Summary
כאן נתאר עבור פרוטוקול immunoprecipitation היעילה כרומטין (ChIP) ואחריו רצפי DNA תפוקה גבוהה (צ'יפ-seq) של רקמת שומן חום (בת) מבודד מן העכבר. פרוטוקול זה מתאים גם מיפוי היסטון שינויים וגם חוקרים הגנום כולו לוקליזציה של חלבונים היסטון שאינו של הריבית ב vivo.
Abstract
תהליכים תאיים ביותר מוסדרים על ידי אפנון תעתיק של תוכניות גנים ספציפיים. אפנון כזה מושגת באמצעות הפעולות בשילוב של מגוון רחב של גורמי שעתוק (שר), cofactors בתיווכן של תעתיק או דיכוי באמצעות שינויים במבנה כרומטין. Immunoprecipitation כרומטין (ChIP) היא גישה ביולוגיה מולקולרית שימושי עבור מיפוי היסטון שינויים של פרופיל גורמי שעתוק/קשירה ל- DNA cofactors, ובכך לספק תמונת מצב של השינויים הדינמיים גרעיניים המתרחשים במהלך שונים תהליכים ביולוגיים.
ללמוד תקנה תעתיק של רקמת שומן, מונצחים דגימות נגזר במבחנה תרביות תאים של או קווים התא הראשי הם לעיתים קרובות העדיף בתוך השבב מבחני בגלל שפע מתחיל חומר מופחתת השתנות ביולוגי. עם זאת, מודלים אלה לייצג תמונה מוגבלת של המדינה בפועל כרומטין היצורים החיים. לפיכך, יש צורך קריטי עבור פרוטוקולים ממוטבת לבצע שבב על רקמת שומן דגימות שמקורם בבעלי חיים.
כאן נתאר פרוטוקול עבור שבב-seq יעיל של שינויים היסטון והן הלא-היסטון חלבונים בתוך רקמת שומן חום (בת) מבודד מן העכבר. הפרוטוקול ממוטב חוקרים הגנום כולו לוקליזציה של חלבונים של עניין epigenetic סמני המחבט, אשר הוא רקמה מורפולוגית, מבחינה פיזיולוגית ברורים בין המחסנים שומן.
Introduction
בעוד שומן לבן (וואט) מתמחה לאחסון אנרגיה, רקמת שומן חום (בת) כלתה אנרגיה בצורת חום בשל יכולתה כדי להמיר אנרגיה תרמית ויה מיטוכונדריאלי uncoupling1פחמימות ושומנים. בגלל פונקציה מיוחדת זו, בתחנה בת נדרש עבור שמירה על טמפרטורת הגוף בתנאים פיזיולוגיים, בתגובה החשיפה הקרה. בזמן שינויים בביטוי גנים במהלך התמיינות בת ועל הלחץ תרמוגנית נחקרו בהרחבה ויוו, הפריה, המנגנונים המולקולריים שבבסיס שינויים אלה היו בעיקר גזור בקווים תא מונצחים ולא ראשי adipocytes מראש, למעט מספר מחקרים ויוו2,3,4,5.
התקנה של תוכניות ביטוי גנים ספציפיים באמצעות רגולציה תעתיק מושגת על ידי מתואמות לשינויים כרומטין מבנה דרך שעתוק שונים גורמים בשיתוף גורמים פעולות. Immunoprecipitation כרומטין (ChIP) היא גישה ביולוגיה מולקולרית יקר עבור חוקרים הגיוס של גורמים אלה ל- DNA, יצירת פרופיל השינויים הקשורים בנוף כרומטין. גורמי מפתח להצלחת הניסויים שבב כוללים אופטימיזציות של כרומטין ההטיה עקביות לאורך כל מדגמים שונים, זמינות של חומר המוצא נאותה ואיכות, בעיקר, של הנוגדנים ותנאים crosslinking. בעת ביצוע שבב של כל הרקמות, חשוב גם לשקול הטרוגניות של הדגימות ולמטב את פרוטוקול כדי לשפר את היעילות של גרעינים בידוד, עם האחרון להיות צעד רגישים במיוחד בעת עבודה עם רקמת שומן בשל התוכן שומנים בדם גבוהות. למעשה, טכניקות הבידוד המולקולרי של אדיפוז בכל מחסני הם מסובכים על ידי הנוכחות של רמות גבוהות של טריגליצרידים, פרוטוקולים חייב להיות ממוטב כדי להגדיל את כמות בידוד כרומטין. לבסוף, כאשר רצף תפוקה גבוהה מבוצע לאחר בידוד שבב-DNA, העומק רצף הוא קריטי לקביעת מספר פסגות שזוהו בביטחון.
כאן, אנו מתייחסים תקני עבודה והנחיות כלליות לניסויים שבב-seq המומלץ על ידי קידוד ו- modENCODE קונסורציומים6 מומלצות של, אנו מתמקדים תיאור צעד אחר צעד של פרוטוקול אופטימיזציה עבור שבב-seq (BAT). הפרוטוקול המתואר מאפשר בידוד יעיל של כרומטין של רקמת שומן לביצוע ברמת הגנום רצפי DNA מחייב גורמים עם פסגות מוגדרים היטב, כמו גם סימני היסטון עם אותות מתמשכת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
השלבים לטיפול בבעלי חיים של הפרוטוקול אושרו על-ידי של אוניברסיטת בוסטון אכפת לי חיה מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC).
1. יום 1: ניתוח והכנה של בת Immunoprecipitation כרומטין (ChIP)
- המתת חסד עכברים באמצעות תא פחמן דו-חמצני (CO2), ולבצע את הקרע מיד לאחר מכן. תרסיס עכבר פרווה עם 70% אתנול לפני החיתוך. הנח את העכבר עם גבו כלפי מעלה, ואז לחתוך את העור לאורך הצוואר. לאתר את המחבט ישירות מתחת לעור בין הכתפיים (interscapular; נראה כמו שתי אונות, בצורת פרפר, עם שכבה דקה של שמן לבן כי צריך להיות בזהירות להסיר7).
הערה: עבור 3 בן חודש C57BL/6J לעכבר מוזן דיאטה רגילה צ'או (משקל העכבר בטווחים בגיל הזה בין 27 ו-30 g), האונה כל בת היא כ 1 ס"מ. המשקל הכולל של בתחנה בת הוא כ- 0.15 גרם בעכברים גם זכר וגם נקבה. - השתמש בלוח בת 1 בשביל 3 צ ' יפס. רפידות בת מרובים בו זמנית ניתן לעבד עד sonication.
- Crosslink כל עטלף פד ב 10 מ"ל פורמלין באגירה פוספט מלוחים (PBS) המכיל 1% למשך 15 דקות מסתובב ב 150 סל ד בטמפרטורת החדר (RT).
- להרוות crosslinking על-ידי הוספת 2.5 מטר גליצין ריכוז סופי של 125 מ מ עבור 5 דקות, מסתובב ב 150 סל ד-RT.
- להעביר משטח בת 500 µL פירוק היפוטוניק מאגר (10 מ מ HEPES, 1.5 mM MgCl2, 10 מ מ. אשלגן כלורי, 0.5 מ מ DTT, 0.2 מ מ PMSF) ולהוסיף 2 פלדת אל-חלד חרוזים (גודל: 3.2 מ"מ קוטר, ראה טבלה של חומרים) עבור כל משטח בת. השתמש מהמגן רקמות מבוסס-חרוז (ראה טבלה של חומרים) לגרוס את הרקמה.
- התחל עם 5 דקות על מקסימום כוח. אם יש צורך, להאריך את הזמן עד הרקמה הוא הומוגני, תאים בודדים מופרדים. להעביר את הדגימות לתוך צינור חדש צנטריפוגה ב 4 ° C ב 16,000 x g למשך 10 דקות.
- לאחר צנטריפוגה, להעביר את תגובת שיקוע לתוך צינור ולשמור בגדר תא על קרח. Centrifuge את תגובת שיקוע ב 4 ° C ב g 16,000 x 10 דקות למנוע אובדן של ריחוף תאים. למחוק את תגובת שיקוע הסופי, resuspend שני כדורי תא ביחד ב- 300 µL מאגר פירוק מרחביות (מרחביות 1%; EDTA 10 מ"מ; Tris-HCl pH 8, 50 מ"מ) עם 1 x מעכב פרוטאז (ראה טבלה של חומרים). דגירה על קרח למשך 10 דקות.
- Sonicate את lysates כדי להפיק DNA שברי 200-500 בסיס זוגות ארוך. לאחר sonication, הסרת לכלוך על ידי צנטריפוגה 10 דקות ב x 16,000 g ב 4 ° C, בדוק להצלחת sonication באמצעות DNA אלקטרופורזה על ג'ל agarose 1%. עבור ג'ל בגודל בינוני, לרוץ במהירות 120 וולט; הפרדה טובה מושגת לאחר 45 דקות.
הערה: Sonication אופטימיזציה עשויים להידרש כדי להשיג גודל תקין של קטעים. עם sonicator שבחרת (ראה טבלה של חומרים), פעולה זו דורשת 2 פעמים ב W הספק 320 ותדירות-20 קילו-הרץ למשך 10 דקות, באמצעות מחזורים של 30 s ב- 30/s חופש. - לדלל את השבר supernatant 10-fold (נפח סופי הוא 3 מ עבור כל משטח בת) במאגר דילול שבב (מרחביות 0.01%; טריטון 1.1%; EDTA 1.2 מ מ; טריס-HCl pH 8, 16.7 מ מ; NaCl 167 מ מ) עם 1 x מעכב פרוטאז. לשמור הצידה 1% פתרון זה כרומטין (שווה ל- 30 µL עבור 3 מ"ל) כקלט של השבב. להשאיר את הקלט ללילה ב 4 ° C (עד שלב 2.4).
הערה: השבר הנ ל יספק את הפניית קלט על כימות היחסית של החומר immunoprecipitated לעומת כמות הדנ א נוכח בכל מדגם לפני immunoprecipitation. - הוספת נוגדן שבב (ראה טבלה של חומרים עבור נוגדנים משמש כאן כדוגמה) עד 1 מ"ל של כרומטין פתרון דגירה בין לילה ב 4 ° C עם סיבוב. לבצע immunoprecipitation מקבילים עם החיסון מראש המתאימה IgG, אם הם זמינים, או נורמלי IgG מאותו המין (למשל. רגילה ארנב IgG אם הנוגדן מיוצר ארנב). לחלופין, שמור 1 מ"ל של כרומטין פתרון עבור פקד לא-נוגדן.
הערה: הכמות האופטימלית של נוגדן צריך להיקבע השפעול עבור כל נוגדן חדש, אם ריכוז נוגדן לא ידוע. אחרת, 2 – 5 µg של נוגדן הוא ההתחלה סבירה לשימוש. השתמש נוגדנים שבב-כיתה במידת האפשר, או נוגדנים יש מאומתים immunoprecipitation.
2. יום 2: אוסף מתחמי המערכת החיסונית
- להוסיף 50 µL של חלבון A Agarose 50% slurry מתחמי המערכת החיסונית, תקופת דגירה של h 1 ב 4 ° C עם סיבוב ב 150 סל ד.
-
גלולה החרוזים על ידי צנטריפוגה עבור 1 דקות x 100 g ב- 4 מעלות צלזיוס. ביצוע שוטף רציף של החרוזים עם מאגרים של הגדלת לכתחילה.
- ראשית, לשטוף עם מאגר שטיפת מלח נמוכה (150 מ מ NaCl; טריס-HCl pH 8, 20 מ מ; EDTA 2 מ"מ; טריטון-X 1%; מרחביות 0.1%), ולאחר מכן באמצעות מאגר מלח גבוהה לשטוף (500 מ מ NaCl; טריס-HCl pH 8, 20 מ מ; EDTA 2 מ מ, טריטון-X1%; מרחביות 0.1%), ולאחר מכן עם שטיפת LiCl (0.25 M LiCl; טריס-HCl pH 8, 10 מ מ; EDTA 1 מ"מ; Igepal 1%; deoxicholate 1%), ולבסוף עם טה 1 x (טריס-HCl pH 8, 10 מ מ; EDTA).
- לבצע כל שוטף 0.45 מיקרומטר PVDF צנטריפוגלי מסנן בעמודות (טבלה של חומרים) על ידי הראשון מעביר את החרוזים העמודות באמצעות µL 500 שטיפת מלח נמוכה המאגר. גלולה החרוזים העמודות עבור 3 דקות ב x 2500 גרם. למחוק את הזרימה דרך וחזור פעם אחת עבור כל המאגרים שטיפת ברשימה בשלב 2.2.1.
- לאחר השלמת את מנקי, elute את מתחמי המערכת החיסונית על-ידי הוספת µL 300 של • תנאי מאגר 1% מרחביות, M NaHCO 0.13) החרוזים pelleted בעמודות. דגירה-RT במשך 30 דקות על מטרף-400 סל ד. לאסוף את eluate על ידי ספינינג עמודות עבור 3 דקות ב x 2,500 g בשפופרת טריים.
- הפוך את crosslinks על ידי המקננת את eluate ואת תשומות שנאספו בשלב 1.9-65 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
3. יום 3: שחזור של DNA עם פנול/כלורופורם החילוץ
- הוסף µL 300 של פנול: כלורופורם: רשות העתיקות, 1:1 eluate, תשומות. מערבולת 10 s.
- ספין ב 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ב 21,000 x g. להעביר את תגובת שיקוע צינור טריים. להוסיף 3 µL של גליקוגן, 30 µL של 3 מ' סודיום אצטט µL 750 של אתנול 100% קר. מערבולת לחנות ס' 10 ב-80 מעלות צלזיוס במשך שעתיים.
- ספין למטה ב g 21,000 x ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות, לשמור את צניפה, ולמחוק את תגובת שיקוע. צניפה לשטוף עם 1 מ"ל קר 70% EtOH, ולאחר מכן ספין למטה ב 21,000 x g ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק. למחוק את תגובת שיקוע, מילה נהדרת בגדר.
- Resuspend בגדר ב 70 µL של מים נטולי DNAse.
- המשך לשלב 4 עבור בדיקות כרומטין התפוסה על אזורים ספציפיים גנומית על ידי תגובת שרשרת של פולימראז כמותית (qPCR) או לשלב 5 כדי להתכונן דגימות רצף.
4. ניתוח של שבב באמצעות qPCR (Single/Multiple גנים Readout)
- לדלל את הקלט DNA מ שלב 3.4 ליצירת עיקול רגיל הפניה. טורי דילולים של 1/10 1/100, ו- 1/1000 הן בדרך כלל מספקות ללכוד את הטווח. ליניארית, אבל בהמשך דילולים. העשויים להידרש לדוגמאות מרוכז יותר.
- עבור כל זוג פריימר (כאן, השתמשנו תחל מיקוד היזמים NDUFV1 ו- TOMM20), להכין שתי ערכות של תגובות qPCR: אחד באמצעות דגימות קלט מדולל מן שלב 4.1, ואת השני עם דגימות ה-DNA מבודדת על ידי immunoprecipitation מהשלב 3.4. לבצע את התגובה לכל דולר.
הערה: ניתן להגדיר תגובות במקביל גנים מרובים באמצעות לוחות 96 - או 384-ובכן. - 1 μL של פריימר להגדיר נפח התגובה של μL 10 לכל טוב עם 5 μL של x PCR 2 מיקס (טבלה של חומרים), לערבב (1 μM פריימר לפנים ו פריימר הפוכה 1 μM), וμl 4 של ה-DNA שבב (או הפקד קלט).
- בקצרה ספין למטה הצלחת.
- הפעל את התגובות qPCR על מערכת ה-PCR בזמן אמת באמצעות הפרוטוקול המומלץ על ידי היצרן, ריאגנט לזיהוי (טבלה של חומרים). כאן השתמשנו בתנאים הבאים: 1) 1s ב 95 ° C עבור מחזור 1; 2) 1 s ב 95 ° C ואחריו 20 s ב 60 מעלות צלזיוס במשך 45 מחזורים; 3) 15 s ב 95 ° C ולאחריו 60 s-60 ° C ואחריו 15 s ב 95 ° C עבור מחזור 1.
הערה: בדוק את עקומת דיסוציאציה: הנוכחות של פסגה אחת בחלקה דיסוציאציה תרמי מרמז אמפליקון בודד נוצר מתוך התגובה ה-PCR. אם שיא אחד או יותר הוא מדמיין, זה מעיד על פוטנציאל amplicons מרובות, שאינם ספציפיים; בכל מקרה, אנו ממליצים על העיצוב של פריימר חלופי זוגות. - לקבוע את שלב ליניארי של מעריכי הגברה של התגובה PCR עבור כל פריימר מוגדר על-ידי חישוב העקומה רגיל באמצעות הסדרה של דנ א גנומי מדולל בשלב 4.1. לפי הערך Ct (מחזור מפתן).
- אם הערך Ct של הדנ א שבב ושליטה קלט בתוך הערך ליניארי טווח של Ct, לחשב את העשרת של הדנ א שבב יחסי הקלט, על-פי הגורם דילול של DNA שבב ושליטה קלט בשלב 4.1.
5. הגברה של הדנ א שבב על רצף (הגנום כולו Readout) תפוקה גבוהה
הערה: שלב זה יכול להיות במיקור חוץ מתקן הליבה אקדמי או רצף מסחר החברה כאשר רצף יכולות אינם זמינים בארגון.
- להכין ספריית דנ א של ה-DNA שחולץ עם הכנה הספריה המתאימה שבב קיט (ראה טבלה של חומרים) ההוראות של היצרן.
- רצף הספרייה במערכת רצף תפוקה גבוהה, באמצעות 50 bp יחיד-קצה כמו readout (ראה טבלה של חומרים).
הערה: בהתאם להנחיות שבב-seq שהוצעה על ידי קידוד6, מינימום של 10 מיליון קריאות מומלצת בתרבית של הגנום.
6. ניתוח נתונים גולמיים
- ביצוע בקרת איכות על רצף raw קריאות באמצעות FastQC8.
הערה: מדדי איכות רצף נפוצים כוללים לכל רצף הבסיס איכותיים, לכל תוכן הבסיס רצף, לכל תוכן רצף GC, אורך הרצף, ורמות שכפול רצף. באופן כללי, ציון איכות קריאה של Q > 30 מעבר לכל תפקיד הבסיס הוא מרמז על תוצאות באיכות גבוהה רצף. חלוקת תוכן GC על פני כל קריאות צריך בערך דומה בהתפלגות רגילה, לשיא כיעד המינים גנומית GC תוכן שאחוז בפועל. - הסר את כל רצף מתאם זיהום וקורא באיכות נמוכה דרך קרא זמירה השירות Trimmomatic9.
הערה: הפרמטרים של ברירת המחדל מיושם לציין ההסרה של מתאמי התלויים פלטפורמה, הסרה של בסיסים באיכות נמוכה המובילים, נגררים, שימוש של חלון הזזה רחב 4-בסיס כדי לחתוך קורא מתי איכות ממוצעת לכל בסיס טיפות מתחת לסף שצוין מסוים. - יישר קריאות מעובד העכבר MM10 הגנום של הפניה10 עם ה aligner Bowtie211 באמצעות פרמטרים ברירת המחדל.
- לסנן מיושר קריאות על ידי הסרת אלה עם איכות מיפוי Bowtie2 ציון (MAPQ) של פחות מ 10 באמצעות Samtools12.
- לקבוע מדדי איכות יישור שלאחר שונים כגון אחוז קריאות ממופה, סטראנד קרוס-קורלציה, מצטבר לקרוא סיקור, ודגימת לשכפל הפארמצבטית.
הערה: חבילות שונות כולל SPP13, ChIPqc14ו- Deeptools15 זמינות לחישוב מדדי איכות אלה. - לבצע ניתוח שיחות שיא עם בקרת קלט או מדגם KO המתאים באמצעות אלגוריתם (MACS2) של מקינטוש16 עם פרמטרים ברירת המחדל.
- הסר את כל הפסגות שנקרא חופפים עם אזורים מקארתיזם ידוע17 מ הביאור mm10 באמצעות Bedtools18.
הערה: מקארתיזם אזורים הם אזורים בגנום הוכחו יש אות גבוה או ספירת קריאה עצמאית של תאים בטור או רצף טכניקה. אזורים אלה להציג אותות החפץ מלאכותי גבוה באזורים מסוימים בגנום זה ניתן לסנן מתוך רצף גנטי פונקציונלי ניסויים. משכפל כל צריך להיות מעובד באופן עצמאי דרך הצינור, ואז ניתן להשתמש עבור קצב גילוי irreproducibility (ד ר רודי). ד ר רודי הוא מועסק כדי למדוד את הפארמצבטית ממצאים בין ושכפול באמצעות השיטה כפי שתואר על ידי19,Li, בראון, הואנג, ביקל20. שיטת ד ר רודי באופן כמותי מעריך עקביות בין משכפל, ומומלצת על ידי קידוד ו- modENCODE כחלק הנחיות שבב-seq שלהם. - השתמש פסגות סטטיסטית עבור ניתוחים במורד הזרם שונים כגון גנים אונטולוגיה21,22, העשרה או מוטיב ניתוח23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1: שבב אימות על-ידי qPCR. שבב-qPCR ניתוח של נציג GPS2 יעד גנים NDUFV1 (משמאל) ו TOMM20 (מימין), העטלף של עכברים WT ו- GPS2-עכו, מציג את השינויים ברמת מתילציה H3K9 ואיגוד GPS2 ו- Pol2. מהגרפים מייצג את המדגם של משכפל 3 עם * 0.05 < p ו * * p < 0.01 כמשהו מחושב עם מבחן t של סטודנט. נתון זה משתנה מ- Cardamone et al.2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
דוגמאות של שבב-qPCR באמצעות מחבט מבודד עכברים WT או GPS2-עכו מוצגים באיור 12. שמצאו כי GPS2 היה נדרש עבור הביטוי של גנים מיטוכונדריאלי גרעיני מקודד תא שונים קווים2, בדקנו את גיוס GPS2 על שני מקודד הגרעיני מיטוכונדריאלי גנים ספציפיים, NDUFV1 , TOMM20, ב עטלף של עכברים כדוגמה טישו מועשר מאוד בתוך המיטוכונדריה. תחילה השווינו GPS2 מקדם התפוסה GPS2-עכו בעכברים ובבני הארנבונים מאותה פראי-סוג, התבוננות בירידה צפויה באיגוד GPS2 על גנים סלקטיבי היעד המחבט של עכברים GPS2-עכו. באמצעות פרוטוקול המתואר כאן, גם הקלטנו את איגוד מוגברת של RNA פולימראז 2 (Pol2), הסימן היסטון דכאניים H3K9me3 המחבט של GPS2-עכו עכברים לעומת הארנבונים מאותה פראי-סוג. עבור כל נוגדנים, האיגוד היה משמעותי לעומת האות רקע שנצפתה המדגם שליטה IgG. תוצאות אלו לאשר הגיוס של GPS2 את הגנים מיטוכונדריאלי גרעיני בקידוד הנבחר, להציג GPS2 נמצא הנדרשים למניעת ההצטברות של H3K9me3, ולכן נדרש השתהות של הפעילות תעתיק Pol2 על היזמים היעד. ראה את הטבלה של חומרים לקבלת פרטים נוספים על הנוגדנים ואת הפרסום המקורי עבור נתונים נוספים ודיון מקיף יותר של אלה תוצאות2.
איור 2: מגרש של איכות ציונים של קריאות raw רצף מבודד חולשה (א) איכות התוצאות משקפות חיזוי של ההסתברות של שגיאה במהלך בסיס-טלפון. זה מתבטא בדרך כלל בתור ערך שלם, Q = - 10log10(P), אשר P הוא ההסתברות של שגיאה ב- base-טלפון. המוצג לעיל הוא לפי רצף הבסיס איכות העלילה שנוצר על ידי FastQC מבוסס על רצף גולמי, לא מעובד קריאות המופקים בת. (B) GC הפצת תוכן הקריאות לאחר הסרת מתאם וקריאה זמירה מדגימות בת. GC תוכן צריך בערך דומה בהתפלגות רגילה לשיא כיעד שבר המינים בפועל של תוכן גנומית GC. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיכות רצף איור 2, ציונים, מקרינים לכל בסיס רמה, ואת קריאות עשוי להיות מעובד יותר על ידי גיזום כל זיהום מתאם שיורית והסרת קריאות איפה התוצאה איכות ממוצעת על פני חלון הזזה נופל מתחת הסף שצוין. גם הוא חלוקת תוכן GC מעבר קריאות לאחר הסרת מתאם וגיזום קריאה. רצף איכות ו- GC תוכן הפצה הם שניים נרחב המשמשים מדדים להערכת נתונים רצף ' הדור הבא ' לפני מבוצעים ניתוחים חישובית. תוצאות אלו מדגימים כי הפרוטוקול מייצרת כמות מספקת של כרומטין איכותי מבודד בת התואמת טכנולוגיות רצף הדור הבא במורד הזרם.
איור 3: מנורמל אישיות חשובה הקבצים שנוצרו מתוך נתוני שבב-seq מתוך העטלף של עכברים WT ו- GPS2-עכו- איור זה מציג את הכיסוי קריאה מנורמל לאורך מיקומה ג'ין Slc25a25 לשיאה באופן משמעותי נקרא האזור יזם. GPS2 הוצגה לווסת את הביטוי של גנים מיטוכונדריאלי גרעיני מקודד על ידי שינוי מדינת היעד ג'ין היזמים כרומטין. תוצאות אלו מציגים את החזיית לשיא הנקרא באופן משמעותי על גן נציג מיטוכונדריאלי גרעיני מקודד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
בתרשים 3 אישיות חשובה עקבות WT, GPS2-עכו מיושר קבצים באם מנורמל 1 x עומק (קורא לכל הגנום כיסוי) כפי מיושם ב- deepTools. המוצג הוא הנוכחות של שיא משמעותי סטטיסטית ממוקם באזור יזם גן מיטוכונדריאלי Slc25a25. המסילה מנורמל לאפשר ויזואליזציה של העשרת הקריאות המתאים הפסגה שנקרא והפחתת מספר קריאות במיקום זה המחבט של עכברים GPS2-עכו ביחס הארנבונים מאותה פראי-סוג.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן מייצג כלי רב ערך עבור ביצוע שבב של רקמות מאתר, הממוטב במיוחד רקמת שומן חום. אחד האתגרים גדול בביצוע שבב מרקמות מתאוששת מספר מספיק של תאים במהלך הכנת הדוגמא. הטיית את המחבט באמצעות בלנדר מהמגן רקמות בשילוב עם חרוזים פלדת אל-חלד במקום כבעלי זכוכית הקנוני משמעותית מפחית את מספר התאים איבדו בשל רקמת רצופה. יתר על כן, homogenizing את הרקמה ישירות במאגר היפוטוניק מסייע לשחרור שומנים כי אז ניתן בקלות מופרדים מן הגרעינים באמצעות צנטריפוגה במהירות גבוהה.
Sonication נכונה חיוני גם לביצוע מבחני שבב לשחזור ועקביים. השימוש אמבט מים אולטרה-sonicator מאפשר עיבוד סימולטני של דגימות מרובים, ובכך שיפור הפארמצבטית של כרומטין הטיה ולהקטין את הסיכון של זיהום צולב הדגימה. בנוסף, השימוש במערכת sonication מבוקרי טמפרטורה מצמצמת התחממות יתר של הדגימות, אשר יש להימנע כדי למנוע מדגם השפלה ואובדן הכרה epitope על ידי הנוגדן (לפרטים, ראה טבלה של חומרים ).
עוד שלב מאתגר זה ההתאוששות של קומפלקסים immunoprecipitated. Beads מגנטי עדיפים לעתים קרובות בשלב זה כי הם מאפשרים שוטף מהיר ויעיל יותר בעת שימוש יחד עם מתלה מגנטי. עם זאת, יש להם קצב נמוך יותר של ה-DNA שחזור לעומת חלבון A Agarose, אשר יכול להיות מגבלה רצינית בעבודה עם כמות קטנה של החומר מתחיל. אנו מוצאים כי השילוב של חלבון A Agarose slurry PVDF מיקרומטר 0.45 צנטריפוגלי מסנן עמודות הוא פתרון נהדר כדי להשיג מקסימום DNA תשואות עם כביסה מינימלי וזמן הפארמצבטית גבוה יותר.
לגבי הבידוד דנ א, שפע של עמודות מבוססי DNA אלייזה יכול לשמש. מניסיוננו, מגבלה אחת של גישה זו היא הקיבולת של העמודות כדי להשפיע על התשואה של שחזור ה-DNA. כדי להתגבר על הבעיה, אנו מעדיפים באמצעות שיטה מסורתית יותר כמו פנול/כלורופורם להפקת DNA.
הצינור שבב-seq המפורטים משלבת מספר נפוצה ומקובלת כלים ועזרים לדור הבא רצף ניסויים. בקצרה, הקריאות הם נתון בסיסי בקרת איכות באמצעות FastQC ו- Trimmomatic, ואז המיושר הגנום MM10 העכבר באמצעות Bowtie2. קריאות ששרד מסוננים על-ידי מיפוי איכות לפני בשימוש עבור שיא התקשרות דרך האלגוריתם MACS2. עם זאת, יצוין כלים אחרים זמינים, המאומת עשוי לשמש גם בהתאם לאופי הניסוי ואת הנתונים הנוצר. השימוש של כל אישית פרמטרים במהלך עיבוד קדם, יישור, או שיא הביקור גם ייתכן המתאים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bullet Blender Tissue Homogenizer | Next Advence | BBX24 | |
| Stainless Steel Beads 3.2 mm Diameter | Next Advence | SSB32 | |
| Bioruptor Sonicator | Diagenode | ||
| 1.5 mL Micro Tube TPX Plastic | Diagenode | C30010010-5 | |
| Complete-Protease inhibitor | Roche | 11836145001 | |
| Protein A Agarose Slurry | Invitrogen | 101041 | |
| GPS2 antibody | In house | Rabbit polyclonal, Ct antibody (Cardamone et al., Mol Cell 2018) | |
| Pol2 antibody | Diagenode | C15100055 | |
| h3K9me3 antibody | Millipore | 05-1242 | |
| Fast Syber Green Master Mix | Aplied Biosytem | 4385612 | |
| ViiA7 | Aplied Biosytem | ||
| TruSeq ChIP Library Preparation Kit | Illumina | IP-202-1012 | |
| HiSeq 2000 | Illumina |
References
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. , (2004).
- Cardamone, M. D., et al. Mitochondrial Retrograde Signaling in Mammals Is Mediated by the Transcriptional Cofactor GPS2 via Direct Mitochondria-to-Nucleus Translocation. Molecular Cell. 69, (2018).
- Emmett, M. J., et al. Histone deacetylase 3 prepares brown adipose tissue for acute thermogenic challenge. Nature. , (2017).
- Harms, M. J., et al. PRDM16 binds MED1 and controls chromatin architecture to determine a brown fat transcriptional program. Genes & Development. , (2015).
- Shapira, S. N., et al. EBF2 transcriptionally regulates brown adipogenesis via the histone reader DPF3 and the BAF chromatin remodeling complex. Genes & Development. , (2017).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22, 1813-1831 (2012).
- Liisberg Aune, U., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells. Journal of Visualized Experiments. , e50191 (2013).
- Andrews, S. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc (2010).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30, 2114-2120 (2014).
- Genome Browser Gateway. , Available from: https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway?db=mm10 (2018).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. , 357-359 (2012).
- Li, H., et al. The Sequence alignment/map (SAM) format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins. Nature Biotechnology. 26, 1351-1359 (2008).
- Carroll, T. S., Liang, Z., Salama, R., Stark, R., de Santiago, I. Impact of artifact removal on ChIP quality metrics in ChIP-seq and ChIP-exo data. Frontiers in Genetics. 5, 75 (2014).
- Ramírez, F., et al. deepTools2: A next Generation Web Server for Deep-Sequencing Data Analysis. Nucleic Acids Research. , (2016).
- Zhang, Y., et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9, R137 (2008).
- ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).
- Li, Q., Brown, J. B., Huang, H., Bickel, P. J. Measuring reproducibility of high-throughput experiments. Annals of Applied Statistics. 5 (3), 1752-1779 (2011).
- Irreproducible Discovery Rate (IDR). , Available from: https://github.com/nboley/idr (2018).
- The Gene Ontology Consortium. Expansion of the Gene Ontology Knowledgebase and Resources. Nucleic Acids Research. 45, D331-D338 (2017).
- Ashburner, M., et al. Gene Ontology: tool for the unification of biology. Nature Genetics. 25, 25-29 (2000).
- Boeva, V. Analysis of Genomic Sequence Motifs for Deciphering Transcription Factor Binding and Transcriptional Regulation in Eukaryotic Cells. Frontiers in Genetics. 7, 24 (2016).
