Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Reproduktionsteknik för ovariell övervakning och kontroll i amfibier

Published: May 12, 2019 doi: 10.3791/58675
Automatic Translation
1,2, 3, 2, 2, 4
1Reproductive Sciences, San Diego Zoo Institute for Conservation Research, 2Recovery Ecology, San Diego Zoo Institute for Conservation Research, 3Menagerie du Jardin des Plantes, Museum National d'Histoire Naturelle, 4Cincinnati Zoo & Botanical Garden, Center for Conservation and Research of Endangered Wildlife

Summary

Studiet av amfibiobiologi ger värdefull information om de reproduktiva, fysiologiska, embryologiska och utvecklingsprocesser som driver organismer i många taxonomiska grupper. Här presenterar vi en omfattande guide om olika metoder som kan användas för att studera ovariell kontroll och övervakning i amfibier.

Abstract

Ovariell kontroll och övervakning i amfibier kräver en mångfacetterad strategi. Det finns flera program som framgångsrikt kan framkalla reproduktions beteenden och förvärvet av könsceller och embryon för fysiologisk eller molekylär forskning. Amfibier bidra till en-12:45-tredjedel av ryggradsdjur forskning, och av intresse i detta sammanhang är deras bidrag till det vetenskapliga samfundet kunskap om reproduktions processer och embryologisk utveckling. Men de flesta av dessa kunskaper kommer från ett litet antal arter. På senare tid har decimering av amfibier över hela världen krävt ökat ingripande av naturvårdare. De captive-och säkrande kolonierna som fortsätter att dyka upp som svar på risken för utrotning gör befintliga forsknings-och kliniska tillämpningar ovärderliga för överlevnad och reproduktion av amfibier som hålls under mänsklig vård. Framgången för någon fångenskap befolkningen bygger på dess hälsa och reproduktion och förmågan att utveckla livskraftiga avkomma som bär fram den mest varierande genetiska representationen av deras arter. För forskare och veterinärer, förmågan att övervaka och kontrollera äggstocks utveckling och hälsa är därför absolut nödvändigt. Fokus i denna artikel är att belysa de olika assisterad reproduktionsteknik som kan användas för att övervaka och, när det är lämpligt eller nödvändigt, kontrollera äggstocksfunktion i amfibier. Helst bör alla reproduktiva och hälsofrågor minskas genom ordentlig uppfödning, men som med alla djur, frågor om hälsa och reproduktiv patologier är oundvikliga. Icke-invasiva tekniker inkluderar beteendemässiga bedömningar, visuell inspektion och palpation och morphometriska mätningar för beräkning av kroppens kondition index och ultraljud. Invasiva tekniker inkluderar hormonella injektioner, blodprovstagning, och kirurgi. Äggstocks kontroll kan utövas på flera olika sätt beroende på vilken ansökan som krävs och arter av intresse.

Introduction

Amfibier har länge erkänts som viktiga biologiska och medicinska modeller av ett brett spektrum av forskningsdiscipliner. Uppgifter som erhållits genom att studera särskilda arter som Xenopus laevis och X. tropicalis, leopardgrodan (Lithobates (tidigare Rana) Myggan) och axolotl (Ambystoma mexicanum) har tillämpats på ett antal andra ryggradsdjur, inklusive människor. Veterinär-, djurhållnings-och assisterad befruktning som har uppstått genom att studera dessa och andra amfibier ge stöd till dem som har till uppgift att utveckla framgångsrik vård, underhåll och hållbarhet av ovanligare populationer i fångenskap 1 , 2 , 3 , 4.

Intresset för samtidig användning av in-och ex situ-naturskyddsbaserade metoder för att vända utrotnings tiden för många i riskzonen amfianarter1,2. Denna artikel innehåller de metoder som för närvarande finns tillgängliga för att övervaka och kontrollera amfibier funktionen i modell arter av anurans och Caudates. Dessutom, befintliga tekniker för att ta itu med en gemensam reproduktiv patologi av ägg retention presenteras.

Som i många taxonomiska grupper, Amfibie ovariell kontroll innebär en rad tätt synkroniserade interaktioner mellan miljö och fysiologi. Temperatur och den fotoperiod (känt som närliggande signaler) avkodas av ögat och hjärnan där de snabbt omvandlas till genetiska, hormonella och cirkadiska processer (ultimata signaler)3,4. Metoderna för att övervaka och kontrollera äggstocks funktionen som beskrivs i denna artikel inkluderar invasiva och icke-invasiva tekniker. Institutionsvård och användning kommittén (IACUC) forskning och undervisning krav definiera icke-invasiva tekniker som de som kommer att orsaka minimal till ingen fysisk smärta eller psykisk stress och kräver inga smärtstillande läkemedel5. Här, icke-invasiva tekniker inkluderar visuell inspektion och palpation, beteendemässiga observationer, morfometriska bedömningar och ultraljud. Tvärtom, de metoder för blod insamling, hormon administration och kirurgi (ovariektomi och avlägsnande av kvarhållna ägg) klassificeras som invasiva eftersom de kan resultera i viss smärta eller obehag och kräver anestesi eller post-processuella läkemedelsbehandling.

Icke-invasiva ovariell övervakning tekniker kan enkelt införlivas i den dagliga vården rutin för de flesta captive amfibier. Beroende på arten, äggstocks graviditet kan ofta bestämmas genom enkel visuell inspektion (glas groda). I andra fall kan palpation indikera om en hona är dräktig. Olika organ tillstånds index (BCI) såsom vikt, nos urostyle längd (Sul), nos-Vent längd (SVL) och standardmassa index (SMI) finns tillgängliga för att förutsäga förekomst eller frånvaro av ägg4,6,7, 8,9. Emellertid, försiktighet bör iakttas med tolkningen av resultaten som de flesta inte anser ålder, kroppsform eller sammansättning (t. ex., vatten kvar kontra äggstocks massa eller fett)6. Slutgiltiga reproduktions diagnoser kan uppnås via ultraljud med mer djupgående kunskap om ägg utveckling och iscensättning av äggstocks cykeln4,7. Ultraljud ger också ett sätt att bekräfta och övervaka reproduktiva patologier och tillhörande fysiologiska villkor4,8.

Förutom att ge information om hälsostatus kan blodprovstagning användas för att mäta reproduktionshormoner. Om hormon profilering är det slutliga målet, det är viktigt att undvika stressrelaterade influenser som kan blanda ihop systemiska steroid data. Medan ett potentiellt kraftfullt övervakningsverktyg, det finns ännu inte en studie som visar medfödda endokrinologiska svar på EXOGEN hormon administration i någon amfibo arter. Blod kan säkert tas från flera platser; i grodor Detta inkluderar ventrala buk venen, linguala plexus, lår bens ven och hjärta9,10. I Caudates, blod samlas in från ventrala svans ven. Graden av invasivitet, mängden återhållsamhet som krävs, behovet av bedövningsmedel, den delikatess av det organ som riktas, och storleken på djuret är faktorer som skall beaktas när man väljer en insamlings teknik för den amfianska patienten. Denna artikel kommer att presentera tekniken för blod insamling från ansiktet maxillary eller musculocutaneous ven av grodor som ursprungligen beskrevs av Forzan et al.9.

Ovariell kontroll är artspecifika och, som sådan, hormon protokoll bör testas och optimeras. Annat än säsongsvariationer och tillhörande cirkulerande hormon miljö, äggstocks kontroll kan också vara tätt kopplade till ålder, tid i fångenskap och exponering för upprepad hormon administration, för vilka det finns lite information i litteraturen11 , 12 , 13. genomförandet av hormonbehandlingar för att framkalla reproduktiva beteenden, könscell produktion, mognad och oviposition har blivit ett allmänt rapporterat tillvägagångssätt för att lösa gemensamma reproduktiva problem i samband med fångenskap4, 8,14,15,16. Eftersom mekanismerna för att kontrollera reproduktion hos ryggradsdjur är starkt bevarade finns det ett antal hormoner, neuropeptider och kommersiellt tillgängliga läkemedel som används terapeutiskt i andra taxonomiska grupper som också kan användas på ett tillförlitligt sätt i ett antal groddfisk (tabell 1). Koriongonadotropin releasing hormon (GnRH) och humant koriongonadotropin (hCG) (eller varianter därav, dvs, pmsg och EKG)17,18, antingen individuellt eller i kombination, har använts i stor utsträckning i amfii fångenskap avelsprogram inklusive: Southern Rocky Mountain Boreal (Anaxyrus Boreas Boreas)4,19,20; toaden, Dusky gopher groda, Rana sevosa (Langhorne et al., opublicerade)7; Gulf Coast Waterdog, Necturus beyeri20; Wyoming padda, Anaxyrus baxteri18; bullgrodan, Rana av21; Amerikanen toaden, Anaxyrus americanus22; gräs grodan, Lymnodyaster tasmaniensis23; den Coqui, Eleutherodactylus Coqui24; Xenopus, Xenopus laevis25; den Gunther ' s toadlet, Pseduophryne guentheri26; den norra leoparden groda, Lithobates Myggan; den argentinska Horned-groda, Ceratophrys utsmyckade; den Cranwell ' s Horned-groda, C. cranwelli; den amerikanska Ground-Frog, Odontophrynus americanus27; och branden Salamander (Salamandra)228. Steroidhormoner, som progesteron (P4), är mindre vanligt rapporterade men har visat god effekt i framkalla ägglossning och oviposition hos vissa arter av anurans16,18,29. Prostaglandiner (särskilt prostaglandin 2-alfa (PGF2α)) är involverade i ägglossningen tillsammans medkortikosteroider 30,31,32,34 och nå höga nivåer under den ovulatoriska fasen31.

I in vitro-studier är PGF2 α en potent inducerare av ägglossningen31, medan in vivo kan inducera oviposition av behållna ägg i Rana muscosa4,30,32. Hypofys extrakt är också effektiva inducerare av ägglossning15,16,34; farhågor kring biosäkerhet och potentialen för sjukdomsspridning är dock ofta avskräckande för häckningskolonier i fångenskap när man överväger detta tillvägagångssätt35.

Den sista delen av denna artikeldetaljer kirurgiska ingrepp och ger alternativa metoder för att expandera äggstocks studier eller stöd med upplösningen av reproduktiv patologier. Ovariectomies är vanligast utförs i amfibier att få oocyter för embryologisk forskning. Emellertid, det kan också ge ett botemedel för kvarhållna ägg när ett annat alternativ misslyckas. Även om detta förfarande är invasiv, kräver full anestesi och snitt för att exponera ägg massorna, det kräver inte eutanasi. Dessutom, efter partiell ovariektomi, djur kan göra en fullständig återhämtning och fortsätta att vara reproducerbara aktiva efter operationen8,36.

De protokoll som beskrivs nedan beskriver invasiva och icke-invasiva metoder för ovariell kontroll och övervakning i anurans och Caudates. De särskilda arter som valts för att illustrera tekniker i anurans inkluderar R. slemhinnan och X. laevis. Necturus maculosus, n. beyeri, n. alabamensisoch A. mexicanum omfattar de arter som används för att på liknande sätt beskriva tekniker i caudates.

Protocol

Salamander förfaranden godkändes av Cincinnati Zoo & botaniska trädgården (CZBG) institutionella vård och användning Committee (IACUC) protokoll 11-106, 13-110, 14-133, och 15-138. Alla Frog och Toad förfaranden godkändes av San Diego Zoo global (SDZG), institutionsvård och användning utskott (IACUC) protokoll: 15-001, 16-005 och 18-003.

Vård och behandling av djur godkändes av etiska kommittén för National Museum of Natural History (Paris) (Museum National d'Histoire Naturelle-Ménagerie du Jardin des Plantes (MNHN)), i enlighet med de institutionella och nationella riktlinjer (Kommissionen de Génie Génétique, Direction départementale des Services vétérinaires, Europeiska unionens direktiv 2010/63/EU, avtals beslut nr. C75-05-01-2 för den europeiska konventionen för ryggradsdjur som används för experimentella och andra vetenskapliga ändamål. Alla protokoll som används i denna studie godkändes under referensnumret 68-037.

1. icke-invasiva ovarieövervakningstekniker

  1. Okulärbesiktning och palpation
    1. Håll honan Anuran på ett av de tre sätt som beskrivs nedan.
      1. Säkra grodan eller padda ben med ringen och lillfingret, stödja dorsala sidan (buken) av grodans kropp med index och långfingret och den ventrala sidan med tummen (figur 1a).
      2. Håll grodan eller padda i den dominerande handen med en tumme på buken och resten av fingrarna säkra baksidan av djuret. Använda den icke-dominerande handen för att palpera djurets buk, känner om det är subdermala ojämnheten (figur 1b).
      3. Vila grodan eller padda mage på handflatan, främre armarna drapalade över pekfingret och en tumme på sin övre rygg.
    2. Eftersom Caudates är helt akvatiska i naturen, utföra visuell inspektion av en av två metoder som beskrivs nedan.
      1. Flytta djur till en separat 4 L behållare som innehåller tank vatten. Håll behållaren (locket säkrat) upp och lysa ficklampa på undersidan för att visualisera närvaron/frånvaron av ägg.
      2. Anesthetize i MS222 (0,5 g/L; Tricaine methanesulfonate, buffrad med 0,5 M NaHCO3). Efter induktion, rotera djuret på ryggen och undersök buken.
  2. Morphometriska bedömningar
    1. Anurans
      Obs: anestesi krävs inte.
      1. Med hjälp av bromsok, Mät djuret från spetsen av munnen, längs mitten av kroppen till spetsen av svansen för att få SUL och SVL (figur 2A, B).
      2. En plastbehållare på en digital precisions skala. Placera djuret i en tarerats behållare och väg (figur 2C).
      3. För större djur, som Bullfrogs, eller vid erhållande av vikter i fältet, Använd en hängande skala (figur 2D).
      4. Som i många talamancae arter, skilja R. muscosa vuxna honor från hanar av deras större storlek och avsaknaden av bröllops (tumme) kuddar på händerna (figur 3).
      5. Beräkna kropps villkoret, som en grundläggande bedömning av den allmänna hälsan med följande formel:
        Fultons index: K = massa ÷ längd3
        Obs: Fulton ' s index använder en dimensionell balans av volym i samband med massa och längd där 3 är den skalning exponenten som relaterar massa och längd Isometriskt.
    2. Caudates
      1. Tara skala med en tom påse innan du placerar icke-sövda djuret inuti. Var noga med att inte införa överflödigt vatten (figur 2D) och agera snabbt som djur utsöndrar slem som en stressreaktion på att vara återhållsam.
      2. Få vuxna åtgärder genom att immobilisera individer i en rak position på botten av en återförslut kan plastpåse eller i en separat plastbehållare som kan rymma utökade bromsok.
      3. Mät kroppslängden med bromsok (figur 2e).
      4. Mät caudatus från spetsen av nos till spetsen av svansen (SVL) för att övervaka tillväxten.
  3. Beteendemässiga observationer
    1. Fysiskt observera djur i realtid eller använda en videokamera för att spela in beteende.
    2. Rekord observationer av djur kategorisera beteenden och konstruera ett ethogram (figur 4).
    3. Klassificera reproduktiva beteenden
      Anm.: figur 4 exemplifierar en typ av reproduktions beteende som observerats hos anurans.
  4. Ultraljud
    Anmärkning: ultraljud givaren av val, i detta fall, 7,5 mHz linjär eller en Multi-Frequency (10-6 mHz) mikro-konvex, rekommenderas för Necturus och en 10 MHz sond och vattenlöslig, saltfri gel för R. muscosa. Utföra ultraljud på salamandrar kan kräva anestesi (se avsnitt 1,5 för instruktioner).
    1. Anurans
      1. Utför ultraljud på R. muscosa med två personer (figur 5a).
      2. Första person: Håll djuret med den dominerande handen och tillämpa vattenlöslig, saltfri gel till djurets buk.
      3. Andra person (Ultra-sonographer): ta 10 MHz sonden i den dominerande handen och tillämpa den på buken och se till att göra bra kontakt mellan sonden och gelen.
      4. Skjut inåt från strax under armhålan mot mitten av djurets buken mittlinjen för att visualisera hela äggstockarna.
      5. Ultra-sonographer: Använd icke-dominerande hand för att frysa ram och fånga de önskade bilderna på ultraljud.
      6. Kategorisera stadiet av ovarialcykeln med det klassificeringssystem som fastställts för släktet4 (tabell 2, Figur 5b-F).
      7. Skölj alla gel av djur i slutet av förfarandet.
    2. Caudates
      1. Överför icke-sövda Necturus till 4 l rektangulär behållare fylld med 2 l tank vatten.
      2. Minimera djurens rörlighet genom att vrida rummet lamporna och/eller kopp en hand över huvudet av djuret.
      3. Placera givaren på ett avstånd av 1-2 cm från kaross väggen.
      4. Lokalisera hjärtat vid ventrala mittlinjen nivå till frambenen och sedan flytta givaren distalt och undersöka äggstocksvävnad7.
      5. Kategorisera honor enligt klassificeringssystem som fastställts för släktet4 (figur 6a, B, C).
      6. Få noggranna åtgärder av ägg i mitten till slutet av dräktiga skede genom att fånga bilder när djurets kropp är i vinkel mot givaren (dvs, inte linjär, men liten båge; Figur 6b). Annars, överlappande folliklar gör det svårt att skilja enskilda ägg storlek.
  5. Anestesi induktion och återhämtning
    1. Anurans
      1. Anesthetize i MS222 (0,5 g/L; Tricaine methanesulfonate buffrat (0,5 M NaHCO3) som tidigare beskrivits.
      2. Använd den rätande reflex som en primär indikator på i vilken grad djuret har blivit sövda. Fullständig förlust av reflex visar ett tillstånd av djup anestesi.
      3. Ta bort djuret från vatten-bad-baserade anestesi (MS-222) när den rätande reflex är förlorad.
      4. Placera djuret på en våt (med bedövnings fritt de-klorerade vatten) handduk.
      5. Se till att hålla djuret fuktigt under hela kirurgiska ingrepp.
      6. Intubera små amfibier med röda gummikatetrar, et rör eller klassisk bojad endotrakealtuber utan att blåsa upp manschetten.
      7. Ge ett lågt flöde av syre (0,5-0,75 L/min) med 0,5-1% isofluran.
      8. Stoppa isofluran efter ingreppet men hålla flödet av syre i 1 minut.
      9. Extubera djuret och skölj djuret noggrant med anestesi fritt deklorerat vatten i 2 minuter.
      10. Lägg djuret i en Grundmängd av de-klorerade vatten eller på en våt handduk.
      11. Utvärdera djurens återhämtning genom att försiktigt dra på en bakben till elongate. Någon reagera contraction av extremiteten indikerar tillbakadragande reflex.
      12. Övervaka andra indikatorer för återhämtning såsom ektangulärt respirationer (hals rörelse) och den rätande reflex.
      13. Tänk på att amfianan återhämtade sig när alla reflexer har återvänt, och hjärt-och andningsfrekvensen har återvänt till pre-anestesi värden.
    2. Caudates
      1. Anesthetize Necturus och Ambystoma i MS222 (0,5 g/L tricaine methanesulfonate, buffrad med 0,5 M NaHCO3, (MS222) i en 4 L rektangulär tank.
      2. Placera en luft sten (1 tum) och luftpumpen i tanken och slå på den till ett konstant flöde för att ge adekvat syresättning.
      3. När lem funktion och rätande reflex förloras, ta bort djuret från vatten-bad-baserad anestesi (MS-222) och sätta djuret på en våt (med bedövnings fritt de-klorerat vatten) handduk.
      4. Bibehålla huden och väta fukt med en klämma flaska vatten.
      5. För att återvinna djuret, försiktigt placera den ventrala sida ner i en 4 L plastbehållare fylld med 2 L tank vatten med en luft sten.
        Obs: återhämtning börjar med Gill blinkande, följt av förmågan att flytta sin svans och driva fram och slutligen funktionell förflyttning av armar och ben.
      6. Returnera djuret till sin ursprungliga hus tank och övervaka noga under de närmaste 24 h.
        Anmärkning: andra metoder för anestesi för amfibier finns och dessa beskrivs i Wright och Whitaker8.

2. invasiva ovariella övervaknings-och kontroll tekniker

Anmärkning: denna procedur har anpassats från Forzán et al.10.

  1. Håll grodan i den dominerande handen, och sandskädda torka den venipunktering sidan av grodans ansikte med en steril torka eller gasbinda.
  2. Torka ansiktet för att undvika att blodet sprids över huden för mycket.
  3. Sätt in nålen (26 G 1/2 "och 27 G 1/2"), med fasningen vänd uppåt, genom huden där den upphöjda huden runt ögat och den övre käftåsen möts för att bilda punkten i en triangel (gul kontur) (figur 7a) tillgång till Vena facialis nära Vena orbitalis posteriort.
  4. Punktera ansikts venen under det högra ögat och ovanför den övre käkåsen, med början mellan 1-2 mm tillbaka från mittlinjen i ögat (figur 7a).
    Anmärkning: för mindre grodor (under 20 g), flytta insättningspunkten närmare en position direkt under mittlinjen av ögat.
  5. Vinkel microhematocrit röret nedåt för att möjliggöra gravitation för att hjälpa blodflödet in i röret. Blod ska flöda omedelbart efter punktering (figur 7b, C).
  6. Vid första tecken på blodflöde, Placera spetsen av microhematocrit röret på punkteringsstället och samla 1-2 full microhematocrit rör av blod och placera rören i lämpliga behållare för uppsamling (figur 7b, C).
  7. Om blod inte flyter lätt, eller volymen är mycket låg, flytta införandet av nålen något eller sätt in nålen i andra sidan av ansiktet.
  8. Stoppa blödning genom att trycka på gasbinda ordentligt på punkteringsstället i minst 20 s.
  9. Lämna groda ur vattnet i 10 minuter för att bekräfta punktering webbplats inte öppna.
  10. Använd en ny nål och nya microhematocrit rör för varje groda samplas.

3. hormon induktion

  1. Hormonpreparat
    1. Förbered hormon injektioner omedelbart före användning för att säkerställa maximal effekt.
    2. Välj ett hormon från urvalet som listas i tabell 1.
    3. Bestäm koncentrationen av hormonet som ska injiceras med hjälp av en μL eller mL/g kroppsvikt16.
    4. Späd ut hormonet i något av följande: vatten, fosfatbuffrad saltlösning (PBS), saltvattens ring (SARS) eller koksalt.
    5. Överskrid inte en injektionsvolym på 200 μL för grodor som väger 30-70 g och 300 μL för grodor som väger 80-110 g (personlig observation)16.
    6. För korrekt hållande av ett djur under hormon administrering av något djur som sträcker sig från 10-100 g, Använd någon av de lämpliga metoder för att hålla som beskrivs i avsnitt 1,1.
  2. Anurans
    1. Beräkna den koncentration som krävs per individ med hjälp av ett gram per kroppsvikt beräkning (g/kroppsvikt).
    2. Strax före administrering, Rekonstituera i en steril spädningsvätska val.
    3. Se till att inga bubblor finns kvar i sprutan före injektionen.
    4. Håll djuret säkert i den icke-dominerande handen och administrera injektionen med dominant hand.
    5. Administrera injektion enligt hormonspecifikationer. De vanligaste injektionerna i anurans är sub-kutana, Intra peritonealdialys eller intra muskulös (figur 8).
    6. Administrera IP-injektioner i nedre delen av buken eller i nedre delen av ryggsidan av kroppen nära bakbenet (figur 9).
    7. Administrera intramuskulär injektioner företrädesvis i bakbenen.
  3. Caudates (Necturus)
    1. Rekonstituera det hormon som finns i sterilt vatten enligt det gram per kroppsvikt metod som beskrivs ovan.
    2. När det gäller Necturus, Använd doser på 1,7-2,3 μg GnRH/g kroppsvikt.
    3. Avlägsna Necturus från bedövnings kammaren och placera på en 45 ° yta täckt med kirurgisk drapering.
    4. Placera djuret med huvudet pekande nedåt.
    5. Approach bakre kvadrant av buken (caudal av bakre benet) vid en 15-20 ° vinkel. Var noga med att inte införa luft i sprutan.
    6. Injicera (IP) med en insulinspruta och 27-30 G nål.
    7. Injicera hormonet med hjälp av en insulinspruta och 27-30 G nål.

4. kirurgi

  1. Allmän kirurgisk beredning och procedur
    1. För att bibehålla aseptiska procedurer, Använd tydliga sterila plast draperier att isolera kirurgisk plats. Reducera avdunstning genom att hålla den omgivande huden fuktig.
    2. Fukta alla material som kommer att kontakta djurets hud med sterilt vatten. Gör huden snitt med ett nummer 15 eller nummer 11 skalpell blad.
      Obs: en kombination av kallt stål, radiokirurgi eller diodlaser. Hemostas i mild hemorragisk förfarande kan uppnås genom elektrocauter eller diodlaser.
    3. Använd bomull tippas spjut eller applikatorer för att möjliggöra tillämpning av lokaliserade trycket till små fartyg att hålla koll på blodförlust.
    4. Använd bomullstippade spjut eller applikatorer för att hantera små trånga utrymmen istället standard gasväv torg.
    5. Använd mikro-instrument, som oftalmologiska instrument, med fina, små tips, när du utför kirurgi på djur som väger mindre än 1 kg.
    6. Använd plast, självhållande upprullningsdon (t. ex. Lone Star upprullningsdon) för att passa olika storlekar av snitt.
    7. Använd Ögonlocksplastik för tillbakadragning av coelomic snitt.
    8. Använd förstorings instrumentering när det behövs för att utföra kirurgi på mindre patienter.
      Anmärkning: analgesi krävs med alla kirurgiska ingrepp i amfibier. Underlåtenhet att administrera adekvat analgesi under operationen har förknippats med fördröjd återgång av normala funktioner. Dessutom, analgesi potentierar effekterna av anestesi läkemedel (tabell 3)34.
  2. Anurans
    1. När X. laevis har sövda som beskrivs i steg 1.5.1, placera djuret i dorsala vilo (figur 10A, C).
    2. Förbered det kirurgiska fältet aseptiskt genom att torka fuktig steril gasväv med utspädd povidon-jod lösning (1/10) på platsen för 10-15 s eller 0,75% klorhexidin lösning på operationsområdet för minst 10 min före operationen35.
    3. Gör en 3 mm paramedian hud snitt i mitten coelom (mellan axlarna och cloaca) med en fet stroke lämnar ett rent snitt med en No. 15 eller nr 11 skalpell.
      Obs: man kan använda en diodlaser även för hud snitt.
    4. Höj buk membranet, gör och snitt och dissekera försiktigt med en No. 15 eller No. 11 skalpell. (Figur 10B, D).
    5. Dra tillbaka de coelomiska snitten med ögonlocks upprullningsdon (eller lämplig utrustning).
    6. Punktskatter en del av äggmassan utan ligating några blodkärl.
    7. För komplett ovariektomi, bränna omgivande blodkärlen genom elektrocautery eller laserdiod (figur 11).
    8. Använda monofilament sutur, nära celiotomy snitt med en avbruten, everting sutur mönster.
  3. Caudates
    1. En gång. mexicanum har bedövningsmedel, placera den i den högra laterala recumbency, med vänster bäckenbenet helt enkelt placeras mot svansen basen.
    2. Förbered det kirurgiska fältet aseptiskt genom att placera fuktig steril gasväv med utspädd povidon-jod lösning (1:10) på platsen för 10-15 s. Alternativt kan du använda steril gasväv indränkt i 0,75% klorhexidin lösning och placera på operationsområdet i minst 10 min före operationen (figur 12a)36,37 .
    3. Dra en linje mellan axeln och bakbenen för att dela upp kroppen i tre lika delar (figur 12B).
    4. Gör snittet platsen mellan den andra och tredje delen.
    5. Ta tag i underliggande muskler och lyfta bort från coelomic Viscera.
    6. Försiktigt tvinga små hemostatika genom coelomic muskulatur och i coelomic hålighet.
    7. Dra tillbaka de coelomiska snitten med ögonlocks upprullningsdon (eller lämpligt material) (figur 12C).
    8. För komplett ovariektomi, bränna omgivande blodkärlen genom elektrocautery eller laserdiod (figur 12d).
    9. Använda monofilament sutur, nära celiotomy snitt med en avbruten, everting sutur mönster.

Representative Results

Morphometrics och reproduktion

Visualisering av kvinnlig reproduktions status i amfibier varierar beroende på arten. Den mest effektiva metoden är ultraljud; vissa arter kan dock uppvisa varierande grad av transparens i huden (figur 13a, B, C). Visuell inspektion kan ofta tydligt illustrera skillnaderna mellan en dräktig och icke-dräktig hona när huden är halvgenomskinlig som observerats i n. alabamensis och n. maculosus (figur 13a, B); eller genomskinlig som illustreras av glas grodan (figur 13C). Den mörka fläckiga huden färgning på buken av N. beyeri förbjuder denna bedömning ska göras. I R. muscosa, huden är inte genomskinlig men märkbara skillnader kan upptäckas mellan kvinnor som är dräktig jämfört med dem som nyligen oviposited eftersom huden är slapp, och djuret ser tunnare (gul linje) jämfört med en kvinna som är dräktig (blå linje) (figur 13D). Med erfarenhet föraren kan bekanta sig med skillnaden mellan en stor hona och en dräktig en men bekräftelse av dräktig skede kommer att kräva ultraljud. Body mass index i amfibier kan beräknas med hjälp av ett antal formler, men deras tillämpning som ett prediktivt verktyg för reproduktion är diskutabel. När det gäller R. muscosaär sambandet mellan Fultons index, hälsa och reproduktions status oklart.

Reproduktions beteende och ultraljud

Våra resultat visar hur man karakteriserar reproduktions beteenden i R. muscosa för förutsägelse av oviposition (figur 4). Flera etapper varar från några timmar till flera veckor inkluderar, uppvaktning där en manlig aktivt jagar en hona (figur 4a), de manliga fästen och fast knäppar på kvinnans rygg, kallas amplexus (figur 4b). När amplexed, paret kan förbli i amplexus för 1 – 5 veckor och paret kommer att visa andra beteenden utöver amplexus. Amplexus är ett mycket aktivt beteende som inkluderar hanen klämma honan i en mjuk pumpning sätt (figur 4c); den kvinnliga flyttar runt och börjar Visa hand-Stand beteenden intermittent (figur 4D, E); och närmare tiden för oviposition, den kvinnliga, i en hand-Stand, kommer att luta sig mot ytor som hon kan sticka ägg på medan hanen pumpar hennes mage kraftigt (i detta fall är det möjligt att också observera den kvinnliga gnugga hennes mage nedåt från under hennes arm gropar mot cloaca. Detta kan vara ett mekaniskt sätt att driva ägg ner ovikanalerna) (figur 4F, G).

Denna studie illustrerar hur ultraljud kan ge information som att fastställa reproduktions status hos kvinnliga R. muscosa och Necturus. Fyra utvecklingsstadier representeras i R. muscosa (figur 5c, D, E, F) och karaktäriseras på liknande sätt i Necturus4 (figur 6a, B, C). Dessutom kan kvarvarande ägg inte utvisas vilket leder till kvarhållande av ägg (figur 5G, figur 15a, B). Steg 1 visar en äggstock direkt efter oviposition där folliklar är svåra att visualisera (figur 5c). Steg 2 representeras av uppkomsten av ekogena prickar (vita fläckar) spridda över äggstockarna (figur 5D). Steg 2 och 3 representeras av större, rundade ekogena prickar med mörka centra som representerar spände medium till stora folliklar (figur 5e, F). Från 2013-2017, fångenskap kvinnliga Necturus undersöktes av ultraljud på månadsbasis. Under varje tentamen tilldelades individer en betygspoäng enligt de reproduktions kriterier som fastställts för släktet (tabell 2). Andelen kvinnor som utvecklar nya ägg varje år i genomsnitt 88,2 ± 3,01% (tabell 5). Medan ägg utvecklingen var hög var oviposition inte säkerställd (figur 16). En majoritet av honor som genomgick oviposition deponerade fullt komplement av ägg, medan vissa individer deponeras endast en bråkdel av de ägg som utvecklats. De R. muscosa och Necturus honor med balanserade ägg samtidigt med vätske vinst i kroppens hålighet var utåt visuellt förstorade med röda fläckar på huden som överensstämmer med brista blodkärl (figur 14a, B ) . Graden av vätskeretention kan bedömas ytterligare via ultraljud (figur 15B). I båda arterna genomgick behållna ägg atresi eller tog på ett mer ekogent utseende (figur 14c, D, figur 15a).

Hormon administrering

Beroende på djupet av den typ av injektion vinkeln och djupet av nålen kommer att variera. För de flesta injektioner djupet av nålen behöver inte vara mer än 1 -2 mm djup när man arbetar med arter som R. muscosa men kommer att variera i vinkeln av penetration. Prostaglandin injektioner krävde en intra-muskulös (im) nål insättning vinklad vid 90 °, i bakbenet av R. muscosa medan intra-peritoneala (IP) injektioner, med ett liknande djup till intramuskulär injektioner, administrerades i området av coelomic hålighet vid en 45 ° (figur 10). Administrering av Amphiplex hade ingen signifikant effekt när det gäller att öka antalet ägg som satts in av hormonbehandlade honor jämfört med kontroller (P = 0,547), och inte heller fanns det några skillnader i antalet embryon som klyvs (P = 0,673) eller överlevde till grodyngel (P = 0,629) (tabell 4). I allmänhet minskade andelen kvinnor ovipositing från 80% i 2011 till 28% i 2014. Antalet hondjur ovipositing i 2015 var signifikant högre än 2013 (P = 0,0002), 2013 (P = 0,0001) och 2014 (P = 0,0026) men inte 2011 (P = 0,0885), bekräftar tanken att honor av denna art inte får föda årligen och att hormonella protokoll kräver refi förädlingen. För R. muscosa honor med tecken på ägg retention, intramuskulös injektioner av PGF2α hade en 60% framgång i att framkalla utvisning av degenererade ägg. Men i 1 av de 5 kvinnliga injicerade, PGF2 α var inte tillräckligt för att orsaka fullständig utvisning och vissa ägg kvar inuti honan till följande häckningssäsong. Sjutton Necturus honor fick LHRH/(GnRH) och 13 fick en simulerad injektion av sterilt vatten för att fungera som en kontroll (tabell 5). Totalt gick sju kvinnliga Necturus (n = 4 alabamensis, n = 2 beyeri, n = 1 maculosus) till oviposit elva fulla klor som tillskrevs både GnRH behandlade (n = 6) och kontroll (n = 5) individer. Tre honor (n = 2 beyeri, n = 1 maculosus) oviposited fem partiella kopplingar (figur 13). Detta fenomen verkar inte vara associerat med EXOGEN hormonbehandling som tre kontroll kvinnor deponeras på liknande sätt partiella kopplingar (tabell 5). Oviposition inträffade under en 37-dag (3/31-5/7) tidsram under loppet av fem år (tabell 5). Det fanns ingen skillnad (P = 0,194) i ovipositions-frekvenser mellan LHRH/GnRH-behandlade (41 ± 13,08%, intervall 17-67%) och kontroll (66,75 ± 11,79%, område 50-100%) Kvinnor. LHRH/GnRH behandlade honor deponerade ägg i genomsnitt 7,44 ± 1,41 (intervall 3-13) dagar efter injektion. Med tanke på den helt akvatiska arten av arten och oförmåga att manuellt hindra utan bedövning var det nödvändigt att säkerställa en lämplig nivå av sedering innan du utför IP hormon injektioner (se avsnitt 3,2 för instruktioner om anestesi).

Blod insamling, anestesi och kirurgi

Blod provs tekniken i denna artikel togs från Forzan et al. 201310 och har visat ett effektivt sätt att samla in blod från R. muscosa med minimal invasivitet och stress. Med mikrohematokritrör kan cirka 35-45 μl plasma eller serum samlas in per 70 μL helblod (figur 7). Maximal uppsamlings volym i R. muscosa var 1 full microhematocrit tub per 10 g groda, upp till 4 tuber per groda för grodor 40 g och större. Detta var en konservativ uppsamlings volym på 0,7 mL per 100 g, 70% av den maximala rekommendationen på 1,0 mL per 100 g (anpassad från Allender och Fry, 2008)13.

Anestesi och kirurgi i amfibier rapporteras sällan men det är viktigt att notera att doser och effekt kommer att variera på ett artspecifikt sätt. I Bombina orientalis till exempel har MS222 en mycket låg effekt, även med höga doser (1 g/L) medan i boreala paddor, Anaxyrus Boreas Boreas, 1 g/L är snabb (fråga om minuter) och långvarig (3 + h) (Calatayud, personlig observation). I R. muscosa, anestesi kräver doser rapporterade för A. Boreas Boreas och har liknande effekt och återhämtning gånger. Fastande amfibier före anestesi är vanligtvis inte krävs eftersom deras struphuvudet förblir väl tillsluten även under narkos. Men om det bedöms nödvändigt, särskilt om bedövningsmedel förfarandet är att inkludera celomic kirurgi, djur kan fastas 24 h före anestesi.

Under operationen är den rätande reflex den primära indikatorn att djuret har blivit sövda. Den rätande reflex är förmågan och graden av lätthet med vilken ett djur kan återvända till en upprätt position efter att ha placerats på ryggen. Förlust av reflex antyder ett lätt skede av anestesi. Ett kirurgiskt plan indikeras genom förlust av abstinens reflex som innehåller lätt dra på extremiteterna för att räta ut den och djuret inte längre är kapabel att dra tillbaka den7. Reproduktiv kirurgi har inga överväldigande hinder och amfiboska patienter huvudsakligen läka väl tolererar blodförlust mer än högre ryggradsdjur. Kirurgi bör gå snabbt, varar cirka 15 minuter från början till. Steg bör tidsinställda ungefär så här: < 1 minut för den initiala snittet och < 2 minut för celiotomy och upprullningsdon insättning, < 2-3 minuter för isolering per äggstock och < 1 minut för fartyg sutur eller kauterisation och hudsuturen < 4 minuter. Den totala återhämtningstiden efter operationen med MS222 protokoll är cirka 45 minuter men detta kan vara artspecifika. I A. Boreas Boreas och R. muscosa återhämtning gånger kan vara längre, upp till 1 – 2 h. När du utför kirurgi, försiktighet måste iakttas för att undvika punktera lungorna, mag-tarmkanalen eller en utspänd urinblåsa, och inte skada de makroskopiska körtlar, lymfa hjärtan, och blodkärl, särskilt mitten av ventrala ven. Beroende på säsong, närvaron av stora feta kroppar kan göra visualisering av andra organ svårt. En gång synligt vaken, ett djurs svar på extremitets stimulering, såsom resistens mot en mild stretching av en rygg lem eller blinkar när området runt ögat stimuleras (personlig observation), klassificeras som abstinensbesvär. Den rätande reflex tillsammans med andra återhämtnings indikatorer inklusive, tillbakadragande reflexer och ektangulärt rörelser, är viktiga indikatorer för återhämtning.

Administration
Allmänt namn Arter Hormon Förfarande Priming förening Priming dos rapporterade Antal priming doser Timing (HR före ägglossning dos) Förening (er) som administreras för slutlig ägglossning/oviposition Doser Referens
Puertoricansk Crested padda Peltophryne Lemur GnRH & hCG Ip Hcg 1,5 IE/g 2 hCG-48 GnRH HCG GnRHa + hCG 0,2 μg; 4 IU; 0,5 μg + 4 IE Calatayud et al. opublicerade
Berggulbent groda Auktor Amphiplex, lut Ip GnRHa (des-Gly10, D-Ala6, Pro-NHEt9-GnRH) 0,4 μg/g 1 24 GnRH + MET 1 x 0,4 μg/g + 10 μg/g Calatayud et al., 2018
PGF2α Im PGF2α 5 ng/g 1 48 PGF2α 5 ng/g
Southern Rocky Mountain boreala TOAD Anaxyrus Boreas Boreas hCG, GnRH Ip Hcg 3,7 IE/g 2 96, 24 hCG + GnRHa 13,5 IE/g + 0,4 μg/g Calatayud et al., 2015
Nordisk Cricketgroda Auktor Amphiplex tillsätts till vatten (10 mL) Ingen Ingen 0 Na GnRH + MET 0,17 μg + 0,42 μg/μl Snyder et al., 2012
Nordlig Leopardgroda Auktor Amphiplex Ip Ingen Ingen 0 24 GnRH + MET 1 x 0,4 μg/g + 10 μg/g Trudeau et al., 2010
Argentinsk Horned groda Auktor Amphiplex Ip Ingen Ingen 0 24 GnRH + MET 1 x 0,4 μg/g + 10 μg/g
Cranwell ' s Horned Frog Mer från Ceratophrys Auktor Amphiplex Ip Ingen Ingen 0 24 GnRH + MET 1 x 0,4 μg/g + 10 μg/g
Amerikansk mark groda Mer från Odontophrynus americanus Amphiplex Ip Ingen Ingen 0 24 GnRH + MET 1 x 0,4 μg/g + 10 μg/g
Dusky gopher groda Auktor hCG, GnRH Ip Hcg 3,7 IE/g 2 96, 24 GnRH + hCG 1 x 0,4 μg/g + 13,5 IE/g Graham et al., 2018
Vanliga Coqui Auktor Fisk, aviär, däggdjurs & GnRH (D-Ala, des-GLY, ETH LHRH), hCG Sc mLHRH;  aLHR; fLHRH; GnRHa; Hcg Ingen 0 Na mLHRH;  aLHR; fLHRH; GnRHa; Hcg 7μg, 33 μg; 28μg. 7μg, 20μg; 5, 10, 15, 20 μg; 165 IU Michael et al 2004
Gunther ' s toadlet Mer från Pseudophryne guentheri Gnrh GnRHa 0,4 μg/g 1 26 GnRHa med eller utan Prime 0,4 μg/g Silla 2010
Korroboree groda Pseudophryne corroboree Lucrin Sc Lucrin 1 μg 1 26 Lucrin 5 μg Byrne & Silla, 2010
Nordlig Korroboree groda Mer från Pseudophryne pengilleyi GnRHa GnRH (D-Ala, des-GLY, ETH LHRH) TA Ingen Ingen 0 Na GnRHa 0,5-2,0 μg/g Silla et al., 2017
Gulf Coast Waterdog Auktor [des-Gly10, D-Ala6]-LhRH-RH etylamidacetat salt hydrat Ip Ingen Ingen 0 Na Lhrh 100 μg/500 μL Stoops et al., 2014
Southern Bell Frog/morrande Grass Frog Auktor des-Gly10, D-Ala6-[LHRH] Sc Ingen Ingen 0 Na des-Gly10, D-Ala6-[LHRH] 50 μg Mann et al., 2010
Fowlers padda Auktor GnRH, hCG, P4 Ip Hcg 3,7 IE/g Browne et al., 2006
Axolotl (mexikansk Salamander) Mer från Ambystoma mexicanum Follikelstimulerande hormoner Im Ingen Ingen 0 Na Fsh 400IU Trottier och Armstrong, 1974
Afrikansk klöst Frog Auktor hCG & P4 tillsatt vatten; Ip PMSG, hCG Marcec, 2016
Tiger Salamander Mer från Ambystoma tigrinum. hCG, LH
Wyoming padda Auktor hCG, GnRHa, P4 Ip hCG + GnRHa 100 IU + 0,8 μg 1 72 hCG + GnRHa 100 IU + 0,8 μg Browne et al., 2006
Nordlig Leopardgroda Auktor Hypofys-extrakt (PE), P4, testosteron (T), kortikosteron [C], Amphiplex, domperidon (D) SC, IP Ingen Ingen 0 Na PE, PE + T, PE + P4, PE + C; Amphiplex, GnRH + D ~ 100 IE (LHRH) i 1 mL; PE + 0,002 μg/μL. PE + 0,01 mg/50 ml; PE + 0,1 mg/50 ml; 0,4 μg/g + 10 μg/g;  0,4 μg/g + D Wright, 1961; Fort, 2000; Trudeau et al., 2013
Mald groda Mer från lymnodynastes tasmeniensis Hypofys extrakt, hCG, GnRHa, PZ Ip GnRHa 0,9-1,2 μg/g + PZ 10 μg/g 1 20 PE PE + hCG; GnRH + PZ PE Vol; PE Vol + 100 IE hCG; GnRH (0,9-1,2 μg/g) + PZ (10 μg/g) Clulow et al., 2018
Green och Golden Bell Frog Litoia Aurea Gnrh Ip GnRHa 10 μg 1 72 GnRHa + hCG 20 μg + 300 IE Clulow et al., 2018
Stor preskriberad groda Auktor hCG & PMSG Sc PMSG, hCG 50 IE & 25 IE; 1x100 IE 2 2 PMSG-144 & 96;  hCG-24 Hcg 100IU Clulow et al., 2012
För mer hormon protokoll och arter se Wright och Whitaker, 2001

Tabell 1: amfibinska arter och några av de EXOGEN hormoner som testats på dem som rapporterats i litteraturen. Humant koriongonadotropin (hCG); Gonadotropin releasing-hormon (GnRH); Lutenizing hormon-releasing hormon (LHRH); bokstäverna m, a och f representerar "däggdjur", "aviär" och "fisk". gravid sto serum koriongonadotropin (PMSG); progesteron (P4); Follikelstimulerande hormon FSH); hypofys-extrakt (PE); testosteron (T); kortikosteron (C). Listade Dopaminantagonister inkluderar: domperidon (D); Pimozid (P); metoklopramid (MET). Amphiplex är namnge som ges till en sammansättning som göras upp av GnRH och Metoclopramide27. Lucrin är en kommersiellt tillgänglig GnRH-agonist med den aktiva substansen som Leuprorelinacetat. 4 , 7 , 17 , 18 , 19 , 20 , 26 , 27 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 , 44 , 45

Klass Reproduktions status Beskrivning
0 Icke-dräktig Inga ägg syns.
1 Tidig dräktig Ägg synliga (1-2mm i storlek) ingen distinkt echogenic linje i samband med ägg.
2 Mid gravid Ägg 2-3mm i storlek, distinkta echogenic linje (s) i samband med varje ägg.
3 Sen dräktig Ägg 4-5mm i storlek, echogenic linjer fortfarande synlig, markant ökning av ekofritt rum utseende av ägg.
4 Behållna ägg Varierande grad av ekgen material som finns i inre ägg struktur, ta på sot form. Vissa kan bli mycket echogenic och associerade med vätskeansamling i kroppens hålighet.

Tabell 2: graderingssystem som används för att göra det reproduktions tillstånd hos kvinnor som Auktor av ultrasonography.

Läkemedel Dosering och administreringssätt Kommentarer-referens
Buprenorphin 50 mg/kg (intracelomic) Experimentell studie i en östlig Rödfläckig newt (Notophthalmus viridescens). Analgesi bör ges före operationen. (Koeller, 2009)
Butorfanol 1 – 10 mg/kg (IM eller intracelomic) Det finns olika specifika respons. Det rekommenderas att börja på 1 mg/kg.
Butorfanol 0,5 mg/L (bad) Experimentell studie i en östlig Rödfläckig newt (Notophthalmus viridescens). (Koeller, 2009)
Fentanyl 1 mg/kg Analgesi > 4 h, antagoniserad av naltreen (Stevens, 1997)
Meloxicam 0,1 till 0,2 mg/kg (IM) (Minter, 2011)

Tabell 3: protokoll för analgesi i amfibier.

Auktor
År 2014 2015
No. ♀ 18 18
Ägg utveckling 61% 94%
Kontroll ♀ 4 6
Amphiplex ♀ 4 7
Genomsnittlig dag efter Amphiplex till oviposit 10,5 10,9
Ovipositions frekvens (Amphiplex) 22,20% 33,33%
Ovipositions hastighet (kontroll) 22,20% 38,88%

Tabell 4: en jämförelse av reproduktionsparametrar mellan amfiplex-behandlade jämfört med kontroll fångenskap kvinnor Auktor i 2014 och 2015.

Necturus sp.
År 1 2 3 4 5
No. ♀ 6 7 7 7 7
Ägg utveckling 83% 100% 86% 86% 86%
LHRH ♀ 3 5 3 6 0
Kontroll ♀ 2 2 3 0 6
Dag efter LHRH till Oviposit 5 7 5,5 (intervall 3-8) 13 n/a
Ovipositions frekvens (LHRH) 60% 20 67% 17 n/a
Ovipositions hastighet (kontroll) 50% 50% 100% n/a 67%
* n = 1 ♀ ingen ägg utveckling

Tabell 5: en jämförelse av reproduktionsparametrar mellan LHRH (GnRH) -behandlade och kontroll (sterilt vatten) fångenskap kvinnliga Necturus från tre arter under en 5-årig tidsperiod (2012-2017).

Figure 1
Figur 1: tre metoder för att hålla en groda. A) förfarande 1. B) förfarande 2. C) förfarande 3. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Morphometriska bedömningar. (a, B) SVL/SUL (C, D). vikt, i R. muscosa och D. Necturus. (E). storleksmätning med bromsok. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: sexuell dimorfism kännetecknas av bröllops tumme kuddar på vuxna R. muscosa män jämfört med honor. A) hona (B) hane. Den nedre panelen visar längden på manliga vs hona. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: karakterisera reproduktions beteenden som leder upp till oviposition i R. muscosa (A) uppvaktning. (B) amplexus. (C) manliga klämma kvinnlig medan i amplexus. (D, E) Amplexed hona i en hand-Stand. (F, G) Buk sammandragningar och oviposition. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: ultraljud utförs på R. muscosa A-B med reproduktions status enligt utvecklingsstadium4. (A, B) utför ultraljud på Rana muscosa. C) grad 0. Dgrad 1. (E) grad 2. Fgrad 3. G) grad 4 (ovulerade och behållna ägg) Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: ultraljudsbilder av Necturus. A) lönegrad 1. (B) grad 2. Cägg av klass 3. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: blod samling i R. muscosa. (A) blod insamling genom att punktera Vena orbitalis posterior ansikts venen strax ovanför käklinjen i mitten av omloppsbanan. (B, C) Blod släpps ut på hudens yta och samlas med ett hepariniserad kapillärrör. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 8
Figur 8: injektions metoder i amfibier. Beroende på djupet av den typ av injektion vinkeln och djupet av nålen kommer att variera. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 9
Figur 9: hormon injektion i R. muscosa. Induktion av oviposition genom hormonell behandling i Rana muscosa honor injiceras med amfiplex intraperitonealt. Äggstockarna kan hittas i coelomic kaviteten vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 10
Figur 10: förberedelser inför operationen. A) aseptisk beredning av det kirurgiska området med hjälp av utspädd povidon-jodlösning (1/10), Trachycephalus resinifictrix. (B) Clean skalpell snitt i en Xenopus laevis eller, (C) Laser-Diode hud snitt, Lithobates catesbeianus. (D) undvika att skada mitten av ventrala ven, Trachycephalus resinifictrix. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 11
Figur 11: ovariektomi i Xenopus laevis. (A) exponera och flytta stora feta kroppar för att avslöja äggmassan. B) punktskatter en portion ägg massa utan att ligera några blodkärl. (C) cauterisera omgivande blodkärlen genom elektrocautery för fullständig ovariektomi. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 12
Figur 12: prekirurgisk förberedelse och ovariektomi i A. mexicanum. A) steril gasväv indränkt, 0,75% klorhexidin lösning appliceras på operationsstället (B). En linje mellan axeln och bakbenen delar djuret i tre lika delar och den blå fläcken markerar platsen på snittet. C) dra tillbaka de coelomiska snitten med upprullningsdon för ögonlock. D) för fullständig ovariektomi, cauterisera de omgivande blodkärlen genom elektrocautery. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 13
Figur 13: visuell bedömning av reproduktions stadier. (a, B) Visuella bedömningar av reproduktions stadiet genom halvgenomskinlig hud, Necturus. Cgenomskinlig hud, Hyalinobatrachium (glas groda). Dvisuell bedömning av R. muscosa före (höger, blå linje) och efter oviposition (vänster-gul linje). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 14
Figur 14: kvarhållande av ägg. (a, B) Kvinnlig Rana muscosa med svåra fall av ägg retention. (C) ultraljud visar gammal degenerering, ägg (topp) och större ägg (mitten och bottenpanelen) haft ägglossning och fångade i coelom. D) behållna ägg som hämtats genom manuell borttagning. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 15
Figur 15: ultraljud bilder av bevarade ägg i Necturus att (a) blev echogenic i utseende (cirkel) och var förknippade med (B) vätskeretention i kroppens hålighet (pil). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 16
Figur 16: procentandel kvinnliga Neturus i fångenskap som oviposited fulla eller partiella kopplingar (2013-2017) jämfört med dem som inte oviposit. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Direkt hantering, visuell observation och morphometriska åtgärder ger icke-invasiva tekniker och är de första bedömningskriterierna för att bestämma kvinnlig fortplantnings fas. Denna studie visar dock att dräktiga äggstockar inte alltid kan identifieras på ett tillförlitligt sätt genom palpation. Beroende på art kan dräktiga äggstockar ibland visuellt upptäckas genom halvgenomskinliga (figur 13a, B) eller helt genomskinlig hud på den ventrala sidan av djuret (figur 13c). Kvinnor som har genomgått oviposition kan visa uppenbara förändringar i sitt utseende jämfört med dräktiga honor (t. ex. lös hud och förlust på upp till 30% av kroppsmassan, figur 13D). Under avel, män och kvinnor kommer att visa vissa beteenden som ger information om närhet till ägglossning och oviposition. När det gäller R. muscosa indikationer på att en hona är nära oviposition börja med den kvinnliga in hand stativ.

Tillämpningen av ultraljud teknik för att anurans och Caudates tillåter diagnos av förekomst eller frånvaro av ägg och om oviposition var förknippad med fullständig eller partiell frisättning av utvecklade ägg. Sålunda, denna metod ger en mer komplett och korrekt bedömning av reproduktiv status utan att vara begränsad till att fastställa dräktig/icke-dräktig status via en visualiseringsteknik som varierar med buken huden öppenhet, eller epidermal konsistens bland de olika amfikrararterna. Ultraljud kan utföras med relativ lätthet och med lite stress för djuren (figur 5 och figur 13) och kan användas för att karakterisera reproduktionscykler och för att bestämma reproduktions status4. Det är viktigt att bekanta sig med arten; denna studie visade dock att Necturus och R. muscosa har gemensamma utvecklings tecken i sina reproduktions mönster som möjliggör liknande klassificering av reproduktions stadiet (figur 5). Genom denna teknik finns det nu belägg för att ägg utvecklingen är hög i fångenskap Necturus och R. muscosa och att båda dessa arter följer ett säsongsbetonat mönster. Även om orsakerna till dessa fenomen är okända och kräver ytterligare utredning, utan användning av ultraljud, flera områden av ovariell dysfunktion, såsom ägg retention och partiell oviposition, skulle ha gått oupptäckt. Framtida tillämpningar av denna teknik kommer att användas för att avgöra om honor bör väljas ut för avel under ett givet år och om oviposition är klar.

Ett blod insamlings protokoll, som det som presenteras i R. muscosa, som är både effektivt och orsakar minimalt lidande för djuret, är optimalt att studera hormon profiler i fångenskap och vildfångad anurans (Calatayud, opublicerade). Hittills finns ingen information om den årliga hormon profiler av Captive R. muscosa och, därför, ingen kunskap om hur hormoner påverkar deras hälsa och reproduktion. Dessutom, med bevis för att honor av denna art inte kan vara årliga uppfödare, hormonella profilering kommer att vara en annan metod för att spåra äggstockarna cykler. Tillsammans med ultraljud, hormon analys kan leda till bättre förutsägelse av vad honor kommer att vara redo för oviposition. Under det gångna året har dessutom två fall av intersexuella i den företagsinterna R. muscosa -populationen dokumenterats. Dessutom har utvecklingen av tumme kuddar noterats på några av de äldre grundande honor. Orsakerna till detta är för närvarande under utredning men initiala resultat tyder på att det kan avse förändringar i testosteronnivåer (Calatayud, opublicerade). Kräsna hormonella cykler hos kvinnor i olika åldrar kommer att hjälpa oss att förstå varför honor kan utveckla manliga-associerade sekundära sexuella egenskaper och om detta är att förväntas i en åldrande befolkning.

Exogent hormonbehandling har använts för att övervinna reproduktiv dysfunktioner som ofta påträffas i fångenskap amfibier. Emellertid, för både R. muscosa och Necturus populationer i denna studie, inga signifikanta skillnader i oviposition mellan hormon-behandlade och kontroll kvinnor upptäcktes under en 2 och 5-års period av tid, respektive. Detta kan tyda på att hormon administration protokoll, doser, priming och hormon kombination som används inte var tillräcklig för arten. Närmare analys av enskilda kvinnliga reproduktiva historier antyder R. muscosa får inte uppleva årlig avel, som också kan redogöra för bristen på hormonell effekt observerades hos behandlade honor. Eftersom en viss andel av kvinnor konsekvent hoppade avel varje år, förstå den naturliga historia av arterna kan hjälpa till att avgöra om det finns ett behov av exogena hormoner och när de kan vara mest effektiva. De förfaranden som beskrivs i denna artikel kan tillämpas på ett antal arter, (tabell 1) och är för anurans som sträcker sig från 5 g till 150 g; större djur kan kräva olika sprutor och nålmätare. Placeringen av injektionen varierar med vissa hormoner som kräver intramuskulös, Intra-peritoneal, sub-kutan eller intradermal injektion (figur 7).

Kirurgi i syfte att ovariektomi är en vanlig metod som används i olika amfibo arter för att få oocyter för embryologiska studier. Ovariektomi kan också anges för befolkningskontroll och medicinska problem såsom ägg retention. Vid partiella ovariektomi där äggcell skörd utförs i forskningssyfte måste kirurgi säkerställa att djuret förblir reproduktivt. Administrering av PGF2α har visat några löfte att lösa ägg retention i kvinnlig R. muscosa. Hos flera individer, PGF2α framkallade fullständig avsättning av tidigare bevarade ägg, men i andra endast partiell deposition inträffade kräver manuell strippning för att ta bort alla ägg. Medan PGF2 α kan fungera som ett alternativ till kirurgi för ägg retention i R. muscosa, dess förmåga att avhjälpa liknande patologiska förhållanden i andra amfibier kommer att kräva artspecifika validering. När kirurgiska ingrepp är i uppdrag för Anuran eller Caudate patienten, är det nödvändigt att säkerställa ett adekvat plan av anestesi innan snitt görs. Skarpsinnig observation färdigheter behövs för att bedöma och övervaka de normativa induktion och återhämtning svar som beskrivs i denna studie för varje taxa. När man är bekant med den specifika anatomin, en lämplig kirurgisk strategi, hemostas, mild vävnads manipulation och adekvat postoperativ hantering, reproduktiv operationer utgör inga överväldigande hinder.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Natalie Calatayud vill tacka Dr Barbara Durrant för utbildning och hjälp med ultraljud och Exploradora de immuebles, S.A. (EISA) för att bevilja ekonomiskt stöd till min forskarassistent position på SDZG. Tack till Dr Kylie Cane för kommentarer till manuskriptet samt till de officiella granskarna (vem de än kan vara). Tack till Jonathan Dain vår 2018 sommar Fellow, San Diego Zoo Institutet för bevarande forskning för att tillhandahålla bilder (figur 1a, B). Monica Stoops förlänger uppskattning till föreningen för djurparker och akvarier bevarande kapital fond och Disney Worldwide Conservation Fund för att ge ekonomiskt stöd för att etablera fångenskap Necturus befolkningen. Dessutom, stöd mottogs också genom privata donationer från amfile advokat MS Iris de La Motte. Tack, ges till Mr Christopher DeChant och Dr Mark Campbell för deras betydande bidrag till forskningen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GE logiq Book XP and 8C-RS probe 4e10 MHz GE Medical Systems GE medical systems GE logiq Book XP Ultrasound
Aloka 500 7.5mHz linear or IBEX multi-frequency (10-6mHz) micro-convex GE medical systems 8C-RS (10 MHz) Ultrasound probe
BD disposable U-100 insulin syringe (28-29 G needle) Mettler Electronics Corp CA Sonigel Ultrasound gel (water soluble, salt-free)
Hormone
Gonadotropin releasing hormone BACHEM 4012028 synonym: [Des-Gly10, D-Ala6, Pro-NHEt9]-GnRH acetate
abbreviation: GnRH
Lutenizing hormone releasing hormone BACHEM, Sigma-Aldrich 4033013;     L1898 synonym: Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 acetate salt;
[D-Ala6}-LHRH acetate salt hydrate
abbreviation: LHRH
Human chorionic gonadotropin BACHEM, Sigma-Aldrich 4030270, 4018894; C1063, CG5, CG10 synonym: Chorionic gonadotropin-β (109-145)(109-119); Choriogonin, HCG (2,500IU, 5,000IU, 10,000IU)
abbreviation: hCG
Prostaglandin 2α Sigma-Aldrich P40424; synonym: (5Z,9α,11α,13E,15S)-9,11,15-Trihydroxyprosta-5,13-dienoic acid tris salt, PGF2α−Tris;
abbreviation: PGF2α
Follicle-stimulating hormone Sigma-Aldrich F4021, F8174 synonym: porcine, sheep
abbreviation: FSH
Progesterone Sigma-Aldrich 46665;      P7556 synonym: Vetranal; P4 water soluble
abbreviation: P4
Pituitary extract na synonym: Check papers for amphibian species derivation
abbreviation: PE
Pregnant Mare Serum Gonadotropin Prospec;       Lee Biosolutions; Sigma-Aldrich HOR-272;    493-10; 9002-70-4 synonym: Pregnant Mare Serum Gonadotropin
abbreviation: PMSG
Metaclopromide Sigma-Aldrich M0763 synonym: 4-Amino-5-chloro-N-[2-(diethylamino)ethyl]-2-methoxybenzamide, Methoxychloroprocainamide
abbreviation: MET
Lucrin BACHEM; Sigma-Aldrich 4033014;   L0399 synonym: Leuprorelin acetate
abbreviation: Lucrin
Lutalyse Pfizer synonym: PGF2α - Dinoprost tromethamine
abbreviation: Lut
Pimozide Sigma-Aldrich P1793 synonym: 1-[1-[4,4-bis(4-Fluorophenyl)butyl]-4-piperidinyl]-1,3-dihydro-2H-benzimidazol-2-one
abbreviation: PZ
Amphiplex see above synonym: Gonadotropin releasing hormone + metoclopramide
abbreviation: GnRH + MET
Ovopel Ovopel na synonym: GnRHa + dopamine receptor antagonist (administered 1 pellet/ kg)
abbreviation: Ovo
Ovaprim Pentair aquatic eco-systems Ova10 synonym: Salmon gonadotropin + domperidone
abbreviation: Ova
Domperidone Sigma-Aldrich D122 synonym: 4-(5-Chloro-2-oxo-1-benzimidazolinyl)-1-[3-(2-oxobenzimidazolinyl)propyl]piperidine
abbreviation: DOM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Conde, D. A., Flesness, N., Colchero, F., Jones, O. R., Scheuerlein, A. An emerging role of zoos to conserve biodiversity. Science. 331 (6023), 1390-1391 (2011).
  2. Conde, D. A., et al. Zoos through the Lens of the IUCN Red List: A Global Metapopulation Approach to Support Conservation Breeding Programs. PLoS ONE. 8 (12), e80311 (2013).
  3. Morrison, C., Hero, J. -M. Geographic variation in life-history characteristics of amphibians: a review. Journal of Animal Ecology. 72 (2), 270-279 (2003).
  4. Calatayud, N. E., Stoops, M., Durrant, B. S. Ovarian control and monitoring in amphibians. Theriogenology. , 70-81 (2018).
  5. National Research Council. Institutional Animal Care and Use Committee Guidebook. , (2010).
  6. Peig, J., Green, A. J. New perspectives for estimating body condition from mass/length data: the scaled mass index as an alternative method. Oikos. 118 (12), 1883-1891 (2009).
  7. Graham, K. M., Langhorne, C. J., Vance, C. K., Willard, S. T., Kouba, A. J. Ultrasound imaging improves hormone therapy strategies for induction of ovulation and in vitro fertilization in the endangered dusky gopher frog (Lithobates sevosa). Conservation Physiology. 6 (1), coy020 (2018).
  8. Wright, K. M., Whitaker, B. R. Amphibian Medicine and Captive Husbandry. , Krieger Publishing Company. (2001).
  9. Forzán, M. J., Vanderstichel, R. V., Ogbuah, C. T., Barta, J. R., Smith, T. G. Blood collection from the facial (maxillary)/musculo-cutaneous vein in true frogs (family Ranidae). Journal of Wildlife Diseases. 48 (1), 176-180 (2012).
  10. Allender, M. C., Fry, M. M. Amphibian hematology. Veterinary Clinics of North America: Exotic Animal Practice. 11 (3), 463-480 (2008).
  11. Green, S. L., Parker, J., Davis, C., Bouley, D. M. Ovarian hyperstimulation syndrome in gonadotropin-treated laboratory South African clawed frogs (Xenopus laevis). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 46 (3), 64-67 (2007).
  12. Jorgensen, C. B. External and internal control of patterns of feeding, growth and gonadal function in a temperate zone anuran, the toad Bufo bufo. Journal of Zoology. 210 (2), 211-241 (1986).
  13. Jørgensen, C. B. Growth and reproduction. Environmental Physiology of the Amphibians. , 439-466 (1992).
  14. Vu, M., Trudeau, V. L. Neuroendocrine control of spawning in amphibians and its practical applications. General and Comparative Endocrinology. 234, 28-39 (2016).
  15. Clulow, J., Trudeau, V. L., Kouba, A. J. Amphibian declines in the twenty-first century: why we need assisted reproductive technologies. Reproductive Sciences in Animal Conservation. , 275-316 (2014).
  16. Kouba, A., et al. Assisted reproductive technologies (ART) for amphibians. Amphibian Husbandry Resource Guide. 2, 60-118 (2012).
  17. Clulow, J., et al. Optimisation of an oviposition protocol employing human chorionic and pregnant mare serum gonadotropins in the Barred Frog Mixophyes fasciolatus (Myobatrachidae). Reproductive Biology and Endocrinology. 10 (1), 60 (2012).
  18. Browne, R. K., Seratt, J., Vance, C., Kouba, A. Hormonal priming, induction of ovulation and in-vitro fertilization of the endangered Wyoming toad (Bufo baxteri). Reproductive Biology and Endocrinology. 4 (1), 34 (2006).
  19. Calatayud, N. E., et al. A hormone priming regimen and hibernation affect oviposition in the boreal toad (Anaxyrus boreas boreas). Theriogenology. 84 (4), 600-607 (2015).
  20. Stoops, M. A., Campbell, M. K., Dechant, C. J. Successful captive breeding of Necturus beyeri through manipulation of environmental cues and exogenous hormone administration: a model for endangered Necturus. Herpetological Review. 45 (2), 251-256 (2014).
  21. Mc Creery, B. R., Licht, P. Induced ovulation and changes in pituitary responsiveness to continuous infusion of gonadotropin-releasing hormone during the ovarian cycle in the bullfrog, Rana catesbeiana. Biology of Reproduction. 29 (4), 863-871 (1983).
  22. Johnson, C. J., Vance, C. K., Roth, T. L., Kouba, A. J. Oviposition and ultrasound monitoring of American toads (Bufo americanus) treated with exogenous hormones. Proceedings of the American Association of Zoo Veterinarians. 299, 301 (2002).
  23. Herbert, D. Studies of assisted reproduction in the spotted grass frog Limnodynastes tasmaniensis: ovulation, early development and microinjection (ICSI). , (2004).
  24. Michael, S. F., Buckley, C., Toro, E., Estrada, A. R., Vincent, S. Induced ovulation and egg deposition in the direct developing anuran Eleutherodactylus coqui. Reproductive Biology and Endocrinology. 2, 6 (2004).
  25. Ogawa, A., Dake, J., Iwashina, Y., Tokumoto, T. Induction of ovulation in Xenopus without hCG injection: the effect of adding steroids into the aquatic environment. Reproductive Biology and Endocrinology. 9 (1), 11 (2011).
  26. Silla, A. J. Effects of luteinizing hormone-releasing hormone and arginine-vasotocin on the sperm-release response of Günther’s Toadlet, Pseudophryne guentheri. Reproductive Biology and Endocrinology. 8 (1), 139 (2010).
  27. Trudeau, V. L., et al. Hormonal induction of spawning in 4 species of frogs by coinjection with a gonadotropin-releasing hormone agonist and a dopamine antagonist. Reproductive Biology and Endocrinology. 8 (1), 36 (2010).
  28. Krause, E. T., von Engelhardt, N., Steinfartz, S., Trosien, R., Caspers, B. A. Ultrasonography as a minimally invasive method to assess pregnancy in the fire salamanders (Salamandra salamandra). Salamandra. 49, 211-214 (2013).
  29. Browne, R. K., Li, H., Seratt, J., Kouba, A. Progesterone improves the number and quality of hormone induced Fowler toad (Bufo fowleri) oocytes. Reproductive Biology and Endocrinology. 4 (1), 3 (2006).
  30. Bramucci, M., et al. Different modulation of steroidogenesis and prostaglandin production in frog ovary in vitro by ACE and ANG II. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 273 (6), R2089-R2096 (1997).
  31. Gobbetti, A., Zerani, M. Possible roles for prostaglandins E2 and F2α in seasonal changes in ovarian steroidogenesis in the frog (Rana esculenta). Journal of Reproduction and Fertility. 98 (1), 27-32 (1993).
  32. Gobbetti, A., Zerani, M., Carnevali, O., Botte, V. Prostaglandin F2α in female water frog, Rana esculenta: Plasma levels during the annual cycle and effects of exogenous PGF2α on circulating sex hormones. General and Comparative Endocrinology. 80 (2), 175-180 (1990).
  33. Guillette, L. J. Jr, Dubois, D. H., Cree, A. Prostaglandins, oviducal function, and parturient behavior in nonmammalian vertebrates. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 260 (5), R854-R861 (1991).
  34. Clulow, J., Mahony, M., Browne, R., Pomering, M., Clark, A. Applications of assisted reproductive technologies (ART) to endangered anuran amphibians. Declines and Disappearances of Australian Frogs'. Campbell, A. , 219-225 (1999).
  35. Browne, R. K., Wolfram, K., García, G., Bagaturov, M. F., Pereboom, Z. Zoo-based amphibian research and conservation breeding programs. Amphibian and Reptile Conservation. 5 (3), 1-14 (2011).
  36. Chai, N. Surgery in amphibians. Veterinary Clinics: Exotic Animal Practice. 19 (1), 77-95 (2016).
  37. Gentz, E. J. Medicine and surgery of amphibians. Ilar Journal. 48 (3), 255-259 (2007).
  38. Snyder, W. E., Trudeau, V. L., Loskutoff, N. M. 168 a noninvasive, transdermal absorption approach for exogenous hormone induction of spawning in the northern cricket frog, Acris crepitans: a model for small, endangered amphibians. Reproduction, Fertility and Development. 25 (1), 232-233 (2012).
  39. Kouba, A. J., et al. Emerging trends for biobanking amphibian genetic resources: the hope, reality and challenges for the next decade. Biological Conservation. 164, 10-21 (2013).
  40. Michael, S. F., Buckley, C., Toro, E., Estrada, A. R., Vincent, S. Induced ovulation and egg deposition in the direct developing anuran Eleutherodactylus coqui. Reproductive Biology and Endocrinology. 2 (1), 6 (2004).
  41. Fort, D. J. Frog reproduction and development study 2000 rana pipiens reproduction and development study. , Environmental Protection Agency. (2003).
  42. Clulow, J., et al. Differential success in obtaining gametes between male and female Australian temperate frogs by hormonal review: A Review. General and Comparative Endocrinology. 265, 141-148 (2018).
  43. Trottier, T. M., Armstrong, J. B. Diploid gynogenesis in the Mexican axolotl. Genetics. 83 (4), 783-792 (1976).
  44. Marcec, R. M. Development of assisted reproductive technologies for endangered North American salamanders. , Mississippi State University. (2016).
  45. Wright, M. L. Melatonin, diel rhythms, and metamorphosis in anuran amphibians. General and Comparative Endocrinology. 4, (2002).

Tags

Biologi Circadian ägg retention celiotomi exogena hormoner ultraljud och ovariektomi.
Reproduktionsteknik för ovariell övervakning och kontroll i amfibier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Calatayud, N. E., Chai, N., Gardner, … More

Calatayud, N. E., Chai, N., Gardner, N. R., Curtis, M. J., Stoops, M. A. Reproductive Techniques for Ovarian Monitoring and Control in Amphibians. J. Vis. Exp. (147), e58675, doi:10.3791/58675 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter