Summary
Här beskriver vi ett detaljerade protokoll som beskriver en ny fluorescerande färgning teknik för totalprotein upptäckt i polyakrylamidgeler. Protokollet använder tredjeparts en silver ion-specifika fluorescens turn-on sond, som upptäcker Ag+-proteinkomplex, och eliminerar vissa begränsningar av traditionella kromogen silver fläckar.
Abstract
Silverfärgning är en kolorimetrisk teknik som ofta används för att visualisera protein band i polyakrylamidgeler efter sodium dodecyl sulfate-polyakrylamid gelelektrofores (SDS-PAGE). Klassisk silver fläckar har vissa nackdelar, såsom hög bakgrund färgning, dålig protein återvinning, låg reproducerbarhet, ett smalt linjära dynamiska omfång för kvantifiering och begränsad kompatibilitet med masspektrometri (MS). Nu, med hjälp av en fluorogenic Ag+ sond, TPE-4TA, vi utvecklat en fluorescerande silver färgning metod för totalprotein visualisering i polyakrylamidgeler. Denna nya fläck undviker det besvärande silver minskning steget i traditionella silver fläckar. Dessutom visar fluorescerande silver fläcken bra reproducerbarhet, känslighet och linjär kvantifiering i protein upptäckt, vilket gör det till en användbar och praktisk protein gel fläck.
Introduction
Många färgning metoder har varit användas för att visualisera proteiner efter gelelektrofores, till exempel använder kolorimetriska färgämnen som Coomassie Brilliant Blue, silver fläcken, fluorescens, eller radioaktiv märkning1,2, 3 , 4. silverfärgning anses vara en av de mest känsliga teknikerna för protein upptäckt som kräver enkel och billig reagenser. Det kan delas in i två stora familjer: ammoniak silver fläcken och silvernitrat fläcken5,6. I alkaliska ammoniak silver metoden, silver-diamine anläggningen produceras med ammoniak och natriumhydroxid och reduceras till metalliskt silver under utveckling med en sura formaldehydlösning. Fläcken rymmer effektivt för grundläggande proteiner men visar en komprometterad prestanda för sura och neutrala proteiner och är dessutom begränsad till klassiskt glycin och taurin elektroforetiska system. I jämförelse, silvernitrat fläckar utnyttja hög bio-frändskapet av silverjoner till protein, främst de sulfhydryl carboxyl grupper från sida kedjorna och tenderar att färga sura proteiner effektivare7. Efter silverjoner bindande, en utveckla lösningen (vanligtvis gjorda av en metall karbonat lösning innehållande formaldehyd och natrium tiosulfat) används för att reducera silverjoner till metalliskt silver korn, som bygger upp en brun till mörkt färg att visualisera den protein band.
Silverfärgning har varit känt för sin mångsidighet och hög känslighet sedan dess utveckling i 1970-talet8, är metoden ofta betraktas som knepigt. Silver-färgning metoder har tid-begränsat steg och visar låg reproducerbarhet. Eftersom färgen på silver fläcken inte är oftast enhetlig och beroende av det steget-minskning som är svårt att styra, silver fläcken är inte en kvantitativ metod och, således, rekommenderas inte för gel jämförelse studie och protein kvantifiering9. Metoder optimerad i känslighet kan utnyttja aldehyder som också kan ge en mer enhetlig färgning10. Detta är dock på bekostnad av ytterligare nedströms analys på grund av tvärbindning av proteiner av aldehyder. Snabb protokoll mestadels kombinera eller förkorta steg för att minska tid, att kompromissa med reproducerbarhet och likformighet av fläcken5. Som ett resultat finns det många silver färgning varianter inom protein gel färgning, var optimerad för att passa vissa krav. till exempel, enkelhet, känslighet eller peptid återvinningsgraden för efterföljande analys. Dessa attribut kan också ha en inverkan på varandra, och uppfyller alla krav i ett protokoll kan vara svårt.
I detta arbete introducerar vi nya fluorescerande silver färgning protein detektionsmetod i polyakrylamidgel. Den här metoden använder vi en fluorogenic sond för silverjoner, TPE-4TA (figur 1), att visualisera silver-impregnerade proteiner11. TPE-4TA är designad av principen om sammanläggning-inducerad utsläpp (AIE). Det är icke-emissive när upplöst i vattenlösning, men är mycket emissive i närvaro av silverjoner. Genom att ersätta kromogen utvecklingen i traditionella silver fläckar med en fluorogenic utveckla steg, kan metoden fluorescerande silver robust färgningen av totala proteiner med reducerad bakgrund.
Fluorescerande silver fläcken visade en bra linjär dynamik för protein kvantifiering, jämförbar med utbredda SYPRO Ruby fläcken och inte kan uppnås med traditionella silver fläckar. Gelen kan avbildas på vanliga gel dokumentationssystem med UV-lampa (excitation våglängd: 302/365 nm kanal; utsläpp: ~ 490-530 nm) på många biologiska laboratorier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av Gel
Obs: Demonstrationen följer ett standardprotokoll för att förbereda gelen för färgning kort efter SDS-PAGE12. I korthet följande steg beskriva beredning av proverna och gel elektrofores.
- Utföra SDS-PAGE med 4% - 12% Bis-Tris protein gels (1 mm, 15-brunn) med hjälp av en mini gel tank fylld med 2-(N -morpholino) ethanesulfonic syra (MES) buffert.
- Späd ut proverna med en blandning av destillerat vatten, litium dodecyl sulfate (LDS) buffert och en prov-reducerande agent.
- Ladda den första lane med dubbla mängden lager (10 µL), följt av det normala lager beloppet (5 µL) och en serie dubbla utspädningar av beståndet därefter (13 spädningar, från 2 x till 8192 x).
- Kör gelen vid en konstant spänning på 200 V för 30 min.
2. fixering av Gel
- Efter elektrofores, dränka gelerna i en 100 ml 40% ethanol/10% ättiksyra i orbitalskak vid 50 rpm i rumstemperatur 2 x (varje 30 min), eller över natten vid 4 ° C.
- Tvätta gelerna 3 x 10 min varje i ultrarent vatten i en ren behållare. Det tvätt steget är kritisk. Om syran från fastställande lösningen inte avlägsnas ordentligt i fluorogenic utveckla steg, den överdrivna TPE-4TA kommer att aktiveras av syran och leda till stark bakgrund fluorescens i gelen.
3. beredning av AgNO3lösning och Silver impregnering av Gel
- Att göra AgNO3 lösningen (0,0001%) för impregnering, först Lös 0,01 g AgNO3 i 10 mL av ultrarent vatten för att förbereda en 0,1% AgNO3 stamlösning. Nästa, tillsätt 100 µL 0,1% AgNO3 stamlösning i 100 mL av ultrarent vatten för att göra arbetslösning.
Obs: AgNO3 lösningen bör förvaras i mörker innan användning. - Impregnera gelen med 100 mL silver arbetar lösning för 1 h i orbitalskak på 50 rpm i en tillsluten glasbehållare. Det är viktigt att utföra silver impregneringen under dragskåp, skyddas från ljus med aluminiumfolie.
- Tvätta gelen med ultrarent vatten (ca 100 mL) i en ren behållare för 2 x 60 s.
4. Fluorogenic utveckling av Gel
- För att förbereda dye stamlösning (0.1 mM), lägga till 3,0 mg av TPE-4TA färgämnet i 50 mL av ultrarent vatten. Sonikera lösningen ett par minuter och tillsätt några NaOH-lösning (till exempel 1 M) för att lösa upp färgen.
- Kontrollera fluorescensen av lösningen under en 365 nm UV-lampa för att säkerställa att färgämnet molekylen är helt upplöst. Bara ange svag eller nonemissive lösningar full upplösning.
Obs: Färgämnet TPE-4TA var syntetiseras följande protokollet rapporterade nyligen av Xie o.a. 10 TPE-4TA lösningen är mycket stabil och kan hållas i mörkret i månader. - För att bereda 100 mL fluorogenic utveckla lösningen (10 µM), tillsätt 10 mL av stamlösningen TPE-4TA till 90 mL av ultrarent vatten. Kontrollera pH-värdet i lösningen med en pH-mätare och ställa den till 7-9 med en natriumhydroxidlösning (1 µM).
- Överföra gelen till en ren och förslutningsbara behållare med 100 mL fluorogenic utveckla lösningen. Kontrollera att gelen är helt nedsänkt i lösningen. Täta behållaren. Täcka det från ljus och skaka den över natten i orbitalskak vid 50 rpm vid rumstemperatur. Alternativt kan inkuberingssteget också förkortas till cirka ~ 2 h genom förvärmning AIE utveckla lösningen till 80 ° C för färgning och sedan lämnar det vid rumstemperatur.
5. avfärgning och Imaging
- Överföra gelen till en ren behållare och avfärga det i 100 mL 10% etanol i 30 min.
Obs: Enbart vatten kan användas för att tvätta gelen. Det är dock mer tidseffektivt att använda en lösning med 10% i etanol för den avfärgning. Detta kommer att bidra till att minska destaining processen från timmar till 30 min. - Skölj gelen i ultrarent vatten i 5 min.
- Bild gelen på 365 nm kanalen eller 302 nm kanal av en gel dokumentation maskin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De protein band färgas av fluorescerande silver fläcken uppvisar en intensiv grön fluorescens under en 365 nm UV-lampa. Alla 14 protein band (10-200 kDa), var från toppen till botten, klart synliga, korrelera väl med de 14 röd-färgade som färgas av SYPRO Ruby färgämne (figur 2)10.
När det gäller kvantitativa protein upptäckt, gelerna var fotograferad av en gel som imaging system med automatiserade procedurer och bilderna var analyseras och jämförs med hjälp av kommersiell programvara. Detta fluorescerande silver färgning metod verkar ha hög upplösning. För vissa protein band är känsligheten hos fluorescerande silver fläcken också något bättre än fluorescerande SYPRO Ruby fläcken. I synnerhet förbättrades prestandan hos fluorescerande silver fläcken för ~ 10 till 40 kDa protein band, som anger att den nya metoden är särskilt användbar för påvisande av proteiner med lågt molekyl vikter. Data tyder också på att fluorescerande silver fläcken gav en bra och enhetlig linjäritet för alla 14 proteiner över ett relativt brett spektrum för protein kvantifiering (figur 3)11.
I motsats till silvernitrat fläcken som gav hög bakgrund signal och förvrängd toppar, upptäckt fluorescerande silver fläcken banden med bra kontrast och enhetlig intensitet fördelning jämförbar med SYPRO Ruby fläcken över alla 14 proteiner (Figur 3).
Observera att otillräcklig tvättning efter gel fixering kommer att resultera i höga bakgrunden färgning (figur 4). Kvarstående ättiksyra kommer att lysa upp den TPE-4PA och leda till en stark bakgrund.
Figur 1: Kemisk struktur av TPE-4TA och dess avkänning mekanism till Ag+. X = H eller Na+. Anpassad från tidigare arbete, copyright 2018 WILEY-VCH11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: fluorescerande silverfärgning. A) Sammanfattning av protokollet. B) en jämförelse av geler färgas av fluorescerande silver fläcken (vänster) och SYPRO Ruby fläcken (höger) avbildas parallellt med en handhållen UV-lampa under 365 nm bestrålning. Proteinerna (10-200 kDa) lästes av tvåfaldiga seriella utspädning start från 200-500 ng/band på den vänstra körfältet. Anpassad från tidigare arbete, copyright 2018 WILEY-VCH11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: fluorescensintensiteten hos proteiner mot protein belopp, representativa gel bilder och signal profiler (från den femte lanen) av geler med tre olika fläckar. (A) silvernitrat fläckar,()B) fluorescerande silver fläcken (365 nm magnetisering) och (C) SYPRO Ruby fläcken. Den första kolumnen i figuren visar intensiteten i fläcken för varje band av 14 proteiner (10-200 kDa) mot mängden protein normaliserade till första körfält (start till vänster). Den andra kolumnen visar representativa gel bilder av motsvarande fläcken. Mängden protein som lästs in gelen beskrivs i figur 2. Anpassad från tidigare arbete, copyright 2018 WILEY-VCH11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: färgade gel från ett suboptimalt experiment. I detta experiment var tvätt otillräcklig efter fixering steget. Kvarstående ättiksyra inducerad sammanläggning av TPE-4TA och orsakade en stark bakgrund. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Presenteras här är en roman fluorescerande silver färgning metod för proteiner i polyakrylamidgeler. Denna strategi integrerar konventionella silver fläckar och fluorescerande fläckar. Färgning bedrifter selektiva bindningen av silverjoner till proteiner som i andra silver fläckar men sysselsätter mycket känsliga fluorogenic silver probe TPE-4TA att lysa upp silver bundna proteinerna. Eftersom fluorogenic sonden TPE-4TA kan känna silverjoner i en ganska låg koncentration i nanomolar utbud11, möjliggör det en mycket känslig detektion utan ytterligare efterfrågan av en reduktiv visualisering steg som behövs i traditionella Silver fläckar. Detta minimerar kör-och-kör variationer. Under tiden undviker man användning av starka kemikalier, inklusive formaldehyd och glutaraldehyd, som ofta stör peptid identifiering i MS analys. Dessutom, TPE-4TA AIE-aktiva och fria från själv släcka problem, de tätt ackumulerade färgämnena i ett protein band kan avge kollektivt svar på antalet dye molekyler. Detta bidrar till ett brett linjär dynamisk utbud (LDR) för upptäckt av protein och en mycket ljusare färgning jämfört med SYPRO Ruby fläcken.
Jämfört med traditionella silverfärgning, en betydligt mindre mängd silvernitrat krävs för denna nya färgning teknik-specifikt, 0,0001% från 0,1% rapporterades i vanliga används silvernitrat färgning protokoll4. Det kan vara hypotes om att framgången för nya fläcken är rent ner till kombinationen av otroligt ljusa och känsliga fluorescerande sonden mot Högkontrast bakgrund. I jämförelse kräver minskning i utvecklingsländer steg i traditionella silver fläckar en högre mängd silver producera mörka synliga band, särskilt när det sker mot en hög bakgrund. I denna metod är fluorogenic tiden längre än den traditionella kemiska utvecklingen. Detta kan dock diskuteras som en begränsning eller som en fördel. Gelen kan lämnas i utveckla lösningen för långa perioder med inga konsekvenser, vilket resulterar i lägre variationer som kan härröra från operatören. Inte bara finns det färre steg krävs, men också fler pauser kan tas, vilket gör detta protokoll ganska bekvämt. Det finns ingen risk för overstaining till skillnad från i den traditionella utveckla steg som kan overdevelop i gel, vilket resulterar i en mörk bakgrund. Denna fluorescerande silver fläck förväntas också ha en mindre interprotein variant, om än en ytterligare utvärdering av ytterligare protein prover är befogad (figur 3).
Det är viktigt att följa den föreslagna silvernitrat koncentrationen från protokollet. använda högre koncentration resulterar inte i bättre prestanda och känslighet men istället producerar en stark bakgrund fluorescens som kan uppsluka fluorescensen av banden. När det gäller felsökning, kan förlust i känslighet och ljusstyrka resultera från överdriven tvätt i tvättningen före fluorogenic utveckling eller otillräcklig silver impregnering. För denna metod är fluorescens signalen från protein bandet beroende av antalet proteinbundet silverjoner, vilket är viktigt för bildandet av fluorescerande TPE-4TA-Ag+ komplex. Proteinet bör vara mättad med silverjoner att maximera potentialen av denna färgningsmetod.
Slutligen, som nämnts tidigare, fluorogenic färgen för silverjoner används i denna metod, TPE-4TA, är också pH-känsliga. Lågt pH kan protonate det fri TPE-4TA att fluorescera i gel, vilket resulterar i en hög bakgrunden fläcken. Därför felaktig tvätt steg, som lämnar kvarstående ättiksyra från fixering lösning, kommer kraftigt att påverka fläcken kvaliteten. Det är viktigt att hålla gelen relativt neutral i pH i fluorogenic utveckling steg (figur 4). Det kan också vara bra att justera pH-värdet i TPE-4TA lösningen innan färgning. Det förväntas att denna färg kommer att kommersialiseras inom en snar framtid.
I Sammanfattning beskrev vi ett praktiskt protokoll roman fluorescerande silver fläcken för visualisering av totala proteiner i SDS-PAGE gel. Färgningen är enkel, lätt-till-använda, kostnadseffektiva, och har en bra färgning prestanda. Denna metod kan underlätta identifiering av protein band geler och ger ett användbart verktyg för proteinanalys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
En patentansökan på denna fluorescerande silverfärgning har lämnats in.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Patrick Chan på Ming Wai Lau Centre för reparativ medicin, Karolinska Institutet, för hans teknisk support. S. X. är tacksam för stödet från Vetenskapsrådet (Grant No. 2017-06344).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
LDS Sample Buffer (4X) |
Thermo Fisher Scientific | NP0007 | Reagent |
4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well |
Thermo Fisher Scientific | NP0323BOX | Precast gel |
| Sample Reducing Agent (10X) | Thermo Fisher Scientific | NP0004 | Reagent |
| MES SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fisher Scientific | NP0002 | Reagent |
| Mini Gel Tank | Thermo Fisher Scientific | A25977 | Equipment |
| 300W Power Supply (230 VAC) | Thermo Fisher Scientific | PS0301 | Equipment |
| Unstained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific | 26614 | Sample |
| Silver nitrate | Sigma-Aldrich | 31630-25G-R | Reagent |
| Ethanol | Bragg and co. | 42520J | Reagent |
| Acetic acid | J.T. Baker | 103201A | Reagent |
| Milli-Q Synthesis A10 | Merk | - | Provides 18.2 MΩ.cm water |
| gel documentation system (c600 model) | Azure biosystems | - | Equipment |
References
- Chevalier, F. Highlights on the capacities of "Gel-based" proteomics. Proteome Science. 8 (1), (2010).
- Harris, L. R., Churchward, M. A., Butt, R. H., Coorssen, J. R. Assessing detection methods for gel-based proteomic analyses. Journal of Proteome Research. 6 (4), 1418-1425 (2007).
- Gauci, V. J., Wright, E. P., Coorssen, J. R. Quantitative proteomics: assessing the spectrum of in-gel protein detection methods. Journal of Chemical Biology. 4 (1), 3-29 (2011).
- Candiano, G., Bruschi, M., et al. Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25 (9), 1327-1333 (2004).
- Chevallet, M., Luche, S., Rabilloud, T. Silver staining of proteins in polyacrylamide gels. Nature Protocols. 1 (4), 1852-1858 (2006).
- Jin, L. T., Hwang, S. Y., Yoo, G. S., Choi, J. K. Sensitive silver staining of protein in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using an azo dye, calconcarboxylic acid, as a silver-ion sensitizer. Electrophoresis. 25 (15), 2494-2500 (2004).
- Celis, J. E., et al. Cell Biology: A Laboratory Handbook. , Elsevier Academic Press. Amsterdam, the Netherlands. (2006).
- Bartsch, H., Arndt, C., Koristka, S., Cartellieri, M., Bachmann, M. Silver Staining Techniques of Polyacrylamide Gels. Methods in Molecular Biology. 869 (1), 481-486 (2012).
- Rabilloud, T., Vuillard, L., Gilly, C., Lawrence, J. Silver-staining of proteins in polyacrylamide gels: a general overview. Cellular and Molecular Biology. 40 (1), 57-75 (1994).
- Zhou, M., Yu, L. Proteomic Analysis by Two-Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis. Advances in Protein Chemistry. 65 (1), 57-84 (2003).
- Xie, S., et al. Fluorogenic Ag+-Tetrazolate Aggregation Enables Efficient Fluorescent Biological Silver Staining. Angewandte Chemie International Edition. 57 (20), 5750-5753 (2018).
- Protein gel electrophoresis technical handbook. , Thermo Fisher Scientific. Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf (2015).
