Summary
هذه الورقة تفاصيل بروتوكول لإعداد ثقافة مشتركة من خلايا cryptococcal والأميبا التي يتم دراستها باستخدام الصور الفلورية لا يزال، والصور عالية الدقة نقل المجهر الإلكتروني. ويتضح هنا كيف يمكن للبيانات الكمية أن تكمل هذه المعلومات النوعية.
Abstract
لمحاكاة عدوى Cryptococcus، يمكن استخدام الأميبا، وهو المفترس الطبيعي لخلايا cryptococcal في البيئة، كنموذج للماكروفيج. هذا الكائن الحي المفترس، على غرار الضامة، يستخدم phagocytosis لقتل الخلايا الداخلية. مع مساعدة من مجهر الليزر المسح الضوئي، يتم التقاط الصور التي تصور لحظات تفاعلية بين خلايا cryptococcal والأميبا. قوة القرار من المجهر الإلكتروني يساعد أيضا على الكشف عن التفاصيل الهيكلية جدا من خلايا cryptococcal عندما المحاصرين داخل الفراغ الغذاء الأميبا. وبما أن الفياغوسية عملية مستمرة، ثم يتم دمج البيانات الكمية في التحليل لشرح ما يحدث في الوقت المناسب عندما يتم التقاط صورة. وعلى وجه التحديد، تُقرأ وحدات الفلورة النسبية من أجل تحديد كفاءة الأميبا في استيعاب خلايا الكريبتوك. لهذا الغرض، وملطخة خلايا cryptococcal مع صبغة التي تجعلها الفلورة مرة واحدة محاصرين داخل البيئة الحمضية من vacuole الغذاء. عند استخدامها معا، يمكن أن توفر المعلومات التي يتم جمعها من خلال هذه التقنيات معلومات حاسمة للمساعدة في استخلاص استنتاجات حول سلوك ومصير الخلايا عند استيعابها من قبل الأميبا، وربما، من قبل الخلايا الفيوسية الأخرى.
Introduction
وقد تطورت الميكروبات مع مرور الوقت لتحتل وتزدهر في منافذ إيكولوجية مختلفة مثل الحدود المادية المفتوحة للتربة والمياه، من بين أمور أخرى1. وفي هذه المنافذ، كثيرا ما تشارك الميكروبات في المنافسة المباشرة على الموارد المحدودة؛ الأهم من ذلك، للمغذيات التي يستخدمونها لدعم نموها أو الفضاء،والتي يحتاجونها لاستيعاب السكان الآخذة في التوسع 2،3. في بعض الحالات، قد بعض الكائنات الثلاثية الأبعاد مثل الأميبا حتى predate على خلايا cryptococcal كوسيلة لاستخراج المواد الغذائية من الكتلة الحيوية الخاصة بهم4،5. وهذا بدوره يسمح لهذه الكائنات بترسيخ الهيمنة الإقليمية عن طريق السيطرة على أعداد سكان فريستها. وبسبب هذا الضغط المفترس ، يمكن اختيار بعض الفرائس لإنتاج عوامل ميكروبية ، مثل كبسولة cryptococcal6، للتوفيق بين الآثار السلبية للضغط. ومع ذلك، كنتيجة غير مقصودة لهذا الضغط، بعض الميكروبات اكتساب العوامل التي تسمحلهم بعبور حاجز الأنواع والبحث عن منافذ جديدة لاستعمار 7، مثل المساحات المحصورة في جسم الإنسان التي هي غنية بالمواد الغذائية ولها مثالية الظروف. هذا الأخير قد يفسر كيف ميكروبالأرض مثل Cryptococcus (C.) يمكن أن تتحول neoformans لتصبح المسببة للأمراض.
لهذه الغاية، من المهم دراسة الاتصال الأولي أن خلايا cryptococcal قد يكون مع الأميبا وكيف يمكن أن تختار لهم لتصبح المسببة للأمراض. وبشكل أكثر تحديداً، قد يعطي هذا أدلة على كيفية تصرف خلايا الكريبتوككل عندما يتصرف عليها الضامة أثناء العدوى. ولهذا السبب تم اختيار الأميبا كنموذج للماكروفيج هنا ، حيث أنها رخيصة نسبيا وسهلة للحفاظ على ثقافة الأميبا في مختبر8. وكان من المهم أيضا أن تدرس كيف cryptococcal الأيض الثانوي أي 3-هيدروكسي الأحماض الدهنية9،10 تؤثر على التفاعل بين الأميبا وخلايا cryptococcal.
وهناك طريقة بسيطة لإدراك التفاعل بين الأميبا وفريستها بالعين المجردة هو إنشاء حديقة باستخدام فريستها على سطح لوحة أجار وبقعة الأميبا. يصور تصور اللوحات أو المناطق الواضحة على لوحة أجار المناطق التي قد تكون قد أطعمت فيها الأميبا فريستها. ومع ذلك، على هذا المستوى الكلي، يتم ملاحظة فقط نتيجة العملية، وعملية البلغم هو ميكانيكية لا يمكن ملاحظتها. لذلك، لتقدير العملية على أساس خلية إلى خلية، وهناك العديد من الطرق المجهرية التي يمكن استخدامها11،12. على سبيل المثال، يمكن استخدام المجهر المقلوب مع غرفة الحضانة لتسجيل الفيديو الفاصل الزمني للأحداث بين خلية phagocytic وهدفها13. لسوء الحظ، بسبب تكلفة المجهر مع وظيفة الفاصل الزمني، فإنه ليس من الممكن دائما للمختبرات لشراء مثل هذا المجهر، وخاصة في الموارد البيئات الفقيرة.
للتحايل على القيد المذكور أعلاه، تقدم هذه الدراسة تصميمًا استكشافيًا متسلسلًا يقيّم تفاعل C. neoformans viz C. neoformans UOFS Y-1378 وC. neoformans LMPE 046 مع Acanthamoeba castellani . أولاً، يتم استخدام طريقة نوعية تسبق طريقة كمية. يتم التقاط الصور الثابتة باستخدام مجهر الفلورة المقلوب، فضلا عن المجهر الإلكتروني انتقال لتصوير التفاعلات الأميبا-Cryptococcus. وأعقب ذلك قياس الفلورة باستخدام قارئ لوحة لتقدير كفاءة الأميبا لاستيعاب خلايا الكريبتوكال. عند التوفيق بين النتائج من هذه الأساليب خلال مرحلة تفسير البيانات، وهذا قد يكشف بنفس القدر من المعلومات الحرجة مثل الاطلاع على شريط فيديو الفاصل الزمني phagocytosis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ويعتبر النيوفورمانات Cryptococcus وبعض سلالات Acanthamoeba castellanii كمسببات الأمراض من المستوى 2 للسلامة الأحيائية (BSL-2)؛ وبالتالي، يجب على الباحثين اتخاذ الاحتياطات المناسبة عند العمل مع هذه الكائنات الحية. على سبيل المثال، يجب أن يكون لدى موظفي المختبرات تدريب محدد ومعدات حماية شخصية (PPE) مثل معاطف المختبر والقفازات وحماية العين. وينبغي استخدام مجلس الوزراء السلامة البيولوجية (المستوى 2) للإجراءات التي يمكن أن تسبب العدوى14.
1. زراعة وتوحيد الخلايا الفطرية (المعدلة من Madu وآخرون 15 )
- خط من سلالات الفطرية اختبار (أي C. neoformans UOFS Y-1378 و C. neoformans LMPE 046) من ثقافات الأسهم (لا يزيد عمرها عن 9 أشهر) على الخميرة-peptone-سكر العنب (YPD) لوحات أجار. ويمكن الاطلاع على معلومات عن مكونات أجار YPD في الجدول1.
ملاحظة: C. neoformans UOFS Y-1378 وقد ثبت لإنتاج الأحماض الدهنية 3-هيدروكسي، في حين C. neoformans LMPE 046 لا تنتج 3-هيدروكسي الأحماض الدهنية. راجع الملف التكميلي 1 للحصول على معلومات حول كيفية تحديد وجود هذه الجزيئات. - احتضان لوحات أجار لمدة 48 ساعة عند 30 درجة مئوية.
ملاحظة: يمكن تخزين لوحة لمدة تصل إلى 2 أشهر في 4 درجة مئوية قبل أن يمكن التخلص منها أو استخدامها لجعل ثقافة الأسهم16. - كشط قبالة حلقة من خلايا cryptococcal(C. neoformans UOFS Y-1378 أو C. neoformans LMPE 046) من لوحة 48 ح-العمر وتلقيح في قارورة مخروطية 250 مل تحتوي على 100 مل من مرق YNB المعرفة كيميائيا (6.7 غرام / لتر) مع 4٪ ( ث / ف) الجلوكوز. ويمكن الاطلاع على معلومات عن مكونات مرق YNB في الجدول 2.
- احتضان القوارير في 30 درجة مئوية لمدة 24 ساعة في حين التحريض في 160 دورة في الدقيقة على شاكر دوارة.
- بعد فترة حضانة 24 ساعة، عد الخلايا الفطرية باستخدام مقياس الهيموميتومتر وضبط رقم الخلية إلى 1 × 106 خلايا / مل مع PBS في الرقم الهيدروجيني 7.4.
ملاحظة: تم استخدام التلقيح C. neoformans UOFS Y-1378 المعد في الخطوتين 3-1 و3.2، في حين تم استخدام C. neoformans LMPE 046 inoculum فقط في الخطوة 3.2.
2- زراعة وتوحيد خلايا الأميبا (المعدلة من Madu et al. 15)
- إذابة ثقافة الأسهم من أكانثامويبا كاستيلاني وإحضارها إلى درجة حرارة الغرفة (RT).
ملاحظة: أُعدت أميبا استناداً إلى البروتوكولات المعدلة لأكسلسون - أولسون وآخرون8 وشوستر17. - ماصة 1 مل من الثقافة المذابة وتلقيحها في أنبوب الطرد المركزي 50 مل تحتوي على 15 مل من ATCC المتوسطة 712. ويمكن الاطلاع على معلومات عن مكونات ATCC المتوسطة 712 في الجدول3.
- يهز يدويا بلطف وعلى الفور الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 400 × ز و 30 درجة مئوية.
- يستنشق الخارق.
- إعادة تعليق الخلايا في 15 مل من ATCC المتوسطة 712 وحضانة الأنبوب في 30 درجة مئوية لمدة 14 يوما.
ملاحظة: تحقق بشكل دوري من الخلايا، باستخدام مجهر خفيف بسيط، لتحديد ما إذا كانت في حالة تروبهوزويت. مرة واحدة هم في حالة تروبهوزويت، بدء ثقافة جديدة. - ماصة 1 مل من الثقافة التي تظهر الخلايا في حالة تروبهوزويت واستخدامها لتلقيح أنبوب الطرد المركزي معقمة 50 مل تحتوي على 15 مل من الطازجة، معقمة ATCC المتوسطة 712.
- احتضان الأنبوب في 30 درجة مئوية لمدة 1 أسبوع في حين التحريض في 160 دورة في الدقيقة على شاكر دوارة.
- بعد أسبوع، عد خلايا الأميبا باستخدام مقياس الهيموميتومتر وضبط رقم الخلية إلى 1 × 107 خلايا / مل مع الطازجة، معقمة ATCC المتوسطة 712.
- إجراء اختبار الصلاحية باستخدام وصمة عار الأزرق trypan كما هو مفصل من قبل Strober18. المضي قدما في الثقافات التي تظهر ما لا يقل عن 80٪ من الجدوى.
3. تلطيخ الفلورة من الخلايا لدراسة البلغم (المعدلة من Madu وآخرون 15 )
- جمع البيانات النوعية من خلال استخدام مجهر الفلورة
ملاحظة: إجراء هذا الفحص مع أكانثامويبا كاستيلاني و C. نيوفورمانز UOFS Y-1378.- الاستغناء عن تعليق 200 درجة مئوية من الأميباي موحدة (1 × 107 خلايا / مل في ATCC المتوسطة 712) في آبار غرفة من شريحة ملتزمة وحضانة لمدة 2 ساعة في 30 درجة مئوية للخلايا التمسك السطح.
- في حين أن خلايا الأميبا تستقر للتمسك، وصمة عار موحدة C. neoformans UOFS Y-1378 الخلايا التي تم تعديلها إلى 1 × 106 خلايا / مل (في 999 ميكرولتر من PBS) مع 1 ميكرولتر من الفلوريسين إيزوثيوسينات في أنبوب بلاستيكي 1.5 مل.
ملاحظة: إعداد وصمة عار عن طريق حل 1 ملغ من الفلوريسين إيزوثيوسينات في 1 مل من الأسيتون. - تحريك بلطف C. neoformans UOFS Y-1378 الخلايا على شاكر المدارية تعيين في 50 دورة في الدقيقة لمدة 2 ساعة في RT وفي الظلام.
- بعد 2 ح، الطرد المركزي في 960 × ز لمدة 5 دقائق في 30 درجة مئوية لبيليه الخلايا.
- يستنشق supernatant لإزالة PBS مع وصمة عار.
- إضافة 1 مل من PBS إلى أنبوب لغسل بيليه الخلية. غسل الخلايا عن طريق الأنابيب بلطف.
- طرد مركزي الخلايا في 960 × ز لمدة 5 دقائق في 30 درجة مئوية. تجاهل الـ supernatant. كرر خطوة الغسيل مرة أخرى.
- إعادة تعليق الخلايا المغسولة في 1 مل من PBS.
- الاستغناء عن تعليق 200 ميكرولتر من الخلايا الملونة C. neoformans UOFS Y-1378 إلى آبار الغرفة التي تحتوي على خلايا الأميبا غير ملطخة.
- احتضان الثقافة المشتركة المعدة في 30 درجة مئوية لفترة إضافية 2 ساعة.
ملاحظة: يمكن احتضان الثقافة المشتركة لنقاط زمنية مختلفة لتناسب الغرض من التجربة. - في نهاية فترة الحضانة المشتركة، يستنشق محتويات الآبار.
- إضافة 300 درجة مئوية من PBS إلى الآبار لغسل آبار الغرفة وإزالة أي خلايا غير مقيدة ذات ثقافة مشتركة. القيام بذلك عن طريق الأنابيب لطيف. يستنشق محتويات الآبار. كرر خطوة الغسيل مرة أخرى.
- إعداد حل الجلوتالارهايد 3٪ عن طريق إضافة 3 مل من الجلوتالالديهايد إلى 97 مل من الماء المقطر.
- إصلاح الخلايا المشتركة الثقافات عن طريق إضافة 250 درجة مئوية من حل 3٪ إلى آبار الغرفة وحضانة لمدة 1 ساعة.
- يستنشق المثبت وغسل آبار الغرفة كما هو مفصل من الخطوة 3.1.13.
- تفكيك آبار الغرفة باستخدام أداة التي تم توفيرها مع الشرائح الغرفة.
- إضافة قطرة من مركب أنتيفادي، 1،4-ديازابيسيكلو-[2.2.2]-أوكتان إلى الشريحة لمنع التبييض التلقائي. يُغطّى بغطاء واغلق الجانبين بطلاء أظافر لمنع التبخر.
- عرض الخلايا ذات الثقافات المشتركة باستخدام العدسة الموضوعية 100x (مع النفط) من مجهر المسح الضوئي بالليزر البؤري.
ملاحظة: من المهم التقاط الصور في مجال مشرق والفلورة لعرض التفاعل بين الأميبا وخلايا cryptococcal. وحيثما أمكن، يمكن فرض الفلورة بشكل فائق على صور الحقول الساطعة. خلايا الأميبا عادة ما تكون أكبر في الحجم (أي، 45-60 ميكرومتر)، وخلايا تروبهوزويت لها شكل غير منتظم. خلايا Cryptococcal هي 5-10 ميكرومتر في القطر ولها globose إلى شكل ovoid. عندما تتعرض لأشعة الليزر ، فمن الممكن أن خلايا الأميبا غير الملطخة قد تنبعث منها الفلورة التلقائية. الرجوع إلى Beisker ودولبير19 وكلانسي وكولر20 لطرق للحد من الفلورة الذاتية.
- الحصول على البيانات الكمية من خلال استخدام قارئ لوحة الفلورة
ملاحظة: إجراء هذا الفحص مع أكانثامويبا كاستيلاني و C. نيوفورمانز UOFS Y-1378 أو C. neoformans LMPE 046.- الاستغناء عن تعليق 100 درجة مئوية من الأميباي موحدة (تعديلها إلى 1 × 107 خلايا / مل في ATCC المتوسطة 712) في أسود، وملتصق 96 لوحة ميكروتتر جيدا.
- احتضان لوحة لمدة 2 ساعة في 30 درجة مئوية للسماح خلايا الأميبا التمسك السطح.
- في حين أن خلايا الأميبا تستقر للتمسك، وصمة عار موحدة C. neoformans UOFS Y-1378 الخلايا التي تم تعديلها إلى 1 × 106 خلايا / مل (في 999 ميكرولتر من PBS) مع 1 ميكرولتر من pHrodo الأخضر Zymosan A BioParticles في أنبوب الطرد المركزي الصغير 1.5 مل. وصمة عار C. neoformans LMPE 046 الخلايا وكذلك في أنبوب منفصل.
ملاحظة: الصبغة، على عكس FITC، البقع الانتقائية الخلايا التي هي المحاصرين داخل البيئة الحمضية من خلية phagocytic21،22. لهذه التقنية، من المهم الحفاظ على خلايا cryptococcal في وسط مع درجة الحموضة محايدة (PBS) والأميبا في وسط مع درجة الحموضة محايدة (ATCC المتوسطة 712). وسيؤدي وجود وسيلة ذات بيئة حمضية إلى قراءة إيجابية خاطئة لوحدات الفلورة النسبية، مما يعني أن عددا أكبر من الكريبتوكلوكال قد تم استيعابه. - تحريك بلطف خلايا cryptococcal على شاكر المدارية تعيين في 50 دورة في الدقيقة لمدة 2 ساعة في RT وفي الظلام.
- بعد 2 ح، الطرد المركزي أنبوب الطرد المركزي في 960 × ز لمدة 5 دقائق في 30 درجة مئوية لبيليه الخلايا. يستنشق supernatant لإزالة PBS مع وصمة عار.
- إضافة 1 مل من PBS إلى الأنبوب لغسل الخلايا الكريات. غسل الخلايا عن طريق الأنابيب لطيف.
- طرد مركزي الخلايا في 960 × ز لمدة 5 دقائق في 30 درجة مئوية. تجاهل الـ supernatant. كرر خطوة الغسيل مرة أخرى.
- إعادة تعليق بيليه من الخلايا المغسولة في 1 مل من PBS.
- الاستغناء عن تعليق 100 ميكرولتر من خلايا cryptococcal الملون إلى الآبار التي تحتوي على خلايا الأميبا غير ملطخة.
- احتضان الثقافة المشتركة المعدة في 30 درجة مئوية لفترة إضافية 2 ساعة.
ملاحظة: يمكن احتضان الثقافة المشتركة لنقاط زمنية مختلفة لتناسب الغرض من التجربة. - في نهاية فترة الحضانة المشتركة، قياس الفلورة على قارئ ميكروبليت. تحويل الإشارات اللوغاريتمية إلى وحدات الفلورة النسبية.
ملاحظة: الإثارة الصبغة في 492 نانومتر والانبعاثات في 538 نانومتر. استشارة Beisker ودولبير19 وكلانسي وكولر20 لطرق للحد من الفلورة الذاتية.
4. استخدام مجهرية الإلكترون الإرسال لدراسة الفياغوسية (المعدلة من فان ويك ووينغفيلد 23 )
- إضافة تعليق 5 مل من الأميباي (تعديلها إلى 1 × 107 خلايا / مل في ATCC المتوسطة 712) إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل والسماح لهم لتسوية لمدة 30 دقيقة في 30 درجة مئوية.
- إضافة تعليق 5 مل من الخلايا C. neoformans UOFS Y-1378 (المعدلة إلى 1 × 106 خلايا / مل في PBS) إلى نفس أنبوب الطرد المركزي الذي يحتوي على 5 مل من خلايا الأميبا موحدة.
- السماح للحامل أنبوب لمدة 2 ساعة في 30 درجة مئوية.
- طرد مركزي الأنبوب في 640 × ز لمدة 3 دقائق في 30 درجة مئوية لبيليه الخلايا المشتركة المستزرعة. يستنشق الخارق. لا تغسل الخلايا المشتركة الثقافة.
- إصلاح الخلايا المشتركة المستزرعة عن طريق إعادة تعليق بيليه في 3 مل من 1.0 M (درجة الحموضة = 7.0) فوسفات الصوديوم المخزنة 3٪ الجلوتارالهايد لمدة 3 ساعة.
- طرد مركزي الأنبوب في 1120 × ز لمدة 5 دقائق في 30 درجة مئوية لبيليه الخلايا المشتركة الثقافة. يستنشق الخارق.
- إضافة 5 مل من احتياطي فوسفات الصوديوم إلى أنبوب الطرد المركزي لغسل الخلايا الكريات. غسل بلطف عن طريق الأنابيب محتويات الأنبوب لمدة 20 s.
- طرد مركزي الأنبوب في 1120 × ز لمدة 5 دقائق في 30 درجة مئوية لبيليه الخلايا المشتركة الثقافة.
- كرر الخطوات 4.8 إلى 4.10. يستنشق الخارق.
- إصلاح الخلايا المشتركة المستزرعة مرة أخرى عن طريق إعادة تعليق بيليه في 3 مل من 1.0 M (درجة الحموضة = 7.0) الصوديوم الفوسفات المخزنة 1٪ أوستروكسيد أوزميوم لمدة 1.5 ساعة.
- إزالة المثبت (أوستروكسيد أوزميوم) عن طريق غسل الخلايا المشتركة المستزرعة بطريقة مماثلة لإزالة 3٪ الجلوتالالديهايد.
- تجفيف المواد TEM (المعروف أيضا باسم الخلايا المشتركة المستزرعة) في أسيتونseries متدرجة من 30٪، 50٪، 70٪، 95٪ واثنين من التغييرات من 100٪ لمدة 15 دقيقة لكل منهما، على التوالي. للقيام بذلك، إضافة 3 مل من محلول الأسيتون إلى الخلايا بيليه والسماح لها الوقوف لمدة 15 دقيقة. ثم، الطرد المركزي في 200 × ز لمدة 10 دقيقة في RT تجاهل supernatant وإضافة نسبة أعلى من الحل الأسيتون.
- إعداد الايبوكسي من الاتساق العادي وفقا للبروتوكول من قبل سبور24.
ملاحظة: يتم استخدام راتنج الايبوكسي للتقسيم. - تضمين المواد TEM في الراتنج الايبوكسي أعدت حديثا. للقيام بذلك، اتبع الخطوات التالية.
- إضافة 3 مل من الايبوكسي أعدت حديثا إلى أنبوب يحتوي على المواد TEM علقت في 3 مل من محلول 100٪ من الأسيتون. السماح للأنبوب للوقوف لمدة 1 ساعة.
- الطرد المركزي الأنبوب في 200 × ز لمدة 10 دقيقة في 30 درجة مئوية. يستنشق محلول الايبوكسي الأسيتون.
- إضافة 6 مل من الايبوكسي أعدت حديثا إلى بيليه في الأنبوب. السماح للأنبوب للوقوف لمدة 1 ساعة.
- الطرد المركزي في 200 × ز لمدة 10 دقيقة في 30 درجة مئوية. يستنشق كل محلول الايبوكسي الأسيتون.
- إضافة 3 مل من الايبوكسي أعدت حديثا إلى الأنبوب. السماح للأنبوب للوقوف لمدة 8 ح.
- الطرد المركزي في 200 × ز لمدة 10 دقيقة في 30 درجة مئوية. أسقون كل محلول الايبوكسي
- إضافة 3 مل من الايبوكسي أعدت حديثا إلى الأنبوب. الحفاظ على المواد TEM في حل الايبوكسي بين عشية وضحاها في المجفف فراغ.
تحذير: راتنج الايبوكسي هو مادة مشعة. استخدام PPE للتعامل مع الراتنج الايبوكسي. وينبغي أيضا التعامل مع الراتنج الايبوكسي في غطاء محرك السيارة الدخان. يجب على الباحثين اتباع أنظمة السلامة لتجاهل هذه المواد على النحو المحدد من قبل كل بلد25.
- بوليمرات المواد TEM لمدة 8 ساعة في 70 درجة مئوية.
- على ultramicrotome، تقليم أقسام صغيرة من حوالي 0.1 مم × 0.1 ملم و 60 نانومتر سمك من المواد الايبوكسي جزءا لا يتجزأ من مع سكين الزجاج شنت. تجميع المقاطع على شبكة ووضع الشبكات في مربع حامل عينة TEM قبل تلطيخ.
- وصمة عار المقاطع مع انخفاض من خلات أورانيل 6٪ لمدة 10 دقيقة في الظلام. تأكد من تغطية الأقسام بالكامل.|
ملاحظة: إعادة تشكيل وصمة عار (6 غرام) في 100 مل من الماء المقطر.
تحذير: خلات أورانيل هي مادة مشعة. استخدام PPE للتعامل مع خلات أورانيل. وينبغي أيضا أن يتم التعامل مع خلات Uranyl في غطاء محرك السيارة الدخان. يجب على الباحثين اتباع أنظمة السلامة لتجاهل هذه المواد على النحو المحدد من قبل كل بلد25. - شطف المقاطع عن طريق غمس لهم خمس مرات في الكأس الذي يحتوي على 100 مل من الماء المقطر.
ملاحظة: يجب التخلص من الماء المقطر وفقا لذلك لأنه يحتوي على آثار خلات أورانيل. - وصمة عار القسم مع قطرة من سيترات الرصاص لمدة 10 دقيقة في الظلام. تأكد من تغطية الأقسام بالكامل.
ملاحظة: يجب إعداد سيترات الرصاص وفقا للبروتوكول من قبل رينولد26. - شطف المقاطع عن طريق غمس لهم خمس مرات في الكأس الذي يحتوي على 100 مل من الماء المقطر.
- تجميع الشبكات بشكل فردي مع أقسام ملطخة على مربع حامل عينة TEM.
- عرض المقاطع مع المجهر الإلكتروني انتقال.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الميكروبات هي كائنات مجهرية لا يمكن تصورها بالعين المجردة. ومع ذلك، قد يؤدي تأثيرها إلى أمراض واضحة سريرياً يمكن ملاحظتها، مثل الالتهابات الجلدية. عند دراسة جوانب معينة من الميكروبات، تتراوح بين مورفولوجيا، والمنتجات الثانوية، والتفاعلات، والقدرة على تقديم الأدلة التصويرية والفيديو هو من الأهمية القصوى.
لقد سعينا أولاً إلى تصور التفاعل بين خلايا الكريبتوكوال والأميبا. ولهذا الغرض، تمت دراسة الصور ذات المجال الساطع التي أظهرت 2 ح الخلايا المشتركة الحاضنة أولاً. كشفت إحدى الصور عن خلية كريبتوكوكال التي كانت على مقربة من الأميبا. وقد شوهد واحد من خلايا الأميبا مع pseudopodia الموسعة لالتقاط خلية cryptococcal (الشكل1A). بعد ذلك، تم التقاط صورة مقابلة في الفلورة للرجوع إليها (الشكل1B). ساعد الفلورة الخضراء على سطح الخلايا الملونة في تأكيد وجود خلايا cryptococcal. الأميبا غير ملطخة أيضا السيارات الفلورية. هذا، بالإضافة إلى حجم الفرق الظاهر ومورفولوجيا، ساعد في زيادة التمييز بين نوعين من الخلايا.
الفلورة الذاتية هي نوعية غالبا ما لوحظت عندما تنبعث الهياكل البيولوجية بطبيعة الحال الضوء التي استوعبت (على سبيل المثال، بعد التعرض لأشعة الليزر أثناء المسح المجهري بالليزر البؤري)27. في الشكل 1C، لوحظت خلايا cryptococcal (في نفس الوقت من 2 ح) التي تم استيعابها بالفعل من قبل الأميبا. كما تم التقاط الصورة المقابلة في الفلورة للرجوع إليها (الشكل1D). واستناداً إلى الأدلة الموجودة في متناول اليد، من المغري أن نخلص إلى أن الأميبا قتلت الزنزانتين المحاصرتين. ومع ذلك، phagocytosis هو عملية ديناميكية حيث المضيف، المفترس والممرض، وفريسة استخدام استراتيجيات مختلفة لتدمير أو التهرب من بعضها البعض28. يتم إظهار فعل الخلايا cryptococcal التهرب من الخلايا الفاغورية بأناقة من قبل vomocytosis29،30، وهو عملية طرد غير ليتيك من الخلايا المحاصرين من الضامة. وقد تم القبض على هذه الخطوة جريئة في أشرطة الفيديو الفاصل الزمني29,30. لسوء الحظ، وهذا يسلط الضوء على الحد من دراسة الصور الثابتة للخلايا الثابتة، كما هو الحال في دراستنا، لتوضيح عملية ديناميكية مثل الفياغوسية. إلى هذه النقطة، قد يغيب الباحث الفاصل الزمني عندما تهرب خلية من القبض عليها.
وللتعويض عن ما تقدم، تم النظر في قراءة وحدات الفلورة النسبية. في الدراسة الحالية، تم أخذ قراءات بعد فترة حضانة مشتركة 2 ساعة وساعدت على مقارنة استجابة سلالات cryptococcal اختبار اثنين [أي واحدة التي تنتج الأحماض الدهنية 3-هيدروكسي (C. neoformans UOFS Y-1378) والآخر الذي لا(C. [نيوفورمنس] [لمب] 046)]. كان من المفترض أن الأحماض الدهنية 3-هيدروكسي قد تكون بمثابة محدد ضراوة التي تضعف تناول خلايا cryptococcal، بما في ذلك phagocytosis بواسطة الأميبا. لمزيد من المعلومات حول تأثير الأحماض الدهنية 3-هيدروكسي على الأميبا، ينصح بالرجوع إلى Madu وآخرون15،31. ويبين الشكل 2 كمية خلايا الكريبتوكوال التي تم استيعابها استناداً إلى قراءة وحدات الفلورة. عند مقارنة عزلتي cryptococcal، كان من الواضح أن الخلايا التي تنتج الأحماض الدهنية 3-هيدروكسي تم استيعابها أقل تواترا بالمقارنة مع الخلايا التي لا تنتج الأحماض الدهنية 3-هيدروكسي.
ولتعزيز البيانات النوعية، أُدرج الفحص المجهري للإلكترون في التحليل (الشكل3ألف). هنا، لوحظ أن سلالة التي تنتج الأحماض الدهنية 3-هيدروكسي(C. neoformans UOFS Y-1378) كان protuberances شائك على كبسولة (الشكل3B)،والتي يمكن استخدامها من قبل الخلية لإطلاق الأحماض الدهنية 3-هيدروكسي إلى البيئة الخارجية.
من المهم أن نلاحظ أن البيانات (في الشكل 1، الشكل 3) تنقل مصير خلايا cryptococcal كما يجري استيعابها وليس قتل / phagocytized. لتحديد ما إذا كانت الخلايا قد نجت من الحدث الفيجوسي، فمن المستحسن أن تشمل فحص إضافي فيه الباحث يلطّس خلايا الأميبا ويعد أجار لوحة انتشار لتعداد وحدات تشكيل مستعمرة cryptococcal (CFU). من خلال عد CFUs، أفاد Madu وآخرون15 أن خلايا cryptococcal المنتجة 3-هيدروكسي الأحماض الدهنية كانت أيضا مقاومة للعمل phagocytic من الأميبا بعد الاستيعاب. وهكذا، أسفرت هذه الخلايا عن معدل بقاء أعلى بكثير بالمقارنة مع الخلايا التي لا تنتج الأحماض الدهنية 3-هيدروكسي.
ويبين الشكل 4 أهمية إعداد عينات TEM وفحصها. وفي هذه الحالة، تعرضت أقسام C. neoformans UOFS Y-1378 عن قصد للقصف بالإلكترون. في النهاية، لا يمكن استخدام الصورة التي تم التقاطها، لأنها تعرض للخطر جودة المعلومات التي يمكن استنتاجها. وتبين المعلومات التي تم الحصول عليها معا أنه من خلال الجمع بين هذه التقنيات المختلفة، يمكن للباحث أن يستنتج معلومات كافية لتحديد مصير الخلايا المشفرة عندما تشارك في الثقافات مع الأميبا.
| العنصر | كميه |
| البيتوني البكتريولوجية | 20 غرام / لتر |
| الخميرة استخراج | 10 غرام / لتر |
| الجلوكوز | 20 غرام / لتر |
| اجار | 15 غرام / لتر |
الجدول 1: المكونات اللازمة لصنع أجار YPD. إضافة المبلغ المطلوب جميع المكونات في 1 لتر من الماء. يُسخّن المزيج مع التحريك لإذابة المكونات تماماً. مرة واحدة القيام به الأوتوكلاف قبل الاستخدام.
| العنصر | كميه |
| كبريتات الأمونيوم | 5 غرام / لتر |
| البيوتين | 2 ميكروغرام/لتر |
| بانتوثينات الكالسيوم | 400 ميكروغرام/لتر |
| حمض الفوليك | 2 ميكروغرام/لتر |
| Inositol | 2000 ميكروغرام/لتر |
| النياسين | 400 ميكروغرام/لتر |
| ف-أمينوبنزويك حمض | 200 ميكروغرام/لتر |
| بيريدوكسين هيدروكلوريد | 400 ميكروغرام/لتر |
| الريبوفلافين | 200 ميكروغرام/لتر |
| الثيامين هيدروكلوريد | 400 ميكروغرام/لتر |
| حمض البوريك | 500 ميكروغرام/لتر |
| كبريتات النحاس | 40 ميكروغرام/لتر |
| يوديد البوتاسيوم | 100 ميكروغرام/لتر |
| كلوريد الحديد | 200 ميكروغرام/لتر |
| كبريتات المنغنيز | 400 ميكروغرام/لتر |
| موليبديت الصوديوم | 200 ميكروغرام/لتر |
| كبريتات الزنك | 400 ميكروغرام/لتر |
| فوسفات أحادي البوتاسيوم | 1 غرام / لتر |
| كبريتات المغنيسيوم | 0.5 جم/ لتر |
| كلوريد الصوديوم | 0.1 جم/ لتر |
| كلوريد الكالسيوم | 0.1 جم/ لتر |
الجدول 2: المكونات اللازمة لصنع مرق YNB. إضافة المبلغ المطلوب جميع المكونات في 1 لتر من الماء. يُسخّن المزيج مع التحريك لإذابة المكونات تماماً. مرة واحدة القيام به الأوتوكلاف قبل الاستخدام.
| الجزء الأول: الوسط القاعدي. | |
| العنصر | كميه |
| بروتيوس بيبتون | 20 غرام / لتر |
| الخميرة استخراج | 1 غرام / لتر |
| أجار (إذا لزم الأمر) | 20 غرام / لتر |
| الجزء الثاني: الملاحق. | |
| المكون (حلول الأسهم) | كميه |
| 0.05 M CaCl2 | 8 مل |
| 0.4 م م. م.س 4 × 7 إتش2س | 10 مل |
| 0.25 M Na2HPO4 × 7H2O | 10 مل |
| 0.25 M KH2PO4 | 10 مل |
| Na سيترات × 2H2O | 1 غرام |
| 0.005 M Fe(NH 4) 2 (SO4)2 × 6H2O | 10 مل |
الجدول 3: المكونات اللازمة لصنع ATCC المتوسطة 712. إعداد الوسط القاعدية في 900 مل من الماء. إعداد المكملات الغذائية بشكل منفصل وإضافة إلى الوسط القاعدية. مرة واحدة القيام به ضبط الحموضة إلى 7.4 مع 1 N حمض الهيدروكلوريك أو 1 N هيدروكسيد والأوتوكلاف. تصفية تعقيم 50 مل الحل من 2 M الجلوكوز (18 غرام / 50 مل) وإضافته بشكل معقم إلى المتوسطة كاملة قبل الاستخدام.
الشكل 1 مشرق المجال والميكروغرافيا الفلورسنت المقابلة التي تظهر الأميبا-Cryptococcus لحظات تفاعلية. (أ) يمكن رؤية خلية الأميبا على مقربة من خلية C. neoformans UOFS Y-1378. يتم عرض صورة الفلورسنت المقابلة في (B). (ج) تصوير خليتين من خلايا C. neoformans UOFS Y-1378 المحاصرين داخل فراغ الطعام الأميبا. يتم عرض صورة الفلورسنت المقابلة في (D). تم تعديل هذا الرقم من Madu et al.15. A = الأميبا; C = C. neoformans. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 نتائج فحص الاستيعاب الداخلي للخلايا المشفرة التي تشترك في الثقافات مع الأميبا. قراءة وحدات الفلورة النسبية يسمح لتفسير ومقارنة كفاءة الأميباي لاستيعاب C. neoformans UOFS Y-1378 و C. neoformans LMPE 046. تمثل أشرطة الخطأ الأخطاء القياسية المحسوبة استناداً إلى ثلاثة عمليات تكرار بيولوجية. تم تعديل هذا الرقم من Madu et al.15. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 الميكروغرافيا الإلكترونية التي تظهر الأميبا: كريبتوككوس التفاعلات. الميكروغرافيا TEM(A، B) تؤكد الملاحظات في الشكل 1C،D. (A) هو مبين هو C. neoformans UOFS Y-1378 خلية المحاصرين داخل فراغ الغذاء الأميبا، في حين (ب) هو وجهة نظر عن قرب من الشكل 3A . تم تعديل هذا الرقم من Madu et al.15. A = خلية الأميبا; C = C. خلية نيوفورمانز. يشير السهم الأحمر إلى البروز الكبسولي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4 صورة مجهرية إلكترونية للإرسال تظهر: C. neoformans UOFS Y-1378 الخلايا. الخلايا معطوبة وبالتالي لا يمكن أن توفر بيانات ذات مغزى. تشير الأسهم الحمراء إلى النقاط التي يتم فيها تمزيق القسم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ملف إضافي 1. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في الورقة، تم استخدام تقنيات مختلفة بنجاح للكشف عن النتيجة المحتملة التي قد تنشأ عندما تتفاعل الأميبا مع خلايا cryptococcal. أيضا، كنا مهتمين لإظهار آثار الأحماض الدهنية 3-هيدروكسي على نتيجة تفاعلات Cryptococcus-الأميبا.
وكانت التقنية الأولى المستخدمة هي الفحص المجهري البؤري، الذي قدم صورا ثابتة. وكان العيب الرئيسي لهذه التقنية هنا أنه قدم لنا فقط المعلومات التي تقتصر على نقطة زمنية معينة. وأي استنتاج يمكن استخلاصه استنادا إلى النتائج يفسح المجال للمنطق الاستقرائي، حيث يمكن للمرء أن يتوصل إلى استنتاج يستند إلى مجموعة من الملاحظات32. ومع ذلك، فقط لأن المرء يلاحظ العديد من الحالات التي يوجد فيها نمط لا يعني أن هذا النمط صحيح لجميع الحالات. وهكذا، فقد تبين الدراسة، وربما حذر، كيف يمكن أن تؤدي هذه المعلومات المحدودة إلى استنتاجات لا أساس لها من الصحة. وإلى هذه النقطة، وفي غياب أدلة متناقضة أو داعمة وتكميلية، يمكن استنتاج أن الاستيعاب الداخلي ربما أدى إلى وجود خلل في الخلايا.
وتيرة التطور في التصوير يجلب فرصا جديدة لجعل الاكتشافات العلمية، كما كان الحال مع الكشف عن vomocytosis29،30. لتوضيح هذه النقطة دون استخدام المجهر الذي يمكن تسجيل أشرطة الفيديو الفاصل الزمني، وهذا الاكتشاف لم يكن ممكنا. ولذلك، فإن عدم إمكانية الوصول إلى هذه الأجهزة الراقية سيكون دائما عقبة في البيئات الفقيرة للموارد التي ليست في طليعة الكشف عن هذه العمليات. وتتمثل إحدى الطرق للتغلب على ذلك في البحث عن تعاون جديد أو اكتشاف طرق مبتكرة لمعالجة مسائل البحوث. وكان أحد التطورات الجديرة بالترحيب هو إدخال وتطبيق البقع المتخصصة مثل وصمة عار phagocytic المستخدمة هنا21،22. هذه وصمة عار حساسة للحموضة والفلورسيس فقط في البيئات الحمضية كما هو الحال في تجويف الأميبا الغذاء vacuole15. ومن الجدير بالذكر أن وصمة عار يعطي فقط المعلومات المتعلقة باستيعاب الخلايا. قد تكون هناك حاجة إلى تحديد ما إذا كانت الخلايا في نهاية المطاف phagocytized في تجارب إضافية.
والأهم من ذلك، أثبتت هذه البقعة أيضا أن تكون مفيدة في قياس الفلورة. وسمح هذا الأخير بإدماج البيانات الكمية في محاولة لشرح ما يحدث بيولوجيا في فترة زمنية محددة واحدة. هنا، تم تمييز مصير الخلايا (أي، تم تحديد ما إذا كان وجود الأحماض الدهنية 3-هيدروكسي يضعف أو يعزز استيعاب الخلايا) عن طريق استقراء معنى من قراءات وحدات الفلورة النسبية.
على عكس هذه الدراسة، قد يختار الباحثون أيضًا قياس الفلورة في الخلايا على مدى فترة زمنية. المعلومات التي تم الحصول عليها مفيدة في تحديد عدد الخلايا التي يتم استيعابها في نقطة زمنية واحدة ومتابعة كيفية تغيير المبلغ خلال الفترة. وبالمثل، يمكن أيضًا التقاط الصور عند نقاط زمنية مقابلة.
وتبين هذه الدراسة قوة الجمع بين عدد من الأساليب للتوصل إلى استنتاج معلل. إن نهج الجمع بين نُهُج متعددة لرصد الفياغوسية إما لمقارنة أو استكمال تقنية أولية ليس جديداً. على سبيل المثال، قارن ميندل وزملاء العمل33 ثلاث تقنيات (تحليل الصورة، الفلورة، وقراءات قياس التدفق) للتحقيق في كيفية تأثير حجم الجسيمات التي تحمل علامة الفلورة على الفيغوسيتيس الضامة. أثبتت الدراسة أن من بين التقنيات الثلاث، قد تكون قراءة لوحة أفضل خيار لرصد الفياغوسية33.
TEM هو أداة قوية بشكل خاص، كما أنه يوفر وجهة نظر الطيور العين في تجويف الفراغ الغذاء. في كثير من الأحيان، كثيرا ما يتم تفويت هذا المستوى من التفاصيل عن طريق الفحص المجهري البؤري في شكل صور ثابتة، بما في ذلك أشرطة الفيديو الفاصل الزمني. إلى هذه النقطة من TEM، كان من المثير للاهتمام لتصور protuberances على أسطح كبسولة cryptococcal. كان يفترض سابقا أن هذه الهياكل السطحية الخلية تستخدم كقناة لإطلاق 3-هيدروكسي الأحماض الدهنية في البيئة المحيطة بها ربما لتعزيز بقاء الخلية9،10،15، 31-وتكشف التفاصيل المتعلقة بالصورة المجهرية TEM كذلك أن النتوءات على الخلية الداخلية ليست مشوهة وأنها حافظت على سلامتها. وهكذا (نظرا لسلامة protuberances)، فمن الممكن أنها قد تسليم الأحماض الدهنية 3-هيدروكسي في بيئة فراغ الغذاء وتغيير الظروف الداخلية، مما يؤدي إلى بقاء الخلية كما ذكرت من قبل Madu وآخرون15،31. وهناك قيد رئيسي لاستخدام المجهر الإلكتروني هو أن إعداد العينة هو شاقة جدا. وعلاوة على ذلك، لتجنب تدمير العينات كما رأينا في الشكل4، يجب أن يكون المُجرِّب مدرباً تدريباً جيداً على تشغيل الميكروتتومي والمجهر يدوياً.
وفي الختام، من المتوخى أن يشجع الباحثون احتمال دراسة البلغم ببساطة عن طريق الجمع بين الصور الفلورية الثابتة والبيانات الكمية. ومن المؤكد أن الباحثين يمكنهم الحصول على معلومات كافية من هذا البروتوكول وتحسينه في دراساتهم الخاصة. وقد يشمل ذلك تطوير أجسام مضادة ضد الأيض المستهدف وتطبيق ذلك على دراسات الفلورة المناعية، بما في ذلك وضع العلامات على الذهب المناعي أثناء فحص TEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن صاحبا البلاغ أنهما ليس لديهما مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
وحظي العمل بدعم من منحة مقدمة من المؤسسة الوطنية للبحوث في جنوب أفريقيا (رقم المنحة: UID 87903) وجامعة الدولة الحرة. كما أننا ممتنون للخدمات والمساعدة التي يقدمها بيتر فان ويك وهانلي غروبلر خلال دراساتنا المجهرية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Diazabicyclo-[2.2.2]-octane | Sigma-Aldrich | D27802 | - |
| 1.5-mL plastic tube | Thermo Fisher Scientific | 69715 | - |
| 15-mL Centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 7252018 | - |
| 50-mL Centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 1132017 | - |
| 8-Well chamber slide | Thermo Fisher Scientific | 1109650 | - |
| Acetone | Merck | SAAR1022040LC | - |
| Amoeba strain | ATCCÒ | 30234TM | - |
| ATCC medium 712 | ATCCÒ | 712TM | Amoeba medium |
| Black 96-well microtiter plate | Thermo Fisher Scientific | 152089 | - |
| Centrifuge | Hermle | - | - |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | - |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon TE 2000 | - |
| Epoxy resin: | |||
| [1] NSA | [1] ALS | [1] R1054 | - |
| [2] DER 736 | [2] ALS | [2] R1073 | - |
| [3] ERL Y221 resin | [3] ALS | [3] R1047R | - |
| [4] S1 (2-dimethylaminoethanol) | [4] ALS | [4] R1067 | - |
| Fluorescein isothiocyanate | Sigma-Aldrich | F4274 | - |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | 489441 | - |
| Fluoroskan Ascent FL | Thermo Fisher Scientific | 374-91038C | Microplate reader |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | - |
| Glutaraldehyde | ALS | R1009 | - |
| Hemocytometer | Boeco | - | - |
| Lead citrate | ALS | R1209 | - |
| Liquid Chromatography Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | - | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | R 34,860 | - |
| Orbital shaker | Lasec | - | - |
| Osmium tetroxide | ALS | R1015 | - |
| pHrodo Green Zymosan A BioParticles | Life Technologies | P35365 | This is the pH-sensitive dye |
| Physiological buffer solution | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | - |
| Rotary shaker | Labcon | - | - |
| Sodium phosphate buffer: | |||
| [1] di-sodium hydrogen orthophosphate dihydrate | [1] Merck | [1] 106580 | - |
| [2] sodium di-hydrogen orthophosphate dihydrate | [2] Merck | [2] 106345 | |
| Transmission electron microscope | Philips | Philips EM 100 | - |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 | - |
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | - |
| Uranyl acetate | ALS | R1260A | - |
| Vacuum dessicator | Lasec | - | - |
| Vial | Sigma-Aldrich | 29651-U | - |
| YNB | Lasec | 239210 | - |
| YPD agar | Sigma-Aldrich | Y-1500 | - |
References
- Barton, L. L., Northup, D. E. Microbial Ecology. , Wiley-Blackwell. New Jersey. (2011).
- Hunter, P. Entente cordiale: multiple symbiosis illustrates the intricate interconnectivity of nature. EMBO Reports. 7, 861-864 (2006).
- Comolli, L. R. Intra- and inter-species interactions in microbial communities. Frontiers in Microbiology. , e629 (2014).
- Siddiqui, R., Khan, N. A. Acanthamoeba is an evolutionary ancestor of macrophages: a myth or reality? Experimental Parasitology. 130, 95-97 (2012).
- Khan, N. A. Acanthamoeba: Biology and Pathogenesis. , Caister Academic Press. Nottingham. (2014).
- Steenbergen, J. N., Casadevall, A. The origin and maintenance of virulence for the human pathogenic fungus Cryptococcus neoformans. Microbes and Infection. 5, 667-675 (2003).
- Casadevall, A., Perfect, J. R. Cryptococcus Neoformans. , ASM Press. Washington D.C. (1998).
- Axelsson-Olsson, D., Olofsson, J., Ellstrom, P., Waldenstrom, J., Olsen, B. A simple method for long term storage of Acanthamoeba species. Parasitology Research. 104, 935-937 (2009).
- Sebolai, O. M., et al. 3-Hydroxy fatty acids found in capsules of Cryptococcus neoformans. Canadian Journal of Microbiology. 53, 809-812 (2007).
- Sebolai, O. M., Pohl, C. H., Botes, P. J., van Wyk, P. W. J., Kock, J. L. F. The influence of acetylsalicylic acid on oxylipin migration in Cryptococcusneoformans var. neoformans UOFS Y-1378. Canadian Journal of Microbiology. 54, 91-96 (2008).
- Yap, A. S., Michael, M., Parton, R. G. Seeing and believing: recent advances in imaging cell-cell interactions. F1000 Research. , e6435.1 (2015).
- Follain, G., Mercier, L., Osmani, N., Harlepp, S., Goetz, J. G. Seeing is believing - multiscale spatio-temporal imaging towards in vivo cell biology. Journal of Cell Science. 130, 23-38 (2017).
- Lewis, L. E., Bain, J. M., Okai, B., Gow, N. A. R., Erwig, L. P. Live-cell video microscopy of fungal pathogen phagocytosis. Journal of Visualized Experiments. , e50196 (2013).
- Duane, E. G. A practical guide to implementing a BLS-2+ biosafety program in a research laboratory. Applied Biosafety. 18, 30-36 (2013).
- Madu, U. L., et al. Cryptococcal 3-hydroxy fatty acids protect cells against amoebal phagocytosis. Frontiers in Microbiology. , e1351 (2015).
- Smith, D., Onions, A. H. S. The Preservation and Maintenance of Living Fungi: IMI Technical Handbooks No. 2. , CAB International. Wallington. (1994).
- Schuster, F. L. Cultivation of pathogenic and opportunistic free-living amebas. Clinical Microbiology Reviews. 15, 342-344 (2002).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 21, 1-2 (2001).
- Beisker, W., Bolbeare, F., Gray, J. W. An improved immunocytochemical procedure for high sensitivity dectection of incorporated bromodeoxyuridine. Cytometry. 8, 235-239 (1987).
- Clancy, B., Cauller, L. J. Reduction of background autofluorescence in brain sections following immersion in sodium borohydride. Journal of Neuroscience Methods. 83, 97-102 (1998).
- Simons, E. R. Measurement of phagocytosis and of phagosomal environment in polymorphonuclear phagocytes by flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , Unit 9, 31 (2010).
- Grillo-Hill, B. K., Webb, B. A., Barber, D. L.
- van Wyk, P. W. J., Wingfield, M. J. Ascospores ultrastructure and development in Ophiostoma cucullatum. Mycologia. 83, 698-707 (1991).
- Spur, A. R. A low viscosity epoxy resin embedding medium for electron microscopy. Ultrastructural Research. 26, 31-43 (1969).
- Department of Minerals and Energy. Radioactive Waste Management Policy and Strategy for the Republic of South Africa. , Department of Minerals and Energy. Pretoria. (2005).
- Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron opaque stain in electron microscopy. Cell Biology. 17, 208-212 (1963).
- Monici, M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications. Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).
- Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 5th edition. , Garland Science. New York. (2001).
- Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. Expulsion of live pathogenic yeast by macrophages. Current Biology. 16, 2156-2160 (2006).
- Alvarez, M., Casadevall, A. Phagosome extrusion and host-cell survival after Cryptococcusneoformans phagocytosis by macrophages. Current Biology. 16, 2161-2165 (2006).
- Madu, U. L., Ogundeji, A. O., Pohl, C. H., Albertyn, J., Sebolai, O. M. Elucidation of the role of 3-hydroxy fatty acids in Cryptococcus-amoeba interactions. Frontiers in Microbiology. , e765 (2017).
- Hayes, B. K., Heit, E. Inductive reasoning 2.0. , Wiley Interdisciplinary Review: Cognitive Science. e1459 (2018).
- Meindl, C., Öhlinger, K., Ober, J., Roblegg, E., Fröhlich, E. Comparison of fluorescence-based methods to determine nanoparticle uptake by phagocytes and non-phagocytic cells in vitro. Toxicology. 378, 25-36 (2017).
