Summary
여기는 갈색 지방이 많은 직물 (박쥐)는 마우스에서 분리의 높은 처리량 DNA 연속 (칩 seq) 다음 효율적인 chromatin immunoprecipitation (칩)에 대 한 프로토콜에 설명 합니다. 이 프로토콜은 히스톤 수정 매핑와 관심 비보의 비 히스톤 단백질의 게놈 넓은 지역화 조사에 적합 합니다.
Abstract
대부분 세포 프로세스는 특정 유전자 프로그램의 transcriptional 변조에 의해 통제 된다. 이러한 변조 다양 한 녹음 방송 요인 (TFs) 및 공동 인자 중재 transcriptional 활성화 또는 염색 질 구조에 변화를 통해 억압의 결합 된 행동을 통해 이루어집니다. Chromatin immunoprecipitation (칩)은 히스톤 수정 매핑 및 다른 하는 동안 발생 하는 동적 핵 변화의 스냅숏으로 제공 녹음 방송 요인/공동 인자 dna 바인딩 프로 파일링을 위한 유용한 분자 생물학 접근 생물 학적 프로세스입니다.
공부 하 고 지방 조직에 transcriptional 규칙, 체 외에서 세포 배양의에서 파생 된 샘플 불후 또는 1 차 셀 라인 시작 물자의 풍부 때문에 칩 분석 실험에 종종 선호 하 고 생물 다양성을 감소. 그러나, 이러한 모델 생명체에서 실제 chromatin 상태의 제한 된 스냅숏을 나타냅니다. 따라서, 동물 모델에서 파생 된 지방 조직 샘플에 칩을 수행 하기 위해 최적화 된 프로토콜에 대 한 중요 한 필요는.
여기 우리는 히스톤 수정 및 갈색 지방이 많은 직물 (박쥐)는 마우스에서 고립에 있는 비 히스톤 단백질의 효율적인 칩 seq에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 프로토콜의 관심과 지방 저장소 사이 형태학 상으로 그리고 생리 적으로 뚜렷한 조직 박쥐에 epigenetic 마커 단백질의 게놈 넓은 지역화를 조사 하 고 최적화 되어 있습니다.
Introduction
반면 흰색 adipose 조직 (WAT)는 에너지 저장을 위해 전문화 된다, 갈색 지방이 많은 직물 (박쥐) 열 에너지를 통해 미토 콘 드리 아 연결을 푸는1탄수화물과 지질을 변환 하는 기능으로 인해 열 형태로 에너지 없어져 요. 이 특수 기능 때문에 박쥐 디포는 생리 적 조건에 찬 노출에 대 한 응답에 체온의 유지 보수를 위해 필요 합니다. 진 식 변화와 박쥐 차별화 동안 thermogenic 스트레스에 따라 vivo에서 그리고 생체 외에서 광범위 하 게 공부 되었다, 그러나 분자 메커니즘 기본이 변경 되었습니다 주로 불멸 하 게 세포에 해 부와 기본 vivo에서 몇몇 예외 사전 adipocytes,2,3,,45를 공부 한다.
Transcriptional 규칙을 통해 특정 유전자 식 프로그램의 조정된 변화 chromatin 구조를 통해 다양 한 녹음 방송 요인 및 공동 작업 요인에 의해 이루어집니다. Chromatin immunoprecipitation (칩)은 DNA 이러한 요소의 채용 조사 및 프로 파일링 chromatin 풍경에 관련 된 변화에 대 한 귀중 한 분자 생물학 접근 이다. 칩 실험의 성공에 대 한 핵심 요인 가교 조건 및 적절 한 시작 물자 및, 특히, 항 체의 품질의 다른 예제를 통해 chromatin 전단 일관성의 최적화를 포함합니다. 전체 조직에서 칩을 수행할 때 그것은 또한 중요 한 고려 하는 샘플의이 고 핵 격리의 효율성을 개선 하기 위해 프로토콜 최적화, 후자와 되 고 특히 민감한 단계 때문에 지방 조직에서 작업할 때 상승 된 지질 내용입니다. 사실, 전체 지방 창 고에서 분자 격리 기술을 높은 수준의 트리 글리세라이드의 존재에 의해 복잡은 고 chromatin 격리의 양을 증가 시키는 프로토콜을 최적화 해야 합니다. 마지막으로, 높은 처리량 시퀀싱 칩-DNA 분리 후 수행 될 때 시퀀싱 깊이 봉우리는 자신 있게 검색의 수를 결정 하기 위한 중요 합니다.
여기, 우리 작업 표준 및 인코딩 및 modENCODE 컨소시엄6 모범 사례에 대 한 권장 하는 칩 seq 실험에 대 한 일반적인 지침을 참조 하 고 우리는 칩 seq 박쥐에서 최적화 된 프로토콜에 대 한 단계별 설명에 초점. 설명된 프로토콜 chromatin 지방 조직에서의 효율적인 절연에 대 한 더 확산 신호와 히스톤 부호 뿐만 아니라 잘 정의 된 봉우리 DNA 바인딩 요소에 대 한 게놈 넓은 시퀀싱을 수행 수 있습니다.
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Protocol
프로토콜의 동물 처리 단계는 보스턴 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인 되었습니다.
1. 주 1: 해 부와 Chromatin Immunoprecipitation (칩)에 대 한 박쥐의 준비
- 이산화탄소 (CO2) 챔버를 사용 하 여 마우스를 안락사 하 고 해 부를 즉시 수행 이후에. 절 개 전에 70% 에탄올 스프레이 마우스 모피. 다음 자르면 목 따라 피부는 다시 위로 향하도록 마우스를 놓습니다. 어깨 사이 피부 바로 아래 박쥐를 찾습니다 (interscapular; 그것은 신중 하 게 해야 하는 흰색 지방의 얇은 층으로 나비 모양의 두 엽 제거7나타납니다).
참고: 마우스에 대 한 3 개월 된 C57BL/6J 일반 차 다이어트 (27과 30 g 사이이 연령 범위에 마우스 무게)을 먹이, 각 박쥐 엽 약 1 ㎝ 길이입니다. 박쥐 디포의 총 무게는 남성 및 여성 쥐에 있는 약 0.15 g 이다. - 1 박쥐 패드를 사용 하 여 3 칩. 여러 개의 박쥐 패드 쥡니다까지 동시에 처리할 수 있습니다.
- Crosslink 각 박쥐 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 포함 1% 포름알데히드 실내 온도 (RT)에서 150 rpm에 회전 하는 15 분의 10 mL에 패드.
- 실시간에서 150 rpm 회전 5 분 125 m m의 최종 농도에 2.5 M 글리신을 추가 하 여 가교를 끄다
- 침투성 세포의 용 해 버퍼 (10 mM HEPES, 1.5 m m MgCl2, 10 m m KCl, 0.5 m m DTT, 0.2 밀리미터 PMSF)의 500 µ L를 박쥐 패드를 전송 하 고 추가 2 스테인리스 구슬 (크기: 3.2 m m 직경 재료의 표참조) 각 박쥐 패드에 대 한. 구슬-기반 조직 균질 화기를 사용 하 여 조직 분쇄기를 (참조 테이블의 자료).
- 최대 전력에서 5 분부터 시작. 필요한 경우 조직 무 균 때까지 시간을 확장 하 고 단일 셀 구분 됩니다. 새로운 튜브와 10 분 동안 16000 x g 에서 4 ° C에서 원심 분리기 샘플을 전송 합니다.
- 원심, 후는 상쾌한 새로운 튜브로 전송 하 고 얼음에 셀 펠 릿을 유지 합니다. 셀의 손실을 방지 하기 위해 10 분 동안 16000 x g에서 4 ° C에서 상쾌한 원심 최종 상쾌한 취소 및 SDS 세포의 용 해 버퍼의 300 µ L에 두 셀 펠 릿을 함께 resuspend (SDS 1%; EDTA 10 밀리미터; Tris-HCl pH 8, 50mm) protease 억제제 x 1 ( 재료의 표참조). 10 분 동안 얼음에 품 어.
- 긴 DNA 파편 200-500 기본 쌍을 생성 하 lysates sonicate 쥡니다, 후 4 ° C에서 16000 x g 에서 10 분 동안 원심 분리 하 여 파편을 제거 하 고 쥡니다 통해 DNA 전기 이동 법의 1 %agarose 젤에 성공을 확인 합니다. -젤 120 V;에서 실행 좋은 분리 45 분 후에 이루어집니다.
참고: 쥡니다 최적화 파편의 적절 한 크기를 달성 하기 위해 필요할 수 있습니다. 선택한 sonicator와 ( 재료의 표참조)에서 30 s/30 s의 사이클을 사용 하 여이 320 W 출력 파워에 10 분, 20 KHz 주파수 2 배 필요 합니다. - 표면에 뜨는 분수를 10 배 희석 (최종 볼륨은 각 박쥐 패드 3 mL) 칩 희석 버퍼에서 (SDS 0.01%; 트리톤 1.1%; EDTA 1.2 m m; Tris HCl pH 8, 16.7 m m; NaCl 167 mM) protease 억제제 x 1. 옆으로 칩 입력으로이 chromatin 솔루션 (30 µ L 3 ml 같음)의 1%를 유지. 입력 하룻밤 4 ° C에서 (까지 계속 단계 2.4).
참고: 위의 분수 DNA immunoprecipitation 전에 각 샘플에 존재의 금액에 비해 immunoprecipitated 소재의 상대 정량화에 대 한 기준 입력된을 제공할 것입니다. - 칩 항 체를 추가 (사용 하는 항 체에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오 예를 들어 여기) chromatin 솔루션의 1 mL에 회전 4 ° C에서 밤새 품 어 고. 해당 사전 면역 IgG, 가능한 경우, 또는 동일한 종의 정상 IgG 병렬 immunoprecipitation을 수행 (예. 일반, IgG 항 체는 토끼에서 생산 하는 경우에, 토끼). 또는, 아니오-항 체의 제어를 위한 chromatin 솔루션의 1 mL를 저장 합니다.
참고: 항 체의 최적의 금액 결정 되어야 합니다 실험적으로 각 새로운 항 체에 대 한 항 체 농도 알 수 없는 경우. 그렇지 않으면, 2-5 µ g 항 체의 사용 하 여 합리적인 시작 금액입니다. 가능 하다 면, 칩 급 항 체 또는 검증 된 항 체를 사용 하 여 immunoprecipitation에 대 한.
2. 면역성이 있는 복합물의 제 2 일: 수집
- 면역성이 있는 복합물을 단백질 A Agarose 50% 슬러리의 50 µ L을 추가 하 고 회전 150 rpm으로 4 ° C에서 1 시간에 품 어.
-
4 ° c.에 100 x g 에서 1 분 동안 원심 분리 하 여 구슬을 펠 렛 증가 엄중의 버퍼와 구슬의 순차적 세척을 수행 합니다.
- 첫째, 낮은 소금 워시 버퍼 (150 m m NaCl; 세척 Tris HCl pH 8, 20 밀리미터; EDTA 2 밀리미터; 트리톤-X 1%; SDS 0.1%), 그 후에 높은 소금 워시 버퍼 (500 m m NaCl; Tris HCl pH 8, 20 밀리미터; EDTA 2mm, 트리톤 X1%; SDS 0.1%), 다음 LiCl 세척 (0.25 M LiCl; Tris HCl pH 8, 10 mM; EDTA 1 밀리미터; Igepal 1%; deoxicholate 1%), 그리고 마지막으로 1 x 테 (Tris HCl pH 8, 10 mM;와 EDTA)입니다.
- 첫 번째 전송 낮은 소금 워시 버퍼의 500 µ L를 사용 하 여 열에 구슬 0.45 μ m PVDF 원심 필터 열 (자료 테이블)에 모든 세척을 수행 합니다. 2500 x g에서 3 분에 대 한 열에 구슬 작은 통해 흐름 무시 하 고 단계 2.2.1에에서 나열 된 모든 워시 버퍼에 대 한 1 시간을 반복 합니다.
- 세척 완료 차입 버퍼 1 %SDS, 0.1 M NaHCO3의 300 µ L을 추가 하 여 면역 복합 elute) 열에서 수송과 구슬에. RT에서 400 rpm에서 통에 30 분 동안 품 어. eluate 신선한 튜브에 2500 x g 에서 3 분에 대 한 열 아래로 회전 하 여 수집 합니다.
- 잠복기 eluate와 하룻밤 65 ° C에서 1.9 단계에서 수집 하는 입력으로는 crosslinks를 반대로.
3. 주 3: 페 놀/클로 프롬 추출 된 DNA의 복구
- 페 놀: 클로 프롬: IAA, eluate 및 입력을 1: 1의 300 µ L를 추가 합니다. 10 소용돌이 s.
- 21000 x g에서 15 분 동안 4 ° C에서 회전 합니다. 신선한 튜브는 상쾌한 전송. 글 리 코겐, 3m 나트륨 아세테이트, 30 µ L 및 감기 100% 에탄올의 750 µ L의 3 µ L를 추가 합니다. 2 h-80 ° C에서 10 s. 저장소에 대 한 소용돌이.
- 20 분 동안 4 ° C에서 21000 x g에서 스핀 다운, 펠 릿, 유지 하 고는 상쾌한 삭제. 워시 펠 릿 찬 70%의 1 mL EtOH, 다음 5 분에 4 ° C에서 21000 x g 에 아래로 회전은 상쾌한 삭제와 펠 릿을 건조.
- DNAse 무료 물 70 µ L에 펠 릿을 resuspend.
- 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량)에 의해 특정 게놈 지역에 chromatin 인을 테스트 하기 위한 4 단계 또는 시퀀싱에 대 한 샘플을 준비 하는 5 단계를 진행 합니다.
4. 정량 (Single/Multiple 유전자 해독)를 사용 하 여 칩의 분석
- 희석 단계 표준 참조 커브를 생성 하는 3.4에서에서 입력 DNA. 직렬 희석의 1/10, 1/100, 1/1000는 일반적으로 선형 범위를 캡처하는 데 충분 하지만 더 희석 집중된 샘플에 대 한 필요할 수 있습니다.
- 각 뇌관 쌍에 대 한 (여기, 우리는 NDUFV1 및 TOMM20 프로모터를 대상으로 하는 뇌관), 사용 정량 반응의 두 세트를 준비: 3.4 단계에서 immunoprecipitation에 의해 고립 된 DNA 샘플 단계 4.1, 및 두 번째에서 희석된 입력된 샘플을 사용 하 여 한. 3 중 각 반응을 수행 합니다.
참고: 반응 96-또는 384-잘 접시를 사용 하 여 여러 개의 유전자에 대 한 동시에 설정할 수 있습니다. - 2 x PCR 혼합 (자료 테이블)의 5 μ와 잘 당 10 μ의 반응 볼륨 설정, 뇌관의 1 μ (1 μ M 앞으로 뇌관 및 역방향 뇌관 1 μ M)을 혼합 하 고, 그리고 DNA 칩 (또는 입력된 컨트롤)에서 4 μ.
- 짧게 접시 아래로 회전 합니다.
- 정량 Pcr 반응에서 실시간 PCR 시 약 검색 (자료 테이블)에 대 한 제조 업체에서 권장 하는 프로토콜을 사용 하 여 실행 합니다. 여기 우리가 다음 조건 사용: 1) 1 개 주기; 95 ° C에서 1 2) 1 20 뒤에 s 95 ° C에서 45 주기; 60 ° C에서 s 3) 15 s 95 ° C에서 60 다음 s 60 ° C에서 15 다음 1 주기 동안 95 ° C에서 s.
참고: 분리 곡선 확인: 열 분리 음모에서 한 피크의 존재 제안 단일 amplicon PCR 반응에서 생성 됩니다. 하나 이상의 피크 시각 이다, 이것이 잠재적으로 나타내는 여러, 일반적인 amplicons; 어떤 경우에, 대체 뇌관 쌍의 디자인을 좋습니다. - 각 뇌관 단계 4.1에서에서 희석된 genomic DNA의 일련을 사용 하 여 표준 곡선을 계산 하 여 설정에 대 한 PCR 반응의 지 수 증폭의 선형 단계를 결정 합니다. Ct (사이클 임계값) 값에 따라.
- DNA 칩 및 입력된 제어에서의 Ct 값 선형 Ct 값 안에 있다면, DNA 칩 및 단계 4.1에서에서 입력된 컨트롤의 희석 비율에 따라 입력을 기준으로 DNA 칩에서의 농축을 계산 합니다.
5. 높은 처리량 (게놈 넓은 판독) 시퀀싱에 대 한 칩에서 DNA의 증폭
참고: 이 단계 시퀀싱 기능 사용할 수 없을 때 사내 학술 핵심 시설 또는 상업적인 시퀀싱 회사 아웃소싱 될 수 있습니다.
- 적절 한 칩 라이브러리 준비와 추출 된 DNA에서 DNA 도서관을 준비 ( 재료의 표참조) 키트 제조업체의 지침에 따라.
- 시퀀스 판독으로 50 bp 싱글-엔드를 사용 하는 높은 처리량 시퀀싱 시스템 라이브러리 ( 재료의 표참조).
참고: 지침에 따르면 칩 seq 인코딩6에 의해 제안, 포유류 게놈 10 백만 읽기의 최소 권장 합니다.
6. 원시 데이터 분석
- FastQC8를 사용 하 여 원시 연속 읽기에서 품질 관리를 수행 합니다.
참고: 일반적인 시퀀싱 품질 통계 기준 시퀀스 품질 당, 기본 시퀀스 콘텐츠 당, 시퀀스 GC 내용, 시퀀스 길이, 및 시퀀스 중복 수준 당 포함 됩니다. 일반적으로, 읽기 품질 평가 점수 Q의 > 30 각 기본 위치에 걸쳐 높은-품질 시퀀싱 결과 나타내는 것입니다. 모든 읽기에 걸쳐 GC 콘텐츠의 유통을 피크 종 실제 게놈 GC 컨텐츠 비율을 중심으로 정규 분포를 닮은 약 한다. - 모든 시퀀싱 어댑터 오염 및 낮은 품질 유틸리티 Trimmomatic9트리밍 읽기를 통해 읽기를 제거 합니다.
참고: 구현 된 기본 매개 변수 지정 플랫폼 종속 어댑터 제거, 선행 및 후행 낮은 품질 기지의 제거 및 손질 때 읽고 4 기반 넓은 슬라이딩 윈도우를 사용 하 여 지정된 된 임계값 아래 기본 상품 당 평균 품질. - 기본 매개 변수를 사용 하 여 Bowtie2 aligner11 마우스 MM10 참조 게놈10 처리 읽기를 맞춥니다.
- 정렬 된 읽기 Bowtie2 매핑 품질에 그들을 제거 하 여 필터링 (MAPQ) 10 미만 Samtools12를 사용 하 여 점수.
- % 읽기 매핑된, 스트랜드 교차 상관, 누적 읽을 적용률과 샘플 재현성 복제와 같은 다양 한 후 맞춤 품질 통계를 확인 합니다.
참고: SPP13를 포함 한 다양 한 패키지, ChIPqc14및15 Deeptools 사용할 수 있습니다 이러한 품질 메트릭을 계산 하. - 피크 입력된 컨트롤 또는 기본 매개 변수가 있는 MAC 알고리즘 (MACS2)16 을 사용 하 여 적절 한 코 샘플 호출 분석을 수행 합니다.
- Bedtools18를 사용 하 여 mm10 주석에서 알려진된 블랙 리스트 지역17 와 겹치는 모든 라는 봉우리를 제거 합니다.
참고: 블랙 리스트는 높은 신호 또는 읽기 수 독립적으로 세포 선 또는 시퀀싱 기법을가지고 표시 되었습니다 게놈에 있는 지역. 이 지역 기능 게놈 시퀀싱 실험에서 필터링 할 수 있는 게놈의 특정 지역에서 인위적으로 높은 유물 신호를 표시 합니다. 모든 복제는 파이프라인을 통해 개별적으로 처리 되어야 합니다 그리고 irreproducibility 검색 속도 (IDR)에 사용할 수 있습니다. IDR 리, 갈색, 황, 및 강사19,20에 의해 설명 된 대로 메서드를 통해 복제 사이 결과의 재현성을 측정 하기 위해 채택 된다. IDR 메서드는 양적 복제 사이의 일관성을 평가 하 고 그들의 칩 seq 지침의 일환으로 인코딩 및 modENCODE에 의해 권장 합니다. - 통계적으로 중요 한 봉우리를 사용 하 여 유전자 온톨로지21,22, 농축, 또는 주제 분석23등 다양 한 다운스트림 분석에 대 한.
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Representative Results
그림 1: 정량 하 여 유효성 검사를 칩. 대표 GPS2의 칩 정량 분석 대상으로 H3K9 메 틸 화 및 GPS2 및 Pol2 바인딩 수준에서 상대적 변화를 보여주는 WT 및 GPS2-아카 호 쥐의 박쥐에 유전자 NDUFV1 (왼쪽)와 TOMM20 (오른쪽). 막대 그래프와 함께 3 복제의 표본 평균이 대표 * p < 0.05와 * * p < 0.01 계산 스튜던트 t-검정으로. 이 그림은 Cardamone에서 수정 외.2. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
예 칩 정량의 WT 또는 GPS2-아카 호 쥐에서 분리 하는 박쥐를 사용 하 여 표시 됩니다 그림 12. GPS2 다른 셀 라인2에 인코딩된 핵 미토 콘 드리 아 유전자의 표현에 대 한 필요 했다 발견, 우리에 두 개의 특정 인코딩된 핵 미토 콘 드리 아 유전자, NDUFV1 및 TOMM20, GPS2의 채용을 테스트 미토 콘 드리 아에서 높게 풍성 하 게 하는 조직에의 한 예로 쥐에서 박쥐. 우리는 먼저 GPS2-아카 호 쥐에서 박쥐에 선택적 대상 유전자 GPS2 바인딩에 예상된 감소 관찰 GPS2-아카 호 쥐와 야생-타입 littermates, GPS2 발기인 인 비교. 여기 설명 된 프로토콜을 사용 하 여, 우리 또한 기록 (Pol2)의 RNA 중 합 효소 2 증가 바인딩 및 억압 적인 히스톤 마크 H3K9me3 야생-타입 littermates 비교 GPS2-아카 호 쥐에서 박쥐에. 모든 항 체에 대 한 바인딩 IgG 컨트롤 샘플에서 관찰 된 배경 신호에 비해 중요 했다. 이러한 결과 선택한 인코딩 핵 미토 콘 드리 아 유전자 GPS2의 채용을 확인 하 고 표시 GPS2 H3K9me3의 축적을 방지 하는 데 필요한 따라서 대상 발기인에 Pol2 transcriptional 활동의 연기에 필요한. 항 체 및 추가 데이터와 이러한 결과2의 더 포괄적인 토론에 대 한 원래 게시에 대 한 자세한 내용은 테이블의 자료 를 참조 하십시오.
그림 2: 품질의 BAT.에서 고립 된 원시 연속 읽기에서 점수 (A) 품질 평가 점수 반영 자료 호출 하는 동안 오류 확률의 예측. 그것은 일반적으로 정수 값, Q로 표시 됨 =-10log10(P), 어떤 P는 기본 호출에서 오류가 발생의 확률. 위의 표시는 기준 시퀀스 품질 당 FastQC에 의해 생성 된 플롯 박쥐에서 생성 된 원시, 처리 되지 않은 연속 읽기에 따라. (B) GC 어댑터 제거 및 읽기 박쥐 샘플에서 트리밍 후 읽기의 콘텐츠 유통 GC 콘텐츠 피크 GC 게놈 콘텐츠 종 실제 분수를 중심으로 정규 분포를 닮은 약 한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2, 시퀀싱 품질 점수에 표시 되는 베이스 레벨, 당 및 읽기를 더 잔류 어댑터 오염을 트리밍 및 슬라이딩 윈도우 전체 평균 품질 평가 점수 아래로 떨어지면 읽기를 제거 하 여 처리 될 수 있습니다는 지정 된 임계값입니다. 또한 어댑터 제거 및 읽기 트리밍 후 읽기에 걸쳐 GC 콘텐츠 유통이 이다. 시퀀스 품질 및 GC 콘텐츠 배포는 두 가지 널리 사용 통계 다음 세대 시퀀싱 데이터 전산 분석 수행 하기 전에. 이러한 결과 프로토콜 다운스트림 차세대 시퀀싱 기술와 호환 되는 박쥐에서 격리 하는 높은-품질 chromatin의 충분 한 금액을 생산 하는 방법을 보여 줍니다.
그림 3: WT 및 GPS2-아카 호 쥐 박쥐에서 칩 seq 데이터에서 생성 된 중요 파일을 정규화. 이 그림 발기인 지역에서 크게 불리 피크와 Slc25a25 유전자 소재 시에 따라 표준화 된 읽기 범위를 보여 줍니다. GPS2 대상 유전자 발기인의 염색 질 상태를 변경 하 여 인코딩된 핵 미토 콘 드리 아 유전자의 표현을 규제 표시 했다. 이 결과 대표적인 핵 인코딩 하는 미토 콘 드리 아 유전자에 크게 불리 피크의 시각화를 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3는 WT의 중요 트랙 그리고 GPS2-아카 호 빵 파일 deepTools에서 구현 1 x 깊이 (게놈 범위 당 읽기)으로 정규화 정렬. 표시 된 Slc25a25미토 콘 드리 아 유전자의 발기인 지구에 있는 통계적으로 중요 한 첨단의 존재가입니다. 정규화 된 트랙 라는 피크 및 야생-타입 littermates 기준 GPS2-아카 호 쥐의 박쥐에이 위치에 읽기의 감소에 해당 하는 읽기의 농축의 시각화를 수 있습니다.
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Discussion
여기에 설명 된 프로토콜 murine 조직, 갈색 지방 조직 최적화에서 칩을 수행 하기 위한 유용한 도구를 나타냅니다. 조직에서 수행 하는 칩에 큰 과제 중 하나는 샘플 준비 하는 동안 세포의 충분 한 수를 회복 됩니다. 박쥐는 정식 유리 유 봉 대신 스테인리스 구슬 크게 결합 조직 균질 화기 믹서 기를 사용 하 여 전단 파손 되지 않는 조직으로 인해 손실 된 세포의 수를 줄입니다. 또한, 소형 버퍼에서 직접 조직 조직 지질 다음 쉽게 분리 하 고 수 있는 고속 원심 분리를 통해 핵에서 제거의 릴리스를 수 있습니다.
적절 한 쥡니다 일관 되 고 재현 가능한 칩 분석 실험을 수행 하기 위한 중요 한 이기도 합니다. 물 목욕 울트라 sonicator 사용할 여러 샘플, chromatin 전단 및 샘플 교차 오염의 위험을 감소 시키기의 재현성 향상의 동시 처리를 위해 수 있습니다. 또한, 쥡니다 온도 제어 시스템의 사용은 항 체 epitope 인식의 손실과 샘플 저하를 방지 하기 위해 피해 야 한다 샘플의 과열 감소 (대 한 자세한 내용은 테이블의 자료 를 참조).
또 다른 도전 단계 immunoprecipitated 복합물의 회복 이다. 마그네틱 구슬 자석 랙 함께 사용 될 때 더 빠르고 더 효과적인 세척을 허용 하기 때문에이 단계에 대 한 선호 많습니다. 그러나, 그들의 DNA 복구 작업 시작 물자의 작은 금액을 할 때 심각한 한계를 될 수 있는 단백질 A Agarose에 비해 낮은 비율이 있다. 우리는 PVDF 0.45 μ m 원심 필터 열 단백질 A Agarose 슬러리의 결합 DNA 최소한의 세척 시간과 높은 재현성으로 항복 하는 최대를 달성 하기 좋은 솔루션입니다 찾으십시오.
DNA 분리에 관한 열 기반 DNA 분리 키트 많이 사용할 수 있습니다. 우리의 경험에서는,이 접근의 한계가 DNA 복구의 수익률에 영향을가지고 열 용량입니다. 문제를 해결 하려면 우리는 DNA 추출에 대 한 페 놀/클로 프롬으로 전통적인 방법을 사용 하 여 선호 합니다.
나열 된 칩 seq 파이프라인 차세대 시퀀싱 실험에 대 한 광범위 하 게 허용된 도구 및 유틸리티의 수를 포함 합니다. 간단히, 읽기 FastQC 및 Trimmomatic를 사용 하 여 기본적인 품질 관리 대상이 다음 Bowtie2를 사용 하 여 마우스 MM10 게놈에 정렬 됩니다. 살아남은 읽기 피크 MACS2 알고리즘을 통해 호출을 위해 사용 되기 전에 품질을 매핑 하 여 필터링 됩니다. 그러나, 그것은 다른 사용 가능 하 고 검증 도구 실험 및 생성 되는 데이터의 특성에 따라도 사용할 수 있습니다 주목 해야한다. 사용 사용자 맞춤, 또는 피크 전화 수도 있습니다 적절 한 사전 처리 하는 동안 매개 변수 지정.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bullet Blender Tissue Homogenizer | Next Advence | BBX24 | |
| Stainless Steel Beads 3.2 mm Diameter | Next Advence | SSB32 | |
| Bioruptor Sonicator | Diagenode | ||
| 1.5 mL Micro Tube TPX Plastic | Diagenode | C30010010-5 | |
| Complete-Protease inhibitor | Roche | 11836145001 | |
| Protein A Agarose Slurry | Invitrogen | 101041 | |
| GPS2 antibody | In house | Rabbit polyclonal, Ct antibody (Cardamone et al., Mol Cell 2018) | |
| Pol2 antibody | Diagenode | C15100055 | |
| h3K9me3 antibody | Millipore | 05-1242 | |
| Fast Syber Green Master Mix | Aplied Biosytem | 4385612 | |
| ViiA7 | Aplied Biosytem | ||
| TruSeq ChIP Library Preparation Kit | Illumina | IP-202-1012 | |
| HiSeq 2000 | Illumina |
References
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. , (2004).
- Cardamone, M. D., et al. Mitochondrial Retrograde Signaling in Mammals Is Mediated by the Transcriptional Cofactor GPS2 via Direct Mitochondria-to-Nucleus Translocation. Molecular Cell. 69, (2018).
- Emmett, M. J., et al. Histone deacetylase 3 prepares brown adipose tissue for acute thermogenic challenge. Nature. , (2017).
- Harms, M. J., et al. PRDM16 binds MED1 and controls chromatin architecture to determine a brown fat transcriptional program. Genes & Development. , (2015).
- Shapira, S. N., et al. EBF2 transcriptionally regulates brown adipogenesis via the histone reader DPF3 and the BAF chromatin remodeling complex. Genes & Development. , (2017).
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