Summary
Hier beschrijven we een methode voor de beoordeling van de Long-expressie van miRNAs die zijn voorspeld te reguleren van inflammatoire genen met behulp van muizen blootgesteld aan ozon of gefilterde lucht in verschillende stadia van de oestrische cyclus.
Abstract
MicroRNA (miRNA) profilering is geworden van belang aan onderzoekers werken in verschillende onderzoeksgebieden van biologie en geneeskunde. Huidige studies tonen een veelbelovende toekomst van het gebruik van miRNAs in de diagnose en behandeling van longziekten. Hier definiëren we een protocol voor miRNA profilering voor het meten van de relatieve overvloed van een groep miRNAs voorspeld te reguleren van inflammatoire genen in het longweefsel uit van een ozon-geïnduceerde luchtweg ontsteking muismodel. Omdat het heeft aangetoond dat circulerende sex-hormoonniveaus kan invloed hebben op de regulering van de aangeboren immuniteit longkanker bij vrouwen, is het doel van deze methode voor het beschrijven van een inflammatoire miRNA profilering protocol in vrouwelijke muizen, rekening houdend met de oestrische cyclus fase van elk dier op het moment van blootstelling van de ozon. We pakken ook toepassing bioinformatics benaderingen van miRNA ontdekking en target identificatie methodes gebruikend het limma, een R/Bioconductor-software, en functionele analysesoftware te begrijpen van de context van de biologische en de trajecten die zijn gekoppeld aan differentiële miRNA expressie.
Introduction
microRNAs (miRNAs) zijn korte (19 tot en met 25 nucleotiden), natuurlijke, niet-coderende molecules van RNA. Sequenties van miRNAs zijn evolutionaire bewaard over soorten, hetgeen wijst op het belang van miRNAs bij het reguleren van de fysiologische functies1. microRNA expressie profilering heeft bewezen nuttig zijn voor het identificeren van miRNAs die belangrijk zijn bij de regulering van een verscheidenheid van processen, waaronder de immuunrespons, celdifferentiatie ontwikkelings processen en apoptosis2. Meer recentelijk zijn miRNAs bekroond voor hun potentiële gebruik in diagnose van de ziekte en therapeutics. Voor onderzoekers bestuderen van mechanismen van genregulering, kan meten van miRNA expressie verlichten systemen-niveau modellen van regelgevende processen, vooral wanneer de miRNA informatie wordt samengevoegd met het mRNA profilering en andere gegevens van genoom-schaal3. Aan de andere kant, miRNAs hebben ook aangetoond dat het stabieler dan mRNAs in een scala van soorten van het specimen worden en zijn ook meetbaar met grotere gevoeligheid dan eiwitten4. Dit heeft geleid tot aanzienlijke belangstelling voor de ontwikkeling van miRNAs als biomarkers voor diverse moleculaire diagnostische toepassingen, met inbegrip van longziekten.
In de Long spelen miRNAs een belangrijke rol in de ontwikkelings processen en het onderhoud van homeostase. Bovendien is hun abnormale expressie geassocieerd met de ontwikkeling en de progressie van verschillende longziekten5geweest. Inflammatoire longziekte geïnduceerd door luchtverontreiniging blijkt grotere ernst en slechtere prognose bij vrouwtjes, die aangeeft dat de hormonen en de oestrische cyclus Long aangeboren immuniteit en miRNA expressie in reactie op de uitdagingen op milieugebied kunnen regelen 6. in dit protocol, gebruiken we ozon blootstelling, dat een belangrijk onderdeel van de luchtverontreiniging is, voor het opwekken van een vorm van Long ontsteking in vrouwelijke muizen dat zich bij het ontbreken van adaptieve immuniteit voordoet. Met behulp van ozon, zijn wij de ontwikkeling van hyperresponsiveness van de luchtwegen die wordt geassocieerd met luchtweg epitheliale celbeschadiging en een toename van de neutrofielen en inflammatoire mediatoren in proximale airways7inducerende. Er zijn op dit moment niet goed beschreven protocollen te karakteriseren en miRNAs over de oestrische cyclus in ozon-blootgesteld muizen analyseren.
Hieronder beschrijven we een eenvoudige methode om oestrische cyclus stadia en miRNA expressie in longweefsel van vrouwelijke muizen blootgesteld aan ozon te identificeren. Wij richten ook effectief bioinformatics benaderingen van miRNA ontdekking en target identificatie, met de nadruk op computationele biologie. We analyseren de microarray gegevens met behulp van limma, een R/Bioconductor-software die voorziet in een geïntegreerde oplossing voor het analyseren van de gegevens van gen expressie experimenten8. Analyse van PCR array gegevens uit limma heeft een voordeel in termen van macht over t-test gebaseerd procedures bij het gebruik van kleine aantal arrays/samples te vergelijken van expressie. Te begrijpen de biologische context van miRNA expressie resultaten, we dan de functionele analysesoftware gebruikt. Om de mechanismen tot regeling van transcriptionele veranderingen te begrijpen en te voorspellen waarschijnlijk resultaten, wordt de software combineert miRNA-expressie datasets en kennis van de literatuur9. Dit is een voordeel in vergelijking met software die kijk voor statistische verrijking in overlappende sets van miRNAs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Penn State University.
1. beoordeling van de oestrische cyclus stadium
- Goed beperken een vrouwelijke C57BL/6 muis (8-9 weken oud) met behulp van de muis van de hand terughoudendheid techniek beschreven in Machholz et al.,10.
- Vul de steriele plastic pipet met 10 μL van ultra zuiver water.
- De tip van de plastic pipet in de vagina te introduceren.
- Voorzichtig spoelen de vloeistof 4-5 keer te verzamelen van het monster.
- Plaats de laatste flush met vaginaal vocht op een glasplaatje.
- Observeer de onbevlekt vaginale flush onder een lichte Microscoop met een doelstelling van 20 x.
Opmerking: Dieren die geen regelmatige cycli als gevolg van pseudopregnancy of andere oorzaken vertonen moeten worden uitgesloten van het experiment. Het is raadzaam voor het uitvoeren van dagelijkse vaginale afscheidingen voor ten minste drie opeenvolgende cycli te bevestigen van cyclicity.
2. Gasbedwelming met behulp van ozon
- Plaats een maximum van 4 muizen in twee 1.2 L glas containers met draad mazen deksels en water ad libitum.
- Zet een glazen container in de zaal van ozon en de andere in de gefilterde luchtkamer in het blootstelling.
- De ozonconcentratie aan 2 ppm en monitor ozonniveaus regelmatig aanpassen.
Opmerking: De ozon-apparaat levert een gereglementeerde luchtstroom (> 30 air wijzigingen/h) met gecontroleerde temperatuur (25 ° C) en relatieve vochtigheid (50%). Het systeem genereert ozon door een elektrische ontlading ozonizer, die wordt gevolgd en gecontroleerd door een ultraviolet ozon analyzer en massastroom controllers, zoals eerder beschreven11. - Glazen containers verwijderen na 3U blootstellingsduur ozon/gefilterde lucht. Dieren cage met beddengoed, voedsel en water ad libitum retourneren
3. lung collectie
- 4 uur na de blootstelling, anesthetize dieren met een intraperitoneale injectie van een ketamine/xylazine cocktail (90 mg/kg ketamine, 10 mg/kg xylazine).
Opmerking: Om te bevestigen op een goed niveau van anesthesie, Controleer de muis voor een pedaal reflex (stevige teen snuifje) en pas de verdoving zo nodig. - Bevochtig de huid van de muis met 70% ethanol.
- Een middellijn-incisie van 2 cm, met behulp van een operationele schaar en chirurgische pincetten bloot de vena cava te maken.
- Offeren muizen door transect van de vena cava en de aorta. Indien nodig, een naald 21 G gauge invoegen de vena cava boven de renale aderen voor het verzamelen van bloed voorafgaand aan exsanguination. U kunt ook het verzamelen van bloed via hart punctie na standaardprotocollen.
- Gebruik een chirurgische scissor de buikholte opengesneden en verwijderen van de huid/Opper spier, verplaatsen naar boven richting de ribben.
- Gebruik een chirurgische schaar om perforaties van het middenrif.
Opmerking: Longen zal instorten uit de buurt van het middenrif. - Knippen weg de ribbenkast met behulp van een chirurgische scissor bloot van het hart en de longen.
- Met behulp van Tang, neem een 1,5 mL RNase-vrije microcentrifuge buis en het onderdompelen in vloeibare stikstof te vullen van de buis.
Opmerking: Gebruik beschermende handschoenen en bril om vloeibare stikstof. - De longen verwijderen, plaats ze in de RNase-vrije microcentrifuge 1,5 mL buizen gevuld met vloeibare stikstof aan module-freeze het weefsel en wacht een paar seconden totdat de vloeistof is verdampt.
- Sluit het deksel van de buis en het weefsel bij-80 ° C bewaren tot gebruik.
4. RNA voorbereiding
- Verpulveren hele longen met behulp van een roestvrijstalen weefsel vergruizers.
Opmerking: Het weefsel vergruizers moet worden geplaatst in vloeibare stikstof voorafgaand aan gebruik. De verstuiver schoon na elk gebruik met RNAse oplossing. - Splitsen van de verpulverde longen en leg in twee 1,5 mL buizen (elke halve Long).
- Voeg 500 µL guanidinium kaliumthiocyanaatoplossing per monsterbuisje en meng. Meng elk monster met behulp van 18 G 21 G en 23 G naalden, respectievelijk.
Opmerking: Monsters kunnen worden verrijkt met 5.6 x 108 exemplaren van een kleine RNA spike-controle (van een andere soort) voordat u verdergaat met de extractie. - 500 µL van ethanol toevoegen aan elk monster en de vortex voor 15 s.
- Belasting het mengsel in een spin-kolom in een collectie buis en centrifuge op 12.000 x g voor 1 min. negeren de doorstroming.
-
Voor DNase ik behandeling (in kolomindeling);
- Voeg 400 µL van RNA Wash Buffer en centrifuge bij 12.000 x g gedurende 1 minuut.
- In een RNase-gratis buis, voeg 5 µL van DNase ik 75 µL 1 x DNA spijsvertering buffer en meng. De mix rechtstreeks toevoegen aan de matrix van de kolom.
- Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
- Voeg 400 µL van RNA prewash oplossing aan de kolom en de centrifuge op 12.000 x g voor 1 min. negeren de doorstroming en herhaalt u deze stap.
- Voeg 700 µL van RNA was buffer naar de kolom en centrifuge op 12.000 x g voor 1 min. negeren de doorstroming.
- Centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 2 minuten om te verwijderen van de resterende buffer. Breng de kolom in een buis RNase-vrij.
- Om Elueer RNA, 35 µL van DNase/RNase-gratis water rechtstreeks toevoegen aan de matrix van de kolom en de centrifuge op 12.000 x g voor 1,5 min.
- Meten van de totale concentratie van RNA (260 nm) en zuiverheid met behulp van een spectrofotometer. Volg de instructies voor het uitvoeren van RNA kwantificering in een 1,5 µL monster aliquoot. Leeg het instrument met DNase/RNase-gratis water gebruikt voor elutie.
Opmerking: Een ratio van 260/280 van ~2.0 wordt het algemeen aanvaard als "pure" voor RNA. Typische RNA-concentratie varieert meestal tussen de 750 en 2.500 ng/µL. - Winkel bij-80 ° C.
5. miRNA Profiling
-
Naar retro-transcriberen kleine RNAs, gebruik 200 ng van totale RNA.
- De mix van de omgekeerde-transcriptie reactie op ijs (totale volume per reactie is 20 µL) voor te bereiden. Voeg voor elke reactie, 4 µL van 5 x buffer, 2 µL van 10 x nucleotiden Meng 2 µL van reverse-transcriptase en 2 µL van RNase-gratis water. Meng alle onderdelen en aliquot in 600 µL RNAse-gratis plastic buizen (10 µL van mix per reactie).
Opmerking: De omgekeerde-transcriptie master mix bevat alle onderdelen die nodig zijn voor de eerste-strand cDNA synthese behalve sjabloon RNA.
Opmerking: Berekenen van overtollige volume (10%) bij de voorbereiding van de master mix. - De sjabloon RNA toevoegen (200 ng in 10 µL) aan elke buis met omgekeerde-transcriptie master mix. Mix, centrifuge voor 15 s 1000 x gen bewaar ze op ijs tot plaatsing in thermocycler of dry block kalibrator.
- Incubeer gedurende 60 minuten bij 37 ° C.
- Incubeer gedurende 5 min bij 95 ° C en plaats de buizen op ijs.
- Verdun de cDNA door 200 µL RNase-gratis water toe te voegen aan elke 20 µL omgekeerde-transcriptie-reactie.
- De mix van de omgekeerde-transcriptie reactie op ijs (totale volume per reactie is 20 µL) voor te bereiden. Voeg voor elke reactie, 4 µL van 5 x buffer, 2 µL van 10 x nucleotiden Meng 2 µL van reverse-transcriptase en 2 µL van RNase-gratis water. Meng alle onderdelen en aliquot in 600 µL RNAse-gratis plastic buizen (10 µL van mix per reactie).
-
Uitvoeren van PCR in real time met behulp van de muis inflammatoire respons en autoimmuniteit miRNA PCR Array.
- Een reactie mix (totale volume 1100 µL) bereiden: voor elke reactie, 550 µL van 2 x PCR master mix, 110 µL van 10 x universele primer mix, 340 µL van RNase-gratis water en 340 µL van sjabloon cDNA (verdunde reactie uit stap 5.1.5) toevoegen.
- Voeg 10 µL van reactie mix aan elk putje van de vooraf geladen miRNA PCR Array gebruikmakend van een meerkanaals pipet.
- De miRNA PCR Array plaat met optische kleeffilm zegel.
- Centrifugeer de plaat voor 1 min bij 1.000 x g bij kamertemperatuur te verwijderen van de bubbels.
- Program het real-time cycler, PCR eerste activeringsstap voor 15 min bij 95 ° C, 3-staps fietsen met denaturatie voor 15 bij 94 ° C, gloeien voor 30 s s bij 55 ° C, en de uitbreiding voor 30 s bij 70 ° C gedurende 40 cycli nummer.
Opmerking: Volg fabrikant fietsen voorwaarden instructies voor het instellen van de real-time cycler. De dissociatie curve stap ingebouwd in de real-time cycler software uitvoeren. - Gegevensanalyses uitvoeren.
6. de gegevensanalyse
- Ct waarden van de real-time PCR-software voor elk monster extraheren in een analysesoftware.
Opmerking: A Ct waarde van 34 wordt beschouwd als de cutoff. Als monsters bevatten spike-controle (b.v., cel-mir-39), normaliseren Ct waarden aan de Prikker in controle voor elk monster. Drempelwaarden wellicht handmatig worden ingesteld. Waarden volgens de basislijn worden automatisch ingesteld. - Normaliseren van de Ct-waarden naar het gemiddelde Ct van zes miRNA huishouding besturingselementen: SNORD61, SNORD68, SNORD72, SNORD95, SNORD96A, RNU6-2, met behulp van de volgende vergelijking:
ΔCt = (Ct_Target − Ct_housekeeping) - Voor vouwen wijzigen berekeningen, ΔΔCt waarden met behulp van een specifiek voorbeeld als het besturingselement, met behulp van de relatieve expressie vergelijking12berekenen:
miRNA relatieve expressie:
2-∆∆Ct, waar - ∆∆Ct =-[∆Ct test - ∆Ct control]
Opmerking: Een verandering van de vouw van 200 wordt beschouwd als de cutoff. - Vouw expressie veranderingswaarden voor het uitvoeren van statistische analyses op R het limma pakket met Bioconductor8te exporteren.
- Voor meerdere vergelijkingen met behulp van de methode Benjamini-Hochberg13corrigeren.
Opmerking: Een kopie van de R-script is beschikbaar op: http://psilveyra.github.io/silveyralab/. Datasets en geanalyseerde gegevens zijn ook beschikbaar op de Gene Expression Omnibus onder nummer GSE111667, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE111667.
7. de data-analyse: Functionele analysesoftware
- De dataset regelen. MiRNAs met hun respectieve expressie log ratio's en de p-waarden bevatten. Zie tabel 1 voor het opmaken van de specifieke dataset.
- Open functionele analysesoftware (versie 01-10).
- Uploaden van de dataset gebruikend het volgende formaat: bestandsindeling: "Flexibele Format", bevat kolomkop: "Ja", selecteer ID type: "miRBase (volwassen)", Array platform gebruikt voor experimenten: Kies het matrix-platform.
Opmerking: Aanvaarde bestandsformaten zijn .txt (door tabs gescheiden tekstbestanden), .xls (excel-bestanden), en .diff (cuffdiff-bestanden). - Selecteer "Afleiden opmerkingen" en controleer of de experimentele groep labeling klopt.
- Ga naar "Dataset samenvatting" te herzien van de totale hoeveelheid toegewezen en niet-toegewezen miRNAs.
-
Klik op de "nieuwe" knop bovenaan links van het programma. Selecteer "Nieuwe MicroRNA Target Filter" en upload een microRNA dataset.
- Bron instellen: TarBase, vindingrijkheid deskundigen bevindingen, miRecords.
- Vertrouwen instellen: experimenteel waargenomen of hoog (voorspelde).
- Selecteer 'Kolommen toevoegen' om een verscheidenheid aan biologische informatie over de doelstellingen zoals de soorten, ziektes, weefsels, trajecten en meer.
- Om zich te concentreren op doelen die expressie in de experiment zijn gewijzigd, selecteert u "toevoegen / vervangen van mRNA dataset". Gebruik "Expressie Pairing" om te zoeken van de microRNAs met de niveaus van dezelfde of een andere expressie.
Opmerking: De filter-analyse krijgt microRNA namen en symbolen, mRNA doelen, de bron die de relatie van doel, en het betrouwbaarheidsniveau van de voorspelde relatie (Figuur 2 beschrijft).
- Klik op "Toevoegen aan mijn traject" voor het verzenden van de gefilterde dataset aan een traject canvas en meer biologische relaties te verkennen.
- Pad Designer gebruiken om een model van de publicatie-kwaliteit van microRNA effecten te maken.
-
Een alternatieve optie is het maken van een analyse van de kern.
- Voor de soort van de analyse van de kern, selecteert u "Expression Analysis".
- Meting in type selecteert u "Expr Log Ratio".
- De samenvatting van de Filter van de analyse: overwegen alleen moleculen en/of relaties waar: (soorten = muis) en (vertrouwen = experimenteel waargenomen) en (gegevensbronnen = "Vindingrijkheid deskundige bevindingen", "Vindingrijkheid ExpertAssist bevindingen", "miRecords", "TarBase", of " TargetScan mens").
- Selecteer een cutoff van p-waarde = 0,05.
- De analyse worden uitgevoerd.
Opmerking: In de lijst opgenomen: canonieke trajecten, stroomopwaartse regelgevende instanties analyse, ziekten en functies, regelgever effecten, netwerken, moleculen en meer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De verschillende soorten cellen waargenomen in de uitstrijkjes zijn gebruikt ter identificatie van de muis oestrische cyclus stadium (Figuur 1). Deze worden geïdentificeerd door de morfologie van de cel. Tijdens proestrus zijn cellen bijna uitsluitend clusters van rond-gevormde, goedgevormde genucleëerde epitheliale cellen (figuur 1A). Wanneer de muis in de estrus fase is, zijn cellen cornified squamous epitheliaale cellen, aanwezig in dichtbevolkte verpakte clusters (figuur 1B). Tijdens metestrus, cornified epitheliale cellen en polymorfonucleaire leukocyten worden gezien (Figuur 1 c). In diestrus zijn leukocyten (kleine cellen) over het algemeen vaker (Figuur 1 d).
We hebben opgehaald RNA van vier muis longen na het protocol beschreven. De concentraties van nucleïnezuur (ng / µL) varieerde tussen 1197.9 en 2178.1 met een gemiddelde van 1583.1 ± 215 (tabel 1). De gemiddelde verhouding van A260/A280 schommelde van 2.010 aan 2.020 met een gemiddelde van 2.016 ± 0.002. Aan de andere kant, de waargenomen A260/A230 verhoudingen schommelde tussen 2.139 en 2.223 met een gemiddelde van 2.179 ± 0.018.
Tabel 2 toont differentiële expressie resultaten verkregen met limma op R. We berekend top differentially uitgedrukte miRNAs tussen muizen blootgesteld aan ozon of gefilterde lucht in proestrus (met behulp van de opdracht toptable)14. De eerste kolom geeft de waarde van de verandering van de vouw log2-Vouw in miRNA expressie tussen ozon en gefilterde lucht blootgesteld dieren. De kolom t vertegenwoordigt de gematigde toetsingsgrootheid t berekend voor elke miRNA in de vergelijking. De kolommen p.value en adj.p.value vertegenwoordigen bijbehorende p-waarden voor elke vergelijking voor en na meerdere testen aanpassing, respectievelijk. Aanpassing voor meerdere vergelijkingen werd gedaan met de Benjamini en Hochberg de methode om te controleren de valse ontdekking tarief15. Kolom B vertegenwoordigt de log-odds thats de miRNA differentially uitgedrukte8.
We de miRNA doel filter en core analyse waarin de verrijking traject analyse uitgevoerd. Na het uploaden van een lijst van 14 miRNAswith de verhouding tussen de aanzienlijke expressie log en de p-waarde, werden alle van hen toegewezen door de miRNA doel filter (tabel 3). De resultaten waren gefilterd en gesorteerd op om naar bepaalde trajecten, in dit geval de "cellulaire immuunrespons". De analyse van de kern verstrekt informatie over canonieke trajecten, ziekten en functie, regelgevers en netwerken (tabel 4). De functionele analysesoftware geproduceerd een netwerkanalyse die de relatie tussen de miRNAs van belang en andere moleculen (Figuur 3 toont).
Figuur 1: identificatie van oestrische cyclus stadia. (A) Proestrus (voornamelijk genucleëerde epitheliale cellen); (B) estrus (voornamelijk kernloze cornified cellen); (C) metestrus (alle drie typen cellen); en (D) diestrus 2 (meerderheid van leukocyten). Schaal bar = 100 µm. vergroting = 20 x. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: functionele analyse software representatieve resultaten: miRNA doel filter. Uitgebreide Profiel van miRNAs in de verschillende stadia van de oestrische cyclus. Na het uitvoeren van miRNA filter, levert de software gedetailleerde lijsten van genen en verbindingen betrokken bij ziekten en andere fenotypen, die kunnen filteren en sorteren om naar bepaalde trajecten, in dit geval "Cellulaire immuunrespons". Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: functionele analyse software representatieve resultaten: netwerken. Vergelijking van netwerken beïnvloed door gefilterde lucht of ozon blootstelling bij vrouwtjes in verschillende stadia van de oestrische cyclus. Diagram van biologische netwerken die zijn gekoppeld aan de miRNAs in de longen van vrouwelijke muizen blootgesteld aan gefilterde lucht vs. ozon in de proestrus (A) of niet-proestrus fasen (B). Dit cijfer is gewijzigd van Fuentes et al.6. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| ID | Nucleic Acid (ng/µL) | A260/A280 | A260/A230 |
| Voorbeeld 1 | 1197.930 | 2.015 | 2.192 |
| Voorbeeld 2 | 1355.703 | 2.018 | 2.223 |
| Monster 3 | 2178.104 | 2.020 | 2.163 |
| Monster 4 | 1600.837 | 2.010 | 2.139 |
| Gemiddelde | 1583.144 ± 215 | 2.016 ± 0.002 | 2.179 ± 0.018 |
Tabel 1: voorbeeld van RNA concentraties en absorptie ratio's op 260, 230 en 280 nm uit gezuiverde Long weefselmonsters van vier muizen. Concentraties werden gemeten met een spectrofotometer.
| logFC | t | P.Value | adj. P.Val | B | |
| MMU-miR-694 | 1.492 | 4.071 | 0.000153 | 0.009514 | 0.759 |
| MMU-miR-9-5 p | 0.836 | 3.916 | 0.000254 | 0.009514 | 0.289 |
| MMU-miR-221-3 p | 0.385 | 3.106 | 0.003014 | 0.075361 | -1.982 |
| MMU-miR - 181d - 5p | 0.597 | 2.891 | 0.005516 | 0.103424 | -2.526 |
| MMU-miR-98-5 p | 0.558 | 2.699 | 0.009243 | 0.138649 | -2.987 |
| MMU-miR-712-5 p | 0.667 | 2.563 | 0.013169 | 0.164609 | -3.299 |
| MMU-miR-106a - 5p | -0.528 | -2.412 | 0.019278 | 0.206547 | -3.632 |
Tabel 2: Limma analyse resultaten voor differentially uitgedrukte miRNAs bij vrouwen die zijn blootgesteld aan ozon VS . lucht gefilterd in de proestrus fase.
| miRNAs ID | Waarneming 1 | Waarneming 1 | Waarneming 2 | Waarneming 2 |
| Expr Log verhouding | P-waarde | Expr Log verhouding | P-waarde | |
| MMU-miR-694 | 1.492 | 0.000153 | 0.543319208 | 0.0021385 |
| MMU-miR-9-5 p | 0.836 | 0.000254 | 0.677595421 | 0.004997439 |
| MMU-miR-221-3 p | 0.385 | 0.003014 | ||
| MMU-miR - 181d - 5p | 0.597 | 0.005516 | 0.342276659 | 0.106467657 |
| MMU-miR-98-5 p | 0.558 | 0.009243 | 0.455392799 | 0.034724699 |
| MMU-miR-712-5 p | 0.667 | 0.013169 | ||
| MMU-miR-106a - 5p | -0.528 | 0.019278 |
Tabel 3: voorbeeld indeling voor multi observatie uploaden van datasets aan functionele analysesoftware. Meerdere experimentele differentiële expressies kunnen worden gegroepeerd in een enkel werkblad en geüpload, en zo veel opmerkingen zo nodig kunnen worden toegevoegd. Kolommen: 1) miRNAs ID; 2) observatie 1: Expr Log verhouding; 3) observatie 1: P-waarde; 4) observatie 2: Expr Log verhouding; 5) observatie 2: P-waarde.
| Non-proestrus | Proestrus | ||||
| A. genen gericht door differentially uitgedrukte miRNAs | |||||
| CAMK2N1 | PAFAH1B2 | SEC23A | ABCB9 | FGD4 | SLC25A27 |
| AUTO 'S | PDE4B | SNX5 | APOO | FRMD4B | SLC38A1 |
| CYP24A1 | PDE7A | SYT4 | ARHGEF38 | GPR137B | TMCC1 |
| DBF4 | PGM3 | THAP12 | AVEN | HMBS | TRIM71 |
| HMGN2 | PNP | TMED7 | CASP3 | METAP1 | XKR8 |
| KMT5A | REV1 | TNFAIP2 | CCNJ | MITF | ZCCHC11 |
| LRRC17 | RPS19BP1 | TNFRSF10C | CMTR2 | MYC | ZIM3 |
| MDH2 | RRAD | TP53 | CNMD | RGMB | ZNF181 |
| MIS18A | SEC62 | UBE2V2 | DSCR8 | SLC14A1 | |
| ZNF420 | |||||
| B. verschillen in top ziekten en biofunctions | |||||
| Ziekten en aandoeningen | P -waarde | Ziekten en aandoeningen | P -waarde | ||
| Ontstekingsziekte | 3.84E-02 - 3.84E-05 | Organisch letsel en afwijkingen | 4.96E-02 - 2.77E-14 | ||
| Inflammatoire respons | 3.84E-02 - 3.84E-05 | Reproductieve systeem ziekte | 2.15E-02 - 2.77E-14 | ||
| Organisch letsel en afwijkingen | 4.17E-02 - 4.17E-05 | Kanker | 4.96E-02 - 1.27E-10 | ||
| C. top moleculaire en cellulaire functies | |||||
| Moleculaire en cellulaire functies | P Waarde | Moleculaire en cellulaire functies | P Waarde | ||
| Cellulaire ontwikkeling | 2.05E-02 - 5.26E-07 | Cellulaire verkeer | 3.77E-02 - 4.47E-07 | ||
| Cellulaire compromis | 3.75E-04 - 3.75E-04 | Cellulaire dood en overleving | 4.91E-02 - 5.61E-06 | ||
| Celcyclus | 2.62E-03 - 2.62E-03 | Cellulaire ontwikkeling | 4.97E-02 - 1.38E-06 | ||
| D. top fysiologische systeemontwikkeling en functie | |||||
| Ontwikkeling en functie | P Waarde | Ontwikkeling en functie | P Waarde | ||
| Organisch ontwikkelen | 4.17E-02 - 1.31E-03 | Embryonale ontwikkeling | 3.30E-02 - 2.12E-05 | ||
| Embryonale ontwikkeling | 1.29E-02 - 1.29E-02 | Bindweefsel ontwikkeling en functie | 1.79E-02 - 6.10E-05 | ||
| Bindweefsel ontwikkeling en functie | 1.93E-02 - 1.93E-02 | Weefsel morfologie | 7.88E-05 - 7.88E-05 | ||
| E. Top verbonden netwerkfuncties | |||||
| Verbonden netwerkfuncties | Score | Verbonden netwerkfuncties | Score | ||
| Cellulaire ontwikkeling, ontstekingsziekte, inflammatoire respons | Organisch letsel en afwijkingen, reproductieve systeem ziekte, kanker | ||||
| 6 | 19 | ||||
Tabel 4: functionele analysesoftware Samenvatting van vrouwen die zijn blootgesteld aan ozon in de niet-proestrus vs. proestrus fasen. De functionele analysesoftware maakt de analyse van de bovenste canonieke trajecten, stroomopwaartse regelgevende instanties, ziekten & functies, top functies, regelgever effect netwerken en meer. Deze tabel is gewijzigd van Fuentes et al.6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MicroRNA profilering is een voordelige techniek voor de diagnose van de ziekte zowel mechanistisch onderzoek. In dit manuscript, hebben we een protocol om te evalueren van de expressie van miRNAs die zijn voorspeld te reguleren van inflammatoire genen in de longen van vrouwelijke muizen blootgesteld aan ozon in verschillende oestrische cyclus fasen gedefinieerd. Methoden voor de bepaling van de oestrische cyclus, zoals de visuele detectiemethode, zijn beschreven16. Echter dit vertrouwen op eenmalige metingen, en daarom zijn onbetrouwbaar. Als u wilt nauwkeurig identificeren alle stadia van de oestrische cyclus bij vrouwen die regelmatig cyclus, wordt de hier beschreven methode aanbevolen. Dit eenvoudige protocol kan daarnaast ook worden gebruikt aan niet indirect schatten dagelijkse hormonale schommelingen in muizen. Ter voorkoming van activering van ongewenste inflammatoire reacties als gevolg van vaginale irritatie, bemonstering moet slechts eenmaal per dag worden uitgevoerd. Vanwege de variabiliteit in de lengte van de cyclus en de huisvesting van invloeden, is het belangrijk voor het uitvoeren van het protocol voor twee tot drie volledige cycli voor het gebruik van dieren in een experiment dat gezien de fase van de cyclus.
Voor de succesvolle extractie van RNA van longweefsel is een nauwkeurige procedure van cruciaal belang. Dit protocol beschrijft een eendaagse methode om te isoleren van RNA van longweefsel die kwalitatief hoogwaardige RNA levert. Wijzigingen van de fabrikant protocol moesten efficiënt uittreksel RNA van longen. Wij toegevoegd een extra centrifugeren stap na toevoeging van de buffer wassen zoveel buffer mogelijk verwijderen. Wij ook geëlueerd RNA met 35 µL DNase/RNase-gratis water, centrifugeren van de kolom voor 1,5 min om hoge concentraties. Spectrofluorometer resultaten bevestigd dat de effectiviteit van onze RNA extractie protocol. De verhouding tussen de absorptie bij 260 en 280 nm (A260/280 ratio) wordt vaak gebruikt ter beoordeling van de zuiverheid van RNA-preparaten. De maximale absorbantie voor nucleïnezuren is 260 en 280 nm, respectievelijk. Het wordt geaccepteerd als "pure" voor RNA als de verhouding ongeveer 2,017 is. Ook voor de A260/A230 besmetting Extinctieverhouding zijn de waarden voor zuiverheid in het bereik van 2.0-2.218. In deze studie, de gemiddelde A260/A280 en A260/A230 ratio's waargenomen waren 2.016 ± 0.002 en 2.179 ± 0.018, respectievelijk (tabel 1). Daarom is ons RNA extractie protocol was succesvol. Een ander voordeel van het gebruikte protocol is de toevoeging van de DNAse behandeling. Dit is belangrijk om te voorkomen dat genomic DNA besmetting19. Een beperking van dit RNA isolatie protocol is het gebruik van zuivering kolommen te ontdoen van afval door neerslag gebruik van alcohol, omdat sommige longkanker puin het membraan, geheel of gedeeltelijk belemmeren kan, wat resulteert in lage opbrengst. Ook, als de homogenisering stap is niet zorgvuldig uitgevoerd, grote hoeveelheden van Long RNA kunnen gemakkelijk verloren of gedegradeerd. Als lage opbrengsten van RNA worden verkregen, kan RNA worden opnieuw gezuiverd en geëlueerd in een kleiner volume. Anderzijds kunnen RNA geprecipiteerde overnachting volgende gepubliceerde protocollen20.
Microarray technologieën toegepast op miRNA profilering zijn veelbelovende tools in veel onderzoeksgebieden. In onze studie gebruikten we PCR arrays, die het voordeel van hogere detectie drempel en normalisatie strategieën voor detectie van differentially uitgedrukte miRNAs vs. andere technologieën zoals sonde gebaseerde miRNA arrays21. Een beperking van dit protocol is dat het vereist een minimum bedrag van het starten van RNA materiaal, en de beschikbaarheid van specifieke reeksen inleidingen voor de miRNAs van belang, in tegenstelling tot andere beschikbare technieken zoals RNAseq. Een ander voordeel van PCR-gebaseerde matrices is de optie van het gebruik van niet-miRNA referentie genen voor qPCR normalisatie (zoals kleine nucleolar RNAs of SNORDs) voor het berekenen van de differentiële expressie van miRNAs. Ten slotte, met behulp van PCR arrays biedt verschillende opties voor data-analyse, variërend van online hulpmiddelen die door de fabrikanten, de conventionele methoden voor het detecteren van differentiële expressie echter Real-Time PCR. Statistische analyse met limma is geschikt voor zowel microarrays en PCR-gebaseerde arrays en de empirische Bayes gemodereerd f- Statistics22gebruikt. Hier, laten we zien dat zowel de p-waarden en de q-waarden (gecorrigeerd voor meerdere testen) kunnen worden verkregen met de opdracht toptable aanpassen van de drempel van het tarief valse ontdekking en identificatie van differentially miRNAs uitgedrukte.
Functionele analysesoftware is een web-based applicatie voor data-analyse in het kader van het traject. De software geeft onderzoekers krachtige zoekmogelijkheden vaardigheden die bij het frame datasets of specifieke doelen in context, binnen een groter plaatje van biologische betekenis helpen kunnen. Hoewel de Softwareomgeving flexibel aan verschillende soorten analyse is (dat wil zeggen, metabolomica, SNPs, proteomics, microRNA, toxicologie, etc.), ons doel hier is om te markeren van aspecten van miRNA analyse. Na het uploaden van een lijst van 14 miRNAs met significante expressie log-ratio's en p-waarden, waren allemaal toegewezen door de software. We de miRNA doel filter en core analyse, waarin de verrijking traject analyse uitgevoerd. Deze analyses echter genen waarvoor de 14 miRNAs wordt voorspeld dat de doel- en niet de miRNAs zelf. Het gedeelte ' resultaten ' lijsten uitgangen zoals: canonieke trajecten, ziekten en functie, genen gericht door differentially uitgedrukte miRNAs, fysiologische systeemontwikkeling, regelgevers en netwerken (tabel 4). De visualisatie van het traject wordt weergegeven onder het tabblad netwerk, waar miRNAs en moleculen worden getoond als klikbare knooppunten die zijn gekoppeld aan gegevens gekoppeld aan het gen van belang (Figuur 3). Een voordeel van de functionele analysesoftware is de kwalitatief hoogwaardige miRNA-gerelateerde resultaten, met inbegrip van zowel experimenteel gevalideerde en voorspelde interacties. De functionele analyse software databases omvatten: experimenteel gevalideerde microRNA-mRNA interacties databases23,24, voorspelde microRNA-mRNA interactie database met lage-vertrouwen interacties (bijvoorbeeld uitgesloten Target Scan)25, experimenteel gevalideerde mens, rat, en muis microRNA-mRNA interacties databases (bijvoorbeeld miRecords)26en literatuur bevindingen (b.v., microRNA-gerelateerde vaststellingen handmatig samengesteld uit gepubliceerde vakliteratuur door de wetenschappelijke deskundigen). Andere studies vergelijken de effectiviteit en bruikbaarheid van bioinformatica tools voor het analyseren van de trajecten die zijn gekoppeld aan miRNA expressie bevestigen de effectiviteit van deze software-27. Algemene, computationele methoden zijn kosteneffectief, minder tijdrovend en gemakkelijk kunnen worden gevalideerd door moleculaire methoden. Met de constante groei en accumulatie van biomedische gegevens, zal bioinformatics methoden worden steeds krachtiger in de ontdekking van miRNA-gemedieerde mechanismen van biologische en ziekte processen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende belangen hebben.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gesteund door subsidies van NIH K01HL133520 (PS) en K12HD055882 (PS). Dr. Joanna Floros bedanken de auteurs voor de hulp met ozon blootstelling experimenten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | 000664 | 8 weeks old |
| UltraPure Water | Thermo Fisher Scientific | 10813012 | |
| Sterile plastic pipette | Fisher Scientific | 13-711-25 | Capacity: 1.7 mL |
| Frosted Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 2951TS | |
| Light microscope | Microscope World | MW3-H5 | 10x and 20x objective |
| Ketathesia- Ketamine HCl Injection USP | Henry Schein Animal Health | 55853 | 90 mg/kg. Controlled drug. |
| Xylazine Sterile Solution | Lloyd Laboratories | 139-236 | 10 mg/kg. Controlled Drug. |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | Dilute to 70% ethanol with water. |
| 21 G gauge needle | BD Biosciences | 305165 | |
| Syringe | Fisher Scientific | 329654 | 1 mL |
| Operating Scissors | World Precision Instruments | 501221, 504613 | 14 cm, Sharp/Blunt, Curved and 9 cm, Straight, Fine Sharp Tip |
| Tweezer Kit | World Precision Instruments | 504616 | |
| Spectrum Bessman Tissue Pulverizers | Fisher Scientific | 08-418-1 | Capacity: 10 to 50 mg |
| RNase-free Microfuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | AM12400 | 1.5 mL |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| Direct-zol RNA MiniPrep Plus | Zymo Research | R2071 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | |
| Mouse Inflammatory Response & Autoimmunity miRNA PCR Array | Qiagen | MIMM-105Z | |
| Thin-walled, DNase-free, RNase-free PCR tubes | Thermo Fisher Scientific | AM12225 | for 20 μL reactions |
| miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control | Qiagen | 219610 | |
| Microsoft Excel | Microsoft Corporation | https://office.microsoft.com/excel/ | |
| Ingenuity Pathway Analysis | Qiagen | https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/ | |
| R Software | The R Foundation | https://www.r-project.org/ | |
| Thermal cycler or chilling/heating block | General Lab Supplier | ||
| Microcentrifuge | General Lab Supplier | ||
| Real-time PCR cycler | General Lab Supplier | ||
| Multichannel pipettor | General Lab Supplier | ||
| RNA wash buffer | Zymo Research | R1003-3-48 | 48 mL |
| DNA digestion buffer | Zymo Research | E1010-1-4 | 4 mL |
| RNA pre-wash buffer | Zymo Research | R1020-2-25 | 25 mL |
| Ultraviolet ozone analyzer | Teledyne API | Model T400 | http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400 |
| Mass flow controllers | Sierra Instruments Inc | Flobox 951/954 | http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html |
References
- Rebane, A., Akdis, C. A. MicroRNAs: Essential players in the regulation of inflammation. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (1), 15-26 (2013).
- Cannell, I. G., Kong, Y. W., Bushell, M. How do microRNAs regulate gene expression? Biochemical Society Transactions. 36 (Pt 6), 1224-1231 (2008).
- Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nature Reviews Genetics. 13 (5), 358-369 (2012).
- Mi, S., Zhang, J., Zhang, W., Huang, R. S. Circulating microRNAs as biomarkers for inflammatory diseases. Microrna. 2 (1), 63-71 (2013).
- Sessa, R., Hata, A. Role of microRNAs in lung development and pulmonary diseases. Pulmonary Circulation. 3 (2), 315-328 (2013).
- Fuentes, N., Roy, A., Mishra, V., Cabello, N., Silveyra, P. Sex-specific microRNA expression networks in an acute mouse model of ozone-induced lung inflammation. Biology of Sex Differences. 9 (1), 18 (2018).
- Aris, R. M., et al. Ozone-induced airway inflammation in human subjects as determined by airway lavage and biopsy. American Review of Respiratory Disease. 148 (5), 1363-1372 (1993).
- Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Research. 43 (7), e47 (2015).
- Krämer, A., Green, J., Pollard, J., Tugendreich, S. Causal analysis approaches in Ingenuity Pathway Analysis. Bioinformatics. 30 (4), 523-530 (2014).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).
- Umstead, T. M., Phelps, D. S., Wang, G., Floros, J., Tarkington, B. K. In vitro exposure of proteins to ozone. Toxicology Mechanisms and Methods. 12 (1), 1-16 (2002).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Phipson, B., Lee, S., Majewski, I. J., Alexander, W. S., Smyth, G. K. Robust hyperparameter estimation protects against hypervariable genes and improves power to detect differential expression. Annals of Applied Statistics. 10 (2), 946-963 (2016).
- Smyth, G. K., et al. Linear Models for Microarray and RNA-Seq Data User's Guide. Bioconductor. , (2002).
- Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing. Journal of the Royal Statistical Society. Series B (Methodological). 57 (1), 289-300 (1995).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. Public Library of Science ONE. 7 (4), e35538 (2012).
- Alves, M. G., et al. Comparison of RNA Extraction Methods for Molecular Analysis of Oral Cytology. Acta Stomatologica Croatica. 50 (2), 108-115 (2016).
- Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity. Biotechniques. 22 (3), 478-481 (1997).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
- Walker, S. E., Lorsch, J.
- Git, A., et al. Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression. RNA. 16 (5), 991-1006 (2010).
- Smyth, G. K. Limma: linear models for microarray data. Bioinformatics and Computational Biology Solutions Using R and Bioconductor. , 397-420 (2005).
- Griffiths-Jones, S. miRBase: the microRNA sequence database. Methods Mol Biol. 342, 129-138 (2006).
- Sethupathy, P., Corda, B., Hatzigeorgiou, A. TarBase: A comprehensive database of experimentally supported animal microRNA targets. RNA. 12 (2), 192-197 (2006).
- Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs. eLife. 4, e05005 (2015).
- Xiao, F., Zuo, Z., Cai, G., Kang, S., Gao, X., Li, T. miRecords: an integrated resource for microRNA-target interactions. Nucleic Acids Res. 37, D105-D110 (2009).
- Mullany, L. E., Wolff, R. K., Slattery, M. L. Effectiveness and Usability of Bioinformatics Tools to Analyze Pathways Associated with miRNA Expression. Cancer Informatics. 14, 121-130 (2015).
