Summary
Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll umreißt eine neue fluoreszierende Färbung Technik für Gesamt-Protein Nachweis in Polyacrylamid-Gele. Das Protokoll nutzt eine Sonde, Silber Ionen-spezifische Fluoreszenz Turn-on, die Ag+erkennt-Proteinkomplexe, und gewisse Einschränkungen der traditionellen chromogenen Silber Flecken beseitigt.
Abstract
Silberne Färbung ist ein kolorimetrischen Verfahren häufig verwendet, um Protein-Bands in Polyacrylamid-Gele nach Sodium Dodecyl Sulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) zu visualisieren. Der klassische silberne Flecken haben bestimmte Nachteile wie hoher Hintergrund Färbung, schlechte Proteingewinnung, niedrige Reproduzierbarkeit, einen schmalen linearen Dynamikbereich zur Quantifizierung und begrenzte Kompatibilität mit der Massenspektrometrie (MS). Jetzt, mit dem Einsatz einer Fluorogenic Ag+ Sonde, TPE-4TA, entwickelten wir eine fluoreszierende silberne Färbung Methode für die Gesamt-Protein-Visualisierung in Polyacrylamid-Gele. Dieser neue Fleck vermeidet das lästige Silber Reduktionsschritt in traditionellen silbernen Flecken. Darüber hinaus zeigt der fluoreszierende silberne Fleck gute Reproduzierbarkeit, Sensibilität und lineare Quantifizierung in Protein-Erkennung, so dass es einen nützliches und praktisches Protein Gel Fleck.
Introduction
Viele Färbung Methoden wurden verwendet, um Proteine nach Gelelektrophorese, z. B. Verwendung von farbmetrischen Farbstoffen wie Coomassie Brilliant Blue, silbernen Fleck, Fluoreszenz zu visualisieren oder radioaktive Markierung1,2, 3 , 4. silberne Färbung gilt als eines der sensibelsten Techniken für Proteindetektion erfordern einfache und billige Reagenzien. Es kann in zwei große Gruppen unterteilt werden: der ammoniakalischen Silber Fleck und das Silbernitrat Flecken5,6. In der alkalischen ammoniakalischen Silber-Methode ist der Silber-Diamin-Komplex mit Ammoniak und Natriumhydroxid hergestellt und während der Entwicklung mit einer sauren Formaldehyd-Lösung zu metallischem Silber reduziert. Der Fleck beherbergt effizient für grundlegende Proteine aber zeigt eine kompromittierte Performance für saure und neutrale Proteine und ist darüber hinaus auf klassischen Glycin und Taurin elektrophoretischen Systemen beschränkt. Im Vergleich dazu die Silbernitrat Flecken nutzen die hohe Bio-Affinität von Silberionen an Protein, in erster Linie die Sulfhydryl Carboxylgruppen Gruppen aus den Seitenketten und tendenziell saure Proteine effizienter Fleck7. Nach Silberionen verbindlich, eine entwickelnde Lösung (in der Regel aus einer Metall-Karbonat-Lösung, die Formaldehyd und Natrium Thiosulphate) wird angewendet, um die Silberionen zu metallischem Silber Körner zu verringern, die eine braun-dunkel Farbe visualisieren bauen die Protein-Bänder.
Obwohl Silber Färbung bekannt für seine Vielseitigkeit und hohe Empfindlichkeit seit seiner Entwicklung in den 1970er Jahren8gewesen, wird die Methode häufig als schwierig angesehen. Silber-Färbung Methoden haben zeitlich begrenzte Schritte und zeigen niedrige Reproduzierbarkeit. Da die Farbe des silbernen Fleck in der Regel nicht ist einheitlich und Reduktionsschritt, die schwer zu kontrollieren ist abhängig, der silberne Fleck ist keine quantitative Methode und somit nicht für Gel Vergleich Studie und Protein Quantifizierung9empfohlen. Methoden in der Empfindlichkeit optimiert können Aldehyde verwenden, die auch eine gleichmäßigeren Färbung10anbieten können. Dies ist jedoch auf Kosten der weiteren nachgeschalteten Analyse durch die Vernetzung von Proteinen durch Aldehyde. Schnelle Protokolle meist kombinieren oder kürzen Sie Schritte zu verkürzen, die Reproduzierbarkeit und Einheitlichkeit der Fleck5zu beeinträchtigen. Infolgedessen gibt es zahlreiche Silber Färbung Varianten innerhalb Protein Gel Färbung, jeweils optimiert, um bestimmte Anforderungen zu entsprechen; zum Beispiel, Einfachheit, Sensibilität oder Peptid Verwertungsquote für nachgelagerte Analyse. Diese Attribute haben ebenfalls einen Einfluss auf einander, und erfüllt alle Anforderungen in einem Protokoll kann schwierig sein.
In dieser Arbeit stellen wir eine neue fluoreszierende silberne Färbung Methode zur Proteindetektion Polyacrylamid-Gel. Bei dieser Methode verwenden wir Fluorogenic Sonde für Silberionen, TPE-4TA (Abbildung 1), die Silber-imprägnierte Proteine11zu visualisieren. TPE-4TA richtet sich nach dem Prinzip der Aggregation-induzierte Emission (AIE). Es ist nicht emissiven, in wässriger Lösung aufgelöst, jedoch höchst emissiven in Anwesenheit von Silber-Ionen. Indem die chromogene Entwicklung im traditionellen silbernen Flecken mit einer Fluorogenic Entwicklung Schritt ermöglicht die fluoreszierende silberne Methode die robuste Färbung des gesamten Proteine mit einem reduzierten Hintergrund.
Darüber hinaus zeigte die fluoreszierende silberne Fleck eine gute lineare Dynamik für Protein Quantifizierung, die vergleichbar mit den weit verbreiteten SYPRO Ruby Fleck und mit traditionellen silbernen Flecken nicht erreichbar ist. Das Gel kann auf häufig verwendete Gel-Dokumentation-Systeme mit einer UV-Lampe abgebildet (Erregung Wellenlänge: 302/365 nm Kanal; Emission: ~ 490-530 nm) bei vielen biologischen Labs.
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Protocol
1. Vorbereitung des Gels
Hinweis: Die Demonstration folgt ein standard Protokoll, um das Gel kurz nach SDS-PAGE12Färbung vorbereiten. Kurz gesagt, die folgenden Schritte beschreiben die Vorbereitung der Proben und gel-Elektrophorese.
- SDS-PAGE mit 4 % - 12 % Bis-Tris Protein Gele (1 mm, 15-Brunnen) durchführen mit einem Mini-Gel Tank gefüllt mit 2-(N -Morpholino) Ethanesulfonic Säure (MES) Puffer.
- Verdünnen Sie die Proben mit einer Mischung aus destilliertem Wasser, Lithium-Dodecyl-Sulfat (LDS)-Puffer und eine Probe-Reduktionsmittel.
- Laden Sie die erste Spur mit doppelt so viel Lager (10 µL), gefolgt von der normalen Lager Menge (5 µL) und eine Reihe von doppelten Verdünnungen des Bestandes danach (von 2 X bis 8192 X 13 Verdünnungen).
- Laufen Sie das Gel bei einer konstanten Spannung von 200 V für 30 min.
2. Fixierung des Gels
- Tauchen Sie nach Elektrophorese die Gele in einer 100 mL-Lösung von 40 % ethanol/10% Essigsäure auf einem Orbitalschüttler bei 50 u/min bei Raumtemperatur 2 x (jeweils für 30 min), oder über Nacht bei 4 ° C.
- Waschen Sie die Gele 3 x 10 min in Reinstwasser in einem sauberen Behälter. Die Waschschritt ist von entscheidender Bedeutung. Wenn die Säure aus der Festlegunglösung im dritten Schritt Fluorogenic nicht ordnungsgemäß entfernt wird, die übermäßigen TPE-4TA wird durch die Säure aktiviert werden und führen zu starken Hintergrundfluoreszenz im Gel.
3. Vorbereitung des AgNO3Lösung und Silber Imprägnierung des Gels
- AgNO3 Lösung (0,0001 %) machen für die Imprägnierung zunächst lösen Sie 0,01 g von AgNO3 in 10 mL Reinstwasser eine 0,1 % AgNO3 Stammlösung vorbereiten auf. Als nächstes fügen Sie 100 µL der Stammlösung 0,1 % AgNO3 in 100 mL Reinstwasser, funktionierende Lösung zu machen.
Hinweis: Die AgNO3 Lösung sollte in der Dunkelheit vor dem Gebrauch aufbewahrt werden. - Imprägnieren Sie das Gel mit 100 mL Silber arbeiten Lösung für 1 h auf einem Orbitalschüttler bei 50 u/min in einem verschlossenen Glascontainer. Es ist entscheidend für die silberne Imprägnierung unter einem Abzug, lichtgeschützt mit Alu-Folie durchführen.
- Waschen Sie das Gel mit Reinstwasser (ca. 100 mL) in einem sauberen Behälter für 2 x 60 s.
(4) Fluorogenic Entwicklung des Gels
- Zur Vorbereitung der Farbstoff-Stammlösung (0,1 mM) fügen Sie 3,0 mg des TPE-4TA Farbstoffs in 50 mL Reinstwasser hinzu. Beschallen Sie die Lösung für ein paar Minuten und fügen Sie einige NaOH-Lösung (z.B. 1 M) um den Farbstoff lösen zu helfen.
- Überprüfen Sie die Fluoreszenz der Lösung unter einer 365 nm UV Lampe um sicherzustellen, dass die Farbstoff-Moleküle vollständig aufgelöst ist. Schwache oder nonemissive Lösungen immer nur volle Auflösung angegeben.
Hinweis: Der Farbstoff war TPE-4TA synthetisiert folgendes Protokoll kürzlich von Xie Et Al. berichtete 10 die TPE-4TA -Lösung ist sehr stabil und kann monatelang im Dunkeln gehalten werden. - Um 100 mL der Fluorogenic entwickelnden Lösung (10 µM) vorzubereiten, fügen Sie 10 mL der TPE-4TA Vorratslösung in 90 mL Reinstwasser. Überprüfen Sie den pH-Wert der Lösung mit einem pH-Meter und tune es 7-9 mit einer Natriumhydroxid-Lösung (1 µM).
- Übertragen Sie das Gel auf einen sauberen und verschließbaren Behälter mit 100 mL der Fluorogenic entwickelnden Lösung. Stellen Sie sicher, dass das Gel ganz in die Lösung eingetaucht ist. Verschließen Sie den Behälter. Bedecken Sie es vor Licht und schütteln Sie sie über Nacht auf einem Orbitalschüttler bei 50 u/min bei Raumtemperatur. Alternativ kann die Inkubationsschritt auch auf ca. ~ 2 h verkürzt werden, durch Vorwärmen der AIE entwickelnden Lösung auf 80 ° C zum Beizen und dann verlassen sie bei Raumtemperatur.
(5) entfärben und Imaging
- Das Gel auf einen sauberen Behälter übertragen und in 100 mL 10 % Ethanol für 30 min destain.
Hinweis: Wasser allein kann verwendet werden, um das Gel zu waschen. Es ist jedoch mehr Zeit-effizient zu nutzen eine 10 % ige Ethanol-Lösung für das entfärben. Dadurch wird das destaining Verfahren von Stunden auf 30 Minuten verkürzen. - Spülen Sie das Gel in Reinstwasser für 5 Minuten.
- Bild das Gel auf die 365 nm oder 302 nm-Kanal von einer Gel-Dokumentation-Maschine.
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Representative Results
Die Protein-Bands befleckt durch fluoreszierende silberne Flecken zeigen ein intensives grün fluoreszieren unter 365 nm UV-Licht. Alle 14 Protein Bänder (10-200 kDa), waren von oben nach unten, deutlich sichtbar, korreliert gut mit den 14 rote Flecken von SYPRO Ruby Farbstoff (Abbildung 2)10.
In Bezug auf quantitative Proteindetektion die Gele wurden durch ein Gel imaging-System mit Hilfe automatisierte Verfahren abgebildet, und die Bilder wurden analysiert und verglichen mit der kommerziellen Software. Diese fluoreszierende Silber Färbung Methode scheint eine hohe Auflösung haben. Für einige Bands Protein ist die Empfindlichkeit der fluoreszierenden Silber Fleck auch etwas besser als die von den fluoreszierenden SYPRO Ruby Fleck. Insbesondere wurde die Leistung der fluoreszierenden Silber Fleck für ~ 10 bis 40 kDa Protein Bands, darauf hinweist, dass die neue Methode besonders nützlich für die Erkennung von Proteinen mit niedrigen Molekül Gewichten ist verbessert. Die Daten zufolge auch der fluoreszierende silberne Fleck gab eine gute und gleichmäßige Linearität für alle 14 Proteine über ein relativ breites Spektrum für Protein Quantifizierung (Abbildung 3)11.
Im Gegensatz zu den Silbernitrat Fleck, der ein hohes Maß an Hintergrundsignal und verzerrten Peaks gab, entdeckt der fluoreszierende silberne Fleck die Bänder mit einem guten Kontrast und gleichmäßige Intensitätsverteilung vergleichbar mit den SYPRO Ruby Fleck über alle 14 Proteine (Abbildung 3).
Beachten Sie, dass nicht ausreichend waschen, nach die Gel-Fixierung in hoher Hintergrund Färbung (Abbildung 4) führt. Die restlichen Essigsäure leuchtet die TPE-4PA und führen zu einem starken Hintergrund.
Abbildung 1: Chemische Struktur von TPE-4TA und die Fernerkundung Mechanismus zur Ag+. X = H oder Na+. Aus früheren Arbeiten, Copyright 2018 WILEY-VCH11angepasst. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: fluoreszierende silberne Färbung. A) Zusammenfassung des Protokolls. B) ein Vergleich der Gele befleckt durch den fluoreszierenden Silber Fleck (links) und SYPRO Ruby Fleck (rechts) abgebildet Parallel mit einem handheld UV-Lampe unter 365 nm Bestrahlung. Die Proteine (10-200 kDa) wurden auf die linke Spur durch zweifache serielle Verdünnung ab 200-500 ng/Band geladen. Aus früheren Arbeiten, Copyright 2018 WILEY-VCH11angepasst. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Fluoreszenzintensität von Proteinen gegen Protein-Menge, repräsentative Gelbildern und Signal-Profile (ab der fünften Spur) von Gelen mit drei verschiedenen Flecken. (A) Silbernitrat Fleck,(B) fluoreszierende silberne Fleck (365 nm Anregung) und (C) SYPRO Ruby Fleck. Die erste Spalte der Abbildung zeigt die Intensität der Fleck für jedes Band 14 Proteine (10-200 kDa) gegen die Menge des Proteins normiert auf die erste Spur (beginnend auf der linken Seite). Die zweite Spalte zeigt die repräsentative Gelbilder von den entsprechenden Fleck. Die Menge des Proteins in das Gel geladen wird in Abbildung 2beschrieben. Aus früheren Arbeiten, Copyright 2018 WILEY-VCH11angepasst. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: gebeizt Gel aus einem suboptimalen Experiment. In diesem Experiment war das Waschen nach der Fixierung Schritt unzureichend. Die restlichen Essigsäure induziert die Aggregation von TPE-4TA und verursacht einen starken Hintergrund. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Hier vorgestellten ist eine neuartige fluoreszierende silberne Färbung Methode für Proteine in Polyacrylamid-Gele. Diese Strategie integriert konventionellen Silber Flecken und fluoreszierende Flecken. Die Färbung Heldentaten die selektive Bindung von Silberionen an Proteine wie in anderen Silber Flecken aber beschäftigt eine hochempfindliche Fluorogenic Silber Sonde TPE-4TA , um die silberne gebundene Proteine Leuchten. Da die Fluorogenic Sonde TPE-4TA silberne-Ionen bei einer relativ niedrigen Konzentration im nanomolaren Bereich11spüren kann, ermöglicht es eine hochempfindliche Detektion ohne weitere Nachfrage eine reduktive Visualisierung Schritt nach Bedarf in traditionellen silberne Flecken. Dies minimiert Run-to-Run-Variationen. In der Zwischenzeit, es vermeidet die Verwendung von ätzenden Chemikalien wie Formaldehyd und Glutaraldehyd, die Peptid-Identifikation in MS-Analyse häufig stören. Außerdem, wie TPE-4TA AIE-aktiv und frei von Problemen selbst abschrecken, die dicht angesammelten Farbstoffe bei einer Protein-Band kollektiv als Reaktion auf die Anzahl der Farbstoffmoleküle emittieren können. Dies trägt zu einem breit linearen Dynamikbereich (LDR) Proteindetektion und eine viel heller Färbung im Vergleich mit den SYPRO Ruby Fleck.
Verglichen mit traditionellen silberne Färbung, eine deutlich weniger Menge an Silbernitrat ist erforderlich für diese neue Technik speziell Färbung, 0,0001 % von 0,1 %, die allgemein verwendet Silbernitrat Färbung Protokolle4. Es kann vermutet werden, dass der Erfolg der neuen Fleck rein auf die Kombination der unglaublich hell und empfindlich fluoreszierende Sonde vor einem kontrastreichen Hintergrund. Im Vergleich dazu erfordert Abbau während der Entwicklung Schritt in den traditionellen silbernen Flecken eine größere Menge an Silber, dunkle Streifen sichtbare, zu produzieren, insbesondere vor dem Hintergrund hoher tritt. Bei dieser Methode ist die Fluorogenic Entwicklungszeit länger als die herkömmlichen chemischen Entwicklung; jedoch kann dies als eine Einschränkung oder ein Vorteil diskutiert werden. Das Gel kann in die entwickelnde Lösung für längere Zeit belassen werden, ohne Konsequenzen, was zu niedrigeren Variationen, die vom Operator hergeleitet werden können. Nicht nur gibt es weniger Schritte erforderlich, aber auch mehr Pausen genommen werden können, wodurch dieses Protokolls sehr bequem. Es gibt kein Risiko von overstaining anders als in der traditionellen Entwicklung Schritt, der das Gel, was zu einem dunklen Hintergrund überentwickeln kann. Diese fluoreszierenden Silber Fleck soll auch eine kleinere interprotein Variante, wenn auch eine weitere Auswertung der zusätzlichen Proteinproben (Abbildung 3) gerechtfertigt ist.
Es ist wichtig, empfohlene Silber-Nitrat-Konzentration aus dem Protokoll zu folgen; mit einer höheren Konzentration führt nicht zu besseren Leistung und Empfindlichkeit, aber stattdessen erzeugt eine starken Hintergrund-Fluoreszenz die Fluoreszenz der Bands verschlingen kann. Im Hinblick auf die Problembehandlung kann Verlust an Empfindlichkeit und Helligkeit von übermäßigen waschen in der Waschschritt vor Fluorogenic Entwicklung oder unzureichende Silber Imprägnierung führen. Für diese Methode ist das Fluoreszenzsignal der Protein-Band hängt von der Anzahl der proteingebundenen Silberionen, essentiell für die Bildung der fluoreszierenden TPE-4TA-Ag+ komplexe. Das Protein sollte mit Silber-Ionen zur Maximierung des Potentials dieser Färbung Methode gesättigt sein.
Zu guter Letzt ist wie bereits erwähnt die Fluorogenic Farbstoff für Silberionen in diese Methode verwendet, TPE-4TA, auch pH empfindlich. Ein niedriger pH-Wert kann Protonate die kostenlose TPE-4TA zur Fluoreszenz in das Gel, was zu einer hohen Hintergrund Fleck. Daher unsachgemäße waschen Schritte, die restlichen Essigsäure aus der Fixierung-Lösung verlassen, haben großen Einfluss auf die Fleck-Qualität. Es ist wichtig, dass das Gel relativ neutralen pH-Wert im Fluorogenic Entwicklungsschritt (Abbildung 4). Es könnte auch hilfreich sein, die Einstellung des pH-Wertes der TPE-4TA -Lösung vor der Färbung sein. Es wird erwartet, dass dieser Farbstoff in naher Zukunft kommerzialisiert werden.
Zusammenfassend lässt sich sagen haben wir eine praktische Protokoll der neuartige fluoreszierende silberne Fleck für die Visualisierung der gesamten Proteinen in SDS-PAGE Gel beschrieben. Die Färbung ist unkompliziert, einfach zu bedienende, kostengünstige, und hat eine gute Färbung Leistung. Diese Methode kann erheblich erleichtern die Identifizierung der Protein-Bands in den Gelen und bietet ein nützliches Werkzeug für Proteinanalytik.
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Disclosures
Eine Patentanmeldung auf diese fluoreszierende silberne Färbung wurde eingereicht.
Acknowledgments
Die Autoren möchten Patrick Chan bei Ming Wai Lau Zentrum für Reparative Medizin, Karolinska Institutet, für seine technische Unterstützung zu danken. S. X. ist dankbar für die Unterstützung von der schwedischen Forschungsrat (Grant No. 2017-06344).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
LDS Sample Buffer (4X) |
Thermo Fisher Scientific | NP0007 | Reagent |
4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well |
Thermo Fisher Scientific | NP0323BOX | Precast gel |
| Sample Reducing Agent (10X) | Thermo Fisher Scientific | NP0004 | Reagent |
| MES SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fisher Scientific | NP0002 | Reagent |
| Mini Gel Tank | Thermo Fisher Scientific | A25977 | Equipment |
| 300W Power Supply (230 VAC) | Thermo Fisher Scientific | PS0301 | Equipment |
| Unstained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific | 26614 | Sample |
| Silver nitrate | Sigma-Aldrich | 31630-25G-R | Reagent |
| Ethanol | Bragg and co. | 42520J | Reagent |
| Acetic acid | J.T. Baker | 103201A | Reagent |
| Milli-Q Synthesis A10 | Merk | - | Provides 18.2 MΩ.cm water |
| gel documentation system (c600 model) | Azure biosystems | - | Equipment |
References
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