Summary
Burada verimli kromatin immunoprecipitation (ChIP) için bir protokol yüksek üretilen iş DNA sıralama (ChIP-seq) kahverengi yağ dokusundan izole bir fare (BAT), ardından açıklayın. Bu iletişim kuralı, hem histon değişiklikler eşleme ve genom çapında yerelleştirme sigara histon proteinleri ilgi içinde vivo, soruşturma için uygundur.
Abstract
En hücresel belirli bir gen programları transkripsiyon modülasyon tarafından düzenlenmektedir. Böyle modülasyon transkripsiyon faktörleri (TFs) ve transkripsiyon harekete geçirmek ya da baskı yoluyla kromatin yapısı değişimler arabuluculuk Kofaktörler geniş bir Birleşik eylemler yoluyla elde edilir. Histon değişiklikler eşleme ve transkripsiyon faktörleri/Kofaktörler DNA için bağlama profil oluşturma, böylece bir anlık görüntüsünü farklı sırasında meydana gelen dinamik nükleer değişiklikleri sağlamak için yararlı moleküler biyoloji yaklaşım kromatin immunoprecipitation (ChIP) olduğunu biyolojik süreçleri.
Yağ dokusu transkripsiyon Yönetmelikte çalışmaya, vitro hücre kültürleri türetilmiş örnekleri ölümsüzleştirilmiş veya birincil hücre hatları kez çip deneyleri içinde malzeme başlayan bereket nedeniyle tercih ve biyolojik değişkenlik azaltılmış. Ancak, bu modeller canlı organizmalar gerçek kromatin durumda sınırlı bir kesitini temsil eder. Böylece, hayvan modellerden elde edilen yağ doku örnekleri üzerinde çip gerçekleştirmek en iyi duruma getirilmiş iletişim kuralları için kritik bir ihtiyaç vardır.
Burada bir iletişim kuralı için verimli ChIP-seq histon modifikasyonları ve kahverengi yağ dokusundan (BAT) bir fareden izole olmayan histon proteinleri, açıklayın. Protokol genom çapında yerelleştirme faiz ve yağ depoları arasında morfolojik ve fizyolojik olarak ayrı bir dokudur yarasa epigenetik işaretleyicilerini proteinlerin soruşturma için optimize edilmiştir.
Introduction
Beyaz Yağ dokusundan (WAT) enerji depolama için uzman iken, kahverengi yağ dokusundan (BAT) karbonhidratlar ve yağlar termal enerji ile mitokondrial uncoupling1dönüştürmek için onun yetenek nedeniyle ısı formunda enerji kalır. Bu özel işlevi nedeniyle yarasa Depo bakımı vücut ısısı fizyolojik koşullarda ve yanıt-e doğru soğuk pozlama için gereklidir. Gen ifade değişiklikleri sırasında yarasa farklılaşma ve termojenik stres üzerine kapsamlı bir şekilde içinde vivo ve tüp bebek incelenmiştir, bu değişiklikler temel moleküler mekanizmaları çoğunlukla disseke ölümsüzleştirdi hücre hatlarında ve birincil edilmiş öncesi adipositler, birkaç içinde vivo çalışmalar2,3,4,5dışında.
Düzenleme, belirli bir gen ifade transkripsiyon düzenleme programlarını koordine değişiklikleri çeşitli transkripsiyon faktörleri ve ortak eylemler faktörler kromatin yapısı ile elde edilir. Kromatin immunoprecipitation (ChIP), işe alım için DNA bu faktörlerin araştırılması ve kromatin manzara ilişkili değişimler profil oluşturma için bir değerli moleküler biyoloji yaklaşımdır. ChIP deneyler başarısı için önemli faktörler crosslinking koşullar ve farklı örnekleri, boyunca kromatin kesme tutarlılık yeterli Başlangıç materyali ve en önemlisi, antikorlar kalitesini en iyi duruma getirmeleri içerir. ChIP bütün dokulardan gerçekleştirirken, heterojen örnekleri göz önünde bulundurun ve çekirdekleri yalıtım verimliliğini artırmak için iletişim kuralı en iyi duruma getirmek önemlidir, ikincisi ile özellikle hassas bir adım olması nedeniyle yağ dokusu ile çalışırken yükseltilmiş lipid içerik. Aslında, tüm yağ depoları moleküler yalıtım teknikleri trigliserid düzeyi yüksek varlığı ile karmaşık ve protokolleri kromatin yalıtım miktarını artırmak için optimize edilmiş olması gerekir. Yüksek işlem hacmi sıralama sonra ChIP-DNA izolasyon gerçekleştirildiğinde, son olarak, sıralama derinlik güvenle algılanır doruklarına sayısını belirlemek için önemlidir.
Burada, biz çalışma standartları ve kodla ve modENCODE konsorsiyumlar6 için en iyi yöntemler tarafından önerilen ChIP-seq deneyler için genel kurallar bakın ve ChIP-seq yarasa üzerinden için optimize edilmiş bir protokol, adım adım açıklamasını odaklanmak. DNA'ya bağlanıcı faktörler iyi tanımlanmış zirveleri ile hem de histon işaretleri kapatıyor sinyalleri ile genom çapındaki sıralama gerçekleştirmek için açıklanan protokol kromatin Yağ dokusundan verimli izolasyon sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan işleme adımları Protokolü'nün Boston Üniversitesi'nin kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış olması.
1. gün 1: Diseksiyon ve kromatin Immunoprecipitation (ChIP) BAT hazırlanması
- Karbondioksit (CO2) odası kullanarak fare ötenazi ve diseksiyon gerçekleştirdikten hemen sonra. Fare kürk kesi önce % 70 etanol ile sprey. Fare, karşı karşıya sırt o zaman boyunca boyun deri kesip yerleştirin. Deri omuz arasında doğrudan altında belgili tanımlık kriket sopası bulun (interscapular; iki loblari, kelebek şeklinde, dikkatli olması gereken beyaz yağ ince bir tabaka ile7kaldırıldı olarak görünür).
Not: Düzenli yemek diyet (fare ağırlık bu yaş aralıkları arasında 27 ve 30 g) beslenen bir 3 aylık C57BL/6J için her yarasa lob yaklaşık 1 cm uzunluğunda faredir. Toplam yarasa depo yaklaşık 0.15 g hem erkek hem de dişi farelerde ağırlığıdır. - 1 yarasa takımını 3 yongaları için kullanın. Birden çok yarasa yastıkları sonication kadar aynı anda işlenebilir.
- Her yarasa Crosslink pad fosfat tamponlu tuz (PBS) içeren % 1 formaldehit 15 dakika oda sıcaklığında (RT) 150 rpm'de dönen 10 ml.
- 125 mM, RT 150 rpm'de dönen 5 min için son bir konsantrasyon 2.5 M glisin eklenerek Crosslinking gidermek
- YARASA pad hipotonik lizis arabellek (10 mM HEPES, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 0,5 mM DTT, 0.2 mM PMSF) 500 µL için nakletmek ve 2 Paslanmaz boncuk eklemek (Boyut: 3.2 mm çap, Tablo malzemelerigörmek) her yarasa pad için. Boncuk tabanlı doku homogenizer kullanın (bakınız Tablo reçetesidokuyu parçalamak için).
- Maksimum güçte 5 dk ile başlayın. Gerekirse, doku homojenize oluncaya kadar süreyi uzatmak ve tek hücreler ayrılır. Örnekleri yeni tüp ve santrifüj 16.000 x g de 4 ° C'de 10 dakika içine aktarın.
- Santrifüjü sonra süpernatant yeni bir tüp içine aktarmak ve hücre Pelet buz üzerinde tutun. Süpernatant 16.000 x g hücreleri kayan kaybını önlemek 10 min için de 4 ° C'de santrifüj kapasitesi. Son süpernatant atmak ve her iki hücre topakları birlikte SDS lizis arabellek 300 µL içinde resuspend (SDS % 1; EDTA 10 mM; Tris-HCl pH 8, 50 mM) 1 x proteaz inhibitörü ile (bkz. Tablo malzeme). 10 dakika buz üzerinde kuluçkaya.
- Lysates DNA parçaları 200-500 baz çifti uzun oluşturmak için solüsyon içeren temizleyicide. Sonra sonication, 16.000 x g 4 ° c de 10 dakika aralıklarla enkaz kaldırmak ve sonication yoluyla DNA Elektroforez % 1'özel jel üzerinde başarı kontrol edin. Orta büyüklükteki jel için 120 V çalıştırın; iyi bir ayrılık 45 dakika sonra elde edilir.
Not: Sonication optimizasyonu parçaları uygun boyutunu elde etmek için gerekli olabilir. Seçilen sonicator ile (bkz. Tablo reçetesi) Bu 2 kez 320 W çıkıș gücü ve 10 dk için 20 KHz frekans gerektirir kapalı 30 sn/30 sn döngüleri kullanarak. - 10 kat süpernatant kesir seyreltik (son hacim ise her yarasa pad için 3 mL) çip seyreltme arabelleği (SDS % 0,01; Triton %1.1; EDTA 1.2 mM; Tris-HCl pH 8, 16,7 mM; NaCl 167 mM) 1 x proteaz inhibitörü ile. Bir kenara bu kromatin çözüm (3 mL için 30 µL eşit) % 1'fiş giriş olarak saklayın. Girdileri gecede 4 ° C'de (adım kadar 2.4) tutmak.
Not: Yukarıdaki kesir immunoprecipitated malzeme DNA örnekleri immunoprecipitation önce mevcut miktarı ile karşılaştırıldığında göreceli miktar için giriş başvuru sağlar. - Çip antikor eklemek ( Tablo malzemeleri kullanılan antikor için görmek burada örnek olarak) için 1 mL kromatin çözeltisi ve gecede rotasyon ile 4 ° C'de kuluçkaya. Karşılık gelen öncesi bağışıklık IgG, varsa veya aynı türden normal IgG ile paralel immunoprecipitation gerçekleştirmek (Örn., düzenli IgG antikor giyen bir tavşan..... üretilen tavşan). Alternatif olarak, 1 mL kromatin çözeltisi no-antikor denetimi için kaydedin.
Not: Antikor konsantrasyon değil biliniyorsa antikor en uygun miktarda her yeni antikor için deneysel olarak tespit edilmelidir. Aksi takdirde, 2-5 µg antikor, kullanmak için bir başlangıç makul olur. ChIP-grade antikorlar mümkün olduğunda veya doğrulandıktan antikorlar için immunoprecipitation kullanın.
2. 2. gün: Koleksiyon bağışıklık kompleksleri
- Protein A özel % 50 Bulamaç 50 µL bağışıklık kompleksleri ekleyin ve 150 RPM döndürme 4 ° C'de 1 h için kuluçkaya.
-
100 x g 4 ° C'de, 1 dk aralıklarla tarafından boncuk cips Boncuk sıralı yıkar arabellekleri sıkılık artması ile gerçekleştirin.
- İlk olarak, yıkama ile düşük tuz yıkama tampon (150 mM NaCl; Tris-HCl pH 8, 20 mM; EDTA 2 mM; Triton-X %1; SDS % 0,1), o zaman yüksek tuz yıkama arabellek (500 mM NaCl; Tris-HCl pH 8, 20 mM; EDTA 2 mM, Triton-X1%; SDS % 0,1), o zaman LiCl yıkama (0.25 M LiCl; Tris-HCl pH 8, 10 mM; EDTA 1 mM; Igepal % 1; deoxicholate %1) ve nihayet ile 1 x TE (Tris-HCl pH 8, 10 mM; EDTA).
- 0,45 µm PVDF santrifüj süzgeç sütunlarda (Malzemeler tablo) tüm yıkama 500 µL düşük tuz yıkama arabelleği kullanarak sütunlar boncuk aktararak gerçekleştirin. 2500 x gde 3 dk için sütunlarında boncuk cips. Akışı aracılığıyla atın ve 2.2.1. adımda listelenen tüm yıkama arabellekleri için 1 kez yineleyin.
- Yıkama tamamlandıktan sonra bağışıklık kompleksleri elüsyon arabellek % 1 SDS, 0.1 M NaHCO3300 µL ekleyerek elute) pelleted boncuk sütunlar için. Bir shaker 400 rpm üzerinde 30 dk için RT kuluçkaya. Sütun için 2500 x g taze bir tüp de 3 dk iplik tarafından eluate toplamak.
- Glossar 65 ° c 1.9 adımda gecede toplanan girişleri ve eluate kuluçka tarafından ters.
3. gün 3: Kurtarma fenol/kloroform çıkarma ile DNA'ın
- Fenol: kloroform: IAA, 1:1 girişleri ve eluate 300 µL ekleyin. 10 için girdap s.
- 21.000 x gde 15 dakika 4 ° C'de spin. Süpernatant temiz bir tüp aktarın. Glikojen, 3 M sodyum asetat 30 µL ve soğuk % 100 etanol 750 µL 3 µL ekleyin. Girdap-80 ° c 2 h için 10 s. deposu için.
- Spin aşağı vasıl 21.000 x g 20 dk için 4 ° C'de, Pelet tutmak ve süpernatant atmak. Yıkama Pelet ile 1 mL soğuk % 70 alkol, sonra 5 dakika süreyle 4 ° C'de 21.000 x g aşağı spin süpernatant atmak ve Pelet kuruması.
- Pelet DNaz ücretsiz su 70 µL içinde resuspend.
- Kromatin doluluk nicel polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) tarafından özel genomik bölgeler üzerinde test etmek için adım 4 veya örnekleri sıralama için hazırlamak için 5 devam etmek.
4. qPCR (Single/Multiple genler okuma) kullanarak ChIP Analizi
- Adım bir standart referans eğri oluşturmak için 3,4 girişten DNA sulandırmak. Seri dilutions 1/100, 1/10 ve 1/1000 doğrusal aralığı yakalamak için genellikle yeterli, ama daha fazla dilutions daha yoğun örnekleri için gerekli olabilir.
- Her astar çifti için (burada, NDUFV1 ve TOMM20 Rehberleri hedefleme astar kullanmış), iki adet qPCR reaksiyonlar hazırlamak: immunoprecipitation adım 3.4 tarafından izole DNA örnekleri ile bir adım 4.1 ve biraz sulandırılmış giriş örnekleri kullanarak. Her reaksiyon nüsha gerçekleştirin.
Not: Tepkiler paralel 96 - veya 384-da plakaları kullanarak birden çok gen için ayarlanabilir. - 5 μL 2 x PCR Mix (Malzemeler tablo) ile iyi başına 10 μL tepki hacmi ayarlayın, astar 1 μL mix (1 mikron ileri astar ve 1 mikron ters astar) ve 4 μL DNA çip (veya giriş denetimi).
- Kısaca plaka spin.
- QPCR reaksiyonlar reaktif algılama (Tablo reçetesi) için üretici tarafından önerilen protokolü kullanarak gerçek zamanlı PCR sistemi çalıştırın. Burada aşağıdaki koşullar kullandık: 1) 1s 95 ° c için 1 döngüsü; 2) 1 s 95 ° C'de 20 tarafından takip s 60 ° c 45 döngüsü; 3) 15 s 95 ° C'de 60 tarafından takip s 60 ° C'de 15 tarafından takip s 95 ° c 1 döngüsü için.
Not: Ayrılma eğrisi kontrol: tek bir amplicon PCR reaksiyon gelen oluşturulan termal ayrılma komplo bir tepe varlığını göstermektedir. Eğer birden fazla tepe görselleştirildiği, bu potansiyel olarak birden çok, non-spesifik amplicons göstergesidir; Bu durumda, alternatif astar çiftleri tasarımını öneririz. - PCR reaksiyon üstel amplifikasyon lineer faz adım 4.1 seyreltilmiş genomik DNA dizisini kullanarak standart Eğri hesaplayarak ayarla her astar için belirleyin. Ct (döngüsü eşik) değerine göre.
- DNA çip ve giriş denetimi Ct değerini içinde Ct doğrusal Aralık değeri varsa, DNA çip ve giriş denetimi adım 4.1 seyreltme faktörü göre çip DNA'dan zenginleştirme giriş, göreli olarak hesaplayın.
5. küçük parça (genom genelinde okuma) sıralama yüksek üretilen iş için DNA amplifikasyon
Not: Sıralama yetenekleri şirket içinde kullanılabilir olduğunda bu adımı bir akademik çekirdek tesis veya ticari sıralama şirket taşeron.
- Ayıklanan DNA ile uygun bir çip Kütüphane hazırlık DNA kitaplığa hazırlamak ( Tablo malzemelerigörmek) kit üreticinin yönergeleri izleyin.
- Kütüphanede okuma 50 bp tek taraflı kenar kullanarak bir yüksek-den geçerek sıralama sistemde sıra ( Tablo malzemelerigörmek).
Not: KODLA6tarafından önerilen ChIP-seq kurallarına göre en az 10 milyon okuma memeli genleri için önerilir.
6. ham veri analizi
- Kalite kontrol ham sıralama okur FastQC8kullanarak gerçekleştirin.
Not: Genel sıralama kalite ölçümleri temel sıra kalite başına, temel sıra içerik başına, sıra GC içerik, sıra uzunluğu ve sıra çoğaltma düzeyleri başına içerir. Genellikle, bir okuma kalite puanı Q > 30 temel her pozisyon arasında yüksek kaliteli sıralama sonuçlarını göstergesidir. İçerik dağıtımı, GC tüm okuma arasında kabaca bir normal dağılım, türün gerçek genomik GC içerik yüzde merkezli bir tepe ile benzemelidir. - Herhangi bir sıralaması bağdaştırıcısı kirlenme ve düşük kaliteli okuma yardımcı programını Trimmomatic9kırparak okunur aracılığıyla kaldırın.
Not: Uygulanan varsayılan parametreleri belirtin platformu bağımlı bağdaştırıcıları kaldırılması, baştaki ve sondaki düşük kaliteli üsleri kaldırılması ve trim okur için ne zaman bir 4-Bankası geniş sürgülü pencere kullanımı aşağıda belirtilen bir eşik temel damla başına ortalama kalite. - Fare MM10 başvuru genom10 işlenmiş okuma varsayılan parametrelerini kullanarak Bowtie2 aligner11 ile hizalayın.
- Bu Bowtie2 eşleme kalite ile kaldırarak hizalanmış okuma filtre (MAPQ) daha az Samtools12kullanarak 10 puan edinildi.
- Yüzde okuma strand çapraz korelasyon, toplu eşlenen, kapsamı ve örnek tekrarlanabilirlik çoğaltmak okumak gibi çeşitli sonrası hizalama kalite ölçümleri belirleyin.
Not: SPP13de dahil olmak üzere çeşitli paketler, ChIPqc14ve Deeptools15 bu kalite ölçümlerini hesaplayabilmesi mevcuttur. - Bir giriş denetimi veya uygun KO örnek MAC'ler algoritması (MACS2)16 varsayılan parametreleriyle kullanma ile en yüksek arama çözümlemesi gerçekleştirin.
- Bilinen kara listeye bölgeler17 üzerinden Bedtools18kullanarak mm10 ek açıklama ile üst üste herhangi bir aranan tepeler kaldırın.
Not: Kara listeye bölgeler yüksek sinyal ya da okuma sayar bağımsız hücre veya sıralama tekniği için gösterilen genom alanlardır. Bu bölgeler fonksiyonel genomik sıralama deneyler dışarı filtre uygulanabilir genomunun belirli bölgelerde yapay olarak yüksek yapı sinyalleri görüntüler. Tüm çoğaltır boru hattından bağımsız olarak işleneceğini ve sonra irreproducibility bulma oranı (IDR) için kullanılabilir. IDR Li, Brown, Huang ve Bickel19,20tarafından açıklandığı gibi bulgular arasında çoğaltır yöntemi aracılığıyla tekrarlanabilirlik ölçmek için istihdam edilmektedir. IDR yöntemi kantitatif çoğaltır arasında tutarlılığı değerlendiriyor ve kodla ve modENCODE tarafından kendi ChIP-seq kurallarına bir parçası olarak tavsiye edilir. - İstatistiksel olarak anlamlı doruklarına gen Ontoloji21,22, zenginleştirme veya motif analiz23gibi çeşitli aşağı akım analizleri için kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1: ChIP doğrulama tarafından qPCR. Temsilcisi GPS2 chIP-qPCR analiz H3K9 metilasyonu ve GPS2 ve Pol2 bağlama düzeyini göreli değişiklikleri gösterilen yarasa farelerin, WT ve GPS2 AKO içinde genlerin NDUFV1 (solda) ve TOMM20 (sağda) hedef. Çubuk grafikler ile 3 çoğaltır örnek ortalaması temsil * p < 0,05 ve ** p < 0,01 olarak hesaplanan bir öğrenci t-testi ile. Bu rakam Cardamone değiştirilir vd.2. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Örnekler ChIP-qPCR Şekil 12'. gösterilir WT veya GPS2 AKO fareler izole yarasa kullanarak GPS2 nükleer kodlanmış farklı hücre hatları2mitokondriyal genlerinde bir ifade için gerekli bulundu, biz GPS2 işe iki belirli nükleer kodlanmış mitokondrial genler, NDUFV1 ve TOMM20, üzerinde test Fareler--dan son derece mitokondri içinde zenginleştirilmiş bir doku örneği olarak BAT. İlk GPS2 organizatörü doluluk GPS2 AKO fareler ve vahşi-türü littermates, GPS2 bağlama GPS2 AKO fareler BAT seçici hedef genler üzerinde beklenen bir azalma gözlemleyerek karşılaştırıldığında. Burada açıklanan protokolü kullanarak, biz de RNA polimeraz 2 artan bağlama (Pol2) ve baskıcı histon mark H3K9me3 BAT GPS2 AKO fareler vahşi tipi littermates karşılaştırıldığında kaydetti. Tüm antikorlar için bağlayıcı IgG denetimi örneğini içinde gözlenen arka plan sinyal ile karşılaştırıldığında önemli. Bu sonuçlar GPS2 işe nükleer kodlanmış seçili mitokondrial genler üzerinde onaylamak ve GPS2 H3K9me3 birikimi önlemek için gerekli ve böylece hedef Rehberleri Pol2 transkripsiyon faaliyete oyalanmak için gerekli olduğunu göstermektedir. Daha fazla ayrıntı için Malzemeler tablo antikorlar ve özgün yayın için ek veri ve bu sonuçlar2ile daha kapsamlı tartışma bakın.
Şekil 2: Arsa kalite puanları ham sıralama okuma dövdüğüne izole--dan (A)Kalite Puanlarını yansıtacak bir hata olasılığını tahmin Bankası-arama sırasında. Yaygın olarak Q bir tamsayı değeri ifade edilir = - 10log10(P), hangi P Bankası-arama bir hata olasılığı olduğunu. Yukarıda gösterilen olduğunu bir temel sıra kalite BAT üretilen ham, işlenmemiş sıralama okuma Arsa FastQC tarafından oluşturulan dayalı. (B) GC içerik Okunma dağıtım bağdaştırıcısı çıkarıldıktan sonra ve yarasa örnekleri kırparak okuyun. GC içeriği kabaca bir normal dağılım GC genomik içerik türün gerçek kısmını merkezli bir tepe ile benzemelidir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2, sıralama kalite puanları, gösterilen bir temel seviye, başına ve okuma daha fazla herhangi bir kalıntı bağdaştırıcısı kirlenme kırparak ve ortalama kalite puanı kayan bir pencere karşısında düştüğü aşağıda okuma kaldırarak işlenen bir belirtilen eşik. Ayrıca GC içerik dağıtım okuma bağdaştırıcı kaldırma ve okuma düzeltme sonra gösterilir. Sıra kalite ve GC dağıtım olan iki yaygın olarak içerik ölçümleri hesaplama analizleri gerçekleştirilmesi için önce sonraki nesil sıralama verileri değerlendirmek için kullanılır. Bu sonuçlar protokolü üzerinden aşağı akım nesil sıralama teknolojileri ile uyumlu olan BAT izole yüksek kaliteli kromatin yeterli miktarda ürettiğini göstermektedir.
Şekil 3: WT ve GPS2 AKO fareler yarasa ChIP-seq verilerinden oluşturulan önemli dosyaları normalleştirilmiş. Bu şekilde normalleştirilmiş okuma kapsama Slc25a25 gen locus organizatörü bölgedeki önemli ölçüde denilen bir tepe ile birlikte gösterilir. GPS2 hedef gen Rehberleri kromatin durumunu değiştirerek ifade mitokondriyal genlerinin nükleer kodlanmış düzenleyen gösterildi. Bu sonuçlar önemli ölçüde denilen bir tepe görselleştirme bir temsilcisi nükleer kodlanmış mitokondrial gen üzerinde görüntüler. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 ' te gösterilen WT önemli parçaları vardır ve GPS2 AKO deepTools içinde uygulanan 1 x Derinlik (okuma başına genom kapsamı) için normalleştirilmiş BAM dosyaları uyumlu. Gösterilen mitokondrial gen Slc25a25organizatörü bölgesinde bulunan istatistiksel olarak anlamlı bir tepe varlığıdır. Normalleştirilmiş parça denilen tepe ve okuma azaltma vahşi tipi littermates göre GPS2 AKO farelerin yarasa bu konumda karşılık gelen okur zenginleştirme görselleştirme sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan protokolü üzerinden fare dokular, özellikle kahverengi yağ dokusu için en iyi duruma getirilmiş ChIP yerine getirmek için değerli bir araç temsil eder. Hücreleri yeterli sayıda numune hazırlama sırasında yapılan çip dokudan işlemlerinde büyük zorluklardan biri kurtarıyor. SOPAYI önemli ölçüde paslanmaz çelik boncuk yerine bir kanonik cam havaneli ile birleştiğinde bir doku homogenizer blender kullanarak kesme kırılmamış doku nedeniyle kayıp hücre sayısını azaltır. Ayrıca, daha sonra kolayca ayrılmış ve çekirdekleri ile yüksek hızlı Santrifüjü kaldırıldı lipidler serbest doku hipotonik arabellekte doğrudan homojenizasyon yardımcı olur.
Uygun sonication tutarlı ve tekrarlanabilir çip deneyleri yapmak için önemlidir. Bir su banyosu ultra-sonicator birden çok örnekleri, böylece kesme ve örnek çapraz bulaşma riskini azaltır kromatin tekrarlanabilirlik artırmak için aynı anda işleme sağlar. Ayrıca, örnek bozulması ve epitope tanıma kaybı önlemek için antikor tarafından kaçınılmalıdır örnekleri, aşırı ısınma sonication ısı kontrollü sistem kullanımını azaltır ( Malzemeler tablo Ayrıntılar için bakınız).
Diğer zorlu adım immunoprecipitated kompleksleri kurtarma olduğunu. Çünkü onlar bir manyetik raf ile birlikte kullanıldığında daha hızlı ve daha etkin yıkama için izin manyetik boncuklar kez bu adım için tercih edilir. Ancak, sahip oldukları DNA kurtarma için Protein A özel, hangi-ebilmek var olmak ciddi bir sınırlama malzeme başlayan az miktarda ile çalışırken kıyasla daha düşük bir hız. Biz Protein A özel Bulamaç PVDF 0,45 µm santrifüj filtre sütun birleşimi DNA verim en az çamaşır zaman ve daha yüksek tekrarlanabilirlik ile maksimum ulaşmak için harika bir çözüm bulacaksınız.
DNA izolasyon ile ilgili DNA izolasyon kitleri sütunları alan bol kullanılabilir. Deneyim, bu yaklaşımın bir sınırlama DNA kurtarma verimi üzerinde etkisi olduğu için sütunların kapasitesidir. Sorunu aşmak için daha geleneksel bir yöntem fenol/kloroform DNA ekstraksiyon için kullanmayı tercih.
Listelenen ChIP-seq boru hattı deneyler sıralama gelecek nesil için yaygın olarak kabul edilen araçları ve yardımcı programları bir dizi içerir. Kısaca, okuma FastQC ve Trimmomatic kullanarak temel kalite denetimine tabi, sonra Bowtie2 kullanarak fare MM10 genom hizalanmış. Hayatta kalan okuma için en yüksek istek MACS2 algoritması sayesinde kullanılmadan önce kalite eşleme tarafından filtre uygulanır. Ancak, diğer kullanılabilir ve doğrulanmış araçlarını da deney ve oluşturulan veri yapısına bağlı olarak kullanılabilir unutulmamalıdır. Herhangi bir kullanım parametreleri hizalama veya tepe arama da uygun olabilir ön işleme sırasında özelleştirilmiş.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bullet Blender Tissue Homogenizer | Next Advence | BBX24 | |
| Stainless Steel Beads 3.2 mm Diameter | Next Advence | SSB32 | |
| Bioruptor Sonicator | Diagenode | ||
| 1.5 mL Micro Tube TPX Plastic | Diagenode | C30010010-5 | |
| Complete-Protease inhibitor | Roche | 11836145001 | |
| Protein A Agarose Slurry | Invitrogen | 101041 | |
| GPS2 antibody | In house | Rabbit polyclonal, Ct antibody (Cardamone et al., Mol Cell 2018) | |
| Pol2 antibody | Diagenode | C15100055 | |
| h3K9me3 antibody | Millipore | 05-1242 | |
| Fast Syber Green Master Mix | Aplied Biosytem | 4385612 | |
| ViiA7 | Aplied Biosytem | ||
| TruSeq ChIP Library Preparation Kit | Illumina | IP-202-1012 | |
| HiSeq 2000 | Illumina |
References
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. , (2004).
- Cardamone, M. D., et al. Mitochondrial Retrograde Signaling in Mammals Is Mediated by the Transcriptional Cofactor GPS2 via Direct Mitochondria-to-Nucleus Translocation. Molecular Cell. 69, (2018).
- Emmett, M. J., et al. Histone deacetylase 3 prepares brown adipose tissue for acute thermogenic challenge. Nature. , (2017).
- Harms, M. J., et al. PRDM16 binds MED1 and controls chromatin architecture to determine a brown fat transcriptional program. Genes & Development. , (2015).
- Shapira, S. N., et al. EBF2 transcriptionally regulates brown adipogenesis via the histone reader DPF3 and the BAF chromatin remodeling complex. Genes & Development. , (2017).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22, 1813-1831 (2012).
- Liisberg Aune, U., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells. Journal of Visualized Experiments. , e50191 (2013).
- Andrews, S. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc (2010).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30, 2114-2120 (2014).
- Genome Browser Gateway. , Available from: https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway?db=mm10 (2018).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. , 357-359 (2012).
- Li, H., et al. The Sequence alignment/map (SAM) format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins. Nature Biotechnology. 26, 1351-1359 (2008).
- Carroll, T. S., Liang, Z., Salama, R., Stark, R., de Santiago, I. Impact of artifact removal on ChIP quality metrics in ChIP-seq and ChIP-exo data. Frontiers in Genetics. 5, 75 (2014).
- Ramírez, F., et al. deepTools2: A next Generation Web Server for Deep-Sequencing Data Analysis. Nucleic Acids Research. , (2016).
- Zhang, Y., et al.
- ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).
- Li, Q., Brown, J. B., Huang, H., Bickel, P. J.
- Irreproducible Discovery Rate (IDR). , Available from: https://github.com/nboley/idr (2018).
- The Gene Ontology Consortium. Expansion of the Gene Ontology Knowledgebase and Resources. Nucleic Acids Research. 45, D331-D338 (2017).
- Ashburner, M., et al. Gene Ontology: tool for the unification of biology. Nature Genetics. 25, 25-29 (2000).
- Boeva, V. Analysis of Genomic Sequence Motifs for Deciphering Transcription Factor Binding and Transcriptional Regulation in Eukaryotic Cells. Frontiers in Genetics. 7, 24 (2016).
