Summary
Nous décrivons ici un protocole détaillé décrivant un fluorescent nouvelle coloration pour la détection de protéines totales dans les gels de polyacrylamide. Le protocole utilise une sonde de turn-on argent ionique spécifique fluorescence, qui permet de détecter Ag+-complexes de protéine et élimine certaines limitations des taches argent chromogène traditionnels.
Abstract
Coloration à l’argent est une technique colorimétrique largement utilisée pour visualiser les bandes de protéines dans les gels de polyacrylamide après électrophorèse sodium dodecyl sulfate polyacrylamide (SDS-PAGE). Les taches argent classiques ont certains inconvénients, comme le haut fond de coloration, de recouvrement de mauvaises protéines, faible reproductibilité, une gamme dynamique linéaire étroite pour la quantification et une compatibilité limitée avec la spectrométrie de masse (MS). Maintenant, avec l’utilisation d’une sonde de fluorogène Ag+ , TPE-4TA, nous avons développé une coloration méthode pour la visualisation de protéines totales dans les gels de polyacrylamide fluorescent à l’argent. Cette nouvelle tache évite l’étape pénible réduction argent en taches argent traditionnels. En outre, la tache argentée fluorescente montre bonne reproductibilité, une sensibilité et une quantification linéaire dans la détection de protéines, ce qui en fait une tache de gel de protéines utiles et pratiques.
Introduction
Plusieurs méthodes de coloration ont été utilisées pour visualiser les protéines après électrophorèse sur gel, par exemple à l’aide de colorants colorimétriques tels que le bleu de Coomassie brillant bleu, tache argentée, fluorescence, ou radioactifs étiquetage1,2, 3 , 4. coloration à l’argent est considérée comme une des techniques plus sensibles pour la détection de protéines nécessitant des réactifs simples et bon marchés. Il peut être classé en deux grandes familles : la tache d’argent ammoniacale et le nitrate d’argent tachent5,6. Dans la méthode argentée ammoniacale alcaline, le complexe de l’argent-diamine est produit avec l’ammoniac et de l’hydroxyde de sodium et réduit à argent métallique au cours du développement à l’aide d’une solution de formaldéhyde acides. La tache peut accueillir efficacement pour les protéines basiques mais montre un compromis performances pour les protéines acides et neutres et est en outre limité à classique glycine et taurine systèmes électrophorétiques. En comparaison, les taches de nitrate d’argent a exploiter la bio-affinité élevée d’ions d’argent aux protéines, principalement les sulfhydryles carboxyle groupes de chaînes latérales et ont tendance à tacher les protéines acides plus efficacement7. Après ion argent contraignant, une solution en développement (généralement en une solution de carbonate de métal contenant du thiosulfate de sodium et de formaldéhyde) est appliquée afin de réduire les ions d’argent aux grains d’argent métalliques, qui s’accumulent d’une couleur brun-foncé à visualiser la bandes de protéines.
Bien que la coloration à l’argent est bien connue pour sa polyvalence et sa sensibilité élevée depuis son développement dans les années 19708, la méthode est souvent considérée comme difficile. Méthodes de coloration à l’argent ont des mesures limitées dans le temps et montrent faible reproductibilité. Étant donné que la couleur de la tache argentée n’est généralement pas uniforme et dépend de l’étape de réduction, ce qui est difficile à contrôler, la tache argentée n’est pas une méthode quantitative et, ainsi, pas recommandé pour gel comparaison étude et protéine quantification9. Méthodes optimisées de sensibilité peuvent utiliser des aldéhydes peuvent également indiquer un uniforme plus coloration10. Cependant, c’est au détriment d’une analyse plus poussée en aval en raison de la réticulation des protéines par des aldéhydes. Protocoles rapides surtout combinent ou raccourcir des étapes pour réduire le temps, compromettre la reproductibilité et l’uniformité de la tache5. En conséquence, il y a nombreux argent souillant des variantes à l’intérieur de gel de protéine, coloration, chacun optimisé pour répondre à certaines exigences ; par exemple, simplicité, sensibilité ou peptide taux de récupération pour l’analyse en aval. Ces attributs peuvent également avoir une incidence sur l’autre, et satisfaire toutes les exigences dans un seul protocole peut s’avérer difficile.
Dans ce travail, nous introduisons une nouvelle méthode pour la détection des protéines en gel de polyacrylamide de coloration à l’argent fluorescent. Dans cette méthode, nous utilisons une sonde fluorogène d’ions d’argent, TPE-4TA (Figure 1), pour visualiser les protéines imprégnées d’argent11. TPE-4TA est conçu selon le principe de l’émission induite par l’agrégation (AIE). Il est non-émissif dissous dans une solution aqueuse, mais est fortement émissif en présence d’ions d’argent. En remplaçant le développement chromogène en taches argent traditionnels par un fluorogène développer étape, la méthode argentée fluorescente permet la coloration robuste des protéines totales avec une formation réduite.
En outre, la tache argentée fluorescente a montré une bonne gamme dynamique linéaire pour la quantification des protéines, qui est comparable avec la tache de SYPRO Ruby largement utilisé et non réalisable avec des taches argent traditionnels. Le gel peut être photographié sur les systèmes de documentation gel couramment utilisés avec une lampe ultraviolette (longueur d’onde excitation : canal de 302/365 nm ; émission : ~ 490-530 nm) à plusieurs laboratoires de biologie.
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Protocol
1. préparation du Gel
Remarque : La démonstration suit un protocole standard utilisé pour préparer le gel pour une coloration peu après SDS-PAGE12. En bref, les étapes suivantes décrivent la préparation des échantillons et électrophorèse sur gel.
- Effectuer des SDS-PAGE avec des gels de protéines de Bis-Tris (1 mm, 15 puits) 4-12 % à l’aide d’un gel mini réservoir rempli de 2-(N -morpholino) tampon d’ethanesulfonic acide (MES).
- Diluer les échantillons avec un mélange d’eau distillée, au lithium dodécyl sulfate (LDS) tampon et un agent réducteur échantillon.
- Charger la première voie avec double la quantité de brut (10 µL), suivie de la quantité normale de stock (5 µL) et une série de dilutions de double du stock par la suite (13 dilutions, de 2 x à x 8192).
- Exécutez le gel à une tension constante de 200 V pendant 30 min.
2. fixation du Gel
- Après électrophorèse, submerger les gels dans une solution de 100 mL d’acide acétique ethanol/10% à 40 % dans un agitateur orbital à 50 tr/min à température ambiante 2 x (chacune pendant 30 min) ou toute la nuit à 4 ° C.
- Laver les gels 3 x 10 min chacun dans l’eau ultrapure dans un récipient propre. L’étape de lavage est essentielle. Si l’acide de la solution de fixation n’est pas supprimé correctement lors de l’étape de développement fluorogène, l' excessive TPE-4TA sera activé par l’acide et conduire à fluorescence de fond fort dans le gel.
3. préparation du AgNO3Solution et imprégnation à l’argent du Gel
- Pour que la solution de3 AgNO (0,0001 %) pour l’imprégnation, tout d’abord, dissoudre 0,01 g de AgNO3 dans 10 mL d’eau ultrapure à préparer une solution 0,1 % AgNO3 . Ensuite, ajouter 100 µL de la solution mère de 0,1 % AgNO3 dans 100 mL d’eau ultrapure pour faire la solution de travail.
Remarque : La solution de3 AgNO devrait être conservée dans l’obscurité avant utilisation. - Imprégner le gel avec 100 mL d’argent solution pendant 1 h de travail dans un agitateur orbital à 50 tr/min dans un récipient de verre scellé. Il est essentiel d’effectuer l’imprégnation à l’argent sous une hotte aspirante, Abrie de la lumière avec du papier aluminium.
- Laver le gel avec de l’eau ultrapure (environ 100 mL) dans un récipient propre pour 2 x 60 s.
4. Fluorogène développement du Gel
- Pour préparer la solution mère de colorant (0,1 mM), ajouter 3,0 mg de teinture TPE-4TA dans 50 mL d’eau ultrapure. Laisser agir la solution pendant quelques minutes et ajouter une solution de NaOH (par exemple 1 M) pour aider à dissoudre le colorant.
- Vérifier la fluorescence de la solution sous une lampe de 365 nm UV pour s’assurer que la molécule de colorant est entièrement dissous. Des solutions faibles ou causées indiquent seulement une dissolution complète.
Remarque : Le colorant que TPE-4TA a été synthétisé suit le protocole rapporté récemment par Xie et al. 10 la solution TPE-4TA est très stable et peut être conservée à l’obscurité pendant des mois. - Pour préparer 100 mL de la solution en développement fluorogène (10 µM), ajouter 10 mL de la solution mère de TPE-4TA dans 90 mL d’eau ultrapure. Vérifier le pH de la solution à l’aide d’un pH-mètre et accordez-la à 7-9 à l’aide d’une solution d’hydroxyde de sodium (1 µM).
- Transférer le gel dans un récipient propre et scellable avec 100 mL de la solution en développement fluorogène. Assurez-vous que le gel est totalement immergé dans la solution. Sceller le contenant. Couvrez-le de la lumière et le secouer pendant la nuit dans un agitateur orbital à 50 tr/min à température ambiante. Alternativement, l’étape d’incubation peut également être raccourcie à environ ~ 2 h en préchauffant la solution en développement AIE à 80 ° C pour la coloration et puis en le laissant à température ambiante.
5. de décoloration et d’imagerie
- Transférer le gel dans un récipient propre et décolorer il dans 100 mL d’éthanol à 10 % pendant 30 min.
Remarque : L’eau seule peut être utilisée pour laver le gel. Toutefois, il est plus économe en temps d’utiliser une solution d’éthanol de 10 % pour la décoloration. Cela aidera à réduire le processus de décoloration de heures à 30 min. - Rincer le gel en eau ultrapure pendant 5 min.
- Le gel à la 365 nm ou 302 nm canaux grâce à une machine de documentation de gel de l’image.
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Representative Results
Les bandes de protéines colorées par la tache argentée fluorescente présentent une fluorescence vert intense sous une lampe à UV 365 nm. Toutes les bandes de protéines 14 (10-200 kDa), de haut en bas, étaient clairement visibles, en corrélant bien avec 14 ceux rouge taché par le SYPRO Ruby colorant (Figure 2)10.
Concernant la détection de protéines quantitative, les gels ont été photographiés par un gel d’imagerie utilisant des procédures automatisées, et les images ont été analysées et comparativement à l’aide du logiciel commercial. Cette coloration méthode fluorescente à l’argent semble avoir une haute résolution. Pour certaines bandes de la protéine, la sensibilité de la tache argentée fluorescente est également légèrement meilleure que celle du colorant fluorescent SYPRO Ruby. En particulier, la performance de la tache argentée fluorescente a été améliorée pour les bandes de protéines ~ 10 à 40 kDa, indiquant que la nouvelle méthode est particulièrement utile pour la détection des protéines avec des poids de la molécule faible. Les résultats suggèrent aussi que la tache argentée fluorescente a donné une linéarité bonne et uniforme pour toutes les 14 protéines dans une gamme relativement large de protéine quantification (Figure 3)11.
Contrairement à la tache de nitrate d’argent qui a donné un haut niveau de signal de fond et de pics déformés, la tache argentée fluorescente a détecté les bandes avec un bon contraste et de la distribution uniforme d’intensité comparable à la tache SYPRO Ruby à travers toutes les 14 protéines (Figure 3).
Notez que lavage insuffisant après que la fixation de gel entraînera ambiants coloration (Figure 4). L’acide acétique résiduelle sera allume la TPE-4PA et conduire à une solide expérience.
Figure 1 : Structure chimique des TPE-4TA et son mécanisme de détection de l’Ag+. X = H ou Na+. Adapté de travaux antérieurs, copyright 2018 WILEY-VCH11. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : coloration à l’argent Fluorescent. A) sommaire du protocole. B) une comparaison des gels colorés par le fluorescent tache argentée (à gauche) et la tache SYPRO Ruby (à droite) imagé parallèle avec une lampe de poche UV sous l’irradiation 365 nm. Les protéines (10 à 200 kDa) étaient chargés par dilution en série double à partir de 200 à 500 ng/bande voie de gauche au maximum. Adapté de travaux antérieurs, copyright 2018 WILEY-VCH11. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : intensité de la Fluorescence des protéines contre quantité de protéine, gel représentant des images et des profils de signal (à partir de la cinquième voie) des gels avec trois différentes taches. Taches de nitrate d’argent (A),(B) fluorescent tache argentée (excitation de 365 nm) et (C) SYPRO Ruby tache. La première colonne de la figure montre l’intensité de la tache pour chaque tranche des 14 protéines (10-200 kDa) contre la quantité de protéines normalisée à la première voie (à partir de gauche). La deuxième colonne indique les gel représentant des images de la tache correspondante. La quantité de protéines chargées dans le gel est décrite à la Figure 2. Adapté de travaux antérieurs, copyright 2018 WILEY-VCH11. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : teinté de gel d’une expérience sous-optimaux. Dans cette expérience, le lavage était insuffisant après l’étape de fixation. L’acide acétique résiduel induites par l’agrégation des TPE-4TA et causé une solide expérience. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Présenté ici est un roman d’argent fluorescent coloration PROCEDE de protéines dans les gels de polyacrylamide. Cette stratégie intègre les taches argent classiques et taches fluorescentes. Les exploits de coloration la liaison sélective d’ions d’argent aux protéines comme dans l’autre argent taches mais emploie un argent fluorogène hautement sensible sonde TPE-4TA pour éclairer les protéines liées argent. Étant donné que la sonde fluorogène TPE-4TA peut détecter des ions d’argent à une concentration assez faible dans la gamme nanomolar11, elle permet une détection très sensible sans toute autre demande d’une étape de visualisation réductrice au besoin en traditionnel taches de l’argent. Ceci minimisera les variations run-to-run. Pendant ce temps, il évite l’utilisation de produits chimiques corrosifs, y compris le formaldéhyde et le glutaraldéhyde, qui empêchent souvent identification de peptide dans MS analyse. En outre, comme les TPE-4TA est AIE-active et libre de tout problème de désactivation automatique, les colorants densément accumulés à une bande protéique peuvent émettre collectivement en réponse au nombre de molécules de colorant. Ceci contribue à une plage dynamique large linéaire (LDR) par détection de protéines et une coloration beaucoup plus lumineux, en comparaison avec la tache SYPRO Ruby.
Par rapport à la traditionnelle coloration à l’argent, beaucoup moins une quantité de nitrate d’argent est nécessaire pour cette nouvelle coloration technique-spécifiquement, 0,0001 % de 0,1 % dans couramment utilisé nitrate d’argent souillant des protocoles4. Il peut être émis l’hypothèse que le succès de la nouvelle tache est purement vers le bas pour la combinaison de la sonde fluorescente incroyablement lumineuse et sensible sur un fond contrasté. En comparaison, la réduction pendant l’étape de développement de taches argent traditionnels exige une plus grande quantité d’argent pour produire des bandes sombres visibles, surtout lorsqu’elle survient dans un contexte de forte. Dans cette méthode, le temps de développement fluorogène est plus long que le traditionnel développement chimique ; Toutefois, cela peut être débattu comme une limitation ou comme un avantage. Le gel peut être laissé dans la solution en développement pendant de longues périodes de temps sans conséquence, ce qui entraîne des variations inférieures qui peuvent découler de l’opérateur. Non seulement y a-t-il moins d’étapes nécessaires, mais aussi, de pauses plus peuvent être prises, ce qui rend ce protocole très pratique. Il n’y a aucun risque d’overstaining contrairement à l’étape de développement traditionnel qui peut surdévelopper le gel, ce qui entraîne un fond sombre. Cette tache argentée fluorescente devrait aussi d’avoir une plus petite variation d’interprotein, bien qu’une évaluation plus poussée des échantillons de protéines supplémentaires est justifiée (Figure 3).
Il est essentiel de suivre la concentration de nitrate d’argent a suggéré du protocole ; en utilisant une concentration plus élevée n’entraîne pas de meilleures performances et sensibilité mais, en revanche, produit une fluorescence de fond fort qui peut engloutir la fluorescence des bandes. En termes de dépannage, perte de sensibilité et de la luminosité peut entraîner de lavage excessif lors de l’étape de lavage avant fluorogène développement ou d’imprégnation insuffisante à l’argent. Pour cette méthode, le signal de fluorescence de la bande de protéine est fonction du nombre d’ions d’argent liés aux protéines, qui est essentiel pour la formation des fluorescents TPE-4TA-Ag+ complexes. La protéine doit être saturée d’ions d’argent afin de maximiser le potentiel de cette méthode de coloration.
Enfin, comme mentionné précédemment, le colorant fluorogène d’ions d’argent utilisée dans cette méthode, TPE-4TA, est également sensible au pH. Un faible pH peut protoner le libre TPE-4TA de fluorescence dans le gel, ce qui entraîne une tache de fond élevé. Par conséquent, les étapes de lavage inapproprié, qui partent acide acétique résiduel de la solution de fixation, seront grandement affecter la qualité de tache. Il est important de garder le gel relativement neutre de pH dans l’étape de développement fluorogène (Figure 4). Il pourrait également être utile ajuster le pH de la solution TPE-4TA avant la coloration. Il est prévu que ce colorant sera commercialisé dans un avenir proche.
En résumé, nous avons décrit un protocole de pratique de la tache argentée fluorescent roman pour la visualisation des protéines totales en gel SDS-PAGE. La coloration est simple, facile à utiliser, rentable et a une bonne performance de coloration. Cette méthode peut grandement faciliter l’identification des bandes protéiques dans les gels et fournit un outil utile pour l’analyse des protéines.
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Disclosures
Une demande de brevet sur cette coloration fluorescente à l’argent a été déposée.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Patrick Chan au Ming Wai Lau Centre pour la médecine réparatrice, Karolinska Institutet, pour son soutien technique. S. X. est reconnaissante pour le soutien du Conseil de recherche suédois (Grant No. 2017-06344).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
LDS Sample Buffer (4X) |
Thermo Fisher Scientific | NP0007 | Reagent |
4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well |
Thermo Fisher Scientific | NP0323BOX | Precast gel |
| Sample Reducing Agent (10X) | Thermo Fisher Scientific | NP0004 | Reagent |
| MES SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fisher Scientific | NP0002 | Reagent |
| Mini Gel Tank | Thermo Fisher Scientific | A25977 | Equipment |
| 300W Power Supply (230 VAC) | Thermo Fisher Scientific | PS0301 | Equipment |
| Unstained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific | 26614 | Sample |
| Silver nitrate | Sigma-Aldrich | 31630-25G-R | Reagent |
| Ethanol | Bragg and co. | 42520J | Reagent |
| Acetic acid | J.T. Baker | 103201A | Reagent |
| Milli-Q Synthesis A10 | Merk | - | Provides 18.2 MΩ.cm water |
| gel documentation system (c600 model) | Azure biosystems | - | Equipment |
References
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