Summary
Vi demonstrera användningen av diskontinuerlig täthetlutningar att skilja bakteriell populationer baserat på kapsel produktion. Denna metod används för att jämföra kapsel belopp mellan kulturer, isolera mutanter med en specifik kapsel fenotyp, eller för att identifiera kapsel regulatorer. Beskrivs här är optimering och driften av analysen.
Abstract
Kapseln är en nyckel virulens faktor i många bakteriearter, medla immun skatteflykt och motståndskraft mot olika fysiska påfrestningar. Medan det finns många metoder för att kvantifiera och jämföra kapsel produktion mellan olika stammar eller mutanter, det finns ingen allmänt använd metod för sortering av bakterier baserat på hur mycket capsule de producerar. Vi har utvecklat en metod att separera bakterier genom kapsel belopp, med hjälp av en diskontinuerlig täthetlutning. Denna metod används för att jämföra kapsel semi kvantitativt mellan kulturer, att isolera mutanter med förändrad kapsel produktion och att rena capsulated bakterier från komplexa prover. Denna metod kan också kopplas till transposon-införande sekvensering att identifiera gener som är inblandade i kapsel. Här demonstreras metoden i detalj, inklusive hur du optimerar gradient villkoren för en ny bakterieart eller stam, och hur att bygga och köra täthetlutningen.
Introduction
Många bakteriearter producera en polysackarid kapsel, som skyddar bakteriecell från olika fysiska påfrestningar och erkännande och dödandet av immunsystemet. I Klebsiella pneumoniaeär kapsel produktion ett absolut krav för infektion1,2. K. pneumoniae kapsel förmedlar resistens mot antimikrobiella peptider, resistens mot komplement-medierad dödande förebyggande av fagocytos, och undertryckande av de medfödda immunsvar3. Kapselns överproduktion är associerade med ökad virulens och samhällsförvärvad (i stället för nosokomial) infektioner4.
Ett urval av kvantitativa och kvalitativa tester finns att undersöka kapsel produktion. För Klebsiella arter inkluderar dessa den sträng test5, där en tandpetare som rörde till en koloni dras uppåt och längden på strängen produceras mätt, och mucoviscosity assay6, vilket innebär en långsam centrifugering av en kultur som följt genom att mäta den optiska densiteten av supernatanten. Dessa metoder är enkel och snabb, men saknar känslighet när det används på klassiskt Klebsiella stammar snarare än kapsel overproducing stammar. En annan metod av kapsel kvantifiering är uronic syra analysen, som är tekniskt krävande och kräver användning av koncentrerad svavelsyra1. Slutligen, kapsel är synliga direkt av mikroskopi (figur 1A). Dessa metoder, endast mikroskopi tillåter användaren att iaktta olika implantatfickan stater inom en enda population, och ingen av dessa metoder gör den fysiska separationen av capsulated och icke-capsulated bakterier.
Densitet-baserade separationer av gradient centrifugering används rutinmässigt i cellbiologi för att rena olika eukaryot cell typer7, men används sällan i mikrobiologisk forskning. Mucoviscosity analysen för Klebsiella bygger på observationen att mycket capsulated bakterier ta mer tid till pellet genom centrifugering, och vi resonerade att detta kan bero på minskad totala tätheten av capsulated celler. Den metod som visas här har utvecklats för att separera K. pneumoniae populationer fysiskt av kapsel belopp, med täthet lutning centrifugering (figur 1). Denna metod tillämpades framgångsrikt Streptococcus pneumoniae, vilket indikerar att den är tillämplig på andra bakteriearter. Täthetlutning separation av en mättad transposon mutant bibliotek tillsammans med transposon-införande sekvensering (densitet-TraDISort) har använts för att identifiera gener som är involverade i kapsel produktion och förordning8. Likaså denna metod användes i samband med slumpmässiga-prime polymeras-kedjereaktion (PCR) av enskilda kolonier för att isolera icke-capsulated K. pneumoniae mutanter. Denna metod kan också användas för snabba jämförelser i Kapselns produktion mellan olika populationer och villkor, eller att rena capsulated bakterier från komplexa prover (figur 1B). Slutligen finns det alternativet till assay andra fenotyper som påverkar densitet, såsom Cellstorlek eller aggregering.
Detta manuskript hur du optimerar för en ny bakterieart eller stam och visar konstruktion och drift av en diskontinuerlig täthetlutning att skilja hyper-capsulated, capsulated och icke-capsulated bakterier.
Protocol
Obs: Se till att eventuella riskbedömningar som är tillämpliga på bakteriestammar följs när odling och hantering av prover. Tänk på att ställa in alltför många övertoningar i taget kan leda till belastningsskador på grund av trycket på inblandade lederna från den långsam pipettering. Planera arbete och vidta försiktighetsåtgärder för att undvika skada.
1. beredning av bakteriestammar eller muterade bibliotek
-
Strimma ut stammarna som ska testas på lämpligt agarplattor. Dessa är lager plattor för experimentet.
- Inkubera plattorna över natten vid önskad temperatur att uppnå enstaka kolonier. För detta experiment, kultur K. pneumoniae (NTUH-K2044 och ATCC43816 stammar) på Luria buljong (LB) agar vid 37 ° C och S. pneumoniae (23F vildtyp och 23F Δcps) på blodagar i en fuktad candle jar vid 37 ° C.
-
Plocka en enda koloni från en stock tallrik (steg 1.1) att Inokulera 10 mL lämplig buljong med en steril ögla eller cocktail stick. För screening av slumpmässiga mutant bibliotek, Inokulera buljong med 10 µL av slumpmässiga mutant bibliotek beståndet (TraDIS bibliotek).
- Inkubera K. pneumoniae -stammar i låg salt LB media vid 37 ° C med skakningar och S. pneumoniae -stammar i hjärnan hjärtat infusion (BHI) media, statiskt vid 37 ° C.
- Överföra den nattliga kulturen till en 15 mL rör och Centrifugera i en bänk Centrifugera i 10 min vid 3,200 x g i utsvängbar hinkar med 15 mL röret skär och aerosol lufttäta lock.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 2 mL 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
Obs: Kassera supernatanten via lämplig flytande biologiskt avfall rutt i laboratoriet. Syftet med centrifugering och resuspension stegen (1.2.2 och 1.2.3) är att koncentrera sig bakterierna för enkel visualisering på övertoningen. Bakteriekulturer kan laddas direkt på övertoningen om föredrog. Tungt capsulated stammar kan inte bilda en tight pellet. Om detta inträffar, ta bort så mycket supernatanten som möjligt utan att ta bort eventuella bakterieceller, Lägg till 1 x PBS till en slutlig volym av 5 mL och återsuspendera pelleten. Fortsätta protokollet med steg 1.2.5. - För icke-slemmig stammar, gå till steg 2.
- Centrifugera rören som beskrivs i steg 1.2.2.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 2 mL 1 x PBS. Cellerna är nu redo att använda.
Obs: Tätheten av bakteriell cellsuspensionen är inte kritisk men måste vara tillräcklig för visualisering i övertoningen. En minsta OD600 (optisk densitet vid 600 nm) av 4 föreslås.
2. beredning av Gradient utspädningar och mini gradient Test
-
Förbereda gradient utspädningar.
Obs: Exakta koncentrationer av täthet lutning medium (t.ex., Percoll) behövs i densitetsgradienter för att uppnå god separation skiljer sig beroende på bakteriell stam och tillväxt används. Mini gradient tester utförs först, för att identifiera de koncentrationer som ger den bästa separationen. Dessa omfattar 500 µL av en enda spädning i en 2 mL tub. Om bakterier kommer att utvinnas från toningen och subkultiveras för nedströms tillämpningar, bör dessa åtgärder utföras under aseptiska förhållanden.- Kombinera täthet lutning medium med 1 x PBS att göra täthet lutning spädningarna. Göra spädningar av 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% och 80% (t.ex., 2 mL av täthet lutning medium plus 8 mL 1 x PBS = 10 mL 20% täthet lutning medium).
- Alikvotens 500 µL 20% lutning utspädningen i en 2 mL tub för varje stam ska testas (t.ex., 4 stammar = 4 rör som innehåller 500 µL 20% lutning utspädning).
- Upprepa steg 2.1.2 för resten av gradient spädningarna.
-
Tillämpa bakterier på övertoningen.
- Tillsätt 100 µL av bakterieceller som förberett i steg 1.2.3 och 1.2.6 till toppen av varje övertoning utspädning följa stegen nedan.
- Ta upp 100 µL av celler med 200 µL pipett och placera pipettspetsen på sidan av röret strax under menisken mini lutning.
- Aspirera bakteriecellerna på övertoningen extremt långsamt så att de bildar ett lager på toppen av övertoningen, utan någon blandning av gränssnittet.
- Upprepa steg 2.2.1.1–2.2.1.2 för alla stammar ska testas.
- Med en fast vinkel rotor med en aerosol tätt lock, Centrifugera beredda rören i en mikrocentrifug för 10 min vid 8000 x g.
- Efter centrifugering, överföra rören till ett rack att visualisera den minsta lutning spädning krävs att behålla cellerna ovanför gradient lagret efter centrifugering.
- Om resultaten inte är klar, upprepa mini gradient testet med steg om 5% täthet lutning medium utspädningar ovan och nedanför de koncentrationer som anges i steg 2.1.1 (t.ex., 25% och 35% utspädningar ska provas om resultatet vid 30% är tvetydigt).
Obs: Se figur 2A för typiska resultat vid en enda densitet gradient medium spädning. - Använda resultaten från steg 2.2.3–2.2.4 för att avgöra de perfekt lutning utspädningarna att använda för att separera celler i större skala diskontinuerligt övertoningar.
- Tillsätt 100 µL av bakterieceller som förberett i steg 1.2.3 och 1.2.6 till toppen av varje övertoning utspädning följa stegen nedan.
3. beredning av celler för det viktigaste experimentet
-
Förbereda färska övernattning kulturer genom ympning 10 mL lämplig buljong som beskrivs i steg 1.2.
- Inkubera kulturerna övernattning i lämpliga villkor som beskrivs i steg 1.2.1.
- Pellets över natten kultur som beskrivs i steg 1.2.2.
- Tvätta cellerna som beskrivs i steg 1.2.3.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 1 mL 1 x PBS. Om stammen är slemmig och inte pellet enkelt, återsuspendera pelleten i upp till 2 mL PBS eller kvarstående media. Cellerna är nu redo att använda.
4. beredning av diskontinuerlig täthetlutningar
Obs: En alternativ metod för gradient förberedelse från botten (mest koncentrerade) till toppen (minst koncentrerade) med pipett beskrivs i steg 7.
-
Pipett 1 mL av den utspädda täthet lutning i en 5 mL polypropylen runt botten rör bildar den högsta, mest spädda, lagret av övertoningen.
Obs: efterföljande lager av mer koncentrerad toning spädningar kommer att läggas under detta lagret med hjälp av en nål, så att inte störa lagren. Minst två och högst tre gradient lager av 1 mL varje rekommenderas för robust separation och enkel visualisering av bakterier.- Med en 1 mL engångsspruta med en 1,5 tums sprutspets, ta 1 mL av nästa mest koncentrerade täthet lutning medium i sprutan. Undvika att ta upp någon luft, som bubblor kan störa gradient lagren.
- Placera nålen änden på botten av röret som innehåller det första lagret. Aspirera spruta innehållet mycket långsamt för att undvika att blanda gränssnittet.
Obs: Gränssnittet för de två utspädningarna stiger mer koncentrerad toning utspädning läggs. Respektera gränssnittet genom håller upp ljus eller en utanför fönstret. Om ingen distinkt gränssnitt observeras, kassera toningen och starta igen.- Ta bort nålen från övertoningens mycket försiktigt så att inte störa gränssnittet mellan olika gradient spädningarna. Placera röret i en lämplig rack för att hålla den upprätt.
- Om du använder tre olika spädningar, upprepa steg 4.1.1–4.1.2.1 så att den tätaste utspädningen är längst. Om övertoningen har konstruerats framgångsrikt, kommer det att finnas tre distinkta lager med ingen blandning vid gränssnitten.
5. lägga till beredda celler till lutningar och Separation genom centrifugering
- Tillsätt 600 µL beredda celler från steg 3.3 till toppen av lutningen i röret mycket långsamt och utan att blanda gränssnittet, som beskrivs i steg 2.2.
-
Placera rören i tube adaptrar och väger kombinerade adaptrar och rör för att säkerställa att de är balanserade.
- Placera röret korten i en fast vinkel rotor inom en Bänkcentrifug. Centrifugera under 30 minuter vid 3 000 x g.
- Efter centrifugering, noggrant bort rören, placera dem i en lämplig rack och fotografera resultatet som en post.
-
Återställa de bakteriella fraktionerna för uronic syra kvantifiering eller DNA-extraktion genom att följa steg 6.
- Om nedströms tillämpningar inte krävs, släng den prover/övertoningar via lämplig flytande biologiskt avfall rutt i laboratoriet.
Obs: Det är viktigt att validera separationen för nya arter/stammar av bakterier. Enskilda fraktioner från lutningen bör undersökas genom mikroskopi, av uronic syra assay (steg 8), eller en annan lämplig kvantitativ analys att bekräfta kapsel fenotypen av respektive fraktion. Om syftet är att skilja utifrån aggregering eller Cellstorlek, bör oberoende lämpliga analyser användas.
- Om nedströms tillämpningar inte krävs, släng den prover/övertoningar via lämplig flytande biologiskt avfall rutt i laboratoriet.
6. återställa prov fraktioner och valfria utväxt steg
-
Återställa fraktioner från en övertoning genom att ta bort och kasta någon vätska från den högsta utspädningen om ingen bakteriedelen finns inom lagret.
- Ta bort den översta fraktionen, använda P200 pipett och försiktigt passera pipettspetsen genom lutningen till bråket, och ta upp bråket. Placera fraktionen i en 1,5 mL tub och märk på lämpligt sätt.
- För att återställa ytterligare bråk, fortfarande använder P200 pipetten, infoga det tip försiktigt genom lutningen till bråket och återställa fraktionen till en fräsch 1,5 mL tub. Ta bort överflödigt gradient fraktioner lägre ner toningen är nås.
- Om DNA-extraktion från en bråkdel som innehåller mycket låga cell nummer krävs (t.ex. för densitet-TraDISort), subkultur bråket genom att följa protokollet från steg 6,2 för valfria utväxt att få fler celler.
Obs: Det blir en låg nivå av överföring från celler överst på övertoningen i lägre fraktioner, som fraktioner tas bort från topp till botten. Minimera detta genom att arbeta noggrant så att inte blanda övertoningen, genom att använda en nål att ta bort nedre fraktioner, och genom att utföra re-rening av mycket låg överflöd prover där överföring kan påverka resultaten.
-
Överföring celler från den låg-överflöd fraktionen i steg 6.1.1–6.1.2 i 5 mL lämplig flytande media. Placera i en inkubator och växa för 2 h vid 37 ° C.
- Efter 2 h av tillväxt eller när provet nått en OD600 1, överföra kulturen till en 15 mL tub. Centrifugera röret för 10 min vid 3,200 x g i en centrifug med utsvängbar hinkar och aerosol lufttäta lock. Tag bort supernatanten
- Återsuspendera cellpelleten i 1 mL 1 x PBS.
-
Förbereda en färsk singel-koncentration täthetlutning i en 5 mL polypropylen rör. Använda övertoning koncentration från precis ovanför platsen för fraktionen i den ursprungliga lutningen (t.ex. för rening av ΔslyA mutant visas i figur 2D, 15% täthet lutning medium skulle användas).
Obs: detta re-reningssteg är valfritt.- Tillämpa cellerna till toppen av lutning och centrifug som beskrivs i steg 2.2 och 5.1.
- Ta bort rören från centrifugen och placera i en lämplig rack. Fotografera toningen och återställa fraktionen för DNA-extraktion som beskrivs i 6.1 – 6.1.2.
Obs: Provet är nu redo för DNA-extraktion eller andra nedströms program.
7. alternativa metoden för Gradient från botten (mest koncentrerade) till toppen (minst koncentrerade) med pipett
-
Använd de lutning utspädningar som anges i steg 2.2.3. Med 1000 µL pipett, tillsätt 1 mL av den tätaste gradient utspädningen till en 5 mL tub.
- Med 200 µL pipett tillsätt 200 µL av nästa tät gradient utspädning mycket långsamt till toppen av lagret i röret, så att inte blanda gränssnittet. Lägga till en annan 200 µL och sedan den sista 600 µL. lägga till flera mindre volymer ger mer kontroll över pipettering hastighet och förhindrar blandning av gränssnittet. Om gränssnittet mixar, kasta och börja om igen.
- Upprepa steg 7.1.1 med tredje, minst tät gradient koncentrationen om tre utspädningar som används. Röret bör nu ha övertoningar antingen 2 mL eller 3 mL beroende på resultatet från steg 2.2.3.
- Gå till steg 5 i protokollet att lägga till celler och fortsätta experimentet.
8. mätning av kapsel mängden Uronic syra Assay
- Justera den OD600 varje återvunna fraktionen till 4.0 genom utspädning med PBS. Fortsätt med kvantifiering av uronic syror som tidigare publicerade1.
Representative Results
Representativa resultat visas i figur 2. Det exakta resultatet att förvänta sig beror på bakteriearter, utformningen av täthetlutningar, och om användaren undersöker en enda stam eller en pool av mutanter. De flesta stammar kommer att migrera till en enda plats inom en lutning, som visas i figur 2A och 2D. Tillämpa metoden på en bakteriell mutant bibliotek kommer att ge upphov till en större bandet över övertoningen, ett mindre tät band som distribueras genom det översta lagret av övertoningen, och en mindre acapsular bråkdel längst ned (figur 2B). Dessa fraktioner skiljer sig i kapsel belopp som framgår av en analys för uronic syror (figur 2B). Transposon införande sekvensering av enskilda fraktioner resulterar i tydligt lokalisering av specifika mutanter inom olika gradient fraktioner, som visas för kapsel biosyntes locus av K. pneumoniae ATCC43816 (figur 2C). Representativa resultat för rena kulturer av K. pneumoniae NTUH-K2044 och S. pneumoniae, och olika kapsel biosyntes eller reglerande mutanter, visas i figur 2D.
Figur 1 : Schematisk av metoden densitet centrifugering separera bakterier baserat på kapseln och dess tillämpningar. (A) en elektronmikroskopi bild av en capsulated Klebsiella pneumoniae cell. Kapseln är synlig som ett tätt skikt på utsidan av cellen. (B) tillämpningar av densitet centrifugering till studien av capsulated bakterier. (Bi) Densitet separation kan användas för att generera hög-, låg- och no-kapsel fraktioner av transposon mutant bibliotek och följt av transposon införande sekvensering att definiera gener som påverkar kapsel produktion. (Bii) Rening av capsulated bakterier från en komplex provet. (Biii) Användning av densitet-baserade separation för snabba jämförelser av kapsel beloppet mellan prover. Denna metod kan också visualisering av heterogen kapsel produktion i bakteriell populationer, som visas i (Biii). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Representativa resultat. (A) exempel på utdata från mini gradient tester. Två olika K. pneumoniae -stammar var centrifugeras på 1 mL 15% täthet lutning medium. Hypermucoviscous NTUH-K2044 stam behålls över täthet lutning medium skiktet, medan ATCC43816 (vilket gör mindre kapsel) migrerar till botten av lagret. (Bi) Användning av en täthetlutning att separera en transposon mutant bibliotek i tre fraktioner. Observera att den nedre fraktionen innehåller en låg andel av mutanter och syns inte på denna bild. (Bii) Validering av olika kapsel belopp i toppen, mitten och botten fraktioner med hjälp av ett test för uronic syror. Celler från översta, mellersta och urvuxna botten fraktioner var isolerade och resuspended i PBS till en OD600 4, sedan kapsel polysackarider utvinns och uronic syror mätt1. (C) exempel densitet-TraDISort resultat. Mutation platser identifieras visas med blå linjer ovanför diagrammet kromosom. Mutanter saknar kapsel kan identifieras som de som finns i ingång biblioteket men är uttömda i övre fraktionen medan att vara berikad i botten fraktionen, som visas här för kapsel biosyntes locus8. (D) ett exempel på användning täthet lutning centrifugering för att jämföra kapsel belopp mellan vildtyp och muterade stammar av K. pneumoniae NTUH-K2044 och S. pneumoniae 23F. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Kapseln är en viktig virulens faktor i många bakteriearter inklusive K. pneumoniae3, Streptococcus pneumoniae9, Acinetobacter10och Neisseria11 arter. Även om det finns olika metoder för kvantifiering och visualisering av bakteriell kapslar, i dagsläget finns ingen allmänt använd metod att fysiskt skilja cellerna capsulated och icke-capsulated. I den här artikeln har vi visat en robust metod för kapsel-baserade separation av bakteriell befolkningar, med flera potentiella tillämpningar i samband med olika uppströms eller nedströms protokoll.
Förekomsten av en yta kapsel kan minska bakteriell cell densiteten, där separation av täthet lutning centrifugering (figur 2D). Vi har validerat denna metod i K. pneumoniae NTUH-K204412 och ATCC4381613 samt Streptococcus pneumoniae 23F14 och dess Δcps mutant15. Denna metod använder Percoll16 som huvudbeståndsdel av täthetlutningen, som är en suspension av belagda kolloidal kiseldioxid partiklar som har låg viskositet och ingen toxicitet mot bakterier - i princip andra ämnen som uppfyller dessa kriterier kan vara för att fastställa täthetlutningen.
Det kan vara svårt att säkerställa att lager av olika densitet blanda inte när konstruera täthetlutningar, och om blandning sker, metoden separation kommer inte att ge rena resultat. Vi har inkluderat två alternativa metoder för att hälla i lutningar, med en nål eller en pipett — båda är effektiva, och vilken metod man använder är helt enkelt en fråga om preferens. För alla åtgärder som involverar pipettering ett ämne (en bakteriesuspension, eller ett mer utspädd gradient lager) ovanför en gradient lagret, kan pipettering flera portioner av mindre volymer göra det lättare att uppnå en skarp gränssnitt utan någon blandning av lager.
En begränsning av detta protokoll är att dess prestanda med andra bakteriearter inte kan garanteras. Det är därför kritisk när man undersöker en ny bakterieart eller stam att validera densitet-baserade separationen med hjälp av en extra, oberoende kapsel kvantifiering. Visualisera bakterierna som finns i respektive fraktion genom mikroskopi med lämpliga kapsel fläckar är en tillförlitlig metod som detaljerade protokollen är tillgängliga17. Alternativt, kapslar innehållande uronic syror (t.ex. de av Escherichia coli och K. pneumoniae) kan kvantifieras med en specifik analysmetod som visas i figur 2B1. Centrifugering-baserade mucoviscosity testet är inte lämplig som en oberoende valideringsmetod, eftersom denna analys beror också på tätheten av bakteriecellerna.
En annan begränsning med denna metod är att kapsel produktion är mycket känslig på kultur och även små förändringar till odlingsmedium, temperatur, eller luftning kan påverka resultaten av denna analys. För att minimera problemet, kan forskare använda en definierad odlingsmedium eller en batch-konsekvent komplexa medium, hålla alla andra tillväxtparametrarna identiska mellan experiment och inkludera lämpliga kontroll stammar för att möjliggöra tolkning av oväntade resultat . Vissa bakteriella kapslar är bräcklig och kan klippa bort från cellen när kulturer är pipetteras. För att undvika den klippning av kapslar, bör kulturer centrifugeras och resuspended högst två gånger under förberedelse för lastning på övertoningen. Om förlust av kapsel under koncentration av kulturerna förblir problematisk, bakteriekulturer kan tillämpas på en täthetlutning direkt, med en större volym av bakteriesuspensionen som lagt till vid behov för visualisering.
Framtida tillämpningar av denna metod är att tillämpa den på andra bakteriearter och använda detta avskiljande i samband med olika uppströms och nedströms tekniker. Utöver densitet-TraDISort8föreslår vi att täthet lutning separation av capsulated bakterier skulle kunna användas för isolering av mutanter med förändrad kapsel, för rening av capsulated celler från blandade kulturer eller komplexa prover, och för snabb profilering av kapsel produktion i flera stammar. Slutligen, denna teknik skulle kunna användas att undersöka andra bakteriella fenotyper såsom aggregering.
Disclosures
Författarna har inga ekonomiska intressen att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Jin-Town Wang och Susannah Salter för att leverera stammar och medlemmar i gruppen Parkhill för bra diskussioner. Detta arbete finansierades av Wellcome Sanger Institute (Wellcome grant 206194), och genom en Sir Henry Wellcome postdoktorsstipendium till F.L.S. (grant 106063/A/14/Z). M.J.D. stöds av doktorand Wellcome Sanger Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Centrifuge 5810R with Rotor A-4-81 and 500 mL buckets | Eppendorf | 5810 718.007 | |
| Adapters for 15 mL tubes | Eppendorf | 5810 722.004 | |
| Fixed andgle rotor F-34-6-38 | Eppendorf | 5804 727.002 | |
| 2.6 to 7 mL tube adapter | Eppendorf | 5804 739.000 | |
| Centrifuge 5424 including Rotor FA-45-24-11 | Eppendorf | 5424 000.460 | |
| 2 mL tubes | Eppendorf | 0030 120.094 | |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | |
| 5 mL polypropylene round bottom tube | Falcon | 352063 | |
| 1 mL disposable syringe Luer slip | Becton Dickinson | 300013 | |
| AGANI Needle 21G Green x 1.5" | Terumo | AN 2138R1 | |
| P1000 pipette and tips | |||
| P200 pipette and tips |
References
- Favre-Bonté, S., Licht, T. R., Forestier, C., Krogfelt, K. A. Klebsiella pneumoniae capsule expression is necessary for colonization of large intestines of streptomycin-treated mice. Infection and Immunity. 67 (11), 6152-6156 (1999).
- Bachman, M. A., et al. Genome-wide identification of Klebsiella pneumoniae fitness genes during lung infection. mBio. 6 (3), 1-9 (2015).
- Paczosa, M. K., Mecsas, J. Klebsiella pneumoniae: Going on the offense with a strong defense. Microbiology and Molecular Biology Reviews : MMBR. 80 (3), 629-661 (2016).
- Shon, A. S., Bajwa, R. P. S., Russo, T. A.
- Fang, C. -T., Chuang, Y. -P., Shun, C. -T., Chang, S. -C., Wang, J. -T. A novel virulence gene in Klebsiella pneumoniae. strains causing primary liver abscess and septic metastatic complications. The Journal of Experimental Medicine. 199 (5), 697-705 (2004).
- Lai, Y. -C., Peng, H. -L., Chang, H. -Y. RmpA2, an activator of capsule biosynthesis in Klebsiella pneumoniae CG43, regulates K2 cps gene expression at the transcriptional level. Journal of Bacteriology. 185 (3), 788-800 (2003).
- Menck, K., et al. Isolation of human monocytes by double gradient centrifugation and their differentiation to macrophages in Teflon-coated cell culture bags. Journal of Visualized Experiments. (91), 1-10 (2014).
- Dorman, M. J., Feltwell, T., Goulding, D. A., Parkhill, J., Short, F. L. The capsule regulatory network of Klebsiella pneumoniae defined by density-TraDISort. , (2018).
- Geno, K. A., et al. Pneumococcal capsules and their types: Past, present, and future. Clinical Microbiology Reviews. 28 (3), 871-899 (2015).
- Weber, B. S., Harding, C. M., Feldman, M. F. Pathogenic Acinetobacter: From the cell surface to infinity and beyond. Journal of Bacteriology. 1986 (6), 880-887 (2016).
- Mubaiwa, T. D., Semchenko, E. A., Hartley-Tassell, L. E., Day, C. J., Jennings, M. P., Seib, K. L. The sweet side of the pathogenic Neisseria.: The role of glycan interactions in colonisation and disease. Pathogens and Disease. 75 (5), 1-9 (2017).
- Wu, K. -M. M., et al. Genome sequencing and comparative analysis of Klebsiellapneumoniae. NTUH-K2044, a strain causing liver abscess and meningitis. Journal of Bacteriology. 191 (14), 4492-4501 (2009).
- Broberg, C. A., Wu, W., Cavalcoli, J. D., Miller, V. L., Bachman, M. A. Complete genome sequence of Klebsiellapneumoniae. Strain ATCC 43816 KPPR1, a rifampin-resistant mutant commonly used in animal, genetic, and molecular biology studies. Genome Announcements. 2 (5), (2014).
- Croucher, N. J., et al. Role of conjugative elements in the evolution of the multidrug-resistant pandemic clone Streptococcuspneumoniae Spain23F ST81. Journal of Bacteriology. 191 (5), 1480-1489 (2009).
- Croucher, N. J., et al. Selective and genetic constraints on Pneumococcal serotype switching. PLoS Genetics. 11 (3), 1-21 (2015).
- Pertoft, H., et al. Density gradients prepared from colloidal silica particles coated by polyvinylpyrrolidone (Percoll). Analytical Biochemistry. 88, 271-282 (1978).
- Breakwell, D. P., Moyes, R. B., Reynolds, J. Differential staining of bacteria: Capsule stain. Current Protocols in Microbiology. 15 (1), 1-4 (2009).
