Summary
여기, 우리는 계량의 rhodopsin 돌연변이 망막 화와 관련 된 전송 하는 콘텐츠 이미징 방법을 설명 합니다. 다중 파장 득점 분석 rhodopsin 단백질 세포 표면에 또는 전체 셀에서 계량에 사용 되었다.
Abstract
Rhodopsin misfolding 돌연변이 상 염색체 지배적인 망막 화 (RP), 효과적인 치료 부족 질병 눈부신 진보로 각 성 하는 로드 포토 리셉터 죽음으로 이어질. 우리가 가설을 misfolded rhodopsin 돌연변이의 세포 독성 약리학 돌연변이 rhodopsin 단백질 안정화에 의해 완화 될 수 있다. P23H 돌연변이 다른 클래스 II rhodopsin 변이 중 인코딩합니다 구조적으로 불안정 rhodopsin 돌연변이 단백질을 바인딩과 그물 (ER)에 누적 된 반면 야생 타입 rhodopsin 포유류에 플라즈마 막에 수송 된다 셀입니다. 우리는 이전 발광 기반 높은 처리량 화면 (HTS)을 수행 하 고 응급실에서 원형질 막의 P23H rhodopsin의 전송 구조 약리 보호자의 그룹을 식별. 돌연변이 rhodopsin 단백질 금액과 전체 세포에서 원형질 막에는 여기, 정량이 콘텐츠 이미징 분석 다음 immunostaining 메서드를 사용 하 여, 우리. 이 메서드는 유익 하 고 가양성 HTS. 다음에서 진정한 안타를 식별 하는 효과적인 또한,이 콘텐츠 이미지 분석 계량 각 화합물의 약리 속성을 평가 하는 하나의 실험에서 여러 매개 변수를 사용할 수 있습니다. 이 분석 결과 사용 하 여, 우리 6 RP 관련 rhodopsin 돌연변이, 이러한 rhodopsin 돌연변이의 구조적 안정성에 대 한 양적 및 질적 이해에 대 한 2 차원 약리 프로필을 얻는 쪽으로 11 다른 화합물의 효과 분석 그리고 이러한 돌연변이 향해 다른 화합물의 효능입니다.
Introduction
단백질 misfolding은 근이 영양 증, 신경 유년으로 망막 화 (RP)1를 포함 하 여 눈부신 질병에 관여. RP 상속 및 진보적인 망막 변성 기능과 항상성 막대 대뇌 또는 망막 안료 epitheliums (RPEs)2,3에 영향을 미치는 60 개 이상의 유전자에 돌연변이와 관련 된입니다. 효과적인 치료는 현재 RP에 대 한 합니다. Rhodopsin 돌연변이 RP의 경우 상 염색체 지배 (광고)의 약 25-30%를 위한 계정. 150 이상 rhodopsin 돌연변이4 (인간의 유전자 돌연변이 데이터베이스, http:/ www.hgmd.cf.ac.uk/), 중 클래스 II 돌연변이 로드 포토 리셉터 죽음에 기여 rhodopsin 단백질의 구조적 불안정의 원인이 고 시력 손실5,6,,78. P23H 이다 북아메리카에 있는 가장 빈번한 rhodopsin 돌연변이 또한 클래스 II rhodopsin 돌연변이9,10의 전형적인 예. 그것의 고유한 구조 불안정으로 인해 misfolded rhodopsin는 야생 타입 rhodopsin 원형질 막5에 위치 하 고 있습니다 반면 포유류 세포에서 바인딩과 그물 (ER)에 축적 됩니다. Misfolded rhodopsin P23H 돌연변이 전시 지배적인 부정적인 세포 독성 haploinsufficiency, 때문만 아니다 하지만 응급실의 활성화로 관련 단백질 강 직 통로 중단된 막대 외부 세그먼트 조직 관련. 로드 포토 리셉터 세포 스트레스 완화, 한 전략 약리 보호자를 사용 하 여 돌연변이 rhodopsin의 네이티브 접는 안정화 하는.
이 위해 우리는 높은 처리량 화면 셀 기반 (HTSs)11,12,13 P23H rhodopsin 돌연변이 플라즈마에 이송 계량 하는 β-galactosidase 조각 보완성 분석 결과 사용 하 여 수행 막입니다. 이 HTS 분석 결과의 강력 하 고 간단한 프로토콜 우리 각 화면에 대 한 정도 79000 작은 분자의 활동을 탐구를 활성화. 그러나,이 HTS 분석 결과 발광 신호 읽기, 때문에 가양성 β-gal 억제제를 포함 하 여 색 또는 세포 독성 화합물 포함 되며 2 차 분석 결과 의해 식별 대기 히트 목록에.
전통적인 immunostaining 및 형광 이미징 방법 포유류 세포5,14,,1516의 rhodopsin 교통 공부를 몇 년 동안 사용 되었습니다. 그러나, 이러한 기존의 방법 신뢰할 수 있는 이미징 분석은 높게 일관 된 조건 하에서 촬영 한 이미지의 많은 수를 요구 하기 때문에 rhodopsin 전송으로 10 개 이상 화합물의 약리 효과 척도를 사용할 수 없습니다. 기존의 이미징 방법으로 하지 amendable. 여기, 우리 misfolded rhodopsin 돌연변이11,,1317의 셀 표면 수송 척도를 2 차 분석 결과 기반으로 하는 immunostaining이 콘텐츠 이미징 프로토콜 개발. 원형질 막에 rhodopsin 레이블을, 우리 생략 세포 막 permeabilization와 immunostained의 단계 rhodopsin 돌연변이 단일 클로 널 (b 6-30) 안티 rhodopsin 셀의 extracellular 측에 rhodopsin의 N 맨끝 epitope를 인식 하 여 막18. 전체 셀에 돌연변이 rhodopsin를 시각화 하려면 우리 rhodopsin 금성 형광 단백질을 융합. 다른 형광 채널에 형광 강렬의 정량화, 총 rhodopsin 강도 포함 하 여 전체 셀, 셀 표면에의 비율에에서 1 개의 단 하나 실험에서 여러 매개 변수를 얻을 수 있습니다. 세포 표면에는 전체 셀에서의 rhodopsin 형광 안정적인 6 misfolded rhodopsin 뮤턴트의 총을 표현 하는 세포에이 방법을 적용, 우리이 뮤턴트 쪽으로 여러 개의 작은 분자 보호자의 약리 프로 파일을 생성할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 모든 셀 immunostained 384-잘 접시에 있으며 매우 일관 된 이미징 조건 하에서 자동된 이미징 시스템을 사용 하 여 몇 군데. 이미지 분석은 600 개 이상의 셀을 셀 모양 및 단백질 표정 수준 변화와 셀의는 인해 변화를 줄이기 위해의 이미지가 포함 된 각 잘 수행 됩니다. 이 프로토콜의 워크플로 그림 1에 요약 됩니다. 이 방법의 장점은 우리 이미지 기반 분석에서 고해상도 이미지 뿐만 아니라 다중 매개 변수 quantifications를 얻을입니다. 일반적으로,이 프로토콜 수정 하 고 계량 관심사의 어떤 misfolded 막 단백질의 수송에 적용 될 수 있습니다.
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Protocol
참고: rhodopsin 전송 시험.
1. 준비 및 세포의 문화
- 부활 cryo 보존 U2OS 안정 세포는 야생 타입 (WT) 또는 돌연변이 마우스 rhodopsin 금성 융해 단백질을 표현. 만 작은 얼음 결정은 유리병에 남아 때까지 37 ° C에서 세포를 녹여.
참고: U2OS 셀 사용 됩니다이 프로토콜에 있기 때문에 포토 리셉터 셀 라인 생체 외에서 연구에 사용할 수 있는 미리 속눈썹 생 합성 rhodopsin의 포유류 세포에 있는 유사한 분자 메커니즘에 의해 규제 됩니다. 또한, U2OS 셀 접시의 바닥에 단단히 부착 있고 큰 세포 기관, 그래서 그들은 rhodopsin 전송 분석 결과 대 한 이상적입니다. 7 U2OS 안정 세포 표현 WT, T4R, P23H, P53R, C110Y, D190N 및 P267L rhodopsin 돌연변이 사용 품질 및 신뢰성 분석 결과의 표시 예를 들어 여기. 분석 결과의 목표에 따라 볼 수 있듯이 다른 rhodopsin 돌연변이 또는 다른 막 단백질을 표현 하는 안정 된 세포를 사용할 수 있습니다. 안정적인 세포 인간의 rhodopsin 표현 가능한 경우이 분석 결과에 사용할 수 있습니다. 때문에 95% 상 동을 공유 하는 마우스 및 인간의 rhodopsin 단백질 화합물이 분석이 결과 의해 확인 된 것 이며 테스트 비보에 rhodopsin P23H 돌연변이8을 들고 마우스 adRP 모델을 사용 하 여 마우스 rhodopsin는 여기 사용 되었다. 안정적인 셀19위에서 설명한 대로 생성 되었다. WT 및 돌연변이 rhodopsin 성적 질문-PCR에 의해 계량 했다 그리고 WT과 돌연변이 rhodopsin 녹취 록의 표현 하는 안정적인 세포의 클론이 분석이 결과 대 한 선정 됐다. Rhodopsin 단백질의 표현은 immunoblot와 immunostaining에 의해 확인 되었다. 이 분석 결과에서 사용 하는 셀의 통로 20 보다 낮은 되어야 합니다. - (높은 포도 당 Dulbecco의 수정이 글의 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 매체 (DMEM)과 5 µ g/mL Plasmocin) 성장 매체의 10 mL를 포함 하는 15 mL 원뿔 튜브로 셀의 각 줄을 전송 합니다.
- 원심 200 x g 5 분 삭제에 튜브는 상쾌한 고 각 셀 라인에 대 한 세포 성장 매체의 5 mL와 함께 셀 펠 릿 resuspend. 60 m m 조직 문화 접시에 셀 서 스 펜 션의 각 줄을 전송 하 고 5% CO2와 37 ° C에서 품 어.
- 하위 조직 문화 접시로 90%의 합류를 도달할 때 셀 참조12에 설명 된.
2. 시드 잘 당 5000 셀에 셀
참고: 조직 문화 후드에서 다음 절차를 수행 합니다.
- 폴 리-리와 플레이트를 취급 합니다.
- 셀을 뿌리기 전에 1 일 치료 블랙 벽 고 20 µ L/잘 30 분 폴 리 리 신 솔루션의 바닥판 384-잘 취소 합니다.
- 액체를 발음 하 고 모든 우물 1 h. 넣어 다시 접시 뚜껑에 대 한 건조 허용 4 ° C에서 하룻밤 셀 시드 접시를 저장.
- 세포 현 탁 액을 준비 합니다.
- 90% 합류까지 100mm 조직 배양 접시에 성장 매체에서 각 셀 라인 문화.
- 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)와 각 접시를 세척 하 고 0.05%의 1 mL로 세포 분리 37 ° c.에 트립 신
- 분석 결과 매체 (10 %FBS, 100 단위/mL 페니실린 및 100 μ g/mL 스 높은 포도 당 DMEM) 10 mL에 셀의 각 라인 resuspend
- 셀을 계산 하 고 분석 결과 매체와 105 셀/mL x 1.25 셀의 각 줄을 희석.
- 씨 셀입니다.
- 전자 멀티 채널 피 펫 또는 자동화 된 시 약 디스펜서를 사용 하 여 셀 선 및 채우기 열 1-21 (그림 2) 384-잘 접시의 당 세 개의 열에 세포 현 탁 액의 40 µ L/잘 분배 하.
- U2OS의 40 µ L/잘 추가 (P23H-Rhodopsin-금성) 열 22-23을 U2OS의 40 µ L/잘 (Rhodopsin-금성) 열 컨트롤로 24.
- 300 x g 30에서 격판덮개 원심 384-잘 접시의 바닥에 모든 셀을 내리게 하기 위해 s.
참고: 셀 시드 후 접시에 물리적 충격을 피하십시오. 그렇지 않으면, 셀의 각, 한 모서리에 짓 눌린 것입니다 하 고 접시가 콘텐츠 이미징에 대 한 적합 하지 않을 것 이다. - 5% CO2 접시의 하단에 연결할 셀 3 h 37 ° C에서 384-잘 접시를 품 어.
3. 치료 화합물과 셀
- 그림 2와 같이 치료 조건 판 지도 생성 합니다.
- 작업 솔루션 96 잘 접시에 최대 15 화합물의 x 5의 300 µ L를 준비 합니다.
- 5 번 96-우물의 우물 A1 g 2에 있는 그들의 마지막 농도의 접시 (그림 2A)을 분석 결과 매체와 cps 1 ~ 15을 희석. 잘 h 2에서 분석 결과 매체의 300 µ L를 추가 합니다.
참고: 각 화합물의 최종 농도 사용 됩니다 가장 효과적인 농도에 P23H rhodopsin의 전송 구조 HTS12,13. - 2% 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)의 당 100 µ L를 추가 25 µ m 9-시스-망막 열 11, 12, 분석 결과 중간에 각각 희석 하는. 추가 9-cis-희미 한 빛에 망막.
- 5 번 96-우물의 우물 A1 g 2에 있는 그들의 마지막 농도의 접시 (그림 2A)을 분석 결과 매체와 cps 1 ~ 15을 희석. 잘 h 2에서 분석 결과 매체의 300 µ L를 추가 합니다.
- 384 잘 플레이트 세포 (그림 2B)와 교양에 대 한 솔루션을 작동 하는 x 5의 당 10 µ L를 추가 합니다.
- 전자 다중 채널 피 펫을 사용 하 여 열 1 ~ 21 (그림 2)에서 화합물 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 및 15 행 A, C, E, G, I, K, M, 및 O를 추가. 화합물을 추가 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 및 열 1 ~ 21에서에서 행 B, D, F, H, J, L, N 및 P M.
- 열 22 및 24 2 %DMSO 당 10 µ L를 추가 합니다. 9-25 µ M의 당 10 µ L 추가시스-망막 열 23.
참고: DMSO는 사용 차량 제어로 모든 화합물 처음 주식으로 DMSO에 용 해 하기 때문에. 22 DMSO 치료 세포를 포함 하는 P23H 표현 rhodopsin 사용 됩니다 0% 제어 하는 열입니다. 9-시스-망막 치료 세포 P23H rhodopsin 표현 100% 컨트롤으로 사용 됩니다.
- 알루미늄 호 일 384-잘 접시를 커버 하 고 24 시간 동안 37 ° C에서 접시를 품 어.
4. 세포 표면에 Rhodopsin 단백질 얼룩 막 Permeabilization 없이 Immunostaining.
참고: 어떤 세제를를 지키고 세포 막 전체 immunostaining 과정에서 피하십시오.
- 16%를 diluting 하 여 4 %paraformaldehyde (PFA) 준비 PFA 화학 증기 두건에서 1:4 볼륨 비율에 PBS 가진. 전송 4 %PFA 시 저수지에서.
- 희미 한 붉은 빛으로 어두운 방에 384-잘 접시를 꺼내. 진공 수집 병에 연결 하는 8 채널 흡 인기를 사용 하 여 매체를 부드럽게 발음. 갓된 4%의 당 20 µ L을 추가 하는 전자 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 전체 384-잘 접시에는 PFA 및 실 온에서 20 분 동안 품 어. 세포 분리를 방지 하려면 항상 포인트는 흡 인기의 끝 각의 같은 쪽에 열망 하는 동안. 각의 중앙 하단 영역을 만지지 마십시오. 이미지를 복용 했을 때 지역에 흡 인기에 의해 감동 하지 않으려면 필드를 선택 합니다. 10 분 이상 외피, 384-잘 접시 증발을 방지 하는 뚜껑으로 커버.
참고: 셀을 100% 제어의 결과 영향을 미칠 것입니다 재생된 isorhodopsin의 photobleaching을 피하기 위해 어두운 방에 고정 됩니다. 고정, 후 정상적인 빛에서 384-잘 접시 밖으로 촬영 수 있습니다. - 각 잘에서 PFA 발음 전자 다중 채널 피 펫을 사용 하 여 PBS의 당 50 μ를 추가 하는 8 채널 흡 인기를 사용 합니다. PBS 가진 3 개의 세척을 수행을 두 번 더 반복 합니다.
주의: 폐기물 액체 포함 PFA 출장된 병에 수집 하 고 실험 후 유해 화학 낭비로 처분 될 것 이다. - 전체 384-잘 접시에 5% 염소 혈 청의 당 20 µ L을 추가 하 여 셀을 차단 하 고 30 분 동안 실 온에서 품 어.
- 5% 염소 혈 청을 발음 하 고 추가 15 µ L 당 20 µ g mL-1 b 6-30 안티 rhodopsin 항 체의 1% 염소 혈 청에서 2 차 항 체 전용 컨트롤 그룹에 대 한 행 P 1% 염소 혈 청의 잘 당 오 추가 15 µ L A 행.
- 90 분 동안 실내 온도에 또는 4 ° C에서 384-잘 접시를 밤새 품 어. 커버 알루미늄 호 일을 피하기 위해 photobleaching는 fluorophores의 384-잘 접시.
- PBS의 당 50 µ L로 3 회 접시를 씻어.
- PBS를 발음 하 고 5 µ g mL-1 Cy3 활용 된 염소 반대로 마우스 IgG 항 체의 당 15 µ L를 추가 합니다. 알루미늄 호 일 384-잘 접시를 커버 하 고 1 시간을 위한 실내 온도에 또는 4 ° C에서 밤새 품 어.
- PBS의 당 50 µ L로 3 회 접시를 씻어. 1 µ g mL-1 15 분 동안 실 온에서 핵 얼룩 Hoechst 33342 포함 된 PBS의 당 50 µ L를 추가 합니다.
- 이미징 하기 전에 투명 한 필름으로 384-잘 접시를 봉인. 커버 알루미늄 호 일로 384-잘 접시와 이미지 즉시 이동 하는 경우 1 주까지 4 ° C에서 저장 합니다.
5입니다. 영상입니다.
참고:이 콘텐츠 이미징 절차는 자료의 테이블에에서 나열 된 이미징 시스템에 적응. 절차는 다른 높은 콘텐츠 이미징 시스템을 사용 하는 경우 달라질 수 있습니다.
- 뚜껑을 제거 하 고 a 1 접시의 왼쪽된 상단 모서리에 배치와 함께 콘텐츠 영상에 384-잘 접시를 넣어.
- 이미지 수집에 대 한 매개 변수를 설정 하는 이미지 수집 소프트웨어를 엽니다.
- 새로운 설정 판 수집 설정 창을 열고 만들거나 기존 설치 파일을 로드 합니다.
- 20 x 목표를 선택 하 고 픽셀 보정된 픽셀 크기는 0.80 x 0.80 그래서 2로 binning 설정 µ m.을 설정 스캔 라인 2000와 이미지 크기 (W x H) 사이트 당 1000 x 1000 픽셀 (800.00 µ m x 800.00).
- 몇 군데 수 접시 유형을 선택 합니다. 384 잘 플레이트의 제조업체에서 제공 하는 정보를 사용 하 여 접시 크기에 맞게.
- 웰 스는 384-잘 접시에 대 한 이미지를 선택 합니다.
- 잘 당 이미지를 4 개의 사이트를 선택 합니다. 잘 감동 포부 팁의 측면을 하지 마십시오.
- 405, 여기 레이저 선택 및 561 488 nm. DAPI, FITC, 텍사스 레드 채널에 대 한 배출 필터를 선택 합니다. 레이저 파워를 최적화 하 고 긍정적인 통제 우물에서 촬영 한 이미지의 밝기를 보장 하기 위해 각 채널의 이득을 채도 임계값 보다는.
- 자동 초점에 대 한 잘-투-잘 초점을 선택 합니다. 첫 번째 잘 잘 샘플을 찾기 위한 초기도 인수를 선택 합니다. 모든 사이트에 사이트 자동 초점을 설정 합니다.
- 각 채널에 대 한 줄당 4 개의 평균을 선택 합니다. 각 채널에 대 한 Z-오프셋 값을 최적화 합니다.
- 되도록 이미지 384 잘 플레이트의 대각선 모서리에 2-3 웰 스는 초점에 모든 테스트 웰 스, 잘 당 모든 사이트에서 이미지는 셀 이상의 40% 합류, 그리고 모든 채널의 형광 강도 약 절반 포화 100% 테스트 웰 스를 제어 합니다.
- 이미지 수집 방법을 저장 합니다.
- 전체 접시를 실행 합니다. 시계는 영상 캡처 이미지는 영상 떠나기 전에 이미지 품질을 확인 하는 접시의 첫 번째 열에서 완료 될 때까지. 384-잘 접시를 꺼내 고 나중에 사용할 4 ° C에서 저장 합니다.
참고: 잘 찍은 채널 당 선택 하는 사이트의 수에 따라 걸립니다 40 분 한 384-잘 접시 이미징 완료 3 h.
6. 이미지 분석입니다.
- 이 콘텐츠 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 이미지 데이터를 당겨. 매개 변수를 설정 하려면 100% 제어 웰 스 (23 열) 중 하나를 선택 합니다.
- 분석 방법으로 다중 파장 셀 점수 를 선택 하 고 시작 설정 구성.
- DAPI 채널에서 이미지를 사용 하 여 핵을 정의 합니다. 선택 된 정의 핵 모양 잘 핵 이미지와 잘 맞는 다는 것을 확인 하는 미리 보기.
- FITC 채널 rhodopsin 금성 몇 군데에서 셀의 모양을 정의 합니다.
- 텍사스 레드 채널에 rhodopsin 셀 표면 얼룩 영역을 정의 합니다.
- 설정을 최적화 된 경우 확인 하려면 5 우물에 현재 알고리즘을 테스트 합니다. 설정을 저장 하 고 구성 창을 닫습니다.
- 최적화 된 분석 방법으로 모든 웰 스를 실행 합니다.
- 그대로 휴대폰 번호로 개체 수 를 내보냅니다. FITC 채널의 평균 강도 Rhodopsin 금성 강도 (Rhodopsin 금성 INT)로 내보냅니다. 세포 표면 (세포 표면에 Rhodopsin INT)에 rhodopsin 강도로 텍사스 Red 채널의 평균 강도 내보냅니다.
- 스프레드시트 소프트웨어에서 내보낸된 데이터를 엽니다. MEM-총 비율으로 세포 표면에 rhodopsin 강도를 rhodopsin 금성 INT에 의해 나눕니다. Z를 계산 '-분석 결과 품질을 평가 하는 각 매개 변수에 대 한 요소. Z′ = 1−3X (STD+을100% 제어표준0% 제어) / | 100% 제어−Mean0% 제어의미 |.
참고: Z'-요소 0 나타냅니다이 콘텐츠 스크린과 Z에 대 한 충분 한 중간 분석 결과 보다 높은 ' 비율이 0.5와 1 사이 높은 처리량 화면20,21에 필요한 뛰어난 분석 결과 나왔다. - 스프레드시트 소프트웨어를 사용 하 여 각 매개 변수에 대해 두 색 열 맵을 생성 하. 셀 라인 x 축과 y 축에 화합물의 이름을 정렬 합니다.
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Representative Results
우리는 매개 변수가 세 rhodopsin 전송 특징: 전체 (Rhodopsin 금성 INT) 원형질 막 (세포 표면에 Rhodopsin INT)에 rhodopsin의 immunostaining 강도 및 셀의 비율의 rhodopsin 금성 강도 전체 셀 (MEM-총 비율)에 있는 rhodopsin 금성 강도를 세포 표면에 rhodopsin 얼룩. Rhodopsin 전송 분석 결과의 대표적인 결과 그림 3 과 그림 4에 표시 됩니다. DMSO와 9-를 사용 하 여cis-망막 치료 세포 각각 0과 100% 컨트롤 P23H rhodopsin 비너스를 표현 Z'-이 세 개의 매개 변수는 0 0.5, 그 분석 결과 적당 한 품질, 제안 사이의 범위에 대 한 요인 이 콘텐츠 이미징21에 대 한 충분 한. 도 최적화 된 Z'-요인 분석 결과 HTS에 비해 그 상대적으로 복잡 한 절차 때문에 0.5 보다 낮은,이 분석 결과 여전히 강력 하 고 안정적인 이미지 기반 분석에 대 한. 구출 misfolded rhodopsin 활성 화합물 세포 표면에 P 값이 0.05 보다 낮은 DMSO 보다 메모리 총 비율 Rhodopsin INT의 높은 값을 표시 해야 합니다. 3 2 차원 열 지도 평균 rhodopsin 금액 및 지역화 셀 (그림 4) 당 비교 하이 세 개의 매개 변수에서 생성 되었습니다. Triplicates에서 반복, WT 및 6 rhodopsin 돌연변이 가로로 나열 됩니다 그리고 복합 치료의 효과 수직으로 비교 됩니다. 이전 연구와는 rhodopsin 세포 표면에의 MEM 총 비율 INT WT rhodopsin DMSO (그림 4C)5,,2223로 치료에 비해 6 돌연변이 대 한 낮은 있습니다. 세포 표면에 그 메모리 총 비율 rhodopsin INT 9-증가cis-망막 치료는 T4R, P23H, D190N 및 P267L, 하지만 하지 P53R 또는 C110Y 돌연변이, 그 제안에 대 한 9-cis-망막을 구출 하는 T4R의 전송 P23H, D190N 및 P267L rhodopsin 돌연변이 모든 cps T4R, P23H 및 D190N에 대 한 세포 표면에 Rhodopsin INT에 다양 한 수준의 증가 보였다. 3, 4, 5, 7, 8 및 11 cps rhodopsin 금성 INT만 하지 이러한 화합물만 rhodopsin 금액 증가 제안 이러한 rhodopsin 돌연변이의 MEM 총 비율 증가. Cps 1, 2 6과 9는 크게 이러한 화합물 원형질 막에 이러한 rhodopsin 돌연변이의 전송 구조를 제안 하는 T4R, P23H, D190N 및 P267L rhodopsin 돌연변이의 MEM 총 비율 증가. 2 차원 프로필 rhodopsin 전송 다른 약물 치료에 의해 완화이 adRP 관련 된 돌연변이 의해 영향을의 포괄적인 개요를 제공 합니다.
그림 1: rhodopsin 전송 분석 결과의 워크플로. 세포 표면 막 rhodopsin 전송 분석 결과 대 한 permeabilization 없이 rhodopsin의 얼룩에 대 한 절차. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 작업 솔루션 및 384-잘 접시에 96 잘 접시에서 액체 전송 x 5의 준비에 대 한 그림. (작업 솔루션 x 5의 A)는 96 잘 접시 레이아웃. 웰 스 a 1 g 2 열 1과 2에서에서 볼 수 있듯이 작업 솔루션 및 분석 결과 중간 (M) x 15 5 최대의 당 300 µ L를 있다. 화합물 14와 15는 2 %DMSO 25 µ M 9-시스-망막, 각각, WT와 돌연변이 rhodopsin 7 셀 라인에 치료에 대 한. 또한, 열 11, 12 2 %DMSO 25 µ M 9-의 당 100 µ L를가지고cis-망막 제어, 각각, Z의 계산에 대 한 P23H rhodopsin 표현 하는 세포 치료 '-요인. (B) 384-잘 플레이트 세포 유형 및 치료 조건에 대 한 레이아웃입니다. U2OS 셀 표현 WT, T4R, P23H, P53R, C110Y, D190N 및 P267L rhodopsin 금성 같이 시드는. 치료 조건 파란색으로 표시 되어 있습니다. 핑크와 파란색 팁 384 플레이트 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 96 잘 접시에서 잘 잘 액체 전송을 보여 줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 대표 이미지와 rhodopsin 전송 분석 결과의 컨트롤에 대 한 quantifications. (A) 금성 형광 (녹색)와 WT 또는 P23H rhodopsin 비너스를 표현 하는 U2OS 세포의 세포 표면 immunostaining (레드) 처리 DMSO 또는 5 µ M 9-시스-망막. 눈금 막대 = 200 µ m. (B) A 열 작의 rhodopsin 금액 (Rhodopsin 금성 INT) 모든 셀에서을 나타내는 셀 당 평균 금성 강도. p< 0.0001. Z'-팩터 검은 선 아래 표시 됩니다. 열 값과 오차 막대는 각각 평균 및 표준 편차 (사 우 스 다코타) 16 복제입니다. (C) A 열 음모의 세포 표면 (세포 표면에 Rhodopsin INT)에 얼룩진 rhodopsin 나타내는 셀 당 Cy3 강도 의미. (D) 열은 그것의 전체 셀 수준 (MEM 총 비율)를 세포 표면에 rhodopsin 레벨의 비율을 나타내는 셀 당 금성 강도 의미 한 셀당 평균 cy3 강도의 비율의 줄거리. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 2 색으로 열 지도 표시 rhodopsin 전송 분석 결과의 대표적인 하이 콘텐츠 분석. (A)의 열 지도 전체 셀 rhodopsin 수준 (Rhodopsin 금성 INT)를 대표 하는 셀당 금성 강도 의미 한다. 각 블록 데이터 포인트를 나타냅니다 그리고 각 조건 3 중에서 테스트 되었습니다. 색 범례는 왼쪽에 표시 됩니다. Cp, 복합입니다. (B)의 열 지도 셀 표면 (세포 표면에 Rhodopsin INT)에 얼룩진 rhodopsin 나타내는 셀 당 Cy3 강도 의미 한다. (말은 그것의 전체 셀 수준 (MEM 총 비율)를 세포 표면에 rhodopsin 레벨의 비율을 나타내는 셀 당 금성 강도 셀당 Cy3 강도 의미의 C) 열 지도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
여기, 우리는 콘텐츠 이미징 분석 결과 조회 수는 HTS.에서 확인 대상이 사용 보였다 이러한 프로토콜에 관련 된 유일한 자동화 높은 콘텐츠 영상입니다. Immunostaining와 형광 이미징 rhodopsin의 rhodopsin5,14,,1516의 지역화 특성을 일반적으로 사용 되어 왔습니다. 그러나, 전통적인 이미징 방법으로 촬영 한 이미지의 정량화는 충분 한 셀 이미지 조건, 실험, 당 이미지의 낮은 용량 및 품질 제어 매개 변수의 부족의 부족에 의해 제한 됩니다. 우리 384-잘 형식 전통적인 immunostaining 프로토콜을 적응 하 고이 콘텐츠 이미징 전통적인 영상 교체. 이 높은 콘텐츠 이미징 프로토콜을 사용 하 여, 우리가 성공적으로 선택 하 고 구분 HTS11,,1317안타의 활동을 특징. 전통적인 immunostaining 및 이미징 방법에 비해,이 프로토콜 크게 이미징 조건, 이미지 용량 및 양적 약리 효과 비교할 수 있게 이미지 분석 힘의 농도 증가 6 adRP의 전송으로 11 화합물의 rhodopsin 돌연변이 관련.
이전에 사용 된 프로토콜에 비해 rhodopsin immunostaining 및 이미징이이 프로토콜의 주요 변화: 분명 하단 384-잘 접시;의 성장 및 immunostaining 세포를 (1) (2) 이미징이 콘텐츠 영상;를 사용 하 여 셀 그리고이 콘텐츠 이미지 분석 소프트웨어와 함께 (3) 분석 데이터. 이러한 변화는 초기 최적화는 최고의 셀 시드 수, 항 체 농도, 이미징 조건 및 이미지 분석 알고리즘을 찾을 필요 합니다.
프로토콜의 중요 한 단계를 포함: (1) 고정; 전에 50-70% 합류를 허용 하는 셀을 시드 (2) 주의 열망을 피하기 위해 셀 분리; (2) 이미지 초점에 있는지 확인 하 여 모든 채널의 형광 전체 접시에 걸쳐 여러 우물 이미징 초과 하지 않는 긍정적인 제어 웰 스에 대 한 영상의 임계값의 절반 전체 접시; 이미징 하기 전에 (3) 유지 Z'-요인 분석 결과의 신뢰성을 보장 하기 위해 0 보다 더 높은.
이 프로토콜에 대 한 발생할 수 있는 가장 일반적인 문제는 세포 분리 및 낮은 Z'-요인. 첫 번째 문제를 방지 하려면 폴 리-L-리 신 셀 첨부 파일을 촉진 하기 위하여 Hek293 세포 등 쉽게 분리 셀 라인을 사용 하지 마십시오와 384-잘 접시를 pretreat. 또한, 제한 포부 팁을 열망 하는 동안 각의 한 쪽을 터치 하 고 이미징에 대 한 각의 다른 측면을 선택 합니다. Z 개선 하기 '-요소와 셀 셀 모양 또는 소프트웨어에 의해 정의 된 핵 모양을 각 형광 채널에 있는 각 개체와 잘 맞는 있는지 확인 수 및 이미지 분석 매개 변수를 뿌리기 최적화 분석 결과 품질.
이 콘텐츠 이미징 방법 단정 rhodopsin 전송, 세포 표면 ELISA 또는 β-galactosidase 조각 보완성 분석 결과 등을 계량 하는 모든 셀에 셀 표면에 대상 단백질 수준 계산, 다른 방법에 비해 셀; 당 평균 단백질 수준 그리고,이 독특한 기능은 중요 한 변화 요인, 다른 방법에서 최종 판독에 영향을 미치는 휴대폰 번호를 방지 합니다. 또한, 셀 몇 군데이 콘텐츠 이미징 방법으로 정량의 큰 수, 매개 변수는 복제, 분석 결과의 신뢰성에 추가 따라서 사이 잘 보였다 낮은 변형 당 모든 셀에서 평균.
이 프로토콜의 한계가 아니라 그것의 상대적으로 복잡 한 절차와 시간 이미징 접시 당 2 h HTS에 대 한 최고의 분석 다는 것입니다. 따라서, 우리는 5000 개 이상의 화합물과 큰 작은 분자 라이브러리 심사 분석 실험 대체 기자는 것이 좋습니다 하 고 집중된 특성 분석 실험 100 화합물에 제한에 대 한이 콘텐츠 이미징 프로토콜을 사용 하 여. 이 프로토콜의 두 번째 제한 셀 당 rhodopsin 단백질의 양 가진 선형 상관 관계에에 금성 형광 또는 immunostaining 형광 강도 인지 표시 하는 표준의 그것의 부족 이다. Immunostaining에 의해 포화를 피하기 위해, 테스트 및 1 차 및 이차 항 체의 다른 농도와 알을 품는 세포의 immunostaining 농도 플롯 하는 것이 좋습니다. 개화의 선형 범위 내에서 항 체 농도 선택 합니다.
현재 응용 프로그램에서 확대, 우리 정도 10 화합물까지 치료에서이 화합물의 약리 데이터베이스를 생성 하 28 다른 rhodopsin 돌연변이와 페 셀의 이미지에서 rhodopsin 전송 계량 것입니다. 이러한 rhodopsin 돌연변이 나르는 adRP 환자에 게 잠재적인 치료의 지도 위한 활동. 이 프로토콜의 질병 misfolding 다른 단백질의 약물 발견에 대 한 도움이 될 것입니다 어떤 막 단백질의 전 분석에 쉽게 적응 수 있습니다 또한.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
피츠버그 대학 신약 연구소이 콘텐츠 영상 및 초기 교육을 제공 하 고 우리 박사 마크 E. Schurdak를 감사 합니다. 아낌없이 박사 크 Palczewski (케이스 서쪽 예비 대학) 공유 하는 1D 4 및 B630 안티 rhodopsin 항 체. 마우스 rhodopsin 금성 건설의 cDNA를 포함 하는 플라스 미드는 박사 네 빈 램버트 (오 거 스타 대학)에 의해 공유 되었다. 이 작품은 피츠버그 대학 비전 연구 코어 보조금에서 YC를 P30EY008098 건강 그랜트 EY024992의 국립 연구소에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| U2OS (rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (T4R-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P23H-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P53R-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (C110Y-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (D190N-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P267L-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| DMEM high glucose | Genesee Scientific | 25-500 | With L-Glutamine, sodium pyruvate |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16140071 | Heat inactivated |
| Plasmocin | InvivoGen | ant-mpt | Mycoplasma elimination reagent |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Gibco | 15140122 | 100X concentrated antibiotic solutions to prevent bacteria contamination of cell cultures |
| Trypsin-EDTA | Genesee Scientific | 25-510 | 0.25%, 1mM EDTA in HBSS without calcium and magnesium |
| Poly-L-lysine solution | Sigma-Aldrich | P4707-50ML | Mol wt 70,000-150,000, 0.01%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| CellCarrier-384 Ultra Microplates | PerkinElmer | 6057300 | 384-well tissue culutre-treated microplates with black well walls and an optically -clear cyclic olefin bottom for imaging cells in high content analysis |
| Sterile 96-well plate | Eppendorf | 30730119 | Tissue culture treated with lid flat bottom, sterile, free of detectable pyrogens, Rnase, DNase and DNA. Non-cytotoxic |
| Phosphate Buffered Sailine (PBS) | Invitrogen | AM9625 | 10 x PBS Buffer, pH 7.4 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D4540 | >99.5%, cell culture tested |
| 9-cis-retinal | Sigma-Aldrich | R5754 | |
| Compounds tested | Selleckchem/Life Chemicals/Custom synthesized | NA | Compounds were purchased from different vendors or custom synthesized |
| B6-30 anti-rhodopsin antibody | Novus | NBP2-25160 | Gift from Dr. Krzysztof Palczewski |
| Cy3-conjugated goat anti-mouse secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc | 115-165-146 | |
| 16% paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Methanol-free |
| 10% Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 50062Z | Blocking buffer |
| Hoechst 33342, Trihydroch | Invitrogen | H3570 | Nuclear staining solution |
| High-content imager | Molecular Devices | ImageXpress | ImageXpress® Micro Confocal High-Content Imaging System |
| MetaXpress high-content image acquisition and analysis software | Molecular Devices | MetaXpress | High-content image acquisition and analysis software |
| Multichannel pipette (0.5-10 µL) | Rainin | 17013802 | Manual 8-channel pipette, 0.5-10 µL |
| Multichannel pipette (0.5-10c | Rainin | 17013805 | Manual 8-channel pipette, 20-200 µL |
| Electronic multichannel pipette (10-200 μL) | Thermo Scientific | 14-3879-56BT | Electronic multichanenel pipette for 96- and 384-well microplate pipetting tasks |
| 50ml Reagent Reservoir | Genesee Scientific | 28-125 | Reagent reservior for multichannel pippte dispensing |
| 8-Channel aspirator | ABC Scientific | EV503 | 8-Channel stainless steel adaptor for aspirating liquids from 96- or 384-well plates |
| Excel spreadsheet software | Microsoft | Excel2016 | The spreadsheet software for data analysis and heatmap generation |
| Origin2018 scientific data analysis and graphing software | OriginLab | Origin2018 | The data analysis software for generating the dose response curves |
References
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