Summary
В этой статье подробно описывается протокол для подготовки совместной культуры криптококковых клеток и амеб, которые изучаются с использованием неподвижных флуоресцентных изображений и изображений электронного микроскопа с высоким разрешением передачи. Здесь показано, как количественные данные могут дополнять такую качественную информацию.
Abstract
Для имитации инфекции криптококка амеба, которая является естественным хищником криптококковых клеток в окружающей среде, может быть использована в качестве модели для макрофагов. Этот хищный организм, похожий на макрофаги, использует фагоцитоз, чтобы убить интернализированные клетки. С помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа, изображения, изображающие интерактивные моменты между криптококковых клеток и амебы, захвачены. Разрешение мощности электронного микроскопа также помогает выявить ультраструктурные детали криптококковых клеток, когда в ловушке внутри амебы пищи vacuole. Поскольку фагоцитоз является непрерывным процессом, количественные данные затем интегрируются в анализ, чтобы объяснить, что происходит в момент захвата изображения. Чтобы быть конкретным, относительные флуоресценции единицы считываются для того, чтобы количественно эффективность амебы в интернализации криптококковых клеток. Для этой цели, криптококковые клетки окрашены красителем, что делает их флуоресценции раз в ловушке внутри кислой среде пищи vacuole. При использовании вместе, информация, собранная с помощью таких методов может предоставить важную информацию, чтобы помочь сделать выводы о поведении и судьбе клеток, когда интернализированы амебы и, возможно, другими фагоцитическими клетками.
Introduction
Микробы развивались с течением времени, чтобы занять и процветать в различных экологических нишах, таких как открытые физические границы почвы и воды, среди других1. В этих нишах микробы часто участвуют в прямой конкуренции за ограниченные ресурсы; важно, для питательных веществ, которые они используют для поддержки их роста или пространства, которые они должны учитывать расширение населения2,3. В некоторых случаях, некоторые голозоики организмов, как амеба может даже предшествовать на криптококковых клеток, как способ извлечения питательных веществ из их биомассы4,5. Это, в свою очередь, позволяет таким организмам устанавливать территориальное господство путем контроля за численностью населения своей добычи. Из-за этого хищного давления, некоторые жертвы могут быть выбраны для производства микробных факторов, таких как криптококковой капсулы6, чтобы примирить негативные последствия давления. Однако, как непреднамеренное последствие этого давления, некоторые микробы приобретают факторы, которые позволяют им пересечь видовой барьер и искать новые ниши для колонизации7, как ограниченные пространства человеческого тела, которые богаты питательными веществами и имеют идеальный Условия. Последний может объяснить, как наземный микроб,как Cryptococcus (C .) neoformans может трансформироваться, чтобы стать патогенным.
С этой целью важно изучить первоначальный контакт, который могут иметь криптококковые клетки с амебой, и как это может выбрать их, чтобы стать патогенными. В частности, это может дать подсказки о том, как криптококковые клетки ведут себя, когда действуют макрофаги во время инфекции. Именно по этой причине, что амеба была выбрана в качестве модели для макрофагов здесь, так как это относительно дешево и легко поддерживать культуру амебы в лаборатории8. Интерес был также изучить, как криптококковые вторичные метаболиты viz. 3-гидрокси жирные кислоты9,10 влияют на взаимодействие между амебами и криптококковых клеток.
Простой способ воспринимания взаимодействия между амебой и ее добычей невооруженным глазом заключается в создании газона, используя свою добычу на поверхности агаровой пластины и пятно амебы. Визуализация бляшек или четких зон на агарной плите изображает области, где амеба, возможно, кормили свою добычу. Однако на этом макроуровне отмечается только результат процесса, а процесс механизации фагоцитоза не может быть соблюден. Таким образом, чтобы оценить процесс на основе клеток к клетке, Есть несколько микроскопических методов, которые могут быть использованы11,12. Например, перевернутый микроскоп с инкубационной камерой может быть использован для видеозаписи замедленного действия событий между фагоцитарной клеткой и ее целью13. К сожалению, из-за стоимости микроскопа с замедленной функциональностью, не всегда возможно для лабораторий приобрести такой микроскоп, особенно в ресурсах бедных параметров.
Чтобы обойти вышеупомянутое ограничение, это исследование представляет последовательный исследовательский дизайн, который оценивает взаимодействие C. neoformans viz C. neoformans UOFS Y-1378 и C. neoformans LMPE 046 с Acanthamoeba castellani . Во-первых, используется качественный метод, который предшествует количественному методу. Тем не менее изображения захвачены с помощью перевернутого флуоресцентного микроскопа, а также электронный микроскоп передачи, чтобы изобразить амебы-Cryptococcus взаимодействий. За этим последовала количественная флуоресценция с помощью считывателя пластин для оценки эффективности амебы для интернализации криптококковых ячеек. При согласовании выводов этих методов на этапе интерпретации данных, это может в равной степени выявить столько критической информации, как просматривая фагоцитоз замедленного видео.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Cryptococcus neoformans и некоторые штаммы Acanthamoeba castellanii считаются патогенами уровня биобезопасности 2 (BSL-2); Таким образом, исследователи должны принять надлежащие меры предосторожности при работе с этими организмами. Например, лабораторный персонал должен иметь специальную подготовку и средства индивидуальной защиты (СИЗ), такие как лабораторные пальто, перчатки и защита глаз. Кабинет биологической безопасности (уровень-2) следует использовать для процедур, которые могут вызвать инфекцию14.
1. Культивирование и стандартизация грибковых клеток (изменено из Маду и др. 15)
- Стрижка из теста грибковых штаммов (т.е., C. neoformans UOFS Y-1378 и C. neoformans LMPE 046) из фондовых культур (не старше 9 месяцев) на дрожжевых пептон-декстоне (YPD) агар пластин. Информацию о ингредиентах агара YPD можно найти в таблице 1.
ПРИМЕЧАНИЕ: C. neoformans UOFS Y-1378, как было показано, производят 3-гидрокси жирные кислоты, в то время как C. neoformans LMPE 046 не производит 3-гидрокси жирные кислоты. Обратитесь к дополнительному файлу 1 для получения информации о том, как определяется присутствие этих молекул. - Инкубировать агар пластины для 48 ч при 30 градусах Цельсия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пластина может храниться до 2 месяцев при 4 градусах Цельсия, прежде чем она может быть отброшена или использована для создания культуры акций16. - Очистите от петли криптококковых клеток (C. neoformans UOFS Y-1378 или C. neoformans LMPE 046) из 48 h-old пластины и привить в 250 мл конической колбы, содержащей 100 мл химически определенных YNB бром (6,7 г/L) дополнил 4% ( ж/в) глюкоза. Информацию о ингредиентах бульона YNB можно найти в таблице 2.
- Инкубировать колбы при 30 градусах по Цельсию в течение 24 ч при агитации при 160 об/мин на роторном шейкере.
- После 24 ч инкубационный период, рассчитывать грибковых клеток с помощью гемоцитометра и настроить число клеток до 1 х 106 клеток / мл с PBS на рН 7,4.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовленный C. neoformans UOFS Y-1378 inoculum использовался в шагах 3.1 и 3.2, в то время как C. neoformans LMPE 046 inoculum использовался только в шаге 3.2.
2. Культивирование и стандартизация клеток амебы (изменено от Madu et al. 15)
- Оттепель фондовой культуры Acanthamoeba castellanii и довести его до комнатной температуры (RT).
ПРИМЕЧАНИЕ: Amoeba была подготовлена на основе измененных протоколов Аксельссон-Ольссон и др.8 и Шустер17. - Пипетка 1 мл оттаятой культуры и прививать его в 50 мл центрифуги трубки, содержащие 15 мл ATCC среднего 712. Информация о ингредиентах ATCC среднего 712 можно найти в таблице 3.
- Вручную встряхните его осторожно и сразу же центрифуга в течение 5 мин при 400 х г и 30 градусов по Цельсию.
- Аспирируй супернатанта.
- Приостанавливайте клетки в 15 мл atCC среднего 712 и инкубировать трубку при 30 градусах По Цельсию в течение 14 дней.
ПРИМЕЧАНИЕ: Периодически проверяйте клетки, используя простой световой микроскоп, чтобы определить, находятся ли они в состоянии трофозоита. Как только они находятся в состоянии трофозоита, начать новую культуру. - Пипетка 1 мл от культуры, которая показывает клетки в состоянии трофозоита и использовать его для привить стерильные 50 мл центрифуги трубки, содержащей 15 мл свежих, стерильных ATCC среды 712.
- Инкубировать трубку при 30 градусах По Цельсию в течение 1 недели, а агитации при 160 об/мин на роторном шейкере.
- Через неделю, рассчитывать клетки амебы с помощью гемоцитометра и настроить число клеток до 1 х 107 клеток / мл со свежим, стерильным ATCC среды 712.
- Выполните viability асссее с помощью trypan синий пятно, как подробно Стробер18. Продолжить дальше с культурами, которые показывают, по крайней мере 80% жизнеспособности.
3. Флуоресценция окрашивания клеток для изучения фагоцитоза (изменено от Маду и др. 15 )
- Сбор качественных данных с помощью флуоресцентного микроскопа
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните этот асссс с Acanthamoeba castellanii и C. neoformans UOFS Y-1378.- Распределите 200-Л суспензии стандартизированных амеб (1 х 107 клеток/мл в ATCC среднего 712) в камерные колодцы адепта слайда и инкубировать в течение 2 ч при 30 градусов по Цельсию для клеток, чтобы прилипнуть к поверхности.
- В то время как клетки амебы оседают, чтобы придерживаться, пятно стандартизированных C. neoformans UOFS Y-1378 клеток, которые были скорректированы до 1 х 106 клеток / мл (в 999 Л PBS) с 1 Л изотоцина флюоресцеина в 1,5 мл пластиковой трубки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка пятно путем растворения 1 мг флуоресцеина изотиоцианав в 1 мл ацетона. - Аккуратно агитировать C. neoformans UOFS Y-1378 на орбитальном шейкере, установленном при 50 об/мин в течение 2 ч на RT и в темноте.
- После 2 ч, центрифуга на 960 х г в течение 5 мин при 30 градусов по Цельсию, чтобы гранулы клетки.
- Аспирировать супернатант, чтобы удалить PBS с пятном.
- Добавьте 1 мл PBS в трубку для мытья клеточной гранулы. Вымойте клетки, аккуратно пипетки.
- Центрифуги клетки на 960 х г в течение 5 мин при 30 градусах Цельсия. Отбросьте супернатант. Повторите шаг стирки еще раз.
- Отрежь промытые клетки в 1 мл PBS.
- Утилизировать 200 л суспензии окрашенных C. neoformans UOFS Y-1378 в камеры скважин, содержащих неокрашенные клетки амебы.
- Инкубировать подготовленную кокультуру при 30 градусах по Цельсию в течение дополнительного периода 2 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Со-культура может быть инкубирована для различных точек времени в соответствии с целью эксперимента. - В конце периода совместного инкубации, аспирировать содержимое скважин.
- Добавьте 300 л PBS в скважины, чтобы помыть камеры скважин и удалить любые несвязанные кокультурные клетки. Делайте это путем нежного пипетки. Подавите содержимое колодцев. Повторите шаг стирки еще раз.
- Приготовьте 3% раствор глютаральдегида, добавив 3 мл глютаральдегида в 97 мл дистиллированной воды.
- Исправьте кокультурные клетки, добавив 250 л 3% раствора в камерные колодцы и инкубируя 1 ч.
- Прикрепите фиксатор и промойте камеры скважины, как подробно из шага 3.1.13.
- Разоблаьте камеры скважины с помощью инструмента, который был предоставлен камерные горки.
- Добавьте каплю соединения антифадей, 1,4-диазабикло-2,2,2-октанового числа на слайд, чтобы предотвратить автоматическое отбеливание. Накройте крышкой и запечатайте стороны лаком для ногтей, чтобы предотвратить испарение.
- Просмотр co-культурных клеток с помощью 100x объектив (с маслом) конфокального лазерного сканирования микроскопа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно делать снимки в ярком поле и флуоресценции, чтобы просмотреть взаимодействие между амебой и криптококковой клетки. Там, где это возможно, флуоресценция может быть супер-навязана на яркие поля изображения. Клетки амебы, как правило, больше по размеру (т.е. 45-60 мкм), а трофозоитовые клетки имеют неправильную форму. Криптококкальные клетки имеют диаметр 5-10 мкм и имеют глобозу в форме яйцеклетки. При воздействии лазера, вполне возможно, что неокрашенные клетки амебы могут излучать автофлуоресценции. Обратитесь к Бейскер и Dolbeare19 и Клэнси и Cauller20 для методов снижения автофлюоресценции.
- Получение количественных данных с помощью считывателя флуоресценции
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните этот асссс с Acanthamoeba castellanii и C. neoformans UOFS Y-1378 или C. neoformans LMPE 046.- Распределите 100 л суспензии стандартизированных амеб (скорректированы до 1 х 107 клеток/мл в ATCC среде 712) в черный, приверженец 96 хорошо микротитер пластины.
- Инкубировать пластину в течение 2 ч при 30 градусах Цельсия, чтобы клетки амебы должны были прилипнуть к поверхности.
- В то время как клетки амебы оседают, чтобы придерживаться, пятно стандартизированных C. neoformans UOFS Y-1378 клетки, которые были скорректированы до 1 х 106 клеток / мл (в 999 л PBS) с 1 Л pHrodo Зеленый Зозосан Биочастицы в 1,5 мl микроцентрифуге трубки. Пятно C. neoformans LMPE 046 клеток, а также в отдельной трубке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Краситель, в отличие от FITC, избирательно пятна клеток, которые оказались в ловушке внутри кислой среде фагоцитовой клетки21,22. Для этого метода важно поддерживать криптококковые клетки в среде с нейтральным рН (PBS) и амебой в среде с нейтральным рН (ATCC medium 712). Среда с кислой средой приведет к ложноположительному считыванию относительной флуоресценции, что означает, что большее количество криптококковых были интернализированы. - Аккуратно агитировать криптококковые клетки на орбитальном шейкере, установленном при 50 об/мин в течение 2 ч на RT и в темноте.
- После 2 ч центрифуга микроцентрифуги трубки на 960 х г в течение 5 мин при 30 градусов по Цельсию, чтобы гранулы клеток. Аспирировать супернатант, чтобы удалить PBS с пятном.
- Добавьте 1 мл PBS в трубку, чтобы вымыть пеллетные клетки. Вымойте клетки нежным пипеткой.
- Центрифуги клетки на 960 х г в течение 5 мин при 30 градусах Цельсия. Отбросьте супернатант. Повторите шаг стирки еще раз.
- Отдохните гранулы промытых клеток в 1 мл PBS.
- Распределите 100 л суспензии окрашенных криптококковых клеток до колодцев, содержащих неокрашенные клетки амебы.
- Инкубировать подготовленную кокультуру при 30 градусах по Цельсию в течение дополнительного периода 2 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Со-культура может быть инкубирована для различных временных точек в соответствии с целью эксперимента. - В конце периода совместной инкубации измерьте флуоресценцию на микроплите. Преобразуйте логарифмические сигналы в относительные флуоресценции.
ПРИМЕЧАНИЕ: возбуждение красителя находится на уровне 492 нм, а выбросы - 538 нм. Проконсультируйтесь с Beisker и Dolbeare19 и Клэнси и Каллер20 для методов снижения автофлюоресценции.
4. Использование электронной микроскопии передачи для изучения фагоцитоза (изменено из ван Вик и Уингфилд 23 )
- Добавьте 5 мл подвески амеб (скорректированы до 1 х 107 ячеек/мл в ATCC среднего 712) в 15 мл центрифуги трубки и позволяют им поселиться в течение 30 мин при 30 градусов по Цельсию.
- Добавьте 5 мл подвески C. neoformans UOFS Y-1378 (скорректированы до 1 х 106 ячеек/мл в PBS) в ту же центрифугу трубки, которая содержит 5 мл стандартизированных клеток амебы.
- Разрешить трубки стоять в течение 2 ч при 30 градусах Цельсия.
- Центрифуги трубки на 640 х г в течение 3 мин при 30 градусов по Цельсию, чтобы гранулы co-культурных клеток. Аспирируй супернатанта. Не мыть совместно культивированные клетки.
- Исправить co-культурных клеток путем повторного приостановки гранулы в 3 мл 1,0 М (рН 7,0) фосфата натрия буфера 3% глутаральдегида на 3 ч.
- Центрифуги трубки на 1120 х г в течение 5 мин при 30 градусов по Цельсию, чтобы гранулы co-культурных клеток. Аспирируй супернатанта.
- Добавьте 5 мл фосфатного буфера натрия в центрифужную трубку для мытья пеллетированных клеток. Промойте, аккуратно пайпетики содержимое трубки в течение 20 с.
- Центрифуги трубки на 1120 х г в течение 5 мин при 30 градусов по Цельсию, чтобы гранулы co-культурных клеток.
- Повторите шаги 4.8-4.10. Аспирируй супернатанта.
- Исправить co-культурных клеток снова, приостанавливая гранулы в 3 мл 1,0 М (рН 7,0) фосфат натрия буферизированных 1% тетроксида осмия для 1,5 ч.
- Удалите фиксатор (тетроксид осмия) путем мытья совместно культивированных клеток таким же образом, чтобы удалить 3% глютаральдегида.
- Обезвоживать материал TEM (также известный как co-культурные клетки) в градуированных ацетоновых 30%, 50%, 70%, 95% и два изменения 100% на 15 минут каждый, соответственно. Для этого добавьте 3 мл раствора ацетона в пеллетные клетки и дайте ему постоять 15 мин. Затем, центрифуга на 200 х г в течение 10 минут на RT Отбросить супернатант и добавить более высокий процент раствора ацетона.
- Подготовка эпоксидной нормальной консистенции в соответствии с протоколом Spur24.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эпоксидная смола используется для секционирования. - Встраивайте материал TEM в свежеприготовленную эпоксидную смолу. Для этого выполните приведенные ниже шаги.
- Добавьте 3 мл свежеприготовленной эпоксидной смолы в трубку, которая содержит материал TEM, перевешенный в 3 мл 100% раствора ацетона. Разрешить трубку стоять в течение 1 ч.
- Центрифуга трубки при 200 х г в течение 10 мин при 30 градусах Цельсия. Аспирируй тескусион.
- Добавьте 6 мл свежеприготовленной эпоксидной смолы в гранулы в трубке. Разрешить трубку стоять в течение 1 ч.
- Центрифуга при 200 х г в течение 10 мин при 30 градусах По цельсию. Аспирируй весь эпоксидно-ацетонный раствор.
- Добавьте в трубку 3 мл свежеприготовленной эпоксидной смолы. Разрешить трубку стоять в течение 8 ч.
- Центрифуга при 200 х г в течение 10 мин при 30 градусах По цельсию. Аспирите все эпоксидные растворы
- Добавьте в трубку 3 мл свежеприготовленной эпоксидной смолы. Храните материал TEM в эпоксидном растворе на ночь в вакуумном растворе.
ВНИМАНИЕ: Эпокси смола является радиоактивным материалом. Используйте СИЗ для обработки эпоксидной смолы. Эпоксидная смола также должна быть обработана в дымовой капот. Исследователи должны следовать правилам безопасности для отбрасывания такого материала, как указано в каждой стране25.
- Полимеризуйте материал TEM для 8 ч при 70 градусах Цельсия.
- На ультрамикротоме обрезаем небольшие участки толщиной около 0,1 мм х 0,1 мм и 60 нм толщиной от эпоксидно-встроенного материала с установленным стеклянным ножом. Соберите разделы на сетке и поместите сетки в поле держателя образца TEM перед окрашиванием.
- Пятно разделов с каплей 6% уранила ацетат ацетат в течение 10 минут в темноте. Убедитесь, что разделы полностью покрыты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Восстановить пятно (6 г) в 100 мл дистиллированной воды.
ВНИМАНИЕ: Уранил ацетат является радиоактивным материалом. Используйте СИЗ для обработки ацетата уранила. Уранил ацетат также должны быть обработаны в дым капота. Исследователи должны следовать правилам безопасности для отбрасывания такого материала, как указано в каждой стране25. - Промыть разделы, окунув их пять раз в стакан, который содержит 100 мл дистиллированной воды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Дистиллированная вода должна быть утилизирована соответствующим образом, поскольку она содержит следы ацетата уранила. - Пятно раздела с каплей свинца цитрат в течение 10 минут в темноте. Убедитесь, что разделы полностью покрыты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Свинцовые цитраты должны быть подготовлены в соответствии с протоколом Рейнольд26. - Промыть разделы, окунув их пять раз в стакан, который содержит 100 мл дистиллированной воды.
- Индивидуально собрать сетки с окрашенными секциями на tEM образца держателя коробки.
- Просмотр секций с электронным микроскопом передачи.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Микробы являются микроскопическими организмами, которые не могут быть восприняты невооруженным глазом. Однако их воздействие может привести к наблюдаемым клинически очевидным заболеваниям, таким как кожные инфекции. При изучении некоторых аспектов микробов, начиная от их морфологии, побочных продуктов и взаимодействий, будучи в состоянии обеспечить живописные и видео доказательства имеет первостепенное значение.
Сначала мы попытались визуализировать взаимодействие между криптококковой клеткой и амебой. Для этого сначала были изучены яркие полевые изображения, которые показали 2 ч совместно инкубированных клеток. На одном из изображений была обнаружена криптококковая ячейка, намиевшая в непосредственной близости от амебы. Одна из ячеек амебы была замечена с расширенной псевдоподией для захвата криптококковой ячейки(рисунок 1A). Далее, соответствующее изображение в флуоресценции был захвачен для ссылки(рисунок 1B). Зеленая флуоресценция на поверхности окрашенных клеток помогает подтвердить наличие криптококковых клеток. Незапятнанная амеба также автоматически-флуорес. Это, в дополнение к явной разнице размеров и морфологии, помогли в дальнейшем разграничении двух типов клеток.
Автофлюоресценция является качество часто наблюдается, когда биологические структуры естественно излучают свет, который они поглощают (например, после воздействия лазера во время конфокальной лазерной сканирующей микроскопии)27. На рисунке 1Сбыли отмечены криптококковые ячейки (в то же время 2 ч), которые уже были интернализированы амебой. Соответствующее изображение в флуоресценции было также захвачено для ссылки(рисунок 1D). Основываясь на имеющиеся улики, заманчиво сделать вывод о том, что амеба убила две захваченные клетки. Тем не менее, фагоцитоз является динамичным процессом, в котором хозяин, хищник и патоген, и добыча использовать различные стратегии, чтобы уничтожить или уклониться друг от друга28. Акт криптококковых клеток, уклоняющихся от фагоцитических клеток, элегантно демонстрируется вомоцитозом29,30, который является нелитической процессом изгнания захваченных клеток из макрофагов. Этот смелый шаг был захвачен в замедленном видео29,30. К сожалению, это подчеркивает ограничение изучения неподвижных изображений неподвижных клеток, как в нашем исследовании, чтобы прояснить динамический процесс, как фагоцитоз. В точку, исследователь может пропустить интервал, когда ячейка ускользает от своего захвата.
Для компенсации вышесказанного было рассмотрено считывание единиц относительной флуоресценции. В текущем исследовании, показания были приняты после 2 ч совместного инкубационного периода и помогли сравнить ответ двух тестовых криптококковых штаммов, то есть, который производит 3-гидрокси жирные кислоты (C. neoformans UOFS Y-1378), а другой, который не является (C. neoformans LMPE 046) . Было предсчитано что 3-гидрокси жирные кислоты могут подействовать как детерминант вирулентности который ухудшает поглощение cryptococcal клеток, включая phagocytosis amoeba. Для получения дополнительной информации о влиянии 3-гидрокси жирных кислот на амебу, рекомендуется обратиться к Маду и др.15,31. На рисунке 2 показано количество криптококковых ячеек, которые были интернализированы на основе чтения флуоресценции единиц. При сравнении двух криптококковых изолятов было ясно, что клетки, которые производят 3-гидрокси жирные кислоты были интернализированы реже по сравнению с клетками, которые не производят 3-гидрокси жирных кислот.
Для повышения качества данных в анализ была включена электронная микроскопия передачи(рисунок 3А). Здесь было отмечено, что штамм, который производит 3-гидрокси жирные кислоты(C. neoformans UOFS Y-1378) были колючие выступы на капсуле (Рисунок3B), которые могут быть использованы клеткой для выпуска 3-гидрокси жирных кислот для внешней среды.
Важно отметить, что данные (на рисунке 1, Рисунок 3) передают судьбу криптококковых ячеек как интернализированных, а не убитых/фагоцитированных. Чтобы определить, выжили ли клетки фагоцитарного события, рекомендуется включить дополнительный асс, в котором исследователь лизает клетки амебы и готовит агар спредовой пластины для перечисления криптококковых единиц колонии (CFU). Подсчитывая CFUs, Madu et al.15 сообщили, что криптококковые клетки, производящие 3-гидрокси жирные кислоты, также устойчивы к фагоцитарному действию амебы после интернализации. Таким образом, эти клетки дали значительно более высокую выживаемость по сравнению с клетками, которые не производят 3-гидрокси жирных кислот.
На рисунке 4 показано важность подготовки и обследования образца TEM. В данном случае секции C. neoformans UOFS Y-1378 были целенаправленно переэкспонированы для электронной бомбардировки. В конце концов, захваченное изображение не может быть использовано, так как оно ставит под угрозу качество информации, которая может быть выведена. В совокупности полученная информация показывает, что, объединив эти различные методы, исследователь способен вывести достаточную информацию, чтобы определить судьбу криптококковых клеток при совместной культуре с амебой.
| Ингредиент | Количество |
| бактериологический пептон | 20 г/л |
| дрожжевой экстракт | 10 г/л |
| Глюкозы | 20 г/л |
| Агар | 15 г/л |
Таблица 1: Ингредиенты для изготовления агара YPD. Добавьте необходимое количество всех ингредиентов в 1 л воды. Тепло при помешивании, чтобы полностью растворить ингредиенты. После того, как сделали автоклав до использования.
| Ингредиент | Количество |
| сульфат аммония | 5 г/л |
| Биотин | 2 мкг/л |
| пантотенат кальция | 400 мкг/л |
| фолиевая кислота | 2 мкг/л |
| Инозитол | 2000 мкг/л |
| Ниацин | 400 мкг/л |
| р-аминобензойная кислота | 200 мкг/л |
| пиридоксина гидрохлорид | 400 мкг/л |
| Рибофлавин | 200 мкг/л |
| тиамин гидрохлорид | 400 мкг/л |
| борюдовой кислоты | 500 мкг/л |
| сульфат меди | 40 мкг/л |
| йодид калия | 100 мкг/л |
| феррический хлорид | 200 мкг/л |
| сульфат марганца | 400 мкг/л |
| молибдат натрия | 200 мкг/л |
| сульфат цинка | 400 мкг/л |
| монопотация фосфат | 1 г/л |
| сульфат магния | 0,5 г/л |
| хлорид натрия | 0,1 г/л |
| хлорид кальция | 0,1 г/л |
Таблица 2: Ингредиенты для приготовления бульона YNB. Добавьте необходимое количество всех ингредиентов в 1 л воды. Тепло при помешивании, чтобы полностью растворить ингредиенты. После того, как сделали автоклав до использования.
| Часть I: Базальная среда. | |
| Ингредиент | Количество |
| протеоз пептон | 20 г/л |
| дрожжевой экстракт | 1 г/л |
| агар (при необходимости) | 20 г/л |
| Часть II: Добавки. | |
| Ингредиент (фондовые растворы) | Количество |
| 0.05 M CaCl2 | 8 мл |
| 0,4 M MgSO4 x 7H2O | 10 мл |
| 0,25 M Na2HPO4 x 7H2O | 10 мл л |
| 0,25 M KH2PO4 | 10 мл |
| Na Цитрат x 2H2O | 1 г |
| 0.005 M Fe (NH4) 2 (SO4) 2 x 6H2O | 10 мл |
Таблица 3: Ингредиенты для создания ATCC среднего 712. Приготовьте базальную среду в 900 мл воды. Подготовка добавки отдельно и добавить в базальной среде. После этого настроить рН до 7,4 с 1 N HCl или 1 N NaOH и autoclave. Фильтр стерилизовать 50 мл раствор 2 M глюкозы (18 г/50 мл) и добавить его асептически к полной среде перед использованием.
Рисунок 1 : Яркие поля и соответствующие флуоресцентные микрографы, показывающие амебу-Криптококк интерактивные моменты. (A) Ячейка амебы в непосредственной близости от C. neoformans UOFS Y-1378 ячейки можно увидеть. Соответствующее флуоресцентное изображение отображается в (B). (C) Изображение двух C. neoformans UOFS Y-1378 клеток, которые оказались в ловушке внутри амебы пищи vacuole. Соответствующее флуоресцентное изображение отображается в (D). Эта цифра была изменена с Маду и др.15. Ааэба; C и C. neoformans. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2 : Результаты интернализации исследования криптококковых ячеек совместно с амебой. Чтение относительных флуоресценции единиц позволяет для интерпретации и сравнения эффективности амеба для интернализации C. neoformans UOFS Y-1378 и C. neoformans LMPE 046. Бары ошибок представляют собой вычисленную стандартную ошибку, основанную на трех биологических репликациях. Эта цифра была изменена с Маду и др.15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3 : Трансмиссионные электронные микрографы, показывающие амебу- Криптококк взаимодействия. TEM микрографы (A, B) подтверждают наблюдения на рисунке 1C, D. (A) Показано C. neoformans UOFS Y-1378 ячейки, захваченных внутри амебы пищевой вакуол, в то время как (B) является крупным планом зрения Рисунок 3A . Эта цифра была изменена с Маду и др.15. Клетка амебы; Ячейка C. C. neoformans. Красная стрелка указывает на капсульный выступ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4 : Микрограф электронного трансмиссии, показывающий C. neoformans UOFS Y-1378. Клетки повреждены и, таким образом, не могут предоставить значимые данные. Красные стрелки указывают точки, где секция порвана. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительный файл 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В статье были успешно использованы различные методы, чтобы выявить возможный результат, который может возникнуть при взаимодействии амебы с криптококковой клетки. Кроме того, нам было интересно показать влияние 3-гидрокси жирных кислот на исход взаимодействия Cryptococcus-amoeba.
Первым используемым методом была конфокальная микроскопия, которая визуализировать неподвижные изображения. Основным недостатком этого метода здесь было то, что он только дал нам информацию, которая ограничена конкретной точки времени. Любой вывод, который можно сделать на основе результатов поддается индуктивной рассуждения, в котором можно прийти к выводу на основе набора наблюдений32. Однако только потому, что один наблюдает несколько ситуаций, в которых существует шаблон, не означает, что эта модель верна для всех ситуаций. Таким образом, в исследовании показано и, возможно, предупреждает, как такая ограниченная информация может привести к необоснованным выводам. В виду, в отсутствие противоречивых или вспомогательных, дополнительных доказательств, можно сделать вывод, что интернализация, возможно, привела к фагоцитозу клеток.
Темпы развития в визуализации открывают новые возможности для научных открытий, как это было в случае с раскрытием вомоцитоза29,30. Чтобы проиллюстрировать этот момент без использования микроскопа, который может записывать замедленного видео, это открытие было бы невозможно. Поэтому отсутствие доступа к таким высококлассным приборам всегда будет препятствием для неудовлетворительных ресурсов, которые не находятся на переднем крае раскрытия таких процессов. Один из способов преодолеть это заключается в поиске новых возможностей сотрудничества или поиске инновационных способов решения вопросов, в их адресных исследованиях. Одним из отрадных событий было введение и применение специализированных пятен, таких как фагоцитарное пятно, используемое здесь21,22. Это пятно рН чувствительных и флуоресцентные только в кислотных средах, таких как в просвете амебы пищи vacuole15. Стоит отметить, что пятно дает только информацию, связанную с интернализацией клеток. Определение, если клетки в конечном итоге фагоциты в дополнительных экспериментов может потребоваться.
Важно отметить, что такое пятно также оказалось полезным при измерении флуоресценции. Последнее позволило интегрировать количественные данные в попытке объяснить, что происходит биологически в один конкретный момент времени. Здесь различима судьба клеток (т.е. решалось, не нарушает ли присутствие 3-гидрокси жирных кислот или способствует интернализации клеток) экстраполируя значение из показаний относительно флуоресценции.
В отличие от этого исследования, исследователи могут также выбрать для измерения флуоресценции клеток в течение периода времени. Полученная информация полезна для определения количества клеток, интернализированных в одно время, и отслеживания того, как сумма изменяется за этот период. Аналогичным образом, изображения также могут быть сделаны в соответствующих временных точках.
Это исследование показывает силу объединения ряда методов для достижения аргументированного вывода. Подход к объединению нескольких подходов к мониторингу фагоцитоза для сравнения или дополнения первоначального метода не является новым. Например, Meindl и его коллеги33 сравнили три метода (анализ изображений, флуоресценция и показания цитометрии потока), чтобы исследовать, как размер частиц, обозначенных флуоресценцией, влияет на фароцитоз макрофага. Исследование доказало, что из трех методов, пластины чтения может быть лучшим вариантом для мониторинга фагоцитоза33.
TEM является особенно мощным инструментом, так как он обеспечивает вид с высоты птичьего полета в просвет пищи vacuole. Часто этот уровень детализации часто упускается из конфокальной микроскопии в виде неподвижных изображений, включая видео замедленного времени. К этому моменту TEM было интересно визуализировать выступы на поверхностях криптококковой капсулы. Ранее предполагалось, что эти структуры поверхности клеток используются в качестве канала для выпуска 3-гидрокси жирных кислот в окружающую среду, возможно, способствовать выживанию клеток9,10,15, 31.Подробная информация о микрографе TEM далее показывает, что выступы на интернализированной ячейке не искажаются и сохраняют свою целостность. Таким образом (учитывая целостность выступов), вполне возможно, что они могут доставить 3-гидрокси жирных кислот в пищевой вакуол окружающей среды и изменить внутренние условия, что приводит к выживанию клеток, как сообщаетmad et al.15,31. Основным ограничением использования электронного микроскопа является то, что подготовка образца очень трудоемкая. Кроме того, чтобы предотвратить уничтожение образцов, как видно на рисунке 4, экспериментатор должен быть хорошо обучен вручную управлять ультрамикробом и микроскопом.
В заключение предполагается, что исследователи будут воодушевлены перспективой изучения фагоцитоза, просто объединив еще люминесцентные изображения с количественными данными. Считается, что исследователи могут получить достаточно информации из этого протокола и оптимизировать его в своих собственных исследованиях. Это может включать в себя разработку антител против целевых метаболитов и применение этого для иммунофлуоресценции исследований, в том числе иммуно-золото маркировки во время исследования TEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Работа была поддержана грантом Национального исследовательского фонда южной Африки (номер гранта: UID 87903) и Университета Свободного государства. Мы также благодарны за услуги и помощь, предлагаемые Питером ван Виком и Ханли Гроблер во время наших исследований микроскопии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Diazabicyclo-[2.2.2]-octane | Sigma-Aldrich | D27802 | - |
| 1.5-mL plastic tube | Thermo Fisher Scientific | 69715 | - |
| 15-mL Centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 7252018 | - |
| 50-mL Centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 1132017 | - |
| 8-Well chamber slide | Thermo Fisher Scientific | 1109650 | - |
| Acetone | Merck | SAAR1022040LC | - |
| Amoeba strain | ATCCÒ | 30234TM | - |
| ATCC medium 712 | ATCCÒ | 712TM | Amoeba medium |
| Black 96-well microtiter plate | Thermo Fisher Scientific | 152089 | - |
| Centrifuge | Hermle | - | - |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | - |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon TE 2000 | - |
| Epoxy resin: | |||
| [1] NSA | [1] ALS | [1] R1054 | - |
| [2] DER 736 | [2] ALS | [2] R1073 | - |
| [3] ERL Y221 resin | [3] ALS | [3] R1047R | - |
| [4] S1 (2-dimethylaminoethanol) | [4] ALS | [4] R1067 | - |
| Fluorescein isothiocyanate | Sigma-Aldrich | F4274 | - |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | 489441 | - |
| Fluoroskan Ascent FL | Thermo Fisher Scientific | 374-91038C | Microplate reader |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | - |
| Glutaraldehyde | ALS | R1009 | - |
| Hemocytometer | Boeco | - | - |
| Lead citrate | ALS | R1209 | - |
| Liquid Chromatography Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | - | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | R 34,860 | - |
| Orbital shaker | Lasec | - | - |
| Osmium tetroxide | ALS | R1015 | - |
| pHrodo Green Zymosan A BioParticles | Life Technologies | P35365 | This is the pH-sensitive dye |
| Physiological buffer solution | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | - |
| Rotary shaker | Labcon | - | - |
| Sodium phosphate buffer: | |||
| [1] di-sodium hydrogen orthophosphate dihydrate | [1] Merck | [1] 106580 | - |
| [2] sodium di-hydrogen orthophosphate dihydrate | [2] Merck | [2] 106345 | |
| Transmission electron microscope | Philips | Philips EM 100 | - |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 | - |
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | - |
| Uranyl acetate | ALS | R1260A | - |
| Vacuum dessicator | Lasec | - | - |
| Vial | Sigma-Aldrich | 29651-U | - |
| YNB | Lasec | 239210 | - |
| YPD agar | Sigma-Aldrich | Y-1500 | - |
References
- Barton, L. L., Northup, D. E. Microbial Ecology. , Wiley-Blackwell. New Jersey. (2011).
- Hunter, P. Entente cordiale: multiple symbiosis illustrates the intricate interconnectivity of nature. EMBO Reports. 7, 861-864 (2006).
- Comolli, L. R. Intra- and inter-species interactions in microbial communities. Frontiers in Microbiology. , e629 (2014).
- Siddiqui, R., Khan, N. A. Acanthamoeba is an evolutionary ancestor of macrophages: a myth or reality? Experimental Parasitology. 130, 95-97 (2012).
- Khan, N. A. Acanthamoeba: Biology and Pathogenesis. , Caister Academic Press. Nottingham. (2014).
- Steenbergen, J. N., Casadevall, A. The origin and maintenance of virulence for the human pathogenic fungus Cryptococcus neoformans. Microbes and Infection. 5, 667-675 (2003).
- Casadevall, A., Perfect, J. R. Cryptococcus Neoformans. , ASM Press. Washington D.C. (1998).
- Axelsson-Olsson, D., Olofsson, J., Ellstrom, P., Waldenstrom, J., Olsen, B. A simple method for long term storage of Acanthamoeba species. Parasitology Research. 104, 935-937 (2009).
- Sebolai, O. M., et al. 3-Hydroxy fatty acids found in capsules of Cryptococcus neoformans. Canadian Journal of Microbiology. 53, 809-812 (2007).
- Sebolai, O. M., Pohl, C. H., Botes, P. J., van Wyk, P. W. J., Kock, J. L. F. The influence of acetylsalicylic acid on oxylipin migration in Cryptococcusneoformans var. neoformans UOFS Y-1378. Canadian Journal of Microbiology. 54, 91-96 (2008).
- Yap, A. S., Michael, M., Parton, R. G. Seeing and believing: recent advances in imaging cell-cell interactions. F1000 Research. , e6435.1 (2015).
- Follain, G., Mercier, L., Osmani, N., Harlepp, S., Goetz, J. G. Seeing is believing - multiscale spatio-temporal imaging towards in vivo cell biology. Journal of Cell Science. 130, 23-38 (2017).
- Lewis, L. E., Bain, J. M., Okai, B., Gow, N. A. R., Erwig, L. P. Live-cell video microscopy of fungal pathogen phagocytosis. Journal of Visualized Experiments. , e50196 (2013).
- Duane, E. G. A practical guide to implementing a BLS-2+ biosafety program in a research laboratory. Applied Biosafety. 18, 30-36 (2013).
- Madu, U. L., et al. Cryptococcal 3-hydroxy fatty acids protect cells against amoebal phagocytosis. Frontiers in Microbiology. , e1351 (2015).
- Smith, D., Onions, A. H. S. The Preservation and Maintenance of Living Fungi: IMI Technical Handbooks No. 2. , CAB International. Wallington. (1994).
- Schuster, F. L. Cultivation of pathogenic and opportunistic free-living amebas. Clinical Microbiology Reviews. 15, 342-344 (2002).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 21, 1-2 (2001).
- Beisker, W., Bolbeare, F., Gray, J. W. An improved immunocytochemical procedure for high sensitivity dectection of incorporated bromodeoxyuridine. Cytometry. 8, 235-239 (1987).
- Clancy, B., Cauller, L. J. Reduction of background autofluorescence in brain sections following immersion in sodium borohydride. Journal of Neuroscience Methods. 83, 97-102 (1998).
- Simons, E. R. Measurement of phagocytosis and of phagosomal environment in polymorphonuclear phagocytes by flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , Unit 9, 31 (2010).
- Grillo-Hill, B. K., Webb, B. A., Barber, D. L.
- van Wyk, P. W. J., Wingfield, M. J. Ascospores ultrastructure and development in Ophiostoma cucullatum. Mycologia. 83, 698-707 (1991).
- Spur, A. R. A low viscosity epoxy resin embedding medium for electron microscopy. Ultrastructural Research. 26, 31-43 (1969).
- Department of Minerals and Energy. Radioactive Waste Management Policy and Strategy for the Republic of South Africa. , Department of Minerals and Energy. Pretoria. (2005).
- Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron opaque stain in electron microscopy. Cell Biology. 17, 208-212 (1963).
- Monici, M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications. Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).
- Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 5th edition. , Garland Science. New York. (2001).
- Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. Expulsion of live pathogenic yeast by macrophages. Current Biology. 16, 2156-2160 (2006).
- Alvarez, M., Casadevall, A. Phagosome extrusion and host-cell survival after Cryptococcusneoformans phagocytosis by macrophages. Current Biology. 16, 2161-2165 (2006).
- Madu, U. L., Ogundeji, A. O., Pohl, C. H., Albertyn, J., Sebolai, O. M. Elucidation of the role of 3-hydroxy fatty acids in Cryptococcus-amoeba interactions. Frontiers in Microbiology. , e765 (2017).
- Hayes, B. K., Heit, E. Inductive reasoning 2.0. , Wiley Interdisciplinary Review: Cognitive Science. e1459 (2018).
- Meindl, C., Öhlinger, K., Ober, J., Roblegg, E., Fröhlich, E. Comparison of fluorescence-based methods to determine nanoparticle uptake by phagocytes and non-phagocytic cells in vitro. Toxicology. 378, 25-36 (2017).
