Summary
Aquí, describimos un protocolo detallado que un fluorescente nuevo coloración técnica para la detección de la proteína total en geles de poliacrilamida. El protocolo utiliza una sonda de encendido plata de iones específicos de fluorescencia que detecta Ag+-complejos de proteínas y elimina ciertas limitaciones de manchas plata cromogénicos tradicionales.
Abstract
Tinción de plata es una técnica colorimétrica ampliamente utilizada para visualizar las bandas de proteínas en geles de poliacrilamida siguiendo la electroforesis del gel de la sulfato-poliacrilamida de sodio dodecyl (SDS-PAGE). Las manchas de plata clásico tienen ciertos inconvenientes, como fondo alta coloración, recuperación de proteína pobre, baja reproducibilidad, un estrecho rango dinámico lineal de cuantificación y la compatibilidad limitada con espectrometría de masas (MS). Ahora, con el uso de una sonda de Ag+ fluorógenos, TPE-4TA, hemos desarrollado un método para la visualización total de proteínas en geles de poliacrilamida de tinción de plata fluorescente. Esta nueva mancha evita el paso de reducción plata molestas manchas de plata tradicional. Además, la tinción fluorescente de plata demuestra buena reproducibilidad, sensibilidad y cuantificación lineal de detección de la proteína, lo que es una mancha de gel de proteína útil y práctico.
Introduction
Muchos métodos de tinción han sido usados para visualizar proteínas después de electroforesis en gel, por ejemplo utilizando colorimétricos colorantes como el azul brillante de Coomassie, tinción de plata, fluorescencia, o radiactivo etiquetado1,2, 3 , 4. plata es considerada como una de las técnicas más sensibles para la detección de proteínas que requieren reactivos simples y baratos. Pueden ser categorizado en dos grandes familias: la mancha de plata amoniacal y el nitrato de plata manchan5,6. En el método alcalino de plata amoniacal, el complejo diamina de plata se produce con amoníaco e hidróxido de sodio y reducido a plata metálica durante el desarrollo de una solución de formaldehído ácidas. La mancha acomoda eficientemente las proteínas básicas pero muestra una actuación comprometida para las proteínas ácidas y neutras y es, además, se limita a sistemas electroforéticos taurina y glicina clásica. En comparación, las manchas de nitrato de plata aprovechen la alta bio-afinidad de los iones de plata a la proteína, principalmente el sulfidrilo carboxyl grupos de las cadenas laterales y tienden a manchar más eficientemente las proteínas ácidas7. Después de la Unión de iones de plata, una solución en desarrollo (normalmente hecha de una solución de carbonato de metal que contiene formaldehído y sodio tiosulfato) se aplica para reducir los iones de plata a los granos de plata metálicos, que se acumulan de un color marrón-oscuro para visualizar la bandas de proteínas.
Aunque plata ha sido conocido por su versatilidad y su alta sensibilidad desde su desarrollo en la década de 19708, el método es con frecuencia considerado complicado. Métodos de tinción de plata tienen pasos restringidos por el tiempo y demuestran la baja reproducibilidad. Puesto que el color de plata generalmente no es uniforme y depende de la etapa de reducción, que es difícil de controlar, la tinción de plata no es un método cuantitativo y, por lo tanto, no se recomienda para gel comparación estudio y proteína cuantificación9. Métodos optimizados de sensibilidad pueden utilizar aldehídos que también pueden proporcionar un más uniforme coloración10. Sin embargo, esto es a expensas de posteriores análisis por el entrecruzamiento de proteínas por aldehídos. Protocolos rápidos sobre todo combinaran o acortan pasos para reducir tiempo, comprometer la reproducibilidad y la uniformidad de la mancha5. Como resultado, hay numerosas plata tinción variantes en gel proteína coloración, cada uno optimizado para adaptarse a ciertos requisitos; por ejemplo, sencillez, sensibilidad o péptido tasa de recuperación para el análisis de aguas abajo. Estos atributos también pueden tener un impacto sobre otros, y satisfacer todos los requisitos de un protocolo puede ser difícil.
En este trabajo, presentamos un nuevo método para la detección de proteínas en geles de poliacrilamida de tinción de plata fluorescente. En este método, utilizamos una sonda fluorógenos para iones de plata, TPE-4TA (figura 1), para visualizar las proteínas impregnado de plata11. TPE-4TA es diseñada por el principio de emisión inducida por la agregación (AIE). Es no emisivo cuando está disuelto en solución acuosa, pero es altamente emisiva en presencia de iones de plata. Sustituyendo el desarrollo cromogénico en manchas de plata tradicionales con un fluorógenos desarrollo de paso, el método plata fluorescente permite la tinción robusto de proteínas totales con un fondo reducido.
Además, la mancha de plata fluorescente demostró una buena gama dinámica lineal para la cuantificación de la proteína, que es comparable con la tinción SYPRO Ruby ampliamente utilizado y no alcanzables con manchas de plata tradicionales. El gel puede ser reflejado en el gel comúnmente usado sistemas de documentación con una lámpara ultravioleta (longitud de onda de excitación: canal de 302/365 nm, emisión: ~ 490-530 nm) en muchos laboratorios biológicos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. preparación del Gel
Nota: La demostración sigue un protocolo estándar para preparar el gel para manchas poco después de SDS-PAGE12. En Resumen, los pasos siguientes describen la preparación de las muestras y electrophoresis del gel.
- Realizar SDS-PAGE con geles de proteína de Bis-Tris 4% - 12% (1 m m, 15-bien) usando un gel mini tanque lleno con 2-(N -morfolino) (n-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-ácido tampón de ácido (MES).
- Diluir las muestras con una mezcla de agua destilada, litio dodecil sulfato (LDS) tampón y un agente de reducción de muestra.
- Carga el primer carril con el doble de acción (10 μl), seguido de la cantidad normal de stock (5 μl) y una serie de diluciones del doble de la acción después de eso (13 diluciones, de 2 x para x 8192).
- Correr el gel a una tensión constante de 200 V durante 30 minutos.
2. fijación del Gel
- Después de la electroforesis, sumergir los geles en una solución de 100 mL de ácido acético al 40% ethanol/10% en un agitador orbital a 50 rpm a temperatura ambiente 2 x (cada uno por 30 min), o durante la noche a 4 ° C.
- Lave los geles 3 x 10 min cada uno en agua ultrapura en un recipiente limpio. El paso de lavado es fundamental. Si el ácido de la solución de fijación no se quita correctamente en el paso en desarrollo fluorógenos, la excesiva TPE-4TA será activada por el ácido y llevar a la fluorescencia de fondo fuerte en el gel.
3. preparación del AgNO3solución e impregnación de plata del Gel
- Para hacer la solución de3 AgNO (0,0001%) para la impregnación, en primer lugar, disolver 0.01 g de AgNO3 en 10 mL de agua ultrapura para preparar una solución 0,1% AgNO3 . A continuación, añada 100 μl de la solución 0.1% AgNO3 en 100 mL de agua ultrapura para la solución de trabajo.
Nota: La solución de AgNO3 debe almacenarse en la oscuridad antes de su uso. - Impregnar el gel con 100 mL de solución para 1 h de trabajo en un agitador orbital a 50 rpm en un recipiente de vidrio sellado de plata. Es fundamental realizar la impregnación de plata debajo de una campana de humos, protegida de la luz con papel de aluminio.
- Lavar el gel con agua ultrapura (aproximadamente 100 mL) en un recipiente limpio de 2 x 60 s.
4. fluorógenos desarrollo del Gel
- Para preparar la solución colorante (0,1 mM), agregar 3.0 mg de colorante TPE-4TA en 50 mL de agua ultrapura. Someter a ultrasonidos la solución durante unos minutos y añadir una solución de NaOH (por ejemplo 1 M) para ayudar a disolver el tinte.
- Comprobar la fluorescencia de la solución bajo una lámpara de nm UV 365 para asegurarse de que la molécula del colorante se haya disuelto completamente. Sólo soluciones débiles o nonemissive indican disolución completa.
Nota: El tinte que TPE-4TA fue sintetizado el protocolo recientemente notificado por Xie et al. 10 la solución TPE-4TA es muy estable y puede conservarse en la oscuridad durante meses. - Para preparar 100 mL de la solución en desarrollo fluorógenos (10 μm), añadir 10 mL de la solución madre de TPE-4TA en 90 mL de agua ultrapura. Compruebe el pH de la solución usando un medidor de pH y ajustar a 7-9 usando una solución de hidróxido de sodio (1 μm).
- Transferir el gel a un recipiente limpio y sellable con 100 mL de la solución en desarrollo fluorógenos. Asegúrese de que el gel se sumergen totalmente en la solución. Sellar el recipiente. Cubierta de la luz y agitar durante la noche en un agitador orbital a 50 rpm a temperatura ambiente. Como alternativa, el paso de incubación puede también reducirse a unos ~ 2 h por precalentar la solución en desarrollo de la AIE a 80 ° C para la coloración y luego dejarlo a temperatura ambiente.
5. extracción y proyección de imagen
- Transferir el gel a un recipiente limpio y desmanchar en 100 mL de etanol al 10% durante 30 minutos.
Nota: El agua sola puede utilizarse para lavar el gel. Sin embargo, es más eficiente utilizar una solución de etanol del 10% para la extracción. Esto ayudará a reducir el proceso de extracción de horas a 30 minutos. - Enjuagar el gel en agua ultrapura durante 5 minutos.
- Imagen del gel en los 365 nm o 302 canales de nm por un equipo de documentación de gel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Las bandas de proteínas teñidas por el tinte plata fluorescente presentan una intensa fluorescencia verde bajo una lámpara de UV 365 nm. Todas las bandas de proteína 14 (10-200 kDa), de arriba hacia abajo, eran claramente visibles, correlacionan bien con los 14 color rojo teñido por el tinte (figura 2) SYPRO Ruby del10.
Detección cuantitativa de la proteína, los geles fueron reflejados por un gel usando procedimientos automáticos, sistema de imagen, y las imágenes fueron analizadas y compararon usando el software comercial. Este método de coloración de plata de la fluorescente parece tener una alta resolución. Para algunas bandas de proteínas, la sensibilidad de la tinción fluorescente de plata también es ligeramente mejor que la de la mancha fluorescente SYPRO Ruby. En particular, fue mejorado el rendimiento de la tinción fluorescente de plata para las bandas de proteínas de ~ 10 a 40 kDa, lo que indica que el nuevo método es particularmente útil para la detección de proteínas con pesos bajos de la molécula. Los datos también sugieren que la mancha de plata fluorescente dio una linealidad buena y uniforme para todas las 14 proteínas sobre una gama relativamente amplia de proteína cuantificación (figura 3)11.
En contraste con la mancha de nitrato de plata que dio un alto nivel de la señal de fondo y picos distorsionados, la mancha de plata fluorescente detecta las bandas con un buen contraste y de intensidad uniforme distribución comparable a la tinción SYPRO Ruby a través de todas las 14 proteínas (Figura 3).
Tenga en cuenta lavar insuficiente después de la fijación del gel se traducirá en fondo alta tinción (figura 4). El residual ácido acético se iluminan TPE-4PA y conducir a una sólida formación.
Figura 1: Estructura química de TPE-4TA y su mecanismo de detección de Ag+. X = H o Na+. Adaptado de trabajos anteriores, copyright 2018 WILEY-VCH11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: tinción fluorescente de la plata. A) Resumen del protocolo. B) una comparación de los geles teñidos por la mancha de plata fluorescente (izquierda) y tinción SYPRO Ruby (derecha) imagen URL con una lámpara UV de mano bajo irradiación nm 365. Las proteínas (10-200 kDa) fueron cargadas por doble dilución seriada a partir de 200-500 ng/banda a lo más de izquierda. Adaptado de trabajos anteriores, copyright 2018 WILEY-VCH11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: intensidad de fluorescencia de proteínas contra la cantidad de proteína, gel representativas imágenes y perfiles de señal (desde el quinto carril) de geles con tres manchas diferentes. La mancha de nitrato de plata (A),()B) Mancha de plata fluorescente (excitación de 365 nm) y (C) SYPRO Ruby mancha. La primera columna de la figura muestra la intensidad de la mancha de cada banda de las 14 proteínas (10-200 kDa) contra la cantidad de proteína normalizada en el primer carril (a partir de la izquierda). La segunda columna muestra las imágenes de gel representativo de la mancha correspondiente. La cantidad de proteína en el gel se describe en la figura 2. Adaptado de trabajos anteriores, copyright 2018 WILEY-VCH11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: tinción de gel de un experimento menos. En este experimento, el lavado fue insuficiente después de la etapa de fijación. El ácido acético residual inducida por la agregación de TPE-4TA y causó una gran experiencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Presentada aquí es una novela plata fluorescente tinción de proteínas en geles de poliacrilamida. Esta estrategia integra fluorescentes manchas y manchas de plata convencionales. Las hazañas de tinción la Unión selectiva de iones de plata a las proteínas como en otros plata manchas pero emplea una plata muy sensible fluorógenos sondeo TPE-4TA para iluminar las proteínas límite plata. Puesto que la sonda fluorógenos TPE-4TA puede detectar iones de plata en una concentración bastante baja en el rango nanomolar del11, permite una detección muy sensible sin más la demanda de un paso de visualización reductiva en tradicional manchas de plata. Esto reducirá al mínimo las variaciones de la prueba a prueba. Mientras tanto, evita el uso de productos químicos agresivos, incluyendo formaldehído y glutaraldehído, que con frecuencia interfieren con la identificación de péptidos en el análisis por MS. Por otra parte, como TPE-4TA es AIE-activa y libre de cualquier problema por amortiguamiento, los tintes densamente acumulados en una banda de proteína pueden emitir colectivamente en respuesta al número de moléculas de colorante. Esto contribuye a un rango dinámico lineal amplio (LDR) para la detección de proteína y una coloración mucho más brillante en comparación con la tinción SYPRO Ruby.
En comparación con la coloración tradicional de plata, una significativamente menor cantidad de nitrato de plata se necesita para esta nueva coloración técnica específicamente, 0.0001% 0.1% reportado en comúnmente utiliza4de los protocolos de tinción de nitrato de plata. Puede ser presumido que el éxito de la nueva mancha es puramente a la combinación de la sonda fluorescente muy brillante y sensible contra un fondo de alto contraste. En comparación, la reducción durante la etapa de desarrollo en las manchas de plata tradicionales requiere una mayor cantidad de plata para producir bandas oscuras visibles, particularmente cuando ocurre en un contexto alta. En este método, el tiempo de desarrollo fluorógenos es más largo que el tradicional desarrollo de la química; sin embargo, esto puede debatirse como una limitación o una ventaja. El gel se puede dejar en la solución en desarrollo durante largos periodos de tiempo sin consecuencias, resultando en menores variaciones que puedan derivarse de la operadora. No sólo existen pocos pasos necesarios, pero también, más pausas se pueden tomar, que hace muy conveniente este protocolo. No hay riesgo de overstaining a diferencia de en el paso en vías de desarrollo tradicional que puede sobreexponer el gel, lo que resulta en un fondo oscuro. Esta mancha de plata fluorescente también se espera que una menor variación de interprotein, aunque una evaluación adicional de las muestras adicionales de la proteína está garantizada (figura 3).
Es fundamental para seguir la concentración de nitrato de plata sugiere el protocolo; usando una concentración más alta no lleva a mejor rendimiento y sensibilidad, pero, en cambio, produce una fluorescencia de fondo fuerte que puede fagocitar la fluorescencia de las bandas. En cuanto a la solución de problemas, puede producir pérdida de sensibilidad y brillo excesivo lavado en la etapa de lavado antes de desarrollo fluorógenos o de impregnación de plata insuficiente. Para este método, la señal de fluorescencia de la banda de proteína depende de la cantidad de iones de plata unida a las proteínas, que es esencial para la formación de la fluorescente TPE-4TA-Ag+ complejo. La proteína debe ser saturada con iones de plata para maximizar el potencial de este método de tinción.
Finalmente, como se mencionó anteriormente, el tinte fluorógenos para iones de plata utilizado en este método, TPE-4TA, es también sensible de pH. Un pH bajo puede protonate el libre TPE-4TA de fluorescencia en el gel, resultando en una mancha de fondo alto. Por lo tanto, pasos de lavado inadecuado, que deja residuos ácido acético de la solución de fijación, grandemente afectará la calidad de la mancha. Es importante mantener el gel neutral de pH en el paso del desarrollo fluorógenos (figura 4). También podría ser útil ajustar el pH de la solución TPE-4TA antes de la tinción. Se espera que este tinte va ser comercializado en un futuro cercano.
En Resumen, hemos descrito un protocolo práctico de la novela mancha plata fluorescente para la visualización de las proteínas totales en gel de SDS-PAGE. La tinción es sencillo, fácil de usar, rentable y tiene un buen rendimiento de la tinción. Este método puede facilitar enormemente la identificación de las bandas de proteínas en geles y proporciona una herramienta útil para el análisis de la proteína.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Que se haya presentado una solicitud de patente en esta tinción fluorescente de la plata.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Patrick Chan en el Ming Wai Lau centro para la medicina reparadora, Karolinska Institutet, por su apoyo técnico. S. X. es agradecido por el apoyo del Consejo Sueco de investigación (Grant No. 2017-06344).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
LDS Sample Buffer (4X) |
Thermo Fisher Scientific | NP0007 | Reagent |
4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well |
Thermo Fisher Scientific | NP0323BOX | Precast gel |
| Sample Reducing Agent (10X) | Thermo Fisher Scientific | NP0004 | Reagent |
| MES SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fisher Scientific | NP0002 | Reagent |
| Mini Gel Tank | Thermo Fisher Scientific | A25977 | Equipment |
| 300W Power Supply (230 VAC) | Thermo Fisher Scientific | PS0301 | Equipment |
| Unstained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific | 26614 | Sample |
| Silver nitrate | Sigma-Aldrich | 31630-25G-R | Reagent |
| Ethanol | Bragg and co. | 42520J | Reagent |
| Acetic acid | J.T. Baker | 103201A | Reagent |
| Milli-Q Synthesis A10 | Merk | - | Provides 18.2 MΩ.cm water |
| gel documentation system (c600 model) | Azure biosystems | - | Equipment |
References
- Chevalier, F. Highlights on the capacities of "Gel-based" proteomics. Proteome Science. 8 (1), (2010).
- Harris, L. R., Churchward, M. A., Butt, R. H., Coorssen, J. R. Assessing detection methods for gel-based proteomic analyses. Journal of Proteome Research. 6 (4), 1418-1425 (2007).
- Gauci, V. J., Wright, E. P., Coorssen, J. R. Quantitative proteomics: assessing the spectrum of in-gel protein detection methods. Journal of Chemical Biology. 4 (1), 3-29 (2011).
- Candiano, G., Bruschi, M., et al. Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25 (9), 1327-1333 (2004).
- Chevallet, M., Luche, S., Rabilloud, T. Silver staining of proteins in polyacrylamide gels. Nature Protocols. 1 (4), 1852-1858 (2006).
- Jin, L. T., Hwang, S. Y., Yoo, G. S., Choi, J. K. Sensitive silver staining of protein in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using an azo dye, calconcarboxylic acid, as a silver-ion sensitizer. Electrophoresis. 25 (15), 2494-2500 (2004).
- Celis, J. E., et al. Cell Biology: A Laboratory Handbook. , Elsevier Academic Press. Amsterdam, the Netherlands. (2006).
- Bartsch, H., Arndt, C., Koristka, S., Cartellieri, M., Bachmann, M. Silver Staining Techniques of Polyacrylamide Gels. Methods in Molecular Biology. 869 (1), 481-486 (2012).
- Rabilloud, T., Vuillard, L., Gilly, C., Lawrence, J. Silver-staining of proteins in polyacrylamide gels: a general overview. Cellular and Molecular Biology. 40 (1), 57-75 (1994).
- Zhou, M., Yu, L. Proteomic Analysis by Two-Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis. Advances in Protein Chemistry. 65 (1), 57-84 (2003).
- Xie, S., et al. Fluorogenic Ag+-Tetrazolate Aggregation Enables Efficient Fluorescent Biological Silver Staining. Angewandte Chemie International Edition. 57 (20), 5750-5753 (2018).
- Protein gel electrophoresis technical handbook. , Thermo Fisher Scientific. Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf (2015).
