Summary
ここの褐色脂肪組織 (BAT) マウスから分離した高スループット DNA シーケンス (チップ seq) 続いて効率的なクロマチン免疫沈降 (チップ) のためのプロトコルについて述べる。このプロトコルは、ヒストン修飾のマッピングとゲノムワイド興味の生体内の非ヒストン蛋白質のローカリゼーションを調査の両方に適しています。
Abstract
ほとんどの携帯電話のプロセスは、プログラム特定の遺伝子の転写調節によって規制されています。このような変調は、幅広い転写因子 (TFs) と転写活性化とクロマチン構造の変化を介して抑制を仲介する因子の結合されたアクションによって実現されます。クロマチン免疫沈降 (チップ) はヒストン修飾のマッピングと DNA 結合転写因子/補因子をプロファイリング、従って異なった時に発生する動的核変化のスナップショットを提供するための便利な分子生物学的アプローチ生物学的プロセス。
脂肪組織における転写制御を勉強するサンプルの培養細胞培養由来の不死化または一次電池線出発材料が豊富なのために、しばしばチップ試金で好まれている、生物学的変動を低減します。しかし、これらのモデルは、生物における実際のクロマチンの状態の限られたスナップショットを表します。従って、動物モデルから派生した脂肪組織サンプルでチップを実行する最適化されたプロトコルの重要な必要性があります。
ここでのヒストンの修正および褐色脂肪組織 (BAT) マウスから分離された非ヒストン蛋白質の効率的なチップ seq のプロトコルについて述べる。プロトコルは、ゲノムの関心と脂肪質のターミナルの間で形態学的および生理学的に明瞭な組織であるバットのエピジェネティックな遺伝子マーカー蛋白質のローカリゼーションを調査するために最適化されています。
Introduction
一方、白色脂肪組織 (WAT)、エネルギー貯蔵に特化して、褐色脂肪組織 (BAT) は熱エネルギーを介してミトコンドリア脱共役1炭水化物や脂質に変換されることにより熱の形でエネルギーを散らします。この専門にされた機能に応じて、バット デポは体温寒冷暴露、生理的条件でのメンテナンスが必要です。不死化細胞株で切り裂かれたと主なこれらの変更の基礎となる分子機構はほとんどされている遺伝子発現変動バット分化と熱応力は、生体内および生体外で広く研究されている、しながら前脂肪細胞は、いくつかの生体内研究2,3,4,5を除いて。
転写調節を介して特定の遺伝子発現プログラムの規制は、クロマチン構造を介して様々 な転写因子し、共同行動を要因に協調的な変更によって実現されます。クロマチン免疫沈降 (チップ) は、DNA にこれらの要因の募集を調査するため、関連するクロマチン景観変化のプロファイリング貴重な分子生物学的アプローチです。チップの実験の成功の重要な要因には、架橋条件とクロマチン異なるサンプル全体にせん断の一貫性、適切な開始材料と、最も特に、抗体の品質の可用性の最適化が含まれます。チップを実行すると全体の組織から、また、サンプルの不均一性を考慮し、核分離の効率を改善するためにプロトコルを最適化することが重要だ、後者特に機密性の高いステップのために脂肪組織を操作するとき高脂質内容。実際には、全体脂肪デポから分子の分離技術は、トリグリセリドの高いレベルの存在によって複雑なし、クロマチン分離の量増やすにはプロトコルに最適化しなければなりません。最後に、チップ DNA の隔離後高スループット シーケンスを実行すると、シーケンス処理深さは自信を持って検出されたピークの数を決定する重要です。
ここでは、作業標準とベスト プラクティスについては、エンコードと modENCODE するためのコンソーシアム6推奨チップ seq 実験のための一般的なガイドラインを参照してください我々 と我々 はバットからチップ seq に最適化されるプロトコルの手順説明に焦点を当てます。記述されていたプロトコルは、脂肪組織からクロマチンの効率的な分離、拡散信号とヒストンと同様、明確に定義されたピークを持つ DNA 結合因子のゲノム シーケンスを実行するには
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Protocol
プロトコルの動物の処理手順は、ボストン大学の制度的動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) によって承認されています。
1. 1 日目: 郭清とクロマチン免疫沈降 (チップ) のバットの準備
- 二酸化炭素 (CO2) チャンバーを用いたマウスを安楽死させるし、すぐに解剖を行うその後。切開の前に 70% エタノール スプレー マウス毛皮。首に沿って皮膚をオープンしカット上向き、その背にマウスを配置します。肩の皮膚の下に直接バットを探します (肩甲骨間、慎重にする必要がある白い脂肪の薄い層で、蝶の形の 2 つの葉は、7を削除と表示されます)。
注:各バットの葉は、通常食事ダイエット (27 と 30 g の間この年齢範囲でマウスの重量) を供給されている 3 ヶ c57bl/6 j マウス、約 1 cm 長いです。バット デポの総重量は、男性と女性の両方のマウスの約 0.15 g です。 - 3 チップで 1 バット パッドを使います。超音波まで複数バット パッドを同時に処理することができます。
- 架橋各バットは、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 含まれている 1% のホルムアルデヒド 15 分室温 (RT) で 150 rpm で回転のための 10 mL のパッドします。
- 2.5 M のグリシンを 125 mM 室温 150 rpm で回転、5 分間の最終的な集中に追加することによって架橋を消す
- バット pad を 500 μ L の低張性換散バッファー (10 mM HEPES、MgCl2、1.5 mM 10 mM KCl、0.5 mM DTT、0.2 mM PMSF) に転送し、2 ステンレス ビーズを追加 (サイズ: 直径 3.2 mm、材料表を参照してください) 各バット パッド。ビーズに基づく組織ホモジナイザーを使用 (材料の表を参照)、組織を細断処理します。
- 最大パワーで 5 分で開始します。必要な場合は、組織を均質になるまでの時間を延長、単一セルが区切られます。新しい管に 16,000 x gで 4 ° C で 10 分間遠心するサンプルを転送します。
- 遠心分離の後新しいチューブに上清を移すし、氷の上細胞ペレットを維持します。浮遊細胞の損失を防ぐために 10 分間、16,000 x g で 4 ° C で上清を遠心します。最終的な上澄みを廃棄し、SDS 換散バッファーの 300 μ L で一緒に両方の細胞のペレットを再懸濁します (SDS 1% です。EDTA 10 mM;Tris-HCl pH 8、50 mM) プロテアーゼ阻害剤 1 (材料の表を参照してください)。氷上で 10 分間インキュベートします。
- DNA フラグメント 200-500 塩基対を生成する溶解液を超音波照射します。超音波処理後、4 ° C で 16,000 x gで 10 分間遠心分離によって残骸を削除し、超音波を介してDNA 電気泳動 1% アガロースゲルの成功を確認します。中型ゲル 120 V で実行します。45 分後、良い分離を実現します。
注:超音波処理の最適化は、フラグメントの適切なサイズを達成するために必要があります。選択した超音波発生装置で (材料の表を参照)、オフ 30 s/30 上のサイクルを使用して 320 W の出力電力、10 分の 20 の KHz の周波数で 2 回必要があります。 - 上清画分を 10 倍希釈 (最終巻は各バット パッド 3 mL) チップ希釈バッファー内 (SDS 0.01%;トリトン 1.1%;EDTA 1.2 mM;トリス塩酸 pH 8、16.7 mM;塩化ナトリウム 167 mM) 1 プロテアーゼ阻害剤。チップの入力としてこのクロマチン ソリューション (3 mL の 30 μ L に等しい) の 1% は脇します。一晩 (ステップ 2.4) まで 4 ° c に入力を維持します。
注: 上記の分数は免疫沈降する前に各サンプルで現在の DNA の量と比較して沈澱物の相対的な定量化のため入力のリファレンスを提供します。 - チップ抗体を追加 (使用される抗体の材料表を参照してくださいここでは例として) クロマチン溶液 1 mL に 4 ° C 回転で一晩インキュベートし、。対応する前免疫 IgG、可能な場合、または同じ種の通常 IgG と並列免疫沈降を実行 (e.g。 通常、ウサギ IgG の抗体はウサギの場合)。また、抗体なしコントロールのクロマチン溶液 1 mL を保存します。
注:最適な抗体の量は抗体濃度がわからない場合各の新しい抗体のための実験的に決定する必要があります。それ以外の場合、抗体の 2-5 μ g は使用する適度な開始です。免疫沈降用抗体チップ グレード可能な限り、または検証されている抗体を使用します。
2 免疫の複合体の 2 日目: コレクション
- 免疫複合体に蛋白質 A アガロース 50% スラリーの 50 μ L を追加し、150 rpm で回転で 4 ° C で 1 時間インキュベートします。
-
4 ° C で 100 × gで 1 分間遠心分離によってビーズをペレットします。逼迫化バッファーとビーズの連続洗浄を実行します。
- まず、減塩洗浄バッファー (150 mM NaCl; で洗うトリス塩酸 pH 8、20 の mM;EDTA 2 mM;トリトン X 1%;SDS 0.1%)、高食塩洗浄バッファー (500 mM NaCl; とトリス塩酸 pH 8、20 の mM;EDTA 2 mM、トリトン X1%;SDS 0.1%)、それから LiCl 洗浄 (0.25 M LiCl;トリス塩酸 pH 8、10 mMEDTA 1 mM;Igepal 1% です。deoxicholate 1%) と最後に 1 x TE (トリス塩酸 pH 8、10 mM のEDTA)。
- 最初 500 μ L 低塩洗浄バッファーの列にビーズを転送することによってすべて洗浄 0.45 μ m PVDF 遠心フィルター列 (テーブルの材料) を実行します。2,500 x gで 3 分の列でビーズをペレットします。流れを破棄し、2.2.1 の手順に記載されているすべての種類の洗浄バッファーの 1 時間を繰り返します。
- 洗浄が完了した後は、免疫複合体を 300 μ L の溶出バッファー 1 %sds、0.1 M NaHCO3を追加することによって溶出) 列の小球形にされたビーズに。RT で 400 rpm でシェーカー上で 30 分間インキュベートします。2,500 x g新鮮なチューブで 3 分の列をスピンダウンによって溶出液を収集します。
- クロスリンクを逆方向には、溶出液と一晩ステップ 1.9 65 ° c で収集された入力をインキュベートします。
3. 3 日目: フェノール/クロロホルム抽出 DNA の回復
- フェノール: クロロホルム: IAA、溶出液の入力への 1:1 の 300 μ L を追加します。渦 10 s。
- 21,000 × gで 15 分の 4 ° C で回転します。新鮮なチューブに上清を転送します。冷たい 100% エタノールの 750 μ、30 μ L の 3 M 酢酸ナトリウム、グリコーゲンの 3 μ L を追加します。-80 ° c 2 h で 10 s. ストアの渦。
- 4 ° C、20 分で 21,000 x g でスピンダウンし、ペレットを上澄みを廃棄します。洗浄ペレット 1 ml の冷たい 70% のエタノール、そしてスピン ・ ダウン 4 ° C、5 分で 21,000 x gで上澄みを廃棄し、ペレットを風乾します。
- DNAse 自由な水の 70 μ L でペレットを再懸濁します。
- 手順 4 の量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) によって特定ゲノム領域のクロマチンの占有率をテストするためにまたはシーケンスのサンプルを準備するための 5 ステップに進みます。
4. qPCR (Single/Multiple 遺伝子読み出し) を用いたチップの解析
- 3.4 標準曲線を生成するためのステップから入力 DNA を希釈します。シリアル希薄の 1/10、1/100、1/1000 が通常線形範囲をキャプチャするのに十分なさらに希釈液がより集中しているサンプルに必要な可能性があります。
- 各プライマーのため (NDUFV1 と TOMM20 プロモーターのプライマーを使用している私たち、ここで) は、qPCR 反応の 2 つのセットを準備: ステップ 3.4 から免疫沈降で分離された DNA サンプルと手順 4.1、および 2 番目から希薄化後の入力サンプルを使用して 1 つ。3 通の各反応を実行します。
注:反応は 96 または 384 ウェル プレートを用いた複数の遺伝子を同時に設定できます。 - 2 x PCR ミックス (材料表) の 5 μ l/ウェルあたり 10 μ L の反応量を設定、プライマーの 1 μ L ミックス (1 μ M 前方プライマーと 1 μ M 逆プライマー) と DNA チップ (または入力コントロール) からの 4 μ L。
- プレートを簡単にスピンします。
- 検出試薬 (材料表) の製造元が推奨するプロトコルを用いたリアルタイム PCR システムの qPCR 反応を実行します。ここで我々 は次の条件を使用している: 1) 1 サイクル 95 ° C で 1 秒2) 1 95 ° c s に続いて 20 45 サイクル 60 ° C で s3) 15 95 ° c s に続いて 60 60 ° c s に続いて 15 1 サイクル 95 ° C で s。
注:解離曲線をチェック: 熱解離プロットで 1 つのピークの存在を示唆している単一私アンプリコン、PCR の反作用から生成されます。複数の非特異的産物; の可能性があることを示して 1 つ以上ピークが視覚化される場合その場合、代替のプライマーの設計をお勧めします。 - 4.1 の手順で希釈した DNA のシリーズを使用して標準曲線を計算した各プライマーのため PCR の反作用の指数関数的増幅の直線位相を決定します。Ct (サイクルしきい値) 値によると。
- DNA チップと入力コントロールからの Ct 値は線形範囲の Ct 値の中で、チップおよび 4.1 のステップの入力コントロールからの DNA の希釈係数によると、入力に対する DNA チップからの濃縮を計算します。
5. 高スループット シーケンス (ゲノム読み出し) のチップからの DNA の増幅
注:この手順は、シーケンス機能が社内利用できない場合学術中核施設または商業シーケンス会社に委託できます。
- 適切なのチップ ライブラリ準備抽出した DNA から DNA ライブラリの準備 (材料の表を参照) をキット製造元の指示に従います。
- 読み出しとしてシングル エンド 50 bp を使用して高スループット シーケンス システムのライブラリをシーケンス (材料の表を参照してください)。
注:エンコード6によって提案されたチップ seq のガイドラインによると哺乳類のゲノムの 1000 万読み取りの最小値お勧めします。
6. 生データの分析
- FastQC8を使用して raw 配列読み取りで品質管理を実行します。
注:塩基品質あたり、塩基配列コンテンツにつき、シーケンス GC コンテンツ、シーケンスの長さ、およびシーケンス重複レベルごと、一般的なシーケンスの品質の指標が含まれます。読み取り品質スコアでは一般的に、Q > 各基本の位置で 30 は高品質のシーケンスの結果を示しています。すべての読み取り中の GC コンテンツの配布約種の実際ゲノム GC 含有率を中心としたピークを持つ正規分布のようになります。 - シーケンス アダプター汚染と低画質読み取り読み取りユーティリティ Trimmomatic9をトリミングを削除します。
注:プラットフォーム依存アダプターの除去、トリミングした時に読み込むに 4 ベースの広いスライディング ウィンドウの先頭と末尾の低品質基盤の取り外しそして使用実装されている既定のパラメーターを指定する指定されたしきい値以下基本滴あたり平均品質。 - 既定のパラメーターを使用して Bowtie2 アライナ11マウス MM10 参照ゲノム10処理された読み取りを合わせます。
- Bowtie2 マッピング品質とのそれらを削除することによって一直線に並べられた読み取りのフィルター処理 (MAPQ) を Samtools12を使用して 10 未満のスコアします。
- % 読み取りのマップ、ストランド相互相関、累積的なカバレッジ、およびサンプルの複製再現性を読む様々 なポスト配置品質基準を決定します。
注: SPP13を含む様々 なパッケージ、ChIPqc14Deeptools15これら品質メトリックスを計算します。 - 入力コントロールまたは既定のパラメーターを持つ MAC アルゴリズム (MACS2)16を使用して適切な KO サンプルでピーク呼び出し解析を実行します。
- Bedtools18を使用して mm10 アノテーションから知られているブラック リスト地域17と重複するすべてのと呼ばれるピークを取り除きます。
注:ブラック リストの領域は、高信号または細胞またはシーケンス技術と無関係に読み取り数を持っている示されているゲノムの領域です。これらの地域は、機能ゲノム シーケンス実験からフィルターできますゲノムの特定の地域に人為的に高くアーティファクト信号を表示します。すべてレプリケート パイプラインを介して個別に処理する必要があり、irreproducibility 発見率 (IDR) を使用できます。IDR を採用 Bickel、黄、茶色李19,20で説明されているようにメソッドを介して複製間の調査結果の再現性を測定します。IDR 法は定量的複製間の一貫性を評価し、チップ seq ガイドラインの一部としてエンコードし、modENCODE をお勧めします。 - 遺伝子オントロジーの21,22濃縮、またはモチーフ解析の23など様々 な下流解析のための統計的に有意なピークを使用します。
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Representative Results
図 1: qPCR による検証をチップします。代表 GPS2 のチップ qPCR 解析ターゲット遺伝子NDUFV1 (左) TOMM20 (右) H3K9 メチル化と GPS2 と Pol2 のバインディングのレベルの相対的な変化を示す WT と GPS2 赤穂マウスのバット。バー グラフと 3 複製の標本平均を表す * p < 0.05 と * * p < 0.01 スチューデントの t 検定と計算されました。カルダモンからこの図を変更ら2。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
例チップ qPCR の WT または GPS2 赤穂マウスから分離したバットを使用して、図 12.に示すように。我々 はで 2 つ特定核エンコード ミトコンドリア遺伝子NDUFV1とTOMM20GPS2 の募集をテスト GPS2 だった別のセル行2核でエンコードされたミトコンドリア遺伝子の発現に必要なを見つけて、組織のミトコンドリアの高濃縮の例としてマウスからバットします。最初は、GPS2 赤穂マウスからバット選択的標的遺伝子の GPS2 バインディングで期待さ減少を観察、GPS2 赤穂マウスと野生型同腹子の GPS2 プロモーター占有率を比較しました。ここで説明されているプロトコルを使用して、我々 にも記録 (Pol2) RNA ポリメラーゼ 2 の結合の増加と抑圧的なヒストン マーク H3K9me3 野生型同腹子に比べて GPS2 赤穂マウスからバット。すべての抗体の結合 IgG コントロールのサンプルで観測されたバック グラウンド信号と比較して有意であった。これらの結果は、選択したエンコードされた核のミトコンドリア遺伝子の GPS2 の募集を確認し、GPS2 です、H3K9me3 の蓄積を防止するために必要なしたがって Pol2 ターゲット プロモーターの転写活性の失速に必要な表示。抗体と追加データとこれらの結果2のより包括的な議論のための元の文書材料表の詳細についてを参照してください。
図 2: 品質のプロットのスコア生シーケンス リードしていて無重量だから分離された(A) 品質スコア反映ベースの呼び出し中にエラーの確率の予測。Q の整数値で表されます一般的 = - 10log10(P)、ベースの呼び出しでのエラーの確率は、どの P。上の図は、塩基品質あたり FastQC によって生成されたプロット バットから生成生、未処理の配列の読み取りに基づきます。(B) GC アダプターの取り外しと読み取りバット サンプルからトリミング後読み取りのコンテンツ配信。GC 含量約 GC ゲノム コンテンツの種の実際の割合を中心としたピークを持つ正規分布のようになります。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2、品質スコアが表示されます、基本レベルあたり残留アダプター汚染をトリミングし、スライディング ウィンドウ全体平均品質スコアを下回る読み取りを削除する読み取り可能性がありますさらに加工し、指定したしきい値。また、GC のコンテンツ配信の読み取りの間でアダプターの取り外しおよび読み取りトリミング後。シーケンス品質と GC コンテンツ分布は広く、2 つ計算解析を実行する前に、次世代シーケンサーのデータを評価するための指標を使用しました。これらの結果は、プロトコルが下流の次世代シーケンシング技術と互換性があるコウモリから分離された質の高いクロマチンの十分な量を生成することを示します。
図 3: WT と GPS2 赤穂マウスのバットからチップ seq データから生成された大物ファイルを正規化します。この図は、プロモーター領域の大幅と呼ばれるピークとSlc25a25遺伝子の位置に沿って正規化された読み取り範囲を示しています。GPS2 がターゲット遺伝子プロモーターのクロマチンの状態を変えることによってエンコードされた核のミトコンドリア遺伝子の発現を調節する示されました。これらの結果は、代表的な核エンコードのミトコンドリア遺伝子を大幅と呼ばれるピークの可視化を表示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3に示すように、WT の大物トラック、GPS2 赤穂配置 BAM ファイル deepTools に実装されている 1 x 奥行き (ゲノム カバレッジあたりヒット) に正規化されました。Slc25a25ミトコンドリア遺伝子のプロモーター領域にある統計的に有意なピークの存在である示されています。正規化されたトラックと呼ばれるピークと野生型同腹子を基準にして GPS2 赤穂マウスのバットでこの場所で読み取りの削減に対応する読み取りの濃縮の可視化を許可します。
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Discussion
ここで説明されているプロトコルは、マウス組織、褐色脂肪組織用に最適化されたからチップを実行するための貴重なツールを表します。組織からチップを実行する大きな課題の 1 つはサンプル準備の間十分な細胞数を回復します。標準ガラス杵ではなくステンレス ビーズと相まって大幅組織ホモジナイザー ミキサーを使用してバットをせん断切れ目のない組織のため失われた細胞の数が減少します。また、低張性のバッファーに直接組織を均質化し容易に分離でき、高速遠心分離を介して核から削除脂質のリリースに役立ちます。
適切な超音波処理も一貫して再現可能なチップ試金を実行するために重要です。水お風呂超-超音波発生装置の使用クロマチン剪断およびサンプルの交差汚染のリスクを減らすことの再現性を向上させる、複数のサンプルを同時に処理できます。また、超音波処理の温度制御システムの使用削減、抗体によるサンプル劣化とエピトープ認識の損失を防ぐために避けるべきであるサンプルの過熱 (詳細については材料の表を参照してください)。
別の困難なステップは、沈澱錯体の回復です。磁気ビーズは、磁気ラックと併用する場合より速くより効果的な洗浄ができるのでこのステップの最寄り。ただし、開始材料の少量を使用するとき深刻な制限となる蛋白質 A アガロースに比べて DNA の回復の低い率があります。PVDF 0.45 μ m 遠心フィルター列を持つ蛋白質 A アガロース スラリーの組み合わせが最大 DNA 収量最小限洗濯時間と高い再現性を達成するために最適なソリューションであることがわかります。
DNA の隔離に関する列に基づく DNA 分離キットの多くを使用できます。我々 の経験では、このアプローチの 1 つの制限は、回復 DNA の収量に及ぼす効果を持っている列の容量です。問題を克服するために、我々 は DNA の抽出のフェノール/クロロホルムとして従来の方法を使用して好みます。
記載されているチップ seq パイプラインには、次世代シークエンシング実験のための広く受け入れられているツールとユーティリティの数が組み込まれています。簡単に読み取り、FastQC と Trimmomatic を使用して基本的な品質管理を受ける、Bowtie2 を用いたマウスゲノム MM10 に整列します。存続の読み取りは、MACS2 アルゴリズムによってピークを呼び出すのために使用される前に品質をマッピングによってフィルター処理されます。ただし、他の利用可能な検証ツールは、実験と生成されているデータの性質によってまた使用されるかもしれません。いずれかの使用は事前処理中にパラメーターをカスタマイズし、配置、またはピークの呼び出しが適切なもあります。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bullet Blender Tissue Homogenizer | Next Advence | BBX24 | |
| Stainless Steel Beads 3.2 mm Diameter | Next Advence | SSB32 | |
| Bioruptor Sonicator | Diagenode | ||
| 1.5 mL Micro Tube TPX Plastic | Diagenode | C30010010-5 | |
| Complete-Protease inhibitor | Roche | 11836145001 | |
| Protein A Agarose Slurry | Invitrogen | 101041 | |
| GPS2 antibody | In house | Rabbit polyclonal, Ct antibody (Cardamone et al., Mol Cell 2018) | |
| Pol2 antibody | Diagenode | C15100055 | |
| h3K9me3 antibody | Millipore | 05-1242 | |
| Fast Syber Green Master Mix | Aplied Biosytem | 4385612 | |
| ViiA7 | Aplied Biosytem | ||
| TruSeq ChIP Library Preparation Kit | Illumina | IP-202-1012 | |
| HiSeq 2000 | Illumina |
References
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