Summary
在这里, 我们描述了一个详细的协议, 概述了一种新的荧光染色技术的总蛋白检测在聚丙烯酰胺凝胶。该协议采用了银离子特异性荧光开启探针, 可检测银+蛋白复合物, 并消除了传统的铬性银渍的某些限制。
Abstract
银染色是一种比色技术, 广泛用于可视化聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质带, 遵循十二烷基硫酸盐-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)。经典的银渍有一定的缺点, 如背景染色高、蛋白质恢复不良、重现性差、定量线性动态范围窄、与质谱 (MS) 的相容性有限。现在, 利用氟生成银 + 探针 Tpe-4ta ,我们开发了一种荧光银染色方法, 用于聚丙烯酰胺凝胶中的总蛋白可视化。这种新的污渍避免了传统银渍中麻烦的银还原步骤。此外, 荧光银染色在蛋白质检测中具有良好的重现性、灵敏度和线性定量性, 是一种实用的蛋白质凝胶染色。
Introduction
许多染色方法已被用来可视化蛋白质凝胶电泳后, 例如使用比色染料, 如铜丝明亮蓝, 银染色, 荧光, 或放射性标记1,2,3 个,4. 银染色被认为是蛋白质检测最敏感的技术之一, 需要简单和廉价的试剂。它可分为两个主要的家庭: 氨银染色和硝酸银染色5,6。在碱性氨基银法中, 用氨和氢氧化钠生产银-二胺复合物, 并在开发过程中使用酸性甲醛溶液还原为金属银。该染色可有效地适应基本蛋白质, 但对酸性和中性蛋白表现出的性能受到损害, 而且仅限于经典的甘氨酸和牛磺酸电泳系统。相比之下, 硝酸银污渍利用了银离子对蛋白质的高生物亲和力, 主要是侧链中的磺基和羧基, 并倾向于更有效地染色酸性蛋白质 7.银离子结合后, 开发中的溶液 (通常由含有甲醛和硫代硫酸钠的金属碳酸盐溶液制成) 被用来减少银离子对金属银粒, 这就建立了一个棕色到深色的可视化蛋白带。
虽然银染色自1970年代8以来一直以其多功能性和高灵敏度而闻名, 但这种方法经常被认为是棘手的。银染法具有时间限制的步骤, 重现性低。由于银染色的颜色通常不均匀, 依赖于还原步骤, 这是很难控制的, 银染色不是一个定量的方法, 因此, 不建议用于凝胶比较研究和蛋白质定量9。在灵敏度上优化的方法可以利用醛, 这也可以提供更均匀的染色10。然而, 这是以牺牲进一步的下游分析为代价的, 因为蛋白质通过醛的交联。快速协议大多结合或缩短步骤, 以减少时间, 损害了染色的重现性和均匀性5。因此, 在蛋白质凝胶染色中有许多银染色变种, 每一种都经过优化, 以满足某些要求;例如, 用于下游分析的简单性、灵敏度或肽回收率。这些属性也可能对彼此产生影响, 在一个协议中满足所有要求可能会很困难。
本文介绍了一种新的聚丙烯酰胺凝胶蛋白质检测荧光银染色方法。在这种方法中, 我们使用了银离子的荧光探针Tpe-4ta (图 1), 以可视化浸银的蛋白质11。Tpe-4ta是根据聚合诱导发射 (aie) 原理设计的。它在水溶液中溶解时不具有发射性, 但在银离子存在的情况下具有高度的发射性。荧光银方法取代了传统银污渍中的显色发育, 从而使总蛋白质在减少背景的情况下进行了鲁棒染色。
此外, 荧光银染色在蛋白质定量方面表现出良好的动态线性范围, 与广泛使用的 SYPRO 红宝石染色相当, 与传统的银染色无法实现。这种凝胶可以在许多生物实验室的常用凝胶文档系统上成像 (激发波长: 302165nm 通道; 发射: ~ 490-530 nm)。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 凝胶的制备
注: 演示遵循标准协议, 在 SDS-PAGE12之后不久准备凝胶染色。简单地说, 下面的步骤描述了样品的制备和凝胶电泳。
- 使用含有 2-(n-吗啡) 乙醇磺酸 (mes) 缓冲液 (mes) 的微型凝胶罐, 使用 4%-12% 的 bis-tris蛋白凝胶 (1 毫米, 15 孔) 进行 SDS-PAGE。
- 用蒸馏水、硫酸锂 (LDS) 缓冲液和样品还原剂混合稀释样品。
- 加载第一车道的库存量 (10μl) 的两倍, 其次是正常的库存量 (5μl) 和随后的库存的一系列两次稀释 (13 稀释, 从2倍到 8192x)。
- 在 200 V 的恒定电压下运行凝胶30分钟。
2. 凝胶固定
- 电泳后, 在室温 2倍 (每次 30分钟) 或在4°c 的夜间, 将凝胶浸入100毫升的100毫升溶液中, 浓度为40% 乙醇-10% 乙酸, 在室温振动台上, 每小时为 2X (每次 30分钟)。
- 在一个干净的容器中, 用超纯水清洗凝胶 3 x 10分钟。清洗步骤是至关重要的。如果在荧光发育步骤中不正确去除固定溶液中的酸, 过量的 Tte-4ta将被该酸激活, 并导致凝胶中的强背景荧光。
3. 凝胶银液和银浸渍液的制备
- 制造 AgNO3溶液 (0.001%)对于浸渍, 首先, 溶解 0.01 g 的 AgNO 3 在10毫升的超纯水, 以制备0.1% 的 agno 3 库存溶液.接下来, 将 0.1% AgNO 3 库存溶液中的100Μl 添加到100毫升的超纯水中, 制成工作溶液.
注意: AgNO3溶液应在使用前存放在黑暗中。 - 在50转/分的情况下, 将凝胶浸入密封玻璃容器中, 用100毫升的银工作溶液浸渍1小时。在烟头下进行银浸渍是至关重要的, 用铝箔保护免受光线的影响。
- 用超纯水 (约100毫升) 在干净的容器中清洗凝胶 2 x 60秒。
4. 凝胶的氟原发育
- 要制备染料库存溶液 (0.1 mM), 请在50毫升的超纯水中加入 3.0 mg 的Tpe-4ta染料。将溶液涂成几分钟, 加入一些 NaOH 溶液 (例如 1m), 以帮助溶解染料。
- 检查365nm 紫外线灯下溶液的荧光, 以确保染料分子完全溶解。只有弱或非发射溶液表明完全溶解。
注: 染料Tpe-4ta是按照谢人等人最近报告的协议合成的.10 tpe-4ta解决方案非常稳定, 可以在黑暗中保存数月。 - 为制备100毫升的氟生成发育溶液 (10μm), 将Tpe-4ta库存溶液的10毫升加入到90毫升的超纯水中。使用 pH 计检查溶液的 pH 值, 并使用氢氧化钠溶液 (1μm) 将其调整为7-9。
- 将凝胶转移到具有100毫升荧光发育溶液的清洁密封容器中。确保凝胶完全浸入溶液中。密封容器。将其从光线中覆盖, 并在室温下的轨道振动台夜间在50转的情况下摇一摇。或者, 通过将 AIE 开发的溶液预热到80°c 进行染色, 然后将其留在室温下, 也可以将培养步骤缩短到约约约2小时。
5. 销毁和成像
- 将凝胶转移到干净的容器中, 并以10% 乙醇的100毫升将其转移30分钟。
注: 仅水就可用于清洗凝胶。然而, 使用10% 乙醇溶液进行去抽油更省时。这将有助于将下落过程从几小时缩短到30分钟。 - 用超纯水冲洗凝胶5分钟。
- 通过凝胶文档机将 365 nm 通道或 302 nm 通道上的凝胶成像。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
荧光银染色所染色的蛋白质带在365纳米紫外线灯下表现出强烈的绿色荧光。所有14个蛋白质带 (10-200 kDa), 从上到下, 都是清晰可见的, 与 SYPRO 红宝石染料染色的14个红色蛋白带 (图 2)10有很好的相关性。
在定量蛋白质检测方面, 利用全自动程序对凝胶进行了凝胶成像系统的成像, 并利用商业软件对其进行了分析和比较。这种荧光银染色方法似乎具有较高的分辨率。对于某些蛋白质带, 荧光银染色的灵敏度也比荧光 SYPRO 红宝石染色略好。特别是对 ~ 10 ~ 40 kDa 蛋白带的荧光银染色性能进行了改进, 表明该方法对低分子量蛋白质的检测特别有用。数据还表明, 荧光银染色在相对广泛的蛋白质定量范围内, 为所有14种蛋白质提供了良好和均匀的线性度 (图 3)11。
与硝酸盐银染色提供高水平的背景信号和扭曲的峰值相比, 荧光银染色检测到的波段具有良好的对比度和均匀的强度分布, 与所有14种蛋白质的 SYPRO 红宝石染色相当(图 3)。
请注意, 凝胶固定后的清洗不足会导致高背景染色 (图 4)。残留的醋酸会照亮Tpe-4pa , 并导致一个强大的背景。
图 1: TPE-4TA 的化学结构及其对ag +的传感机制.X = H 或 Na+。改编自以前的作品, 版权 2018年 WLEY-VCH11。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 荧光银染色.A)协议摘要。B)与365nm 辐照下的手持紫外线灯平行的荧光银染色 (左) 和 sypro 红宝石染色 (右) 染色凝胶的比较。从 200-500 Ng\ 带开始, 在最左车道上, 蛋白质 (10-200 kda) 通过两次连续稀释加载。改编自以前的作品, 版权 2018年 WLEY-VCH11。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 蛋白质相对于蛋白质量、代表性凝胶图像和三种不同污渍的凝胶的信号分布 (来自第五车道) 的荧光强度.(A) 硝酸银染色,(b) 荧光银染色 (365 纳米激发), 和 (c) sypro 红宝石染色。图的第一列显示了14种蛋白质 (10-200 kDa) 的每个波段的染色强度与归一至第一车道 (从左侧开始) 的蛋白质量的关系。第二列显示相应污渍的代表性凝胶图像。加载到凝胶中的蛋白质量如图 2所示。改编自以前的作品, 版权 2018年 WLEY-VCH11。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 来自次优实验的染色凝胶.在本实验中, 固定步骤后的洗涤不足。残余醋酸诱导Tpe-4ta 聚集, 形成了强烈的背景。请点击这里查看此图的较大版本.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
本文介绍了一种新的聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质荧光银染色方法。这种策略集成了传统的银渍和荧光污渍。染色利用银离子与其他银渍中的蛋白质的选择性结合, 但采用了高度敏感的荧光银探针Tpe-4ta 来点燃银结合蛋白。由于荧光探针Tpe-4ta 可以在纳米摩尔范围11中以相当低的浓度检测银离子, 因此它能够进行高度敏感的检测, 而无需进一步要求传统中需要的还原可视化步骤。银污渍。这将最大限度地减少运行到运行的变化。同时, 避免了使用苛刻的化学物质, 包括甲醛和戊二醛, 这往往干扰肽鉴定在 MS 分析。此外, 由于Tpe-4ta 具有aie 活性, 不存在任何自淬火问题, 因此在蛋白质带处的密集积累的染料可以根据染料分子的数量共同释放。与 SYPRO 红宝石染色相比, 这有助于实现广泛的线性动态范围 (LDR) 的蛋白质检测和更明亮的染色。
与传统的银染色相比, 这种新的染色技术所需的硝酸银量明显减少, 从常用的硝酸银染色协议4中报告的0.1% 下降。可以假设, 新污渍的成功完全取决于在高对比度背景下令人难以置信的明亮和敏感的荧光探针的组合。相比之下, 在传统银渍的开发过程中, 减少需要更多的银, 才能产生暗色带, 特别是在高背景下发生的时候。该方法的氟生成发育时间比传统的化学发育时间长;然而, 这可以作为一种限制或优势来辩论。凝胶可以长时间留在开发中的溶液中, 不会产生任何后果, 从而导致可能来自操作人员的较低的变化。不仅需要较少的步骤, 而且可以采取更多的暂停, 这使得此协议相当方便。与传统的开发步骤不同, 没有过度染色的风险, 传统的开发步骤可能会过度开发凝胶, 从而产生黑暗的背景。这种荧光银染色预计也会有较小的蛋白质间变异, 尽管需要进一步评估额外的蛋白质样本 (图 3)。
遵循协议中建议的硝酸银浓度至关重要;使用较高的浓度不会产生更好的性能和灵敏度, 而是会产生强烈的背景荧光, 从而吞没带的荧光。在故障排除方面, 灵敏度和亮度的损失可能是由于在荧光发育之前的清洗步骤过度清洗或由于银浸渍不足造成的。对于这种方法, 蛋白质带的荧光信号取决于蛋白质结合银离子的数量, 这对于形成荧光tpe-4ta-ag+复合物是必不可少的。蛋白质应该与银离子饱和, 以最大限度地发挥这种染色方法的潜力。
最后, 如前所述, 该方法中使用的银离子荧光染料Tpe-4ta 对ph 值也很敏感。低 pH 值可以使游离Tpe-4ta 在凝胶中荧光, 从而产生较高的背景染色。因此, 不适当的清洗步骤会使固定溶液中留下残留的醋酸, 从而极大地影响染色质量。在荧光发育步骤中, 保持凝胶在 pH 值中相对中性是很重要的 (图 4)。在染色前调整Tpe-4ta溶液的 ph 值也可能是有帮助的。预计这种染料将在不久的将来商业化。
总之, 我们描述了一种实用的荧光银染色的可视化的总蛋白在 SDS-PAGE 凝胶。染色简单、易于使用、经济高效, 并具有良好的染色性能。该方法极大地促进了凝胶中蛋白质带的识别, 为蛋白质分析提供了有用的工具。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
已提交了关于这种荧光银染色的专利申请。
Acknowledgments
作者感谢卡洛林斯卡研究所明围流康复医学中心的陈嘉诚的技术支持。S. X. 感谢瑞典研究理事会的支持 (2017-06344 号批准)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
LDS Sample Buffer (4X) |
Thermo Fisher Scientific | NP0007 | Reagent |
4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well |
Thermo Fisher Scientific | NP0323BOX | Precast gel |
| Sample Reducing Agent (10X) | Thermo Fisher Scientific | NP0004 | Reagent |
| MES SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fisher Scientific | NP0002 | Reagent |
| Mini Gel Tank | Thermo Fisher Scientific | A25977 | Equipment |
| 300W Power Supply (230 VAC) | Thermo Fisher Scientific | PS0301 | Equipment |
| Unstained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific | 26614 | Sample |
| Silver nitrate | Sigma-Aldrich | 31630-25G-R | Reagent |
| Ethanol | Bragg and co. | 42520J | Reagent |
| Acetic acid | J.T. Baker | 103201A | Reagent |
| Milli-Q Synthesis A10 | Merk | - | Provides 18.2 MΩ.cm water |
| gel documentation system (c600 model) | Azure biosystems | - | Equipment |
References
- Chevalier, F. Highlights on the capacities of "Gel-based" proteomics. Proteome Science. 8 (1), (2010).
- Harris, L. R., Churchward, M. A., Butt, R. H., Coorssen, J. R. Assessing detection methods for gel-based proteomic analyses. Journal of Proteome Research. 6 (4), 1418-1425 (2007).
- Gauci, V. J., Wright, E. P., Coorssen, J. R. Quantitative proteomics: assessing the spectrum of in-gel protein detection methods. Journal of Chemical Biology. 4 (1), 3-29 (2011).
- Candiano, G., Bruschi, M., et al. Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25 (9), 1327-1333 (2004).
- Chevallet, M., Luche, S., Rabilloud, T. Silver staining of proteins in polyacrylamide gels. Nature Protocols. 1 (4), 1852-1858 (2006).
- Jin, L. T., Hwang, S. Y., Yoo, G. S., Choi, J. K. Sensitive silver staining of protein in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using an azo dye, calconcarboxylic acid, as a silver-ion sensitizer. Electrophoresis. 25 (15), 2494-2500 (2004).
- Celis, J. E., et al. Cell Biology: A Laboratory Handbook. , Elsevier Academic Press. Amsterdam, the Netherlands. (2006).
- Bartsch, H., Arndt, C., Koristka, S., Cartellieri, M., Bachmann, M. Silver Staining Techniques of Polyacrylamide Gels. Methods in Molecular Biology. 869 (1), 481-486 (2012).
- Rabilloud, T., Vuillard, L., Gilly, C., Lawrence, J. Silver-staining of proteins in polyacrylamide gels: a general overview. Cellular and Molecular Biology. 40 (1), 57-75 (1994).
- Zhou, M., Yu, L. Proteomic Analysis by Two-Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis. Advances in Protein Chemistry. 65 (1), 57-84 (2003).
- Xie, S., et al. Fluorogenic Ag+-Tetrazolate Aggregation Enables Efficient Fluorescent Biological Silver Staining. Angewandte Chemie International Edition. 57 (20), 5750-5753 (2018).
- Protein gel electrophoresis technical handbook. , Thermo Fisher Scientific. Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf (2015).
