Summary
Burada, biz yeni bir floresan polyacrylamide jellerin toplam protein algılaması için teknik boyama özetleyen bir detaylı iletişim kuralı tanımlamak. Ag+algılar bir gümüş iyon özgü Floresans tahrik sonda protokol kullanır-protein kompleksleri ve geleneksel chromogenic gümüş lekeler belirli sınırlamaları ortadan kaldırır.
Abstract
Gümüş boyama polyacrylamide Sodyum Lauryl Sülfat-polyacrylamide Jel Elektroforez (SDS-sayfa) takip jelleri bantlarında protein görselleştirmek için yaygın olarak kullanılan bir Renkölçer tekniktir. Klasik gümüş lekeleri yüksek arka plan boyama, zavallı protein kurtarma, düşük tekrarlanabilirlik, miktar ve kütle spektrometresi (MS) ile sınırlı uyumluluk için dar bir doğrusal Dinamik Aralık gibi bazı dezavantajları var. Şimdi, bir fluorogenic Ag+ sonda, TPE-4TA, kullanımı ile floresan bir gümüş boyama yöntemi polyacrylamide jellerin toplam protein görselleştirme için geliştirdik. Bu yeni leke geleneksel gümüş lekeleri zahmetli gümüş azaltma adımda önler. Ayrıca, floresan gümüş leke iyi tekrarlanabilirlik, ışık hassasiyeti ve protein bulunması, yapım o bir yararlı ve pratik protein jel leke doğrusal miktar gösterilmektedir.
Introduction
Birçok boyama yöntemi Jel Elektroforez takip, örneğin Coomassie parlak mavi, gümüş leke, Floresans gibi Renkölçer boya kullanarak proteinler görselleştirmek için kullanılan veya radyoaktif1,2, etiketleme olmuştur 3 , 4. gümüş boyama olarak kabul edilir en hassas teknikleri için basit ve ucuz reaktifler gerektiren protein algılama biri olmak. İki büyük aile sınıflandırılabilir:5,6ammoniacal gümüş leke ve gümüş nitrat leke. Alkali ammoniacal gümüş yönteminde, gümüş-diamin karmaşık amonyak ve sodyum hidroksit ile üretilen ve metalik gümüşe asidik formaldehit çözümünü kullanarak geliştirme sırasında düşük. Leke temel proteinler için verimli bir şekilde karşılar ama asidik ve tarafsız proteinler için güvenliği aşılan bir performansı gösterir ve ayrıca, klasik glisin ve taurin elektroforetik sistemleri için sınırlı olduğunu. Buna karşılık, gümüş nitrat lekeleri yüksek biyo-benzeşme protein gümüş iyonların yararlanmak, öncelikle sulfhydryl ve karboksil grupları yan zincirlerinden ve asidik protein daha verimli bir şekilde leke eğilimi7. Bağlama gümüş iyonu sonra (genellikle formaldehit ve sodyum tiyosülfat içeren metal karbonat çözeltisi imal) gelişmekte olan bir çözüm görselleştirmek için bir kahverengi koyu rengi inşa Metalik Gümüş tahıl için gümüş iyonları azaltmak için uygulanır protein bantları.
Gümüş boyama gelişimi 1970'li yıllarda8beri onun çok yönlü ve yüksek hassasiyet için bilinen olmasına rağmen yöntem sık kadar zor kabul edilir. Gümüş boyama yöntemleri zaman sınırlı adımlar ve düşük tekrarlanabilirlik göster. Gümüş leke rengi genellikle tek tip ve kontrol etmek zordur, azaltma adım bağımlı olmadığından gümüş leke nicel bir yöntem değildir ve böylece, jel karşılaştırma çalışma ve protein miktar9için tavsiye edilmez. Duyarlılık içinde en iyi duruma getirilmiş yöntemleri de10boyama daha fazla üniforma sağlayabilir aldehitler yararlanmak olabilir. Ancak, daha fazla akış aşağı analiz protein aldehitler tarafından polietilenin nedeniyle pahasına bu. Hızlı iletişim kuralları çoğunlukla birleştirmek ya da uzlaşma tekrarlanabilirlik ve leke5tekdüzelik süresini kısaltmak için adımları kısaltabilirsiniz. Sonuç olarak, orada çok sayıda gümüş türevleri içinde protein jel, her belirli gereksinimleri uyacak şekilde en iyi duruma getirilmiş boyama boyama; Örneğin, basitlik, duyarlılık veya peptid kurtarma oranı için aşağı akım analizi. Bu öznitelikler de birbirlerine bir etkiye sahip ve bir iletişim kuralı tüm gereksinimlerinin karşılanması zor olabilir.
Bu çalışmada, biz yeni bir floresan gümüş boyama yöntemi polyacrylamide jel protein algılama için tanıtmak. Bu yöntemde, bir fluorogenic sonda gümüş iyonları, TPE-4TA (şekil 1), gümüş emdirilmiş proteinler11görselleştirmek için kullanıyoruz. TPE-4TA toplama kaynaklı emisyon (AIE) ilke tarafından tasarlanmıştır. Bu sigara-sulu çözüm içinde çözünmüş zaman yayıcı ama gümüş iyonlarının varlığında son derece yayıcı. Geleneksel gümüş lekeleri chromogenic geliştirilmesinde adım gelişen bir fluorogenic ile değiştirerek, floresan gümüş yöntemi azaltılmış bir arka plan ile toplam proteinlerin sağlam boyama sağlar.
Ayrıca, floresan gümüş leke için yaygın olarak kullanılan SYPRO Ruby leke ile karşılaştırılabilir ve geleneksel gümüş lekeleri ile ulaşılabilir protein miktar iyi dinamik bir doğrusal Aralık gösterdi. Jel bir ultraviyole lamba ile sık kullanılan jel dokümantasyon sistemleri üzerinde yansıma (uyarma dalga boyu: 302/365 nm kanal; emisyon: ~ 490-530 nm) birçok biyolojik laboratuarlarında.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. hazırlık jel
Not: Gösteri jel sonra kısa bir süre12SDS-sayfa boyama için hazırlamak için standart bir protokol izler. Kısaca, aşağıdaki adımları örnekleri hazırlanması tarif ve Elektroforez jel.
- SDS-sayfa % 4 - % 12 Bis-Tris protein jelleri (1 mm, 15-şey) ile gerçekleştirmek bir mini jel tankı kullanarak dolu ile 2-(N -morpholino) ethanesulfonic asit (MES) arabellek.
- Distile su, lityum Lauryl Sülfat (LDS) arabellek ve örnek azaltma Ajan karışımı ile örnekleri sulandırmak.
- Ardından normal stok tutarı (5 µL) ve bundan sonra iki kat dilutions hisse senedi (8192 x 2 x 13 dilutions) bir dizi ilk yol, iki katına stok (10 µL) yükleyin.
- Jel 30 dk için 200 V sabit voltaj çalıştırın.
2. jel fiksasyonu
- Elektroforez sonra 50 RPM (her biri için 30 dk) x 2 oda sıcaklığında veya gecede 4 ° C'de bir orbital Çalkalayıcı üzerinde 100 mL solüsyon % 40 ethanol/10% Asetik asit jelleri daldırın
- Jelleri 3 x 10 dk her ultrasaf su temiz bir kap içinde yıkayın. Çamaşır, kritik bir adımdır. Sabitleme çözümden asit içinde belgili tanımlık fluorogenic gelişmekte olan adım düzgün kaldırılmaz ise aşırı TPE-4TA asit tarafından etkinleştirilecek ve güçlü arka plan Floresans jel içinde yol.
3. hazırlık AgNO3Çözüm ve jel gümüş emprenye
- AgNO3 çözüm (%0,0001) yapmak emprenye için ilk olarak, AgNO3 10 mL % 0,1 AgNO3 hisse senedi çözüm hazırlamak için ultrasaf su 0,01 g geçiyoruz. Sonra 100 µL % 0,1 AgNO3 hisse senedi çözüm çalışma çözüm yapmak için ultrasaf su 100 mL ekleyin.
Not: Kullanmadan önce karanlıkta AgNO3 çözüm saklanmalıdır. - Jel 100 mL 50 RPM mühürlü cam kap içinde bir orbital Çalkalayıcı 1 h için çözüm üzerinde gümüş ile hamile. Gümüş emprenye ışık alüminyum folyo ile korunan bir duman başlık altında gerçekleştirmek için önemlidir.
- 2 x 60 için temiz bir kapta jel ultrasaf su (yaklaşık 100 mL) ile yıkayın s.
4. Fluorogenic geliştirme jel
- Boya stok çözüm (0,1 mM) hazırlamak TPE-4TA boya 3.0 mg 50 mL ultrasaf su ekleyin. Bir kaç dakikalığına çözüm solüsyon içeren temizleyicide ve boya dağıtılması yardımcı olmak için bazı NaOH çözüm (örneğin 1 M) ekleyin.
- Boya molekül tamamen tasfiye edilir emin olmak için 365 nm UV lambanın altında çözüm Floresans denetleyin. Yalnızca zayıf veya nonemissive çözümleri tam çözülme belirtir.
Not: TPE-4TA yapıldı boya protokol son zamanlarda Xie vd tarafından rapor aşağıdaki sentezledim. 10 TPE-4TA çözüm çok kararlı ve karanlıkta aylarca tutulabilir. - 100 mL fluorogenic geliştirilmesi çözeltisi (10 µM) hazırlamak ultrasaf su 90 mL 10 mL TPE-4TA stok çözeltisi ekleyin. PH metre kullanarak çözüm pH kontrol ve 7-9 sodyum hidroksit çözüm (1 µM) kullanmaya ayarlamak.
- Jel 100 mL fluorogenic geliştirilmesi çözeltisi ile temiz ve yapışmalı konteyner aktarın. Jel tamamen çözümde dalmış olduğundan emin olun. Konteyner mühür. Işıktan yap da gecede 50 RPM oda sıcaklığında bir orbital Çalkalayıcı üzerinde salla. Alternatif olarak, kuluçka adım da yaklaşık ~ 2 h AIE gelişmekte olan çözüm ile 80 ° C arasında boyama ve sonra oda sıcaklığında bırakarak için ön ısıtma ile kısaltılabilir.
5. destaining ve görüntüleme
- Temiz bir kaba jel transfer ve 100 ml % 10 etanol için 30 dk destain.
Not: Jel yıkamak için su tek başına kullanılabilir. Ancak, daha zaman destaining için % 10 etanol çözümü kullanmak verimli olur. Bu destaining işlem için 30 dk dan itibaren azaltmak için yardımcı olur. - Ultrasaf su 5 min için jel durulayın.
- Görüntü 365 nm kanal veya 302 nm kanal bir jel dokümantasyon makine tarafından jel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tarafından floresan gümüş leke lekeli protein bantları 365 nm UV lambası altında yoğun bir yeşil Floresans sergi. Bütün 14 protein grupları (10-200 kDa), yukarıdan aşağıya doğru açıkça görülebilir, iyi tarafından SYPRO Ruby boya (Şekil 2)10lekeli 14 kırmızı renkli olanlar ile birleştiriliyor.
İle ilgili nicel protein algılama, jelleri görüntüleme sistemi otomatik yordamları kullanarak bir jel tarafından görüntüsü ve görüntü analiz edildi ve ticari yazılım kullanarak karşılaştırıldığında. Boyama yöntemi bu floresan gümüş yüksek çözünürlüğe sahip görünüyor. Bazı protein grup için floresan gümüş leke duyarlılığını da biraz floresan SYPRO Ruby leke daha iyi. Özellikle, floresan gümüş leke performansını yeni yöntemi proteinler düşük molekül ağırlıkları ile tespiti için özellikle yararlı olduğunu belirten ~ 10-40 kDa protein grupları için geliştirilmiş. Verileri de floresan gümüş leke nispeten geniş bir aralığında protein miktar (şekil 3)11için iyi ve düzgün doğrusallık tüm 14 proteinler için verdi öneririz.
Arka plan sinyal ve çarpık zirveleri yüksek düzeyde verdi gümüş nitrat leke aksine floresan gümüş leke gruplar iyi kontrast ve Tekdüzen yoğunluğu dağıtım SYPRO Ruby leke karşılaştırılabilir ile tüm 14 proteinler arasında tespit (Şekil 3).
Jel fiksasyon (şekil 4) Boyama yüksek arka planda neden olur sonra bu yetersiz yıkama unutmayın. Artık Asetik asit TPE-4PA kadar hafif ve güçlü bir arka plan için yol.
Resim 1: TPE-4TA ve onun algılama mekanizması AG+kimyasal yapısı. X = H veya Na+. Önceki işten, telif hakkı 2018 WILEY-VCH11uyarlanmış. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: floresan gümüş boyama. A) iletişim kuralı Özet. B) jeller floresan gümüş leke (solda) ve SYPRO Ruby leke (sağ) tarafından lekeli karşılaştırılması 365 nm ışınlama altında el bir UV lamba ile paralel görüntüsü. Proteinler (10-200 kDa) tarafından iki kat seri seyreltme 200-500 ng/gruptan başlayarak en sol şeritte doluydu. Önceki işten, telif hakkı 2018 WILEY-VCH11uyarlanmış. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: floresan yoğunluğu protein miktarı, temsilcisi jel görüntüleri ve sinyal profillerden (beşinci lane) üç farklı lekeleri ile jelleri, karşı proteinlerin. (A)gümüş nitrat leke tutmayan,()B) floresan gümüş leke (365 nm uyarma) ve (C) SYPRO Ruby leke. Rakamın ilk sütun (soldan başlayarak) ilk lane için normalleştirilmiş protein miktarı karşı 14 proteinlerin (10-200 kDa) her grup için leke yoğunluğu gösterir. İkinci sütun karşılık gelen leke temsilcisi jel görüntüleri gösterir. Jel yüklenen protein miktarı Şekil 2' de anlatılan. Önceki işten, telif hakkı 2018 WILEY-VCH11uyarlanmış. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: jel suboptimal deneme lekeli. Bu deneyde, çamaşır fiksasyon adımdan sonra yetersiz. Artık Asetik asit TPE-4TA toplama indüklenen ve güçlü bir arka plan neden oldu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan bir roman floresan gümüş yöntemi polyacrylamide jeller proteinler için boyama. Bu strateji geleneksel gümüş lekeleri ve floresan lekeleri bütünleştirir. Proteinlere olduğu gibi diğer gümüş gümüş iyonu seçmeli bağlama lekeleri ama son derece hassas fluorogenic gümüş kullanır boyama patlatır gümüş ilişkili proteinler kadar ışık için TPE-4TA sonda. Fluorogenic sonda TPE-4TA oldukça düşük konsantrasyon nanomolar Aralık11, gümüş iyonları hissi olabilir bu yana, bir indirgeyici görselleştirme adım geleneksel gerektiği gibi daha fazla talep olmadan son derece hassas bir algılama sağlar Gümüş lekeleri. Bu koş koş varyasyonları en aza indirmek olacaktır. Bu arada, o sert kimyasallar, formaldehit ve oxazolidin, peptid kimlik MS analizde sık sık müdahale gibi kullanımını önler. Ayrıca, TPE-4TA AIE-aktif ve ücretsiz olarak kendi kendine su verme herhangi bir sorun, bir protein grubu, yoğun birikmiş boyalar topluca yanıt boya molekülleri sayısına yayarlar olabilir. Bu bir geniş doğrusal Dinamik Aralık (LDR) protein algılama ve SYPRO Ruby leke ile karşılaştırıldığında çok daha parlak bir boyama için katkıda bulunur.
Geleneksel gümüş boyama ile karşılaştırıldığında, daha az miktarda gümüş nitrat bu yeni tekniği-özellikle boyama için gereklidir, %0,0001 %0,1 yaygın olarak bildirilen gümüş nitrat protokolleri4boyama kullanılan. Bu yeni leke başarısı tamamen aşağı bir yüksek karşıtlık arka plan karşı inanılmaz derecede parlak ve hassas floresan soruşturması birleşimi olduğunu onaylanmadığına karar. Buna karşılık, daha yüksek bir miktar gümüş özellikle yüksek arka planı ortaya çıktığında karanlık görünür bantları, üretmek için azaltma geleneksel gümüş lekeleri gelişmekte olan adımı gerektirir. Bu yöntemde, fluorogenic geliştirme zamanı geleneksel kimyasal geliştirme uzundur; Ancak, bu bir sınırlama olarak veya bir avantaj olarak tartışılabilir. Jel gelişmekte olan çözümde sonuçları operatörden alınabilir alt çeşitlerini sonucunda, uzun bir süre için bırakılabilir. Sadece daha az sayıda adımla gerekmez, ancak aynı zamanda, daha fazla duraklar, bu iletişim kuralını oldukça uygun kılan alınabilir vardır. İçinde karanlık bir arka planda kaynaklanan jel, overdevelop geleneksel gelişmekte olan adım farklı olarak overstaining hiçbir risk yok. Ek protein örnekleri daha fazla bir şekilde değerlendirilmesi (şekil 3) garanti olsa bu floresan gümüş leke da daha küçük bir interprotein değişim bekleniyor.
Önerilen gümüş nitrat konsantrasyonu protokolü takip etmek önemlidir; daha yüksek bir konsantrasyon kullanarak daha iyi performans ve duyarlılık yol açmaz ama, bunun yerine, Floresans gruplarından yutmak bir güçlü arka plan Floresans üretir. Sorun giderme açısından, duyarlılık ve parlaklık kaybına aşırı çamaşır yıkama adım fluorogenic geliştirme önce veya yetersiz gümüş emprenye neden olabilir. Bu yöntem için protein grup Floresans sinyalinin Floresan TPE-4TA-Ag+ karmaşık oluşumu için gerekli olan protein bağlı gümüş iyonları, sayısına bağlıdır. Protein bu boyama yöntemi potansiyelini en üst düzeye çıkarmak için gümüş iyonları ile doymuş.
Son olarak, daha önce fluorogenic boya Bu yöntemde kullanılan gümüş iyonu için belirtildiği gibi TPE-4TA, pH hassas da. Düşük pH protonate bir yüksek arka plan leke kaynaklanan jel bulabilsem için ücretsiz TPE-4TA olabilir. Bu nedenle, artık Asetik asit fiksasyon çözümden bırakın, yanlış yıkama adımları leke kalitesi büyük ölçüde etkiler. Jel fluorogenic geliştirme adım (şekil 4) nispeten nötr pH tutmak önemlidir. Ayrıca TPE-4TA çözüm pH boyama önce ayarlamak yararlı olabilir. Bu boya yakın gelecekte ticari bekleniyor.
Özetle, biz roman floresan gümüş leke SDS-sayfa jel toplam proteinlerin görselleştirme için pratik bir protokol nitelendirdi. Boyama basit, kullanımı kolay, maliyet-etkin ve iyi boyama bir performans sunuyor. Bu yöntem büyük ölçüde jelleri protein bantlarında tanımlamasını kolaylaştırabilir ve protein analizi için yararlı bir araç sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Bu floresan gümüş boyama üzerinde bir patent başvurusu şikayetçi oldu.
Acknowledgments
Yazarlar Patrick Chan Ming Wai Lau merkezinde onarıcı tıp, Karolinska Institutet, onun teknik destek için teşekkür etmek istiyorum. S. X. İsveçli Araştırma Konseyi (Grant No 2017-06344) destek için minnettar olduğunu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
LDS Sample Buffer (4X) |
Thermo Fisher Scientific | NP0007 | Reagent |
4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well |
Thermo Fisher Scientific | NP0323BOX | Precast gel |
| Sample Reducing Agent (10X) | Thermo Fisher Scientific | NP0004 | Reagent |
| MES SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fisher Scientific | NP0002 | Reagent |
| Mini Gel Tank | Thermo Fisher Scientific | A25977 | Equipment |
| 300W Power Supply (230 VAC) | Thermo Fisher Scientific | PS0301 | Equipment |
| Unstained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific | 26614 | Sample |
| Silver nitrate | Sigma-Aldrich | 31630-25G-R | Reagent |
| Ethanol | Bragg and co. | 42520J | Reagent |
| Acetic acid | J.T. Baker | 103201A | Reagent |
| Milli-Q Synthesis A10 | Merk | - | Provides 18.2 MΩ.cm water |
| gel documentation system (c600 model) | Azure biosystems | - | Equipment |
References
- Chevalier, F. Highlights on the capacities of "Gel-based" proteomics. Proteome Science. 8 (1), (2010).
- Harris, L. R., Churchward, M. A., Butt, R. H., Coorssen, J. R. Assessing detection methods for gel-based proteomic analyses. Journal of Proteome Research. 6 (4), 1418-1425 (2007).
- Gauci, V. J., Wright, E. P., Coorssen, J. R. Quantitative proteomics: assessing the spectrum of in-gel protein detection methods. Journal of Chemical Biology. 4 (1), 3-29 (2011).
- Candiano, G., Bruschi, M., et al. Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25 (9), 1327-1333 (2004).
- Chevallet, M., Luche, S., Rabilloud, T. Silver staining of proteins in polyacrylamide gels. Nature Protocols. 1 (4), 1852-1858 (2006).
- Jin, L. T., Hwang, S. Y., Yoo, G. S., Choi, J. K. Sensitive silver staining of protein in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using an azo dye, calconcarboxylic acid, as a silver-ion sensitizer. Electrophoresis. 25 (15), 2494-2500 (2004).
- Celis, J. E., et al. Cell Biology: A Laboratory Handbook. , Elsevier Academic Press. Amsterdam, the Netherlands. (2006).
- Bartsch, H., Arndt, C., Koristka, S., Cartellieri, M., Bachmann, M. Silver Staining Techniques of Polyacrylamide Gels. Methods in Molecular Biology. 869 (1), 481-486 (2012).
- Rabilloud, T., Vuillard, L., Gilly, C., Lawrence, J. Silver-staining of proteins in polyacrylamide gels: a general overview. Cellular and Molecular Biology. 40 (1), 57-75 (1994).
- Zhou, M., Yu, L. Proteomic Analysis by Two-Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis. Advances in Protein Chemistry. 65 (1), 57-84 (2003).
- Xie, S., et al. Fluorogenic Ag+-Tetrazolate Aggregation Enables Efficient Fluorescent Biological Silver Staining. Angewandte Chemie International Edition. 57 (20), 5750-5753 (2018).
- Protein gel electrophoresis technical handbook. , Thermo Fisher Scientific. Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf (2015).
