Summary
Aqui, descrevemos um protocolo detalhado descrevendo uma fluorescente nova técnica para detecção de proteínas totais em gel de poliacrilamida de coloração. O protocolo utiliza uma sonda de excitante prata íon-específicos de fluorescência, que detecta Ag+-complexos de proteínas e elimina determinadas limitações de manchas de prata cromogênica tradicionais.
Abstract
Coloração prata é uma técnica colorimétrica amplamente usada para visualizar bandas de proteínas em gel de poliacrilamida após eletroforese em gel polyacrylamide do sulfato dodecyl de sódio (SDS-PAGE). As manchas de prata clássicas tem alguns inconvenientes, tais como o fundo elevado, coloração, recuperação de proteína pobre, baixa reprodutibilidade, uma estreita faixa dinâmica linear para quantificação e compatibilidade limitada com espectrometria de massa (MS). Agora, com o uso de uma sonda de fluorogenic Ag+ , TPE-4TA, desenvolvemos uma fluorescente prata coloração método para a visualização de proteínas totais em gel de poliacrilamida. Esta mancha nova evita a etapa de redução de prata problemático em manchas de prata tradicionais. Além disso, a mancha de prata fluorescente demonstra boa reprodutibilidade, sensibilidade e quantificação linear na detecção de proteínas, tornando-se uma mancha de gel de proteína útil e prático.
Introduction
Muitos métodos de coloração têm sido usados para visualizar proteínas após eletroforese em gel, por exemplo, usando colorimétricos corantes como azul de Coomassie brilhante, mancha prateada, fluorescência, ou radioativo rotulagem1,2, 3 , 4. coloração prata é considerada uma das técnicas mais sensíveis para a deteção de proteínas que requerem reagentes simples e baratos. Pode ser classificado em duas grandes famílias: a mancha de prata amoniacal e o nitrato de prata mancham5,6. O método de prata amoniacal alcalino, o complexo de prata-diamina é produzido com amônia e hidróxido de sódio e reduzido a prata metálica durante o desenvolvimento usando uma solução de formaldeído ácido. A mancha acomoda eficientemente para proteínas básicas mas mostra um desempenho comprometido para proteínas ácidas e neutras e é, além disso, limitado a clássica glicina e taurinas sistemas eletroforético. Em comparação, as manchas de nitrato de prata exploram a bio-afinidade elevada de íons de prata à proteína, principalmente a sulfidrila e carboxila grupos de cadeias de lado e tendem a manchar as proteínas ácidas mais eficientemente7. Após o íon prateado vinculativo, uma solução em desenvolvimento (normalmente feita de uma solução de carbonato de metal contendo formaldeído e sódio tiossulfato) é aplicada para reduzir os íons de prata para grãos de prata metálicos, que construir uma cor marrom-escuro para visualizar o bandas de proteínas.
Embora a coloração prata bem conhecida por sua versatilidade e alta sensibilidade desde seu desenvolvimento na década de 19708, o método é frequentemente considerado tão complicado. Métodos de coloração de prata tem passos de tempo restrito e mostram baixa reprodutibilidade. Desde que a cor da mancha prateada geralmente não é uniforme e dependente a etapa de redução, que é difícil de controlar, a mancha de prata não é um método quantitativo e, assim, não é recomendado para gel de comparação estudo e proteína quantificação9. Métodos otimizados em sensibilidade podem utilizar aldeídos que podem também fornecer um uniforme mais10de coloração. No entanto, isto é à custa de uma análise mais aprofundada a jusante devido a reticulação de proteínas por aldeídos. Protocolos rápidos principalmente combinam ou encurtam etapas para reduzir o tempo, comprometer a reprodutibilidade e a uniformidade da mancha5. Como resultado, existem numerosas prata coloração variantes dentro do gel de proteína, coloração, cada um otimizado para atender a certos requisitos; por exemplo, simplicidade, sensibilidade ou peptídeo taxa de recuperação para análise a jusante. Esses atributos também podem ter impacto sobre os outros, e satisfazer todas as exigências em um protocolo pode ser difícil.
Neste trabalho, apresentamos uma nova prata fluorescente método para detecção de proteínas em gel de poliacrilamida de coloração. Neste método, usamos uma sonda fluorogenic para íons de prata, TPE-4TA (Figura 1), para visualizar as proteínas impregnado de prata11. TPE-4TA é projetado pelo princípio de emissão induzida por agregação (AIE). É não-emissivo quando dissolvido em solução aquosa, mas é altamente emissivo na presença de íons de prata. Substituindo o desenvolvimento cromogênico em manchas de prata tradicionais com um fluorogenic passo a desenvolver, o método fluorescente prateado permite a coloração robusto de proteínas totais com um fundo reduzida.
Além disso, a mancha de prata fluorescente mostrou uma boa faixa linear dinâmica para quantificação da proteína, que é comparável com a mancha de Ruby SYPRO amplamente utilizado e não realizáveis com manchas de prata tradicionais. O gel pode ser fotografado em sistemas de documentação comumente usados gel com uma lâmpada de ultravioleta (comprimento de onda de excitação: canal de 302/365 nm; emissão: ~ 490-530 nm) em muitos laboratórios biológicos.
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Protocol
1. preparação do Gel
Nota: A demonstração segue um protocolo padrão para preparar o gel para coloração pouco depois de SDS-PAGE12. Em resumo, as etapas a seguir descrevem a preparação das amostras e electroforese do gel.
- Executar SDS-PAGE com géis de proteína de Bis-Tris 4% - 12% (1 mm, 15-bem) usando um gel de mini tanque cheio de 2-(N -Morpholinos) etanesulfónico tampão de ácido (MES).
- Dilua as amostras com uma mistura de água destilada, lítio Dodecil sulfato de sódio (LDS) buffer e um agente de redução de amostra.
- Carrega a primeira pista com o dobro da quantidade de ações (10 µ l), seguida a quantidade normal de estoque (5 µ l) e uma série de diluições do estoque posteriormente (13 diluições, de 2x para 8192 x).
- Funcione o gel em uma constante tensão de 200 V para 30 min.
2. fixação do Gel
- Após a electroforese, mergulhe o gel em uma solução de 100 mL de ácido acético a ethanol/10% 40% em um agitador orbital a 50 rpm em temperatura ambiente 2 x (cada um por 30 min), ou durante a noite a 4 ° C.
- Lave o gel 3 x 10 min cada em água ultrapura em um recipiente limpo. A etapa de lavagem é crítica. Se o ácido da solução fixação não for devidamente removido na etapa de desenvolvimento fluorogenic, a excessiva TPE-4TA será ativado pelo ácido e levar a fluorescência de fundo forte no gel.
3. preparação do AgNO3solução e impregnação de prata do Gel
- Tornar a solução de3 AgNO (0,0001%) para a impregnação, em primeiro lugar, dissolva 0,01 g de AgNO3 em 10 mL de água ultrapura para preparar uma solução a 0,1% AgNO3 ações. Em seguida, adicione 100 µ l da solução estoque de 0.1% AgNO3 em 100 mL de água ultrapura para fazer a solução de trabalho.
Nota: A solução de AgNO3 deve ser armazenada no escuro antes de usar. - Impregnar o gel com 100 mL de solução para 1h de trabalho em um agitador orbital a 50 rpm em um recipiente de vidro fechado de prata. É fundamental para realizar a impregnação de prata sob uma coifa, protegida da luz com papel alumínio.
- Lave o gel com água ultrapura (cerca de 100 mL) em um recipiente limpo para 2 x 60 s.
4. Fluorogenic desenvolvimento do Gel
- Para preparar a solução de corante (0,1 mM), adicione 3,0 mg do TPE-4TA corante em 50 mL de água ultrapura. Proceda à sonicação a solução por alguns minutos e adicionar uma solução de NaOH (por exemplo, 1 M) para ajudar a dissolver o corante.
- Verifique se a fluorescência da solução sob uma lâmpada de nanômetro UV 365 para garantir que a molécula do corante é totalmente dissolvida. Só soluções fracas ou nonemissive indicam dissolução completa.
Nota: A tintura que TPE-4TA foi sintetizada a seguir o protocolo recentemente relatado por Xie et al 10 a TPE-4TA solução é muito estável e pode ser mantida no escuro por meses. - Para preparar 100 mL da solução em desenvolvimento fluorogenic (10 µM), adicione 10 mL da solução-mãe TPE-4TA em 90 mL de água ultrapura. Verificar o pH da solução usando um medidor de pH e ajustá-lo a 7-9 usando uma solução de hidróxido de sódio (1 µM).
- Transferi o gel para um recipiente limpo e selável com 100 mL da solução em desenvolvimento fluorogenic. Certifique-se que o gel está totalmente imerso na solução. Sele o contêiner. Cobri-lo de luz e agitá-lo durante a noite em um agitador orbital a 50 rpm, à temperatura ambiente. Alternativamente, a etapa de incubação também pode ser reduzida para cerca de ~ 2 h por pré-aquecimento a solução em desenvolvimento AIE a 80 ° C, para a coloração e em seguida, deixando-o à temperatura ambiente.
5. descoloração e imagem
- Transferir o gel para um recipiente limpo e destain-lo em 100 mL de etanol a 10% por 30 min.
Nota: A água sozinha pode ser usada para lavar o gel. No entanto, é mais tempo-eficiente usar uma solução de etanol de 10% para a descoloração. Isto ajudará a reduzir o processo de descoloração de horas a 30 min. - Lave o gel em água ultrapura por 5 min.
- Imagem do gel na 365 nm ou 302 nm canais, por uma máquina de documentação de gel.
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Representative Results
As bandas de proteínas coradas pela mancha prata fluorescente apresentam uma fluorescência verde intensa sob uma lâmpada de UV 365 nm. Todas as bandas de proteínas 14 (10-200 kDa), de cima para baixo, eram claramente visíveis, correlacionando-se bem com os 14 cor vermelha manchada com o Ruby SYPRO corante (Figura 2)10.
Em relação a deteção quantitativa de proteína, os géis foram por um gel sistema usando procedimentos automatizados de imagem, e as imagens foram analisadas e comparadas usando o software comercial. Esta prata fluorescente, método de coloração parece ter uma alta resolução. Para algumas bandas de proteínas, a sensibilidade da mancha prata fluorescente também é ligeiramente melhor do que com a mancha de SYPRO Ruby fluorescente. Em particular, o desempenho da mancha prata fluorescente foi melhorado para as bandas de proteína kDa ~ 10 a 40, indicando que o novo método é particularmente útil para a detecção de proteínas com molécula de baixo peso. Os dados também sugerem que a mancha de prata fluorescente deu uma linearidade boa e uniforme para todos os 14 proteínas em um intervalo relativamente amplo para proteína quantificação (Figura 3)11.
Em contraste com a mancha de nitrato de prata que deu um elevado nível de sinal de fundo e picos distorcidos, a mancha de prata fluorescente detectado as bandas com um bom contraste e intensidade uniforme distribuição comparável à mancha Ruby SYPRO através de todas as 14 proteínas (Figura 3).
Observe essa lavagem insuficiente após a fixação do gel resultará em fundo elevado, coloração (Figura 4). O ácido acético residual vai iluminar o TPE-4PA e levar a um forte background.
Figura 1: Estrutura química do TPE-4TA e seu mecanismo de detecção de Ag+. X = H ou nd+. Adaptado do trabalho anterior, copyright 2018 WILEY-VCH11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: coloração prata fluorescentes. A) Resumo do protocolo. B) uma comparação de géis corados pelo fluorescente mancha prateada (à esquerda) e mancha de SYPRO Ruby (à direita) fotografada paralelo com uma lâmpada UV portátil sob irradiação de nm 365. As proteínas (10-200 kDa) foram carregadas por dupla diluição de série a partir de 200-500 ng/banda faixa esquerda no máximo. Adaptado do trabalho anterior, copyright 2018 WILEY-VCH11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: intensidade da fluorescência das proteínas contra a quantidade de proteína, imagens representativas de gel e perfis de sinal (do quinto lane) de géis com três manchas diferentes. Mancha de nitrato de prata (A),(B) fluorescente mancha prateada (excitação de 365 nm) e (C) SYPRO Ruby mancha. A primeira coluna da figura mostra a intensidade da mancha para cada banda de 14 proteínas (10-200 kDa) contra a quantidade de proteína normalizada para a primeira pista (a partir da esquerda). A segunda coluna mostra as imagens de gel de representante da mancha correspondente. A quantidade de proteína carregada no gel é descrita na Figura 2. Adaptado do trabalho anterior, copyright 2018 WILEY-VCH11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: manchado gel de uma experiência de qualidade inferior. Neste experimento, a lavagem foi insuficiente após a etapa de fixação. O ácido acético residual induzida a agregação de TPE-4TA e causou um forte background. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Apresentado aqui é uma romance prata fluorescente método de coloração para proteínas em gel de poliacrilamida. Essa estratégia integra convencionais prata manchas e manchas fluorescentes. As façanhas de coloração a ligação seletiva de íons de prata às proteínas como em outra prata manchas mas emprega uma prata fluorogenic altamente sensível sonda TPE-4TA para iluminar as proteínas prata acopladas. Desde que a sonda fluorogenic TPE-4TA pressentem-se íons de prata em concentrações bastante baixas na faixa nanomolar11, permite uma detecção altamente sensível, sem qualquer outra demanda de uma etapa de visualização redutora conforme necessário no tradicional manchas de prata. Isto irá minimizar variações de execução para execução. Enquanto isso, que evita o uso de produtos químicos, incluindo o formaldeído e glutaraldeído, que frequentemente interferem com identificação de peptídeo em análise de MS. Além disso, como o TPE-4TA é AIE-ativo e livre de quaisquer problemas de têmpera, as tinturas densamente acumuladas em uma banda de proteína podem emitir coletivamente em resposta ao número de moléculas do corante. Isto contribui para uma faixa dinâmica ampla linear (LDR) para detecção de proteínas e uma coloração muito mais brilhante, quando comparado com a mancha de Ruby SYPRO.
Comparado com coloração prata tradicional, uma quantidade significativamente menor de nitrato de prata é necessária para esta nova coloração técnica-especificamente, 0,0001% de 0.1% relatou em comumente usado coloração protocolos4de nitrato de prata. Isso pode ser a hipótese de que o sucesso da nova mancha é puramente para a combinação da sonda fluorescente incrivelmente brilhante e sensível contra um fundo de alto contraste. Em comparação, a redução durante a etapa de desenvolvimento em manchas de prata tradicionais requer uma quantidade mais elevada de prata para produzir faixas escuras visíveis, particularmente quando ocorre num contexto de alta. Neste método, o tempo de desenvolvimento fluorogenic é maior do que o desenvolvimento tradicional de químico; no entanto, isto pode ser debatido como uma limitação ou como uma vantagem. O gel pode ser deixado na solução em desenvolvimento por longos períodos de tempo sem consequências, resultando em variações menores que podem derivar do operador. Não só existem menos etapas necessárias, mas também, mais pausas podem ser tomadas, o que torna este protocolo bastante conveniente. Não há nenhum risco de overstaining ao contrário na etapa de desenvolvimento tradicional que pode overdevelop o gel, resultando em um fundo escuro. Esta mancha prateada fluorescente também deverá ter uma menor variação de interprotein, embora uma nova avaliação de amostras adicionais da proteína é garantida (Figura 3).
É fundamental que siga a concentração de nitrato de prata sugerido do protocolo; usar uma concentração mais elevada não resulta em melhor desempenho e sensibilidade mas, em vez disso, produz uma fluorescência de fundo forte que pode engolir a fluorescência das bandas. Em termos de resolução de problemas, perda de brilho e sensibilidade pode resultar de excesso de lavagem na etapa de lavagem antes do desenvolvimento de fluorogenic ou de insuficiente impregnação de prata. Para este método, o sinal de fluorescência da banda proteína depende do número de íons de prata de proteínas, que é essencial para a formação da fluorescente TPE-4TA-Ag+ complexo. A proteína deve ser saturada com íons de prata para maximizar o potencial deste método de coloração.
Finalmente, como mencionado anteriormente, o corante fluorogenic para íon prateado usado neste método, TPE-4TA, é também pH sensível. Um pH baixo pode protonate a enciclopédia TPE-4TA para fluorescência no gel, resultando em uma mancha de fundo elevado. Portanto, etapas de lavagem inadequada, que deixam residual ácido acético a partir da solução de fixação, grandemente afetará a qualidade de mancha. É importante manter o gel relativamente neutra em pH na etapa de desenvolvimento fluorogenic (Figura 4). Também pode ser útil ajustar o pH da solução de TPE-4TA antes de coloração. Espera-se que esta tintura será comercializada em breve.
Em resumo, nós descrevemos um protocolo prático da novela mancha prata fluorescente para a visualização de proteínas totais em gel de SDS-PAGE. A coloração é simples, fácil de usar, eficiente e tem um bom desempenho de coloração. Esse método pode facilitar grandemente a identificação das bandas de proteínas em gel e fornece uma ferramenta útil para análise de proteínas.
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Disclosures
Tem sido apresentado um pedido de patente nesta coloração fluorescente de prata.
Acknowledgments
Os autores gostaria agradecer Patrick Chan no centro de Lau Wai Ming para medicina reparativa, Karolinska Institutet, seu suporte técnico. S. X. é grato pelo apoio do Conselho de pesquisas sueco (Grant No. 2017-06344).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
LDS Sample Buffer (4X) |
Thermo Fisher Scientific | NP0007 | Reagent |
4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well |
Thermo Fisher Scientific | NP0323BOX | Precast gel |
| Sample Reducing Agent (10X) | Thermo Fisher Scientific | NP0004 | Reagent |
| MES SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fisher Scientific | NP0002 | Reagent |
| Mini Gel Tank | Thermo Fisher Scientific | A25977 | Equipment |
| 300W Power Supply (230 VAC) | Thermo Fisher Scientific | PS0301 | Equipment |
| Unstained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific | 26614 | Sample |
| Silver nitrate | Sigma-Aldrich | 31630-25G-R | Reagent |
| Ethanol | Bragg and co. | 42520J | Reagent |
| Acetic acid | J.T. Baker | 103201A | Reagent |
| Milli-Q Synthesis A10 | Merk | - | Provides 18.2 MΩ.cm water |
| gel documentation system (c600 model) | Azure biosystems | - | Equipment |
References
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