecuentes (figura 1).
Extrajo RNA de cuatro pulmones de ratón, siguiendo el protocolo descrito previamente. Las concentraciones de ácido nucleico (ng / μL) osciló entre 1197.9 y 2178.1 con un promedio de 1583.1 ± 215 (tabla 1). La media de cociente A260/A280 fluctuaron de 2.010 a 2.020 con un promedio de 2.016 ± 0.002. Por otra parte, los cocientes A260/A230 observados oscilaron entre 2.139 y 2.223 con un promedio de 2.179 ± 0,018.
La tabla 2 muestra resultados de expresión diferencial con limma en R. Se calcularon los miRNAs expresados diferencialmente superior entre los ratones expuestos al ozono o filtrado de aire en el proestro (usando el comando toptable)14. La primera columna da el valor de log2-fold doble cambio en la expresión del miRNA entre ozono y aire filtrado expuesto animales. La t de la columna representa el moderado estadístico t calculado para cada miRNA en la comparación. Las columnas p.value y adj.p.value representan valores de p asociados para cada comparación antes y después de múltiples pruebas ajuste, respectivamente. Ajuste para comparaciones múltiples se realizó con el Benjamini y de Hochberg método para controlar la tasa de falso descubrimiento15. Representa de la columna B las probabilidades de registro que el miRNA es diferencialmente expresadas8.
Realizamos el miRNA blanco filtro y base de análisis que incluye el análisis de la vía de enriquecimiento. Después de subir una lista de 14 miRNAswith la relación de registro de expresión significativo y valor de p, todos ellos fueron asignados por el filtro del objetivo de miRNA (tabla 3). Los resultados fueron filtrados y ordenados para llegar a determinados caminos, en este caso la "respuesta inmune celular". El análisis de núcleo proporciona información sobre caminos canónicos, enfermedades y función, los reguladores y redes (tabla 4). El software de análisis funcional produce un análisis de red que muestra la relación entre los miRNAs de interés y otras moléculas (figura 3).
Figura 1: identificación de las etapas del ciclo estral. (A) proestro (células epiteliales nucleadas predominante); (B) estro (predominante anucleated cornified las células); (C) metestro (los tres tipos de células); y diestro (D) 2 (la mayoría de los leucocitos). Barra de escala = 100 μm. aumento = 20 x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: resultados representativos del software de análisis funcional: filtro de miRNA blanco. Perfil comprensivo de miRNAs en diferentes etapas del ciclo estral. Después de realizar el filtro de miRNA, el software ofrece listados de genes y compuestos implicados en las enfermedades y otros fenotipos, que se pueden filtrar y ordenar para llegar a determinados caminos, en este caso "Cellular la respuesta inmune". Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: resultados representativos del software de análisis funcional: redes. Comparación de las redes afectadas por exposición aire u ozono filtrada en las mujeres en las diferentes etapas del ciclo estral. Diagrama de redes biológicas asociadas con miRNAs en los pulmones de ratones femeninos expuestos a aire filtrado vs ozono en proestro (A) o (B) las etapas proestro no. Esta figura ha sido modificada desde Fuentes et al.6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| ID | Ácidos nucleicos (ng/μL) | A260/A280 | A260/A230 |
| Muestra 1 | 1197.930 | 2.015 | 2.192 |
| Muestra 2 | 1355.703 | 2.018 | 2.223 |
| Muestra 3 | 2178.104 | 2.020 | 2.163 |
| Muestra 4 | 1600.837 | 2.010 | 2.139 |
| Promedio | 1583.144 ± 215 | 2.016 ± 0.002 | 2.179 ± 0.018 |
Tabla 1: ejemplo de concentraciones de RNA y proporciones de absorbancia a 260, 230 y 280 nm de las muestras de tejido de pulmón purificado de cuatro ratones. Las concentraciones se midieron con un espectrofotómetro.
| logFC | t | P.Value | adj. P.Val | B | |
| MMU-miR-694 | 1.492 | 4.071 | 0.000153 | 0.009514 | 0.759 |
| MMU-miR-9-5 p | 0.836 | 3.916 | 0.000254 | 0.009514 | 0,289 |
| MMU-miR-221-3 p | 0.385 | 3.106 | 0.003014 | 0.075361 | -1.982 |
| MMU-miR - d 181 - 5p | 0.597 | 2.891 | 0.005516 | 0.103424 | -2.526 |
| MMU-miR-98-5 p | 0.558 | 2.699 | 0.009243 | 0.138649 | -2.987 |
| MMU-miR-712-5 p | 0.667 | 2.563 | 0.013169 | 0.164609 | -3.299 |
| MMU-miR-106a - 5p | -0.528 | -2.412 | 0.019278 | 0.206547 | -3.632 |
Tabla 2: Limma análisis de resultados para miRNAs expresados diferencialmente en las hembras expuestas a ozono vs . aire filtrado en la etapa de proestro.
| ID de miRNAs | Observación 1 | Observación 1 | Observación 2 | Observación 2 |
| Relación de registro de expr | Valor de P | Relación de registro de expr | Valor de P | |
| MMU-miR-694 | 1.492 | 0.000153 | 0.543319208 | 0.0021385 |
| MMU-miR-9-5 p | 0.836 | 0.000254 | 0.677595421 | 0.004997439 |
| MMU-miR-221-3 p | 0.385 | 0.003014 | ||
| MMU-miR - d 181 - 5p | 0.597 | 0.005516 | 0.342276659 | 0.106467657 |
| MMU-miR-98-5 p | 0.558 | 0.009243 | 0.455392799 | 0.034724699 |
| MMU-miR-712-5 p | 0.667 | 0.013169 | ||
| MMU-miR-106a - 5p | -0.528 | 0.019278 |
Tabla 3: formato de ejemplo para cargar múltiples observación de conjuntos de datos a software de análisis funcional. Múltiples expresiones diferencial experimentales pueden ser agrupadas en una sola hoja de cálculo y cargadas, y pueden agregarse tantas observaciones como sea necesario. Columnas: 1) miRNAs ID; 2) observación 1: Relación de registro de Expr; 3) observación 1: Valor de P; 4) observación 2: Registro de Expr relación; 5) observación 2: Valor de P.
| No-proestro | Proestro | ||||
| A. Genes dirigidos por diferencialmente expresan miRNAs | |||||
| CAMK2N1 | PAFAH1B2 | SEC23A | ABCB9 | FGD4 | SLC25A27 |
| COCHES | PDE4B | SNX5 | APOO | FRMD4B | SLC38A1 |
| CYP24A1 | PDE7A | SYT4 | ARHGEF38 | GPR137B | TMCC1 |
| DBF4 | PGM3 | THAP12 | AVEN | HMBS | TRIM71 |
| HMGN2 | PNP | TMED7 | CASP3 | METAP1 | XKR8 |
| KMT5A | REV1 | TNFAIP2 | CCNJ | MITF | ZCCHC11 |
| LRRC17 | RPS19BP1 | TNFRSF10C | CMTR2 | MYC | ZIM3 |
| MDH2 | RRAD | TP53 | CNMD | RGMB | ZNF181 |
| MIS18A | SEC62 | UBE2V2 | DSCR8 | SLC14A1 | |
| ZNF420 | |||||
| B. diferencias en enfermedades superior y biofunctions | |||||
| Enfermedades y trastornos | Valor de P | Enfermedades y trastornos | Valor de P | ||
| Enfermedad inflamatoria | 3.84E-02 - 3.84E-05 | Anomalías y lesiones de la | 4.96E-02 - 2.77E-14 | ||
| Respuesta inflamatoria | 3.84E-02 - 3.84E-05 | Enfermedad del sistema reproductivo | 2.15E-02 - 2.77E-14 | ||
| Anomalías y lesiones de la | 4.17E-02 - 4.17E-05 | Cáncer | 4.96E-02 - 1.27E-10 | ||
| C. principales funciones moleculares y celulares | |||||
| Funciones moleculares y celulares | P Valor | Funciones moleculares y celulares | P Valor | ||
| Desarrollo celular | 2.05E-02 - 5.26E-07 | Movimiento celular | 3.77E-02 - 4.47E-07 | ||
| Compromiso celular | 3.75E-04 - 3.75E-04 | Supervivencia y muerte celular | 4.91E-02 - 5.61E-06 | ||
| Ciclo celular | 2.62E-03 - 2.62E-03 | Desarrollo celular | 4.97E-02 - 1.38E-06 | ||
| D. superior de desarrollo de un sistema fisiológico y función | |||||
| Desarrollo y función | P Valor | Desarrollo y función | P Valor | ||
| Desarrollo de la | 4.17E-02 - 1.31E-03 | Desarrollo embrionario | 3.30E-02 - 2.12E-05 | ||
| Desarrollo embrionario | 1.29E-02 - 1.29E-02 | Función y desarrollo del tejido conectivo | 1.79E-02 - 6.10E-05 | ||
| Función y desarrollo del tejido conectivo | 1.93E-02 - 1.93E-02 | Morfología del tejido | 7.88E-05 - 7.88E-05 | ||
| E. superior asociados a funciones de red | |||||
| Asociados a funciones de red | Puntuación | Asociados a funciones de red | Puntuación | ||
| Desarrollo celular, enfermedad inflamatoria, respuesta inflamatoria | La lesiones y anormalidades, enfermedades del sistema reproductor, el cáncer | ||||
| 6 | 19 | ||||
Tabla 4: software de análisis funcional de Resumen de hembras expuestas al ozono en el no-proestro vs etapas proestro. El software de análisis funcional permite el análisis de los principales caminos canónicos, reguladores de aguas arriba, enfermedades y funciones, funciones principales, regulador efecto redes y más. Esta tabla ha sido modificada desde Fuentes et al.6.
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Discussion
Perfiles de microARN es una técnica ventajosa para investigación mecanicista y diagnosis de la enfermedad. En este manuscrito, se definió un protocolo para evaluar la expresión de miRNAs que se predicen para regular genes inflamatorios en los pulmones de ratones femeninos expuestos a ozono en etapas del ciclo estral diferentes. Métodos para la determinación del ciclo estral, como el método de detección visual, han sido descrito16. Sin embargo, estos dependen de las mediciones de una sola vez y por lo tanto no son confiables. Para identificar con precisión todas las etapas de ciclo estral en las hembras ese ciclo regularmente, se recomienda el método descrito aquí. Además, este Protocolo simple también puede utilizarse para estimar indirectamente las fluctuaciones hormonales diarias en ratones. Para evitar la activación de las respuestas inflamatorias no deseadas debido a la irritación vaginal, toma de muestras debe realizarse sólo una vez al día. Debido a la variabilidad en la duración del ciclo y las influencias de la vivienda, es importante realizar el protocolo de dos a tres ciclos completos antes de usar animales en un experimento teniendo en cuenta la fase del ciclo.
Para la extracción exitosa del ARN de tejido pulmonar, un procedimiento preciso es crítico. Este protocolo describe un método de un día para aislar RNA de tejido pulmonar que produce RNA de alta calidad. Modificaciones al protocolo del fabricante debían extraer eficientemente RNA de los pulmones. Hemos añadido un paso adicional de centrifugación después de añadir el tampón de lavado para quitar tanta amortiguación como sea posible. Nosotros también eluyó RNA con 35 μl de agua libre de DNasa/Rnasa, centrifugar la columna 1,5 min asegurar niveles de alta concentración. Spectrofluorometer resultados confirman la efectividad de nuestro protocolo de extracción de RNA. La relación de absorbancia a 260 y 280 nm (cociente A260/280) se utiliza con frecuencia para evaluar la pureza de las preparaciones de RNA. La absorbancia máxima de ácidos nucleicos es 260 y 280 nm, respectivamente. Se acepta como "puro" para el ARN si la proporción es aproximadamente 2.017. Asimismo, para la relación de absorbancias de contaminación A260/A230, los valores de pureza están en el rango de 2.0-2.218. En este estudio, los cocientes A260/A280 y A260/A230 promedio observados fueron 2.016 ± 0.002 y 2.179 ± 0.018, respectivamente (tabla 1). Por lo tanto, nuestro protocolo de extracción de RNA era acertado. Otra ventaja del protocolo utilizado es la adición del tratamiento de DNasa. Esto es importante para evitar la contaminación de la DNA genomic19. Una limitación de este protocolo de aislamiento de RNA es el uso de columnas de purificación para eliminar residuos mediante precipitación con alcohol porque algunos restos de pulmón pueden obstruir la membrana ya sea parcial o totalmente, lo que resulta en bajos rendimientos. También, si no se realiza cuidadosamente la etapa de homogeneización, grandes cantidades de RNA del pulmón pueden ser fácilmente perdidas o degradadas. Si se obtienen bajos rendimientos de RNA, RNA puede volver a purificado y eluyó en un volumen más pequeño. Alternativomente, RNA puede ser precipitado durante la noche siguiente protocolos publicados20.
Tecnologías de microarrays aplicados a perfiles de miRNA son herramientas prometedoras en muchos campos de investigación. En nuestro estudio, se utilizan matrices PCR, que proporcionan la ventaja de mayor umbral de detección y estrategias de normalización para la detección de miRNAs expresados diferencialmente frente a otras tecnologías tales como miRNA basada en sondeos matrices21. Una limitación de este protocolo es que requiere una cantidad mínima de a partir de material de RNA y la disponibilidad de conjuntos específicos de cartillas para los miRNAs de interés, en comparación con otras técnicas disponibles como RNAseq. Otra ventaja de arreglos de discos basados en PCR es la opción de usar no miRNA genes de referencia para la normalización de la qPCR (como RNAs nucleolares pequeño o SNORDs) para calcular la expresión diferencial de miRNAs. Por último, utilizando PCR proporciona varias opciones para análisis de datos, que van desde herramientas en línea proporcionadas por los fabricantes, a los métodos convencionales para detectar expresión diferencial aunque PCR en tiempo real. Análisis estadístico con limma es conveniente para microarrays y arreglos de discos basados en PCR y utiliza el empírico Bayes moderado f- statisitcs22. Aquí, demostramos que los valores de p y valores de q (ajustados por prueba múltiple) pueden obtenerse con el comando toptable ajuste el umbral de tarifa falsa del descubrimiento e identificar diferencialmente expresado miRNAs.
Software de análisis funcional es una aplicación basada en web para el análisis de datos en el contexto de la vía. El software da a investigadores capacidades de búsqueda potente que pueden ayudar a conjuntos de datos marco o metas específicas en contexto, dentro de un panorama de importancia biológica. Aunque el entorno de software es flexible a los diferentes tipos de análisis (es decir, metabolómica, SNPs, proteómica, microRNA, toxicología, etc.), nuestro objetivo aquí es poner de relieve aspectos de análisis de miRNA. Después de subir una lista de 14 miRNAs con significativa expresión log-tasas y valores de p, todos fueron asignados por el software. Realizamos la miRNA blanco filtro y base de análisis, que incluye el análisis de la vía de enriquecimiento. Sin embargo, tales análisis consideran genes para que los 14 miRNAs son predecibles y no los miRNAs se. La sección de resultados listas de salidas tales como: caminos canónicos, función y enfermedades, genes dirigidos por miRNAs expresados diferencialmente, desarrollo de sistemas fisiológicos, reguladores y redes (tabla 4). La visualización de la vía se muestra en la pestaña de red, donde miRNAs y moléculas se muestran como nodos enlaces que están relacionados con información asociada al gen de interés (figura 3). Una ventaja del software de análisis funcional es los resultados de relacionados con miRNA de alta calidad, incluyendo interacciones experimentalmente validadas y predichas. Las bases de datos de software de análisis funcional incluyen: validado experimentalmente microARN-mRNA interacciones bases23,24, la base de datos de interacción microARN-mRNA predijo con confianza bajo interacciones excluidas (por ejemplo, Scan Target)25, experimentalmente validado humanos, rata y ratón microARN-mRNA interacciones bases de datos (por ejemplo, miRecords)26y hallazgos de la literatura (por ejemplo,, relacionadas con el microARN resultados manualmente curados de literatura publicada por expertos científicos). Otros estudios que comparan la eficacia y la utilización de herramientas bioinformáticas para analizar vías de expresión de miRNA confirman la eficacia de este software27. General métodos computacionales son rentables, menos desperdiciador de tiempo y pueden ser validados fácilmente por métodos moleculares. Con el constante crecimiento y la acumulación de datos biomédicos, métodos bioinformáticos se convertirá en cada vez más poderosos en el descubrimiento de los mecanismos de procesos biológicos y enfermedad mediada por miRNA.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses que compiten.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por subvenciones de NIH K01HL133520 (PS) y K12HD055882 (PS). Los autores agradecen a Dr. Joanna Floros para la ayuda con experimentos de exposición de ozono.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | 000664 | 8 weeks old |
| UltraPure Water | Thermo Fisher Scientific | 10813012 | |
| Sterile plastic pipette | Fisher Scientific | 13-711-25 | Capacity: 1.7 mL |
| Frosted Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 2951TS | |
| Light microscope | Microscope World | MW3-H5 | 10x and 20x objective |
| Ketathesia- Ketamine HCl Injection USP | Henry Schein Animal Health | 55853 | 90 mg/kg. Controlled drug. |
| Xylazine Sterile Solution | Lloyd Laboratories | 139-236 | 10 mg/kg. Controlled Drug. |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | Dilute to 70% ethanol with water. |
| 21 G gauge needle | BD Biosciences | 305165 | |
| Syringe | Fisher Scientific | 329654 | 1 mL |
| Operating Scissors | World Precision Instruments | 501221, 504613 | 14 cm, Sharp/Blunt, Curved and 9 cm, Straight, Fine Sharp Tip |
| Tweezer Kit | World Precision Instruments | 504616 | |
| Spectrum Bessman Tissue Pulverizers | Fisher Scientific | 08-418-1 | Capacity: 10 to 50 mg |
| RNase-free Microfuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | AM12400 | 1.5 mL |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| Direct-zol RNA MiniPrep Plus | Zymo Research | R2071 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | |
| Mouse Inflammatory Response & Autoimmunity miRNA PCR Array | Qiagen | MIMM-105Z | |
| Thin-walled, DNase-free, RNase-free PCR tubes | Thermo Fisher Scientific | AM12225 | for 20 μL reactions |
| miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control | Qiagen | 219610 | |
| Microsoft Excel | Microsoft Corporation | https://office.microsoft.com/excel/ | |
| Ingenuity Pathway Analysis | Qiagen | https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/ | |
| R Software | The R Foundation | https://www.r-project.org/ | |
| Thermal cycler or chilling/heating block | General Lab Supplier | ||
| Microcentrifuge | General Lab Supplier | ||
| Real-time PCR cycler | General Lab Supplier | ||
| Multichannel pipettor | General Lab Supplier | ||
| RNA wash buffer | Zymo Research | R1003-3-48 | 48 mL |
| DNA digestion buffer | Zymo Research | E1010-1-4 | 4 mL |
| RNA pre-wash buffer | Zymo Research | R1020-2-25 | 25 mL |
| Ultraviolet ozone analyzer | Teledyne API | Model T400 | http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400 |
| Mass flow controllers | Sierra Instruments Inc | Flobox 951/954 | http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html |
References
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