Summary
Her beskriver vi en protokol for effektiv kromatin immunoprecipitation (ChIP) efterfulgt af høj overførselshastighed DNA-sekventering (ChIP-seq) af brunt fedtvæv (BAT) isoleret fra en mus. Denne protokol er velegnet til både kortlægning Histon ændringer og undersøge genome-wide lokalisering af ikke-Histon proteiner af interesse in vivo.
Abstract
Mest cellulære processer er reguleret af transcriptional graduering af bestemte gen programmer. Sådan graduering er opnået gennem en bred vifte af transkriptionsfaktorer (TFs) og cofaktorer mægle transcriptional aktivering eller undertrykkelse via ændringer i kromatin struktur kombineret handlinger. Kromatin immunoprecipitation (ChIP) er en nyttig Molekylærbiologi tilgang til kortlægning Histon ændringer og profilering transskription faktorer/cofaktorer binding til DNA, hvilket giver et øjebliksbillede af de dynamiske nukleare forandringer under forskellige biologiske processer.
For at studere transkriptionel regulering i fedtvæv, prøver stammer fra in vitro- cellekulturer af udødeliggjort eller primære cellelinjer er ofte foretrukket i ChIP assays på grund af overfloden af starter materiale og nedsat biologisk variation. Men disse modeller repræsenterer en begrænset øjebliksbillede af de faktiske kromatin stat i levende organismer. Således, der er et kritisk behov for optimerede protokoller til at udføre ChIP på fedtvæv prøver udledes fra dyremodeller.
Her beskriver vi en protokol for effektiv ChIP-FF. i både Histon ændringer og ikke-Histon proteinerne i brunt fedtvæv (BAT) isoleret fra en mus. Protokollen er optimeret for at undersøge genome-wide lokalisering af proteiner af interesse og epigenetiske markører i BAT, som er en morfologisk og fysiologisk forskellige væv blandt fedt depoter.
Introduction
Mens hvidt fedtvæv (WAT) er specialiseret for energilagring, afleder brunt fedtvæv (BAT) energi i form af varme på grund af dens evne til at omdanne kulhydrater og lipider til termisk energi via mitokondrie frakobling1. På grund af denne specialiserede funktion er BAT depot påkrævet til vedligeholdelse af kropstemperaturen i fysiologiske forhold og som svar til koldt eksponering. Mens gen expression ændringer i BAT differentiering og termogeniske stress har været grundigt undersøgt in vivo og in vitro-, har de molekylære mekanismer bag disse ændringer været mest dissekeret i udødeliggjort cellelinjer og primære før adipocytter, med undtagelse af flere in vivo-undersøgelser2,3,4,5.
Regulering af bestemte gen expression programmer gennem transkriptionel regulering er opnået ved koordineret ændringer i kromatin struktur via forskellige transskription faktorer og co faktorer handlinger. Kromatin immunoprecipitation (ChIP) er en værdifuld Molekylærbiologi tilgang for at undersøge ansættelse af disse faktorer til DNA og til profilering de tilknyttede ændringer i kromatin landskab. Nøglefaktorer for succes af ChIP eksperimenter omfatter optimeringer af crosslinking betingelser og kromatin klipning sammenhæng i hele forskellige prøver, tilgængelighed af tilstrækkelig råvare, og, især, kvaliteten af antistoffer. Når du udfører ChIP fra hele væv, det er også vigtigt at overveje heterogenitet af prøverne og optimere protokol for at forbedre effektiviteten af kerner isolation, med sidstnævnte at være et særligt følsomme skridt, når du arbejder med fedtvæv skyldes forhøjet lipid indhold. I virkeligheden, Molekylær isolation teknikker fra hele fedt depoter er kompliceret af tilstedeværelsen af høje niveauer af triglycerider og protokoller skal optimeres for at øge mængden af kromatin isolation. Endelig, når høj overførselshastighed sekventering udføres efter ChIP-DNA isoleret, sekventering dybde er afgørende for fastsættelsen af antallet af toppe, der opdages trygt.
Her henviser vi til arbejdsstandarder og generelle retningslinjer for ChIP-seq eksperimenter anbefalet af den INDKODE og modENCODE konsortier6 for bedste praksis, og vi fokuserer på en trinvis beskrivelse af en protokol optimeret til ChIP-seq fra BAT. Den beskrevne protokol giver mulighed for effektiv isolering af kromatin fra fedtvæv at foretage genome-wide sekventering af DNA-bindende faktorer med veldefinerede toppe samt Histon mærker med mere diffuse signaler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De animalske håndtering trin i protokollen er blevet godkendt af Boston Universitys institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC).
1. dag 1: Dissektion og forberedelse af BAT for kromatin Immunoprecipitation (ChIP)
- Aflive mus ved hjælp af en kuldioxid (CO2) kammer, og udføre dissektion umiddelbart bagefter. Spray mus pels med 70% ethanol før indsnit. Placer musen med ryggen opad, derefter skåret åben huden langs halsen. Find BATTET direkte under huden mellem skuldrene (interscapular; det vises som to lapper, sommerfugl-formet, med et tyndt lag af hvidt fedt, der skal være omhyggeligt fjernet7).
Bemærk: For en 3 måneder gammel C57BL/6J mus, der er fodret med en regelmæssig chow kost (musen vægt på denne aldersintervaller mellem 27 og 30 g), er hver BAT lap ca 1 cm lang. Den samlede vægt af BAT depot er ca. 0,15 g i både mandlige og kvindelige mus. - Brug 1 BAT pad for 3 ChIPs. Flere BAT pads kan behandles samtidig indtil sonikering.
- Bitmapgenkendelse hver BAT pad i 10 mL af phosphat bufferet saltvand (PBS) indeholdende 1% formaldehyd i 15 min. roterende på 150 omdr. / min. ved stuetemperatur (RT).
- Dæmpning crosslinking ved at tilføje 2,5 M Glycin til en endelig koncentration på 125 mM i 5 min, roterende på 150 rpm på RT.
- Overføre BAT pad til 500 µL af hypotonic lysisbuffer (10 mM HEPES, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 0,5 mM DTT, 0,2 mM PMSF) og tilføje 2 rustfrit stål perler (størrelse: 3,2 mm diameter, se Tabel af materialer) for hver BAT pad. Bruge en perle-baserede væv homogeniseringsapparat (Se Tabel af materialer) til at makulere væv.
- Start med 5 min på max power. Hvis det er nødvendigt, udvide tiden, indtil væv er homogeniseret og enkelt celler er adskilt. Overføre prøverne til en ny tube og centrifugeres ved 4 ° C på 16.000 x g i 10 min.
- Efter centrifugering, overføre supernatanten ind i et nyt rør og holde celle pellet på is. Der centrifugeres supernatanten ved 4 ° C på 16.000 x g i 10 min. til at forhindre tab af flydende celler. Endelige supernatanten og resuspend begge celle pellets sammen i 300 µL af SDS lysisbuffer (SDS 1%; EDTA 10 mM; Tris-HCl pH 8, 50 mM) med 1 x protease inhibitor (Se Tabel af materialer). Der inkuberes i isbad i 10 min.
- Der sonikeres lysates for at generere DNA fragmenter 200 – 500 basepar lang. Efter ultralydbehandling, fjerne snavs ved centrifugering i 10 min på 16.000 x g ved 4 ° C og kontrollere succes af sonikering via DNA elektroforese på en 1%-agarosegel. For en medium-størrelse gel, køre på 120 V; en god adskillelse er opnået efter 45 min.
Bemærk: Sonikering optimering kan være nødvendigt at opnå ordentlig størrelse af fragmenter. Med den valgte sonikator (Se Tabel af materialer), dette kræver 2 gange på 320 W udgangseffekt og 20 KHz frekvensen i 10 min, ved hjælp af cyklusser af 30 s på/30 s off. - Fortyndes den supernatanten brøkdel 10-fold (endelige rumfang er 3 mL for hver BAT pad) i ChIP fortynding buffer (SDS 0,01%; Triton 1.1%; EDTA 1,2 mM; Tris-HCl pH 8, 16,7 mM; NaCl 167 mM) med 1 x protease inhibitor. Holde udtaget 1% af denne kromatin løsning (svarende til 30 µL til 3 mL) som ChIP input. Holde indgangene natten over ved 4 ° C (indtil trin 2.4).
Note: Den ovenstående brøkdel vil give input henvisningen til relative kvantificering af immunoprecipitated materiale i forhold til mængden af DNA i hver prøve før immunoprecipitation. - Tilføje ChIP antistof (Se Tabel af materialer for antistoffer bruges her som eksempel) til 1 mL af kromatin opløsning og inkuberes natten over ved 4 ° C med rotation. Udføre parallel immunoprecipitation med tilsvarende pre immun IgG, hvis den er tilgængelig, eller normal IgG af samme art (fx., regelmæssig kanin IgG hvis antistoffet er produceret i en kanin). Alternativt, gemme 1 mL af kromatin løsning til en no-antistof kontrol.
Bemærk: Den optimale mængde antistof bør bestemmes eksperimentelt for hver nyt antistof, hvis antistof koncentration ikke er kendt. Ellers er 2 – 5 µg antistof en rimelig grundbeløb til at bruge. Brug ChIP-grade antistoffer når det er muligt, eller antistoffer, der er blevet valideret for immunoprecipitation.
2. dag 2: Indsamling af de immunkomplekser
- Tilsæt 50 µL af Protein A Agarosen 50% gylle til de immunkomplekser og Inkuber i 1 time ved 4 ° C med rotation på 150 rpm.
-
Pellet perlerne ved centrifugering for 1 min på 100 x g ved 4 ° C. Udføre sekventielle vasker af perlerne med buffere af stigende strenghed.
- Første, vask med lavt saltindhold vaskebuffer (150 mM NaCl; Tris-HCl pH 8, 20 mM; EDTA 2 mM; Triton-X 1%; SDS 0,1%), og derefter med høj-salt vaskebuffer (500 mM NaCl; Tris-HCl pH 8, 20 mM; EDTA 2 mM, Triton-X1%; SDS 0,1%), og derefter med LiCl vask (0,25 M LiCl; Tris-HCl pH 8, 10 mM; EDTA 1 mM; Igepal 1%; deoxicholate 1%), og endelig med 1 x TE (Tris-HCl pH 8, 10 mM; EDTA).
- Udføre alle vasker på 0,45 µm PVDF centrifugal filter kolonner (Table of Materials) ved første overførsel af perler i kolonnerne ved hjælp af 500 µL af lavt saltindhold wash buffer. Pellet perler i kolonnerne for 3 min på 2.500 x g. Kassér gennemstrømnings- og Gentag 1 gang for alle vask buffere listet taktfast 2.2.1.
- Når vasker er fuldført, elueres af immunkomplekser ved at tilføje 300 µL af eluering buffer 1% SDS, 0,1 M NaHCO3) til pelleted perlerne i kolonnerne. Der inkuberes ved RT i 30 min. på en shaker på 400 rpm. Eluatet opsamles af spinning ned kolonner for 3 min på 2.500 x g i en frisk tube.
- Vende krydsbindinger ved at inkubere eluatet og indgange indsamlet trin 1.9 ved 65 ° C natten over.
3. dag 3: Inddrivelse af DNA med fenol/Chloroform udvinding
- Tilsæt 300 µL af phenol: chloroform: IAA, 1:1 til eluat og input. Vortex for 10 s.
- Spin ved 4 ° C i 15 min på 21.000 x g. Overføre supernatanten til en frisk tube. Tilføje 3 µL af glykogen, 30 µL 3 M natriumacetat og 750 µL koldt 100% ethanol. Vortex for 10 s. opbevares ved-80 ° C i 2 timer.
- Spin ned på 21.000 x g ved 4 ° C i 20 min., holde pelleten, og supernatanten. Vask pellet med 1 mL koldt 70% EtOH, så spin ned på 21.000 x g ved 4 ° C i 5 min. supernatanten og lufttørre pellet.
- Resuspenderes i 70 µL DNAse-frit vand.
- Gå videre til trin 4 for at teste kromatin belægning på specifikke genomisk regioner af kvantitative Polymerasekædereaktionen (qPCR) eller til trin 5 for at forberede prøverne til sekvensering.
4. analyse af ChIP ved hjælp af qPCR (Single/Multiple gener udlæsning)
- Fortynd input DNA fra trin 3.4 til at generere en standard reference kurve. Serielle fortyndinger på 1/10, 1/100, og 1/1000 er normalt tilstrækkelig til at fange det lineære område, men yderligere fortyndinger kan være påkrævet til mere koncentreret prøver.
- For hvert tabelpar, primer (her, har vi brugt primere rettet mod NDUFV1 og TOMM20 projektledere), forberede to sæt af qPCR reaktioner: en ved hjælp af de fortyndede input prøver fra trin 4.1, og en anden med DNA-prøver isoleret af immunoprecipitation fra trin 3.4. Udføre hver reaktion i tre eksemplarer.
Bemærk: Reaktioner kan sættes op i parallel til flere gener ved hjælp af 96 - eller 384-godt plader. - Oprette en reaktion volumen af 10 μl pr. brønd med 5 μl af 2 x PCR mix (Table of Materials), 1 μL af primer blandes (1 μM fremad primer og 1 μM omvendt primer), og 4 μL af DNA fra ChIP (eller input kontrol).
- Kort spin ned på pladen.
- Køre qPCR reaktioner på en real-time PCR system ved hjælp af den protokol, der anbefales af fabrikanten til reagens påvisning (Tabel af materialer). Her har vi brugt følgende betingelser: 1) 1s ved 95 ° C i 1 cyklus; 2) 1 s ved 95 ° C efterfulgt af 20 s på 60 ° C i 45 cykler; 3) 15 s ved 95 ° C efterfulgt af 60 s på 60 ° C efterfulgt af 15 s ved 95 ° C i 1 cyklus.
Bemærk: Kontrollere dissociation kurve: tilstedeværelsen af et højdepunkt i den termiske dissociation plot tyder på en enkelt amplikon genereres fra PCR reaktionen. Hvis mere end én peak er visualiseret, er dette potentielt vejledende af flere, ikke-specifik amplikoner; i så fald anbefaler vi design af alternative primer par. - Bestemme den lineære fase af eksponentielle forstærkning af PCR reaktionen for hver primer af beregning af standardkurven benytter serien af fortyndede genomisk DNA i trin 4.1. Ifølge Ct (cyklus tærskel) værdi.
- Hvis Ct værdi af DNA fra ChIP og input kontrol inden for den lineære vifte af Ct værdi, beregne berigelse af DNA fra ChIP i forhold til input, ifølge fortyndingsfaktoren af DNA fra ChIP og input kontrol i trin 4.1.
5. forstærkning af DNA fra ChIP for høj overførselshastighed sekventering (Genome-wide udlæsning)
Bemærk: Dette trin kan outsourcet til en akademisk core facilitet eller kommercielle sekventering selskab, når sekventering kapaciteter ikke der findes in-house.
- Forberede et DNA bibliotek fra den udpakkede DNA med en passende ChIP bibliotek forberedelse kit (Se Tabel af materialer) efter fabrikantens anvisninger.
- Sekvens bibliotek på en høj overførselshastighed sekventering system, ved hjælp af 50 bp single-ende som udlæsning (Se Tabel af materialer).
Bemærk: Ifølge ChIP-seq retningslinjer foreslået af ENCODE6, anbefales et minimum af 10 millioner lyder for pattedyr genomer.
6. rå dataanalyse
- Udføre kvalitetskontrol på rå sekventering læsninger ved hjælp af FastQC8.
Bemærk: Fælles sekventering kvalitet målinger omfatter pr. base sekvens kvalitet, per base sekvens indhold, per sekvens GC indhold, sekvens længde og sekvens dobbeltarbejde niveauer. Generelt, en Læs kvalitetsresultat af Q > 30 på tværs af hvert base holdning er udtryk for høj kvalitet sekventering resultater. Fordelingen af GC indhold på tværs af alle læser bør groft ligne en normalfordeling, med en top, centreret omkring artens faktiske genomisk GC indhold procentdel. - Fjern eventuelle sekventering adapter forurening og lav kvalitet læser gennem Læs trimning nytte Trimmomatic9.
Bemærk: Gennemført standardparametre angiver fjernelse af platform afhængige adaptere, fjernelse af foranstillede og efterstillede lav kvalitet baser, og brug af en 4-base bred skydevinduet til trim læser når den gennemsnitlige kvalitet pr. base falder under en angivet tærskel. - Juster forarbejdede læser til mus MM10 reference genom10 med Bowtie2 aligner11 ved hjælp af standardparametre.
- Filtrer justeret læser ved at fjerne dem med en Bowtie2 kortlægning kvalitet score (MAPQ) på mindre end 10 ved hjælp af Samtools12.
- Bestemme forskellige efter justering kvalitet målinger såsom procent lyder kortlagt, strand cross-korrelation, kumulative læse dækning, og prøven replikere reproducerbarhed.
Bemærk: Forskellige pakker herunder SPP13, ChIPqc14, og Deeptools15 er tilgængelige til at beregne disse quality metrics. - Udføre peak kaldende analyse med en styring af input eller passende KO prøve benytter MACS algoritme (MACS2)16 med standardparametre.
- Fjern eventuelle kaldet toppe, der overlapper med kendte blacklistede områder17 fra mm10 anmærkning med Bedtools18.
Bemærk: Blacklistede områder er områder, der har vist sig at have høj signal eller Læs tæller uafhængig af cellelinie eller sekventering teknik i genomet. Disse regioner vise kunstigt høje artefakt signaler i visse områder af genomet, der kan filtreres ud af funktionelle genomisk sekventering eksperimenter. Alle replikater bør behandles selvstændigt gennem rørledningen og kan derefter bruges til irreproducibility opdagelse sats (IDR). IDR er ansat til at måle reproducerbarhed af resultaterne mellem replikater gennem metoden, som beskrevet af Li, Brown, Huang og Bickel19,20. Metoden IDR kvantitativt vurderer sammenhængen mellem replikater og anbefales af ENCODE og modENCODE som en del af deres ChIP-seq retningslinjer. - Bruge statistisk signifikant toppe for forskellige downstream analyser som gen ontologi21,22, berigelse eller motiv analyse23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1: ChIP validering af qPCR. ChIP-qPCR analyse af repræsentant GPS2 målrette gener NDUFV1 (venstre) og TOMM20 (til højre) i BAT af WT og GPS2-AKO mus, viser relative ændringer i niveauet af H3K9 methylering og binding, GPS2 og Pol2. Bar grafer repræsenterer stikprøvens middelværdi af 3 flergangsbestemmelser med * p < 0,05 og ** p < 0,01 beregnet med Student's t-test. Dette tal er ændret fra Cardamone et al.2. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Eksempler af ChIP-qPCR ved hjælp af BAT isoleret fra WT eller GPS2-AKO mus er vist i figur 12. Efter at have fundet, at GPS2 var påkrævet for udtryk for nuklear-kodet mitokondrielle gener i forskellige celle linjer2, testede vi ansættelse af GPS2 på to specifikke nukleare-kodet mitokondrielle gener, NDUFV1 og TOMM20, i BAT fra mus som et eksempel på en væv, der er stærkt beriget i mitokondrierne. Vi sammenlignede først GPS2 promotor belægning i GPS2-AKO mus og vildtype littermates, observere en forventet nedgang i GPS2 bindende på selektiv target gener i BAT fra GPS2-AKO mus. Ved hjælp af protokollen beskrevet her, indspillet vi også øget binding af RNA polymerase 2 (Pol2) og undertrykkende Histon mark H3K9me3 i BAT fra GPS2-AKO mus i forhold til vildtype littermates. For alle antistoffer var bindingen betydeligt i forhold til baggrunden signalet observeret i IgG kontrolprøve. Disse resultater bekræfter ansættelse af GPS2 på udvalgte nukleare-kodet mitokondrielle gener og viser, at GPS2 er påkrævet for at forhindre ophobning af H3K9me3, og dermed kræves til stalling Pol2 transcriptional aktivitet på target initiativtagere. Se Tabel af materialer for flere detaljer om antistoffer og den oprindelige publikation for yderligere data og mere omfattende diskussion af disse resultater2.
Figur 2: Plot af kvaliteten scorer fra rå sekventering læser isoleret fra BAT. (A) kvalitetsresultater afspejler en forudsigelse af sandsynligheden for en fejl under base-kald. Det er almindeligvis udtrykt som en heltalsværdi, Q = - 10log10(P), i hvilken P er sandsynligheden for fejl i base-kald. Vist ovenfor er en pr. base sekvens kvalitet plot genereret af FastQC baseret på rå, uforarbejdede sekventering læser genereret fra BAT. (B) GC indhold distribution af læser efter adapter fjernelse og Læs trimning fra BAT prøver. GC indhold bør nogenlunde ligner en normal fordeling med en top, centreret omkring artens faktiske brøkdel af GC genomisk indhold. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
I figur 2, sekventering kvalitet score er vist på en per base niveau, og læser kan videreforarbejdes ved trimning kontaminering resterende adapter og fjerne læser hvor den gennemsnitlige kvalitetsresultat på tværs af en glidende vindue falder til under et angivne tærskel. Også vist er GC indhold distribution på tværs af læser efter adapter fjernelse og Læs trimning. Sekvens kvalitet og GC indhold distribution er to udbredte anvendes målinger til vurdering næste generation sequencing data før beregningsmæssige analyser er udført. Disse resultater viser, at protokollen producerer en tilstrækkelig mængde af høj kvalitet kromatin isoleret fra BAT, der er kompatible med downstream næste generation sequencing teknologier.
Figur 3: normaliseret stor kanon filer genereret fra ChIP-seq data fra BAT af WT og GPS2-AKO mus. Denne figur viser de normaliserede Læs dækning langs Slc25a25 gen locus med et betydeligt kaldet peak i promotor-regionen. GPS2 blev vist til at regulere udtrykket af nuklear-kodet mitokondrielle gener ved at ændre kromatin status for mål gen initiativtagere. Disse resultater vise visualiseringen af et betydeligt kaldet højdepunkt på et repræsentativt nukleare-kodet mitokondrie gen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Vist i figur 3 er stor kanon spor af WT og GPS2-AKO tilpasset BAM filer normaliseres til 1 x dybde (læser per genom dækning) som implementeret i deepTools. Vist er tilstedeværelsen af en statistisk signifikant peak beliggende i regionen promotor af mitokondrie-genet Slc25a25. De normaliserede spor tillade visualisering af berigelse af læser svarende til den såkaldte peak og reduktion af læser på denne placering i BAT af GPS2-AKO mus i forhold til vildtype littermates.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen beskrevet her repræsenterer et værdifuldt redskab til at udføre ChIP fra murine væv, specielt optimeret til brunt fedtvæv. En af de større udfordringer i at udføre ChIP fra væv er at inddrive et tilstrækkeligt antal celler under forberedelse af prøver. Klipning BAT ved hjælp af en væv homogeniseringsapparat blender kombineret med rustfrit stål perler i stedet for en kanonisk glas pistil betydeligt reducerer antallet celler tabt på grund af ubrudt væv. Derudover hjælper homogenisering væv direkte i en hypotonic buffer udgivelsen af lipider, der kan derefter nemt adskilt og fjernet fra kerner via højhastigheds centrifugering.
Ordentlig sonikering er også kritisk for at udføre konsekvent og reproducerbar ChIP assays. Brugen af et vand bad ultra-sonikator tillader samtidig behandling af flere prøver, dermed forbedre reproducerbarhed af kromatin klipning og mindske risikoen for prøven krydskontaminering. Desuden brug af en temperatur-kontrolleret sonikering system reducerer overophedning af prøver, som bør undgås for at forhindre prøve nedbrydning og tab af epitop anerkendelse af antistoffet (Se Tabel af materialer for detaljer).
En anden udfordrende skridt er inddrivelse af immunoprecipitated komplekser. Magnetiske perler foretrækkes ofte til dette trin, fordi de giver mulighed for hurtigere og mere effektiv vasker når det bruges sammen med en magnetisk rack. Men de har en lavere sats på DNA opsving i forhold til Protein A agarosegelelektroforese, som kan være en alvorlig begrænsning, når du arbejder med små beløb af starter materiale. Vi finder, at kombinationen af Protein A Agarosen gylle med PVDF 0,45 µm centrifugal filter kolonner er en fantastisk løsning til at opnå maksimale DNA udbytte med minimal vask tid og højere reproducerbarhed.
Vedrørende DNA isolation, masser af kolonner-baseret DNA isoleret kits kan bruges. Vores erfaring er en begrænsning af denne tilgang kolonnerne kapacitet til at have en effekt på udbyttet af DNA opsving. For at overvinde problemet, foretrækker vi at bruge en mere traditionel metode som fenol/chloroform til DNA-ekstraktion.
Børsnoterede ChIP-seq rørledningen inkorporerer en række bredt accepteret værktøjer og hjælpeprogrammer til næste generation sequencing eksperimenter. Kort, lyder underkastes grundlæggende kvalitetskontrol ved hjælp af FastQC og Trimmomatic, så justeres til mus MM10 genom ved hjælp af Bowtie2. Overlevende læsninger er filtreret efter kortlægning kvalitet inden det anvendes til peak kald via MACS2 algoritme. Dog skal det bemærkes, at andre tilgængelige og validerede redskaber kan også anvendes alt efter arten af det eksperiment og data bliver genereret. Brug af enhver tilpassede parametre under forbehandling, justering eller peak kald kan også være hensigtsmæssigt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bullet Blender Tissue Homogenizer | Next Advence | BBX24 | |
| Stainless Steel Beads 3.2 mm Diameter | Next Advence | SSB32 | |
| Bioruptor Sonicator | Diagenode | ||
| 1.5 mL Micro Tube TPX Plastic | Diagenode | C30010010-5 | |
| Complete-Protease inhibitor | Roche | 11836145001 | |
| Protein A Agarose Slurry | Invitrogen | 101041 | |
| GPS2 antibody | In house | Rabbit polyclonal, Ct antibody (Cardamone et al., Mol Cell 2018) | |
| Pol2 antibody | Diagenode | C15100055 | |
| h3K9me3 antibody | Millipore | 05-1242 | |
| Fast Syber Green Master Mix | Aplied Biosytem | 4385612 | |
| ViiA7 | Aplied Biosytem | ||
| TruSeq ChIP Library Preparation Kit | Illumina | IP-202-1012 | |
| HiSeq 2000 | Illumina |
References
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. , (2004).
- Cardamone, M. D., et al. Mitochondrial Retrograde Signaling in Mammals Is Mediated by the Transcriptional Cofactor GPS2 via Direct Mitochondria-to-Nucleus Translocation. Molecular Cell. 69, (2018).
- Emmett, M. J., et al. Histone deacetylase 3 prepares brown adipose tissue for acute thermogenic challenge. Nature. , (2017).
- Harms, M. J., et al. PRDM16 binds MED1 and controls chromatin architecture to determine a brown fat transcriptional program. Genes & Development. , (2015).
- Shapira, S. N., et al. EBF2 transcriptionally regulates brown adipogenesis via the histone reader DPF3 and the BAF chromatin remodeling complex. Genes & Development. , (2017).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22, 1813-1831 (2012).
- Liisberg Aune, U., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells. Journal of Visualized Experiments. , e50191 (2013).
- Andrews, S. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc (2010).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30, 2114-2120 (2014).
- Genome Browser Gateway. , Available from: https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway?db=mm10 (2018).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. , 357-359 (2012).
- Li, H., et al. The Sequence alignment/map (SAM) format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins. Nature Biotechnology. 26, 1351-1359 (2008).
- Carroll, T. S., Liang, Z., Salama, R., Stark, R., de Santiago, I. Impact of artifact removal on ChIP quality metrics in ChIP-seq and ChIP-exo data. Frontiers in Genetics. 5, 75 (2014).
- Ramírez, F., et al. deepTools2: A next Generation Web Server for Deep-Sequencing Data Analysis. Nucleic Acids Research. , (2016).
- Zhang, Y., et al.
- ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).
- Li, Q., Brown, J. B., Huang, H., Bickel, P. J.
- Irreproducible Discovery Rate (IDR). , Available from: https://github.com/nboley/idr (2018).
- The Gene Ontology Consortium. Expansion of the Gene Ontology Knowledgebase and Resources. Nucleic Acids Research. 45, D331-D338 (2017).
- Ashburner, M., et al. Gene Ontology: tool for the unification of biology. Nature Genetics. 25, 25-29 (2000).
- Boeva, V. Analysis of Genomic Sequence Motifs for Deciphering Transcription Factor Binding and Transcriptional Regulation in Eukaryotic Cells. Frontiers in Genetics. 7, 24 (2016).
