Summary
Her beskriver vi en protokoll for effektiv chromatin immunoprecipitation (ChIP) etterfulgt av høy gjennomstrømming DNA sekvensering (ChIP-seq) av brun fettvev (BAT) isolert fra mus. Denne protokollen er egnet for både kartlegging histone modifikasjoner og undersøker genomet hele lokalisering av ikke-histone proteiner av interesse i vivo.
Abstract
Mest cellulære prosesser er regulert av transcriptional modulering av bestemte genet programmer. Slike modulering oppnås gjennom kombinert handlingene til en rekke transkripsjonsfaktorer (TFs) og kofaktorer formidling transcriptional aktivisering eller undertrykkelse via endringer i chromatin-strukturen. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) er en nyttig molekylærbiologi metode for kartlegging histone modifikasjoner og profilering transkripsjon faktorer/kofaktorer binding til DNA, noe som gir et øyeblikksbilde av dynamisk kjernefysiske endringene skjer under ulike biologiske prosesser.
For å studere transcriptional regulering i fettvev, prøver fra i vitro cellekulturer av udødeliggjort eller primære linjer er ofte foretrukket i ChIP analyser på grunn av overflod av starter materiale og redusert biologisk variasjon. Men representerer disse modellene et begrenset øyeblikksbilde av faktiske chromatin i levende organismer. Dermed er det et kritisk behov for optimalisert protokoller utføre ChIP på fettvev prøver fra dyremodeller.
Her beskriver vi en protokoll for effektiv ChIP-seq histone modifikasjoner og ikke-histone proteiner i brun fettvev (BAT) isolert fra mus. Protokollen er optimalisert for å undersøke genomet hele lokalisering av proteiner av interesse og epigenetic markører i balltre, som er en morphologically og fysiologisk forskjellige vev blant fett depoter.
Introduction
Mens hvit fettvev (WAT) er spesialisert for energilagring, forsvinner brun fettvev (BAT) energi i form av varme på grunn av sin evne til å konvertere karbohydrater og lipider i termisk energi via mitokondrie uncoupling1. På grunn av denne spesielle funksjonen er BAT depot nødvendig for vedlikehold av kroppstemperatur i fysiologiske forhold og svar på kalde eksponering. Mens gene expression endringer under BAT differensiering og thermogenic stress har vært grundig studert i vivo og in vitro, har molekylær mekanismene bak disse endringene vært mest dissekert i udødeliggjort linjer og primære pre adipocytter, med unntak av flere i vivo studier2,3,4,5.
Reguleringen av bestemte genet Uttrykksprogrammer transcriptional forskrifts oppnås ved koordinert endringer i chromatin struktur via ulike transkripsjon faktorer og co faktorer handlinger. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) er en verdifull molekylærbiologi tilnærming for å undersøke rekruttering av disse faktorene DNA og profilering tilhørende endringene i det chromatin landskapet. Nøkkelfaktorer for suksess for ChIP eksperimenter inkluderer optimaliseringer crosslinking forhold og chromatin klippe konsistens gjennom forskjellige prøver, tilgjengeligheten av tilstrekkelig utgangsmaterialet, og, spesielt, kvaliteten av antistoffer. Når du utfører ChIP fra hele vev, det er også viktig å vurdere heterogenitet prøvene og optimalisere protokollen for å forbedre effektiviteten i kjerner isolasjon, med sistnevnte blir et spesielt følsomme skritt når du arbeider med fettvev grunn forhøyet lipid innholdet. Faktisk, molekylær isolasjon teknikker fra hele adipose depoter er komplisert ved tilstedeværelse av høye nivåer av triglyserider, og protokollene må være optimalisert for å øke mengden av chromatin isolasjon. Til slutt, når høy gjennomstrømming sekvensering utføres etter ChIP-DNA isolasjon, sekvensering dybden er avgjørende for å bestemme antall topper som oppdages trygt.
Her vi se arbeider standarder og generelle retningslinjer for ChIP-seq eksperimenter anbefalt av kode og modENCODE konsortier6 for beste praksis, og vi fokus på en detaljert beskrivelse av en protokollen optimert for ChIP-seq fra BAT. Beskrevet protokollen tillater effektiv isolasjon av chromatin fra fettvev utføre genomet hele sekvensering for DNA-bindende faktorer med veldefinerte topper samt histone merker med mer diffus signaler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Punktene dyr håndtering av protokollen er godkjent ved Boston Universitys institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC).
1. dag 1: Disseksjon og utarbeidelse av BAT for Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)
- Euthanize mus med en karbondioksid (CO2) kammer og utføre dissection umiddelbart etterpå. Spray musen pels med 70% etanol før snitt. Plass musen med ryggen vendt opp, deretter skjære opp huden langs halsen. Finn balltre direkte under huden mellom skuldrene (interscapular, det ser ut som to fliker, sommerfugl-formet, med et tynt lag av hvite fett som må være forsiktig fjernet7).
Merk: For en 3 måneder gamle C57BL/6J mus som er matet en vanlig chow diett (musen vekt på denne aldersspredningen mellom 27 og 30 g), er hver BAT lobe ca 1 cm lang. Totalvekt BAT depot er ca 0.15 g i både mannlige og kvinnelige mus. - Bruk 1 BAT pute for 3 sjetonger. Flere BAT pads kan behandles samtidig til sonication.
- Krysskobling hver BAT skriveblokken i 10 mL av fosfat-bufret saltvann (PBS) som inneholder 1% formaldehyd i 15 min roterende 150 RPM ved romtemperatur (RT).
- Slukke crosslinking ved å legge til 2,5 M glysin en siste konsentrasjon av 125 mM i 5 minutter, rotere på 150 rpm på RT.
- Overføre BAT puten å 500 µL av hypotonisk lyseringsbuffer (10 mM HEPES, 1, 5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 0,5 mM DTT, 0.2 mM PMSF) og legge 2 rustfritt stål perler (størrelse: 3,2 mm diameter, se Tabellen for materiale) for hver BAT-blokk. Bruk en perle-baserte vev homogenizer (se Tabell for materiale) å makulere vevet.
- Start med 5 min på maks effekt. Hvis nødvendig, forlenge tiden før vevet er homogenisert og enkeltceller skilles. Overføre prøvene i en ny tube og sentrifuge på 4 ° C 16.000 x g for 10 min.
- Etter sentrifugering, overføre nedbryting til en ny tube og beholde celle pellet på is. Sentrifuge nedbryting på 4 ° C 16.000 x g i 10 min å hindre tap av flytende celler. Forkaste siste nedbryting og resuspend begge celle pellets sammen i 300 µL av SDS lyseringsbuffer (SDS 1%. EDTA 10 mM; Tris-HCl pH 8, 50 mM) med 1 x protease hemmer (se Tabell for materiale). Ruge på is 10 min.
- Sonicate lysates for å generere DNA fragmenter 200-500 base parene lang. Etter sonication, fjerne rester av sentrifugering i 10 min 16.000 x g på 4 ° C og sjekk suksessen til sonication via DNA geleelektroforese på en 1% agarose gel. For en mellomstor gel, kjøre på 120 V; en god separasjon er oppnådd etter 45 minutter.
Merk: Sonication optimalisering kan være nødvendig å oppnå riktig størrelse av fragmenter. Med den valgte sonicator (se Tabell for materiale), dette krever 2 ganger på 320 W utgangseffekt og 20 KHz hyppigheten for 10 min, bruke sykluser av 30 s på/30 s. - Fortynn supernatant brøken 10-fold (siste bindet er 3 mL for hver BAT pad) i ChIP fortynning buffer (SDS 0,01%; Triton 1,1%; EDTA 1.2 mM; Tris-HCl pH 8, 16,7 mM; NaCl 167 mM) med 1 x protease inhibitor. Holde til side 1% av chromatin løsningen (tilsvarer 30 µL for 3 mL) som ChIP inngang. Hold innganger over natten på 4 ° C (til trinn 2.4).
Merk: Ovennevnte brøken vil gi inn referansen for relativ kvantifisering av immunoprecipitated materiale i forhold til mengden av DNA i hver prøve før immunoprecipitation. - Legge til ChIP antistoffer (se Tabell for materiale Antistoffene brukes her som eksempel) til 1 mL av chromatin løsning og ruge over natten ved 4 ° C med rotasjon. Utføre parallelle immunoprecipitation med tilsvarende pre immun IgG, hvis tilgjengelig, eller vanlige IgG av samme Art (f.eks., vanlig kanin IgG hvis antistoffer er produsert i en kanin). Du kan også lagre 1 mL av chromatin løsning for en nei-antistoff kontroll.
Merk: Den optimale mengden av antistoff bør fastsettes eksperimentelt for hver nye antistoff, hvis antistoff konsentrasjonen ikke er kjent. Ellers er 2-5 µg antistoff en rimelig startbeløpet du bruker. Bruk ChIP-grade antistoffer mulig eller antistoffer som er blitt godkjent for immunoprecipitation.
2. dag 2: Samling av immun komplekser
- Legge til 50 µL av Protein A Agarose 50% slurry immun komplekser og ruge 1t på 4 ° C med rotasjon på 150 rpm.
-
Pellets perler med sentrifugering for 1 min 100 x g på 4 ° C. Utføre sekvensiell vasker av perler med buffere for å øke stringens.
- Først vaske med lav-salt vaskebuffer (150 mM NaCl; Tris-HCl pH 8, 20 mM; EDTA 2 mM; Triton-X 1%. SDS 0,1%), deretter med høy-salt vaskebuffer (500 mM NaCl; Tris-HCl pH 8, 20 mM; EDTA 2 mM, Triton-X1%. SDS 0,1%), deretter med LiCl vask (0,25 M LiCl; Tris-HCl pH 8, 10 mM; EDTA 1 mM; Igepal 1%. deoxicholate 1%), og til slutt med 1 x TE (Tris-HCl pH 8, 10 mM; EDTA).
- Utføre alle vasker 0,45 µm PVDF sentrifugal filter kolonner (Tabell for materiale) ved første overføring av perlene i kolonnene med 500 µL av lav-salt vaskebuffer. Pellets perlene i kolonnene for 3 min 2500 x g. Forkaste gjennomflytsenhet og gjenta 1 gang for alle vaskebuffere i trinnet 2.2.1.
- Når du vasker er fullført, elute immune komplekser av tilføyer 300 µL elueringsrør buffer 1% eksponeringsmåter, 0.1 M NaHCO3) til pelleted perlene i kolonnene. Ruge på RT i 30 min på en shaker på 400 rpm. Samle eluate av snurrende ned kolonner for 3 min 2500 x g i en fersk rør.
- Reversere krysskoblinger ved rugende den eluate og innganger samlet i trinn 1,9 på 65 ° C over natten.
3. dag 3: Utvinning av DNA med fenol/kloroform utvinning
- Legge til 300 µL av fenol: kloroform: IAA, 1:1 til eluate og innganger. Vortex for 10 s.
- Spinn på 4 ° C i 15 min 21000 x g. Overføre nedbryting slik frisk. Legge 3 µL av glykogen og 30 µL av 3 M natrium acetate 750 µL av kaldt 100% etanol. Vortex for 10 s. butikken ved-80 ° C i 2 timer.
- Nedspinning 21000 x g på 4 ° C for 20 min, holde pellet og forkaste nedbryting. Vask pellets med 1 mL kaldt 70% EtOH, så Nedspinning 21000 x g ved 4 ° C i 5 min. forkaste nedbryting og air-dry pellet.
- Resuspend pellet i 70 µL DNAse uten vann.
- Gå til trinn 4 for testing chromatin belegg på genomisk regioner av kvantitative polymerasekjedereaksjons (qPCR) eller trinn 5 for å forberede prøver sekvensering.
4. analyse av ChIP bruker qPCR (Single/Multiple gener avlesning)
- Fortynne inndataene DNA fra trinn 3.4 generere en standardreferanse kurve. Seriell fortynninger av 1/10, 1/100, og 1/1000 er vanligvis tilstrekkelig å fange lineær området, men ytterligere fortynninger kan kreves for mer konsentrert prøver.
- For hvert primer par (her, vi har brukt primere rettet mot NDUFV1 og TOMM20 arrangører), forberede to sett med qPCR reaksjoner: en bruker utvannet innspill prøvene fra trinn 4.1 og andre med DNA-prøvene isolert av immunoprecipitation fra trinn 3.4. Utføre hver reaksjon i tre eksemplarer.
Merk: Reaksjoner kan defineres parallelt for flere gener bruker 96 - eller 384-godt plater. - Sette opp en reaksjon mengde 10 μL per brønn med 5 μL 2 x PCR blanding (Tabell for materiale), 1 μL primer blande (1 μM frem primer og 1 μM bakover grunning), og 4 μL av DNA fra ChIP (eller inn kontrollen).
- Kort spinne ned platen.
- Kjøre qPCR reaksjoner på en sanntids PCR-system ved hjelp av protokollen som er anbefalt av produsenten for reagens gjenkjenning (Tabell for materiale). Her har vi brukt følgende: 1) 1s ved 95 ° C i 1 syklus; 2) 1 s på 95 ° C etterfulgt av 20 s ved 60 ° C i 45 sykluser; 3) 15 s på 95 ° C etterfulgt av 60 s på 60 ° C etterfulgt av 15 s på 95 ° C i 1 syklus.
Merk: Sjekk dissosiasjon kurven: tilstedeværelsen av en topp i termisk dissosiasjon plottet antyder en enkelt amplicon genereres fra PCR reaksjonen. Hvis mer enn én topp er visualisert, er dette potensielt indikativ av flere ikke-spesifikk amplicons; i så fall anbefaler vi utformingen av alternative primer. - Bestemme lineær fasen av eksponentiell forsterkning av PCR reaksjonen for hver primer ved beregning av standardkurven bruker en rekke utvannet genomisk DNA i trinn 4.1. Ifølge Ct (syklus terskel) verdien.
- Hvis Ct verdien av DNA fra ChIP og input kontroll i lineær utvalg av Ct verdien, beregne anriking av DNA fra ChIP i forhold til innspill, ifølge fortynningsfaktoren DNA fra ChIP og input kontroll i trinn 4.1.
5. forsterkning av DNA fra flis for høy gjennomstrømming sekvensering (Genome hele avlesning)
Merk: Dette trinnet kan bli outsourcet til en akademisk kjernen anlegget eller kommersielle sekvensering selskapet når sekvensering evner ikke tilgjengelig internt.
- Forberede en DNA-biblioteket fra utdraget DNA med en passende ChIP biblioteket forberedelse kit (se Tabell for materiale) følg produsentens instruksjoner.
- Sekvens biblioteket på en høy gjennomstrømming sekvensering system, med 50 bp single-end som avlesning (se Tabell for materiale).
Merk: Ifølge ChIP-seq retningslinjer foreslått av kode6, anbefales minimum 10 millioner leser for pattedyr genomer.
6. rå dataanalyse
- Utføre kvalitetskontroll på rå sekvensering leser bruker FastQC8.
Merk: Vanlige sekvensering kvalitet beregninger inkluderer per base sekvensen kvaliteten, per base sekvens innhold, per sekvens GC innhold, sekvens lengde og sekvens duplisering nivåer. Vanligvis lese kvalitetspoeng q > 30 over hver base posisjon er et tegn på høy kvalitet sekvensering resultater. Fordelingen av GC innhold på tvers av alle leser skal omtrent ligne en normalfordeling, med en topp sentrert rundt arten faktiske genomisk GC innhold prosent. - Fjern alle sekvensering kortet forurensning og lav kvalitet leser gjennom lese trimming verktøyet Trimmomatic9.
Merk: Implementerte standardparametere angir fjerning av plattform avhengige adaptere, fjerning av innledende og etterfølgende lav kvalitet baser, og bruk av en 4-base bredt skyvevinduet å trimme leser når den gjennomsnittlige kvaliteten per base faller under en angitt terskel. - Juster behandlet leser til musen MM10 referanse genomet10 Bowtie2 aligner11 bruker standardparametere.
- Filtrere justert leser ved å fjerne dem med en Bowtie2 kartlegging kvalitet score (MAPQ) på mindre enn 10 bruker Samtools12.
- Bestemme ulike etter justering kvalitet beregninger som prosent leser tilordnet, strand tvers-sammenheng, kumulative lese dekning, og utvalg gjenskape reproduserbarhet.
Merk: Ulike pakker inkludert SPP13, ChIPqc14og Deeptools15 er tilgjengelig for å beregne disse kvalitet beregninger. - Analysere peak ringer med en input eller aktuelle KO utvalget med Mac algoritmen (MACS2)16 med standardparametere.
- Fjern alle kalt topper som overlapper med kjente svartelistet regioner17 fra mm10 merknad med Bedtools18.
Merk: Svartelistet områder er områder i genomet som har vist seg å ha høy signal eller Les teller uavhengig av cellen linje eller sekvensering teknikk. Disse områdene viser kunstig høye gjenstand signaler i enkelte regioner i genomet som kan filtreres ut av funksjonelle genomisk sekvensering eksperimenter. Alle replikater skal behandles uavhengig gjennom rørledningen og kan deretter brukes til irreproducibility funnrate (IDR). IDR er ansatt å måle reproduserbarhet av funn mellom gjentak gjennom metoden som beskrevet av Li, Brown, Huang og Bickel19,20. Metoden IDR kvantitativt vurderer konsistens mellom gjentak og anbefales av kode og modENCODE som en del av sine retningslinjer for ChIP-seq. - Bruk statistisk signifikant topper for ulike nedstrøms analyser som gene ontologi21,22, berikelse eller motiv analyse23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1: ChIP validering av qPCR. ChIP-qPCR analyse av representant GPS2 målrette gener NDUFV1 (venstre) og TOMM20 (høyre) i balltre WT og GPS2-AKO mus, viser relativ endringer i H3K9 metylering og GPS2 og Pol2 binding. Søylediagrammer representerer utvalgsgjennomsnittet av 3 replikat med * p < 0,05 og ** p < 0,01 som beregnet med Student t-test. Dette tallet er endret fra Cardamone et al.2. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Eksempler av ChIP-qPCR bruker BAT isolert fra WT eller GPS2-AKO mus er vist i figur 12. Har funnet at GPS2 var nødvendig for uttrykket av kjernefysisk-kodet mitokondrie gener i ulike celle linjer2, testet vi rekrutteringen av GPS2 på to bestemte kjernefysiske-kodet mitokondrie gener, NDUFV1 og TOMM20, i BAT fra mus som et eksempel på en vev høyanriket i mitokondrier. Vi først sammenlignet GPS2 promoter innkvartering i GPS2-AKO mus og vill-type littermates, observere en forventet nedgang i GPS2 bindende for selektiv målet gener i balltre fra GPS2-AKO mus. Ved hjelp av protokollen som er beskrevet her, registrert vi også økt binding av RNA polymerase 2 (Pol2) og undertrykkende histone merke H3K9me3 i balltre fra GPS2-AKO mus sammenlignet med vill-type littermates. For alle antistoffer var bindingen betydelig i forhold til bakgrunnen signalet i IgG kontroll prøven. Disse resultatene bekrefter rekrutteringen av GPS2 på valgte kjernefysiske-kodet mitokondrie gener og viser at GPS2 er nødvendig for å hindre akkumulering av H3K9me3, og dermed kreves for stoppet Pol2 transcriptional aktivitet på målet arrangører. Se Tabellen for materiale for mer informasjon på antistoffer og den opprinnelige publikasjonen for flere data og mer omfattende diskusjon av disse resultatene2.
Figur 2: tomt kvalitet score fra rå sekvensering leser isolert fra BAT. (A) Kvalitetspoengene reflekterer en forutsigelse av sannsynligheten for feil under base-ringer. Det er vanligvis uttrykt som et heltall, Q = - 10log10(P), der P er sannsynligheten for feil i base-ringer. Vist ovenfor er en per base sekvensen kvaliteten tomten generert av FastQC basert på rå, ubehandlet sekvensering leser generert fra BAT. (B) GC innhold distribusjon av etter kortfjerning og lese trimming fra BAT prøver. GC innhold skal omtrent ligne en normalfordeling med en topp sentrert rundt arten faktiske brøkdel av GC genomisk innhold. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
I figur 2, sekvensering kvalitet score er vist på en per base nivå, og leser kan bearbeides videre ved trimming noen gjenværende kort forurensning og fjerne leser hvor gjennomsnittlig kvalitetspoengene over en skyvevinduet faller under en Angitt terskelverdi. Også vist er GC distribusjonen over leser etter kortfjerning og Les trimming. Sekvensen kvaliteten og GC innhold distribusjon er to mye brukt beregninger evaluere neste generasjons sekvensering data før beregningsformelen analyser utføres. Disse resultatene viser at protokollen gir en tilstrekkelig mengde høykvalitets chromatin isolert fra BAT som er kompatibel med nedstrøms neste generasjons sekvensering teknologi.
Figur 3: normalisert bigwig filer generert ChIP-seq data fra balltre WT og GPS2-AKO mus. Denne illustrasjonen viser normalisert lese dekningen langs Slc25a25 gene locus med en betydelig kalt topp i regionen promoter. GPS2 ble vist å regulere uttrykket av kjernefysisk-kodet mitokondrie gener ved å endre chromatin tilstanden til målet genet arrangører. Disse resultatene viser visualisering av en betydelig kalt topp på et representativt kjernefysiske-kodet mitokondrie gen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Vist i Figur 3 er bigWig sporene på WT GPS2 AKO justert BAM filer normalisert til 1 x dybde (leser per genomet dekning) som er implementert i deepTools. Vist er tilstedeværelsen av en statistisk signifikant topp ligger i regionen arrangøren av mitokondrie genet Slc25a25. Normalisert sporene tillate visualisering av anriking av leser tilsvarer kalt toppen og reduksjon av leser på denne plasseringen i BAT av GPS2-AKO mus i forhold til vill-type littermates.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen beskrevet her representerer et verdifullt verktøy for å utføre ChIP fra murine vev, spesielt optimalisert for brun fettvev. En av de større utfordringene i å utføre ChIP fra vev gjenoppretter et tilstrekkelig antall celler under eksempel forberedelse. Klipping balltre bruke en vev homogenizer blender kombinert med rustfritt stål perler i stedet for en kanoniske glass støter betydelig reduserer antall celler som er tapt på grunn av ubrutt vev. Videre hjelper homogenisere vevet direkte i en hypotonisk buffer utgivelsen av lipider som kan deretter enkelt atskilt og fjernet fra atomkjerner via høyhastighets sentrifugering.
Riktig sonication er også avgjørende for å utføre konsekvent og reproduserbar ChIP analyser. Bruk av en vann bad ultra-sonicator gir samtidig behandling av flere eksempler, dermed forbedre reproduserbarhet av chromatin skjæring og redusere risikoen for eksempel kryssforurensning. I tillegg reduserer bruk av et temperaturkontrollert sonication system overoppheting av prøvene, som bør unngås for å forhindre prøve fornedrelse og tap av epitope anerkjennelse av antistoffer (se Tabell for materiale for detaljer).
En annen utfordrende trinn er utvinning av immunoprecipitated komplekser. Magnetiske perler er ofte foretrukket for dette trinnet fordi de tillater raskere og mer effektiv vask sammen med en magnetisk rack. Men har de en lavere pris på DNA utvinning sammenlignet Protein A Agarose, som kan være en alvorlig begrensning når du arbeider med lite starter materiale. Vi finner at kombinasjonen av Protein A Agarose slurry med PVDF 0,45 µm sentrifugal filter kolonner er en flott løsning for å oppnå maksimal DNA gi med minimal vask og høyere reproduserbarhet.
Om DNA isolasjon, kan mange kolonner-baserte DNA isolasjon kits brukes. I vår erfaring er en begrensning av denne tilnærmingen kapasiteten til kolonnene å påvirke avkastningen av DNA utvinning. For å overvinne problemet, foretrekker vi å bruke en mer tradisjonell metode som fenol/kloroform for DNA utvinning.
Oppførte ChIP-seq rørledningen inneholder en rekke aksepterte verktøy og hjelpemidler neste generasjons sekvensering eksperimenter. Kort, lest er utsatt for grunnleggende kvalitetskontroll med FastQC og Trimmomatic, så justert til musen MM10 genomet bruker Bowtie2. Gjenlevende leser filtreres ved å tilordne kvalitet før den brukes for topp ringer gjennom MACS2 algoritmen. Det bør imidlertid bemerkes at andre tilgjengelige og godkjent verktøy kan også bli brukt avhengig av eksperimentet og dataene blir generert. Bruk tilpasset parametere under pre-prosessering, justering eller topp ringer kan også være riktige.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bullet Blender Tissue Homogenizer | Next Advence | BBX24 | |
| Stainless Steel Beads 3.2 mm Diameter | Next Advence | SSB32 | |
| Bioruptor Sonicator | Diagenode | ||
| 1.5 mL Micro Tube TPX Plastic | Diagenode | C30010010-5 | |
| Complete-Protease inhibitor | Roche | 11836145001 | |
| Protein A Agarose Slurry | Invitrogen | 101041 | |
| GPS2 antibody | In house | Rabbit polyclonal, Ct antibody (Cardamone et al., Mol Cell 2018) | |
| Pol2 antibody | Diagenode | C15100055 | |
| h3K9me3 antibody | Millipore | 05-1242 | |
| Fast Syber Green Master Mix | Aplied Biosytem | 4385612 | |
| ViiA7 | Aplied Biosytem | ||
| TruSeq ChIP Library Preparation Kit | Illumina | IP-202-1012 | |
| HiSeq 2000 | Illumina |
References
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. , (2004).
- Cardamone, M. D., et al. Mitochondrial Retrograde Signaling in Mammals Is Mediated by the Transcriptional Cofactor GPS2 via Direct Mitochondria-to-Nucleus Translocation. Molecular Cell. 69, (2018).
- Emmett, M. J., et al. Histone deacetylase 3 prepares brown adipose tissue for acute thermogenic challenge. Nature. , (2017).
- Harms, M. J., et al. PRDM16 binds MED1 and controls chromatin architecture to determine a brown fat transcriptional program. Genes & Development. , (2015).
- Shapira, S. N., et al. EBF2 transcriptionally regulates brown adipogenesis via the histone reader DPF3 and the BAF chromatin remodeling complex. Genes & Development. , (2017).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22, 1813-1831 (2012).
- Liisberg Aune, U., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells. Journal of Visualized Experiments. , e50191 (2013).
- Andrews, S. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc (2010).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30, 2114-2120 (2014).
- Genome Browser Gateway. , Available from: https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway?db=mm10 (2018).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. , 357-359 (2012).
- Li, H., et al. The Sequence alignment/map (SAM) format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins. Nature Biotechnology. 26, 1351-1359 (2008).
- Carroll, T. S., Liang, Z., Salama, R., Stark, R., de Santiago, I. Impact of artifact removal on ChIP quality metrics in ChIP-seq and ChIP-exo data. Frontiers in Genetics. 5, 75 (2014).
- Ramírez, F., et al. deepTools2: A next Generation Web Server for Deep-Sequencing Data Analysis. Nucleic Acids Research. , (2016).
- Zhang, Y., et al.
- ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).
- Li, Q., Brown, J. B., Huang, H., Bickel, P. J.
- Irreproducible Discovery Rate (IDR). , Available from: https://github.com/nboley/idr (2018).
- The Gene Ontology Consortium. Expansion of the Gene Ontology Knowledgebase and Resources. Nucleic Acids Research. 45, D331-D338 (2017).
- Ashburner, M., et al. Gene Ontology: tool for the unification of biology. Nature Genetics. 25, 25-29 (2000).
- Boeva, V. Analysis of Genomic Sequence Motifs for Deciphering Transcription Factor Binding and Transcriptional Regulation in Eukaryotic Cells. Frontiers in Genetics. 7, 24 (2016).
