Summary
Здесь мы описываем подробный протокол с изложением новых флуоресцентных, техника для определения общего белка в полиакриламидных гелей окрашивания. Протокол использует Серебряный Ион конкретных флуоресценции включения зонд, который обнаруживает Ag+-белковых комплексов и устраняет определенные ограничения традиционных хромогенных серебряные пятна.
Abstract
Серебряный пятнать это колориметрический метод широко используется для визуализации белка полосы в полиакриламидных гелях после натрия Додециловый сульфат полиакриламидный гель-электрофорез (SDS-PAGE). Классические серебряные пятна имеют определенные недостатки, такие как высокая предпосылка окрашивание, восстановления бедных белками, низкая воспроизводимость, узкие линейный динамический диапазон для количественной оценки и ограниченная совместимость с масс-спектрометрия (МС). Теперь с использованием fluorogenic АГ+ зонд, ТЭП 4TA, мы разработали флуоресцентные Серебряный пятнать метод для визуализации общего белка в полиакриламидных гелей. Это новое пятно избегает хлопотно Серебряный сокращения шаг в традиционные серебряные пятна. Кроме того люминесцентные серебряные пятна демонстрирует хорошую воспроизводимость, чувствительность и линейной количественной оценки обнаружения белка, делая это пятно гель полезной и практической белка.
Introduction
Многие пятная методы были используется для визуализации белков после электрофореза геля, например с помощью колориметрических красители Кумасси синим, Серебряная пятно, флуоресценции или радиоактивных маркировки1,2, 3 , 4. Серебряный пятнать считается одним из наиболее чувствительных методов для обнаружения белка, требующих простой и дешевый реагентов. Это могут быть разделены на два основных семей: аммиачный Серебряная пятно и нитрата серебра пятно5,6. В методе щелочной аммиачного серебра серебра диамин комплекс производится с аммиаком и гидроксид натрия и сокращено до металлического серебра во время разработки с помощью решения кислотные формальдегида. Пятно вмещает эффективно для основных белков, но показывает Скомпрометированное представление для кислых и нейтральных белков и, Кроме того, ограничивается классической глицин и таурина электрофоретической систем. В сравнении, нитрата серебра пятна эксплуатировать высокой био близость ионов серебра белка, главным образом сульфгидрильных и карбоксильных групп из боковых цепей и склонны пятно кислые белки более эффективно7. После ионов серебра привязки, развивающихся решение (как правило, сделаны из металла карбонат раствор, содержащий формальдегида и натрия тиосульфата) применяется для снижения ионы серебра Металлик серебряный зерна, которые строить коричневого до темного цвета для визуализации белка полосы.
Хотя Серебряные пятная был хорошо известен своей универсальностью и высокой чувствительности с его развития в 1970-х8, метод часто рассматривается как сложная. Серебро окрашивание методы имеют ограниченный время шаги и показать низкая воспроизводимость. Поскольку цвет серебряные пятна обычно не является единообразной и зависит от сокращения шаг, который сложно контролировать, Серебряная пятно не количественный метод и, таким образом, не рекомендуется для геля сравнения исследования и белка количественная оценка9. Методы оптимизации чувствительности могут использовать альдегидов, которые также могут обеспечить более единообразной пятнать10. Однако это за счет далее вниз по течению анализ благодаря сшивки белков, альдегиды. Быстрый протоколы главным образом объединить или сократить шаги по сокращению времени, ущерба для воспроизводимости и единообразия пятно5. В результате имеются многочисленные Серебряные пятная варианты внутри гель белка, окрашивание, каждый оптимизирована для удовлетворения определенных требований; например простота, чувствительности или пептид ставки возмещения по течению анализа. Эти атрибуты также могут иметь влияние друг на друга, и удовлетворение всех требований в одном протоколе может быть затруднено.
В этой работе мы представляем новый флуоресцентные Серебряный пятнать метод для определения белка в геле полиакриламида. В этом методе мы используем fluorogenic зонд для ионы серебра, ТЭП 4TA (рис. 1), чтобы визуализировать серебро пропитанные белков11. TPE-4TA разработан принцип индуцированной агрегации выбросов (АЕИ). Это не эмиссионные при растворении в водном растворе, но весьма эмиссионных присутствии ионов серебра. Заменив хромогенных развития в традиционные серебряные пятна fluorogenic развивающихся шаг, люминесцентные серебряные метод позволяет надежные пятнать суммарных белков на фоне снижения.
Кроме того люминесцентные серебряные пятна показал хороший линейный динамический диапазон для количественного определения белка, которая сравнима с пятно SYPRO Ruby широко используется и не достижимы с традиционной серебряные пятна. Гель может отражаться на часто используемые гель документации систем с ультрафиолетовой лампой (длина волны возбуждения: 302/365 Нм канал; выбросов: ~ 490-530 Нм) на многих биологических лабораториях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка геля
Примечание: Демонстрация следующим стандартным протоколом для подготовки гель для окрашивания вскоре после SDS-PAGE12. Короче говоря следующие шаги описывают подготовки проб и электрофорез геля.
- Выполняют SDS-PAGE с 4% - 12% бис-трис белка гели (1 мм, 15-а) с помощью танк мини-Гель заполнены с 2-(N -Морфолино) ethanesulfonic кислота (MES) буфера.
- Развести образцы с сочетанием дистиллированной воды, литий Додециловый сульфат (LDS) буфер и образец уменьшение агента.
- Загрузите первый Лейн с удвоить количество запасов (10 мкл), а затем суммы обычных запасов (5 мкл) и серию разведений двойную фондовой впоследствии (13 разведений, с 2 x до 8192 x).
- Побегите гель на постоянное напряжение 200 В течение 30 мин.
2. Фиксация геля
- После электрофореза опускайте гели в 100 мл раствора уксусной кислоты 40% ethanol/10% на орбитальный шейкер на 50 об/мин при комнатной температуре 2 x (каждый 30 минут), или на ночь при 4 ° C.
- Вымойте гели 3 x 10 мин в ультрачистая вода в контейнере чистой. Стиральная шаг очень важен. Если кислоты из крепления решения не удаляется надлежащим образом в fluorogenic развивающихся шаг, чрезмерное TPE-4TA будет активироваться кислоты и привести к флуоресцирования сильный фон в геле.
3. Подготовка AgNO3решения и серебряные пропитки геля
- Чтобы сделать решение3 AgNO (0,0001%) для пропитки во-первых, Растворите 0,01 г3 AgNO сверхчистой воды приготовить раствор штока3 AgNO 0,1% 10 мл. Далее добавите 100 мкл раствора 0,1% AgNO3 штока в 100 мл сверхчистой воды, чтобы сделать рабочий раствор.
Примечание: AgNO3 раствор должен храниться в темноте перед использованием. - Пропитать гель 100 мл серебра рабочего раствора на 1 ч на орбитальный шейкер на 50 об/мин в закрытой стеклянной посуде. Это имеет решающее значение для выполнения Серебряный пропитки под вытяжного шкафа, защищенном от света с алюминиевой фольгой.
- Промойте гель с ультрачистая вода (около 100 мл) в чистую емкость для 2 x 60 s.
4. Fluorogenic развитие геля
- Подготовить раствор красителя (0,1 мм), добавьте 3,0 мг красителя TPE-4TA в 50 мл сверхчистой воды. Sonicate раствор на несколько минут и добавить некоторые растворе NaOH (например 1 М) чтобы помочь растворить краску.
- Проверьте флуоресценции решения под 365 Нм УФ лампа для обеспечения что молекулы красителя полностью растворяется. Только слабые или nonemissive решения указывают полное растворение.
Примечание: Краситель, который был TPE-4TA синтезированы следующие протокола недавно сообщали СЕ et al. 10 решение TPE-4TA очень стабильна и может храниться в темноте в течение месяцев. - Подготовить 100 мл fluorogenic развивающихся раствора (10 мкм), добавьте 10 мл раствора TPE-4TA акций в 90 мл ультрачистая вода. Проверьте рН раствора с помощью рН метр и настроить его для 7-9 с помощью раствора гидроксида натрия (1 мкм).
- Передача геля чистым и герметичные контейнер с 100 мл раствора развивающихся fluorogenic. Убедитесь в том, что гель полностью погружается в решении. Уплотнение контейнера. Накройте его от света и встряхните его на ночь на орбитальный шейкер на 50 об/мин при комнатной температуре. Кроме того на этапе инкубации также может быть сокращен до около ~ 2 h, подогрева развивающихся решение АНО до 80 ° C для окрашивания и затем оставить его при комнатной температуре.
5. минигелей и обработки изображений
- Передавать чистый контейнер гель, Отмойте в 100 мл 10% этанола за 30 мин.
Примечание: Только вода может использоваться для мытья гель. Однако это время эффективнее использовать 10% этанола раствор для минигелей. Это поможет уменьшить destaining процесс от часа до 30 мин. - Промойте гель в ультрачистая вода для 5 мин.
- Изображение геля на 365 Нм канал или 302 Нм канал гель документации машиной.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Белка полосы запятнана люминесцентные серебряные пятна экспонат интенсивный зеленый флуоресценции под лампой УФ 365 Нм. Все 14 белка полосы (10-200 кДа), сверху вниз, были хорошо видны, соотнося с 14 красного цвета те запятнана SYPRO Рубиновый краситель (рис. 2)10.
Что касается количественных белка обнаружения гели были образы гелем изображений системы с помощью автоматических процедур, и изображения были проанализированы и по сравнению с использованием коммерческого программного обеспечения. Этот флуоресцентные Серебряный пятнать метод, как представляется, с высоким разрешением. Для некоторых групп белков чувствительность люминесцентные серебряные пятна также немного лучше, чем флуоресцентные пятна SYPRO Ruby. В частности улучшение производительности люминесцентные серебряные пятна на ~ 10-40 кДа белка полосы, указав, что новый метод особенно полезен для обнаружения белков с низкой молекулы весов. Данные также показывают, что люминесцентные серебряные пятна дал хороший и единообразных линейность для всех 14 белков в относительно широком диапазоне для белка количественной оценки (Рисунок 3)11.
В отличие от пятно нитрата серебра, который дал высокий уровень фонового сигнала и искаженные пиков люминесцентные серебряные пятна обнаружено полосы с хороший контраст и единообразных интенсивности распространения сопоставимы с пятно SYPRO Ruby во всех 14 белков (Рис. 3).
Обратите внимание, что недостаточно мыть после фиксации гель приведет к высокой фоновой окрашивание (рис. 4). Остаточные уксусной кислоты будет загораться TPE-4ПА и привести к сильный фон.
Рисунок 1: Химическая структура TPE-4TA и ее зондирования механизм Ag+. X = H или Na+. Приспособлено от предыдущей работы, авторские права 2018 WILEY-VCH11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: люминесцентные серебряные пятная. A) резюме протокола. B) сравнение гели запятнана люминесцентные серебряные пятна (слева) и SYPRO Ruby пятно (справа) образы параллельно с ручной УФ-лампа под 365 Нм облучения. Белки (10-200 кДа) были загружены на двойную серийный разрежения, начиная от 200-500 нг/полосами на самой левой полосе. Приспособлено от предыдущей работы, авторские права 2018 WILEY-VCH11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: интенсивность флуоресценции белков против количество белка, представитель гель изображения и профили сигнала (от пятого Лейн) гели с трех различных пятен. Пятно нитрата серебра (A),()B) люминесцентные серебряные пятна (365 Нм возбуждения) и (C) SYPRO Ruby пятно. Первый столбец цифра показывает интенсивность пятно для каждой группы 14 белков (10-200 кДа) против количество белка, нормированная на первой полосе (начиная слева). Второй столбец показывает представитель гель изображения соответствующего пятно. Количество белка, загружается в гель описана на рисунке 2. Приспособлено от предыдущей работы, авторские права 2018 WILEY-VCH11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Витражи гель от неоптимальных эксперимент. В этом эксперименте Стиральная недостаточно после фиксации шага. Остаточные уксусная кислота индуцированной агрегации TPE-4TA и вызвало сильную предпосылку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Представленные здесь является роман люминесцентные серебряные пятная метод для белков в полиакриламидных гелей. Эта стратегия объединяет традиционные серебряные пятна и флуоресцентные пятна. Окрашивание подвиги селективного связывание ионов серебра с белками, как и другие серебряные пятна, но использует чувствительный fluorogenic серебро зонд TPE-4TA загорается Серебряный связанных белков. Поскольку fluorogenic зонд TPE-4TA может смысле ионы серебра на довольно низкой концентрации в наномолярных диапазона11, он позволяет высокочувствительный обнаружения без каких-либо дальнейших спрос упрощенной визуализации шага при необходимости в традиционных Серебряные пятна. Это сведет к минимуму варианты запуска к запуску. Тем временем он избегает использования агрессивных химикатов, включая формальдегид и глютаральдегид, которые часто мешают пептид идентификации в масс-Спектральный анализ. Кроме того, как TPE-4TA АНО-активен и свободной от каких-либо проблем самостоятельно тушения, плотно накопленные красителей в группу белка может коллективно излучают в ответ на количество красителя молекул. Это способствует широкий линейный динамический диапазон (LDR) для обнаружения протеина и намного ярче окрашивание, когда по сравнению с SYPRO Ruby пятно.
По сравнению с традиционными Серебряный пятнать, для этой новой пятнать техника специально требуется значительно меньшее количество серебра нитрата, 0,0001% от 0,1%, сообщили в часто используемые нитрата серебра, пятная протоколы4. Можно предположить, что успех нового пятно является чисто до сочетание невероятно яркий и чувствительных флуоресцентного зонда на фоне высокой контрастности. В сравнении сокращение в развивающихся шаге традиционные серебряные пятна требует выше количество серебра производить темные видимых диапазонах, особенно когда это происходит на фоне высокой. В этом методе время разработки fluorogenic дольше, чем традиционные химические разработки; Однако это можно обсудить как ограничение или как преимущество. Гель можно оставить в разработке решения для длительных периодов времени без последствий, что приводит к ниже вариантов, которые могут вытекать из оператора. Не только есть меньше шаги необходимые, но Кроме того, могут быть приняты более паузы, что делает этот протокол довольно удобно. Существует никакого риска overstaining в отличие от традиционных развивающихся шаг, который может overdevelop гель, что привело в темном фоне. Это люминесцентные серебряные пятна также ожидается меньший interprotein вариант, хотя и дальнейшей оценки дополнительного белка образцов является оправданным (рис. 3).
Очень важно следовать за предлагаемые нитрата серебра концентрации от протокола; с использованием более высокой концентрации не приводит к более высокой производительности и чувствительность, но, вместо этого, производит сильный фон флуоресценции, который может поглотить флуоресценции полос. С точки зрения устранения неполадок, может привести к потере чувствительности и яркость от чрезмерной стирки в мыть шаг до fluorogenic развития или недостаточно Серебряный пропитки. Для этого метода сигнал флуоресценции белков группы зависит количество белка прыгните серебряных ионов, который необходим для формирования флуоресцентные TPE-4TA-Ag+ комплекс. Белок следует насыщенный ионами серебра, чтобы максимизировать потенциал этого метода окрашивания.
Наконец как упоминалось ранее, fluorogenic краситель для ионов серебра, используемые в этом методе, ТЭП 4TA, также является чувствительным рН. Низкий рН может protonate бесплатно TPE-4TA для флуоресцировать в гель, что приводит к высокой фоновой пятно. Таким образом неправильное мыть шаги, которые оставить остаточные уксусной кислоты из фиксации решения, существенно повлияет на качество пятно. Важно сохранить гель относительно нейтральный рН на этапе развития fluorogenic (рис. 4). Она также может быть полезно для регулировки рН раствора TPE-4TA до окрашивания. Ожидается, что эта краска будет коммерциализированной в ближайшем будущем.
В целом мы описали практических протокол Роман люминесцентные серебряные пятна для визуализации всего белков в геля SDS-PAGE. Окрашивание просто, easy-to-use, экономически эффективным и имеет хорошую производительность окрашивание. Этот метод может значительно облегчить выявление белка полосы в гели и служат полезным инструментом для анализа белка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Подал заявку на патент на этот люминесцентные серебряные пятная.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Патрик Чан в центре Лау Вай Ming репаративной медицины Karolinska Institutet, за его техническую поддержку. S. X. признательна за поддержку от шведского исследовательского совета (Грант № 2017-06344).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
LDS Sample Buffer (4X) |
Thermo Fisher Scientific | NP0007 | Reagent |
4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well |
Thermo Fisher Scientific | NP0323BOX | Precast gel |
| Sample Reducing Agent (10X) | Thermo Fisher Scientific | NP0004 | Reagent |
| MES SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fisher Scientific | NP0002 | Reagent |
| Mini Gel Tank | Thermo Fisher Scientific | A25977 | Equipment |
| 300W Power Supply (230 VAC) | Thermo Fisher Scientific | PS0301 | Equipment |
| Unstained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific | 26614 | Sample |
| Silver nitrate | Sigma-Aldrich | 31630-25G-R | Reagent |
| Ethanol | Bragg and co. | 42520J | Reagent |
| Acetic acid | J.T. Baker | 103201A | Reagent |
| Milli-Q Synthesis A10 | Merk | - | Provides 18.2 MΩ.cm water |
| gel documentation system (c600 model) | Azure biosystems | - | Equipment |
References
- Chevalier, F. Highlights on the capacities of "Gel-based" proteomics. Proteome Science. 8 (1), (2010).
- Harris, L. R., Churchward, M. A., Butt, R. H., Coorssen, J. R. Assessing detection methods for gel-based proteomic analyses. Journal of Proteome Research. 6 (4), 1418-1425 (2007).
- Gauci, V. J., Wright, E. P., Coorssen, J. R. Quantitative proteomics: assessing the spectrum of in-gel protein detection methods. Journal of Chemical Biology. 4 (1), 3-29 (2011).
- Candiano, G., Bruschi, M., et al. Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25 (9), 1327-1333 (2004).
- Chevallet, M., Luche, S., Rabilloud, T. Silver staining of proteins in polyacrylamide gels. Nature Protocols. 1 (4), 1852-1858 (2006).
- Jin, L. T., Hwang, S. Y., Yoo, G. S., Choi, J. K. Sensitive silver staining of protein in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using an azo dye, calconcarboxylic acid, as a silver-ion sensitizer. Electrophoresis. 25 (15), 2494-2500 (2004).
- Celis, J. E., et al. Cell Biology: A Laboratory Handbook. , Elsevier Academic Press. Amsterdam, the Netherlands. (2006).
- Bartsch, H., Arndt, C., Koristka, S., Cartellieri, M., Bachmann, M. Silver Staining Techniques of Polyacrylamide Gels. Methods in Molecular Biology. 869 (1), 481-486 (2012).
- Rabilloud, T., Vuillard, L., Gilly, C., Lawrence, J. Silver-staining of proteins in polyacrylamide gels: a general overview. Cellular and Molecular Biology. 40 (1), 57-75 (1994).
- Zhou, M., Yu, L. Proteomic Analysis by Two-Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis. Advances in Protein Chemistry. 65 (1), 57-84 (2003).
- Xie, S., et al. Fluorogenic Ag+-Tetrazolate Aggregation Enables Efficient Fluorescent Biological Silver Staining. Angewandte Chemie International Edition. 57 (20), 5750-5753 (2018).
- Protein gel electrophoresis technical handbook. , Thermo Fisher Scientific. Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf (2015).
