Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Родопсин транспорта пробирного анализа изображений высоким содержанием

Published: January 16, 2019 doi: 10.3791/58703
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Ophthalmology, University of Pittsburgh, 2McGowan Institute for Regenerative Medicine, University of Pittsburgh

Summary

Здесь мы описали высоким содержанием изображений метод количественной оценки транспорта родопсин мутантов, связанные с пигментный ретинит. Несколько волны скоринга анализ был использован для количественного определения родопсин белка на поверхности клеток или всю ячейку.

Abstract

Родопсин сворачиванию мутации приводят к смерти фоторецепторных стержня, которая проявляется как аутосомно-доминирующей пигментный ретинит (RP), прогрессивной ослепляющий болезнью, что не хватает эффективного лечения. Мы предполагаем, что цитотоксичность смятых родопсин мутант могут быть решены путем фармакологически стабилизации мутант родопсин белка. P23H мутации, среди других мутации родопсин II класса, кодирует структурно нестабильной родопсин Мутантный белок, который накапливается в эндоплазматический ретикулум (ER), тогда как дикого типа родопсин транспортируется к плазматической мембране в млекопитающих клетки. Мы ранее выполнена на основе свечения экрана высок объём (HTS) и определили группу фармакологической сопровождающих, которые спасли транспорта P23H родопсина из ER к плазматической мембраны. Здесь мы с помощью метода иммуноокрашивания следуют изображений высокой контент-анализа, количественно мутант родопсин белка сумма в клеточных и на плазматической мембраны. Этот метод является эффективным для определения истинной хиты от ложных срабатываний, после Хайтс и информативным Кроме того анализ изображений высоким содержанием позволили нам определить несколько параметров из одного эксперимента оценить фармакологических свойств каждого соединения. С помощью этого анализа, мы проанализировали влияние 11 различных соединений к шести RP связанные родопсин мутантов, получение 2-D фармакологические профиль для количественного и качественного понимания о структурной стабильности этих мутантов родопсин и эффективность различных соединений к этих мутантов.

Introduction

Сворачиванию белков участвует в мышечной дистрофии, нейронной дегенерации, а также ослепляющего заболеваний, включая пигментный ретинит (RP)1. RP-это унаследованные и прогрессивного дегенерация сетчатки, связанных с мутациями в более чем 60 гены, влияющие на функции и гомеостаза стержня фоторецепторов или пигментированной сетчатки epitheliums (RPEs)2,3. Без эффективного лечения в настоящее время доступна для RP. Родопсин мутации приходится около 25-30% аутосомно-доминанта (ad) RP случаев. Среди более чем 150 родопсин мутации4 (человека ген мутации база данных http:/ www.hgmd.cf.ac.uk/), класс II мутации вызывают структурной нестабильность родопсин белок, который способствует стержень фоторецепторных смерти и зрение потери5,6,,78. P23H является наиболее частые мутацией родопсин в Северной Америке, который также является типичным примером класса II родопсин мутации9,10. Из-за присущего структурная нестабильность смятых родопсин накапливается в эндоплазматический ретикулум (ER) в клетках млекопитающих, тогда как родопсин дикого типа расположен на плазматической мембране5. Протеолиз родопсин P23H мутант экспонатов доминирующей негативные цитотоксичность, что не из-за haploinsufficiency, но связано с активацией ER связанные пути деградации белка и организации внешнего сегмента Прерванный стержня. Для облегчения стержень фоторецепторных клеток стресс, одна из стратегий заключается в стабилизации родной складывания мутант родопсина, используя фармакологические сопровождающий.

Для достижения этой цели, мы провели на основе ячеек высок объём экран (HTSs)11,12,13 с помощью анализа взаимодополняемости фрагмент β-галактозидазы для количественного определения мутант P23H родопсина, перевозимых на плазму мембрана. Надежный и простой протокол этот assay HTS позволило нам изучить деятельность около 79000 малых молекул для каждого экрана. Однако потому что этот assay HTS читает свечения сигналов, ложных срабатываний, включая ингибиторов β-Гал, цветные или цитотоксические соединений включены в хит список ожидающих быть идентифицирован вторичного анализа.

Традиционные иммуноокрашивания и флуоресценции тепловизионные методы использовались для лет для изучения родопсин транспорт в mammalian клеток5,14,,1516. Однако эти традиционные методы не может использоваться для количественного определения фармакологические эффекты более 10 соединений к родопсин транспорта, потому что надежный анализ изображений требуется большое количество изображений, снятых при условии высокой согласованностью, который является не исправимый традиционными методами обработки изображений. Здесь мы разработали на основе иммуноокрашивания высоким содержанием визуализации протокола как вторичного анализа для количественного определения клеток поверхности транспорта смятых родопсин мутантов11,13,17. Для обозначения родопсин на плазматической мембране, мы пропущен шаг permeabilization клеточной мембраны и immunostained родопсина мутантов моноклональных анти родопсина (B6-30), признавая N-терминальный epitope родопсина на внеклеточные стороне ячейки мембрана18. Чтобы визуализировать мутант родопсин всю ячейку, мы сплавили родопсин с Венеры флуоресцирование белками. По количественной оценки интенсивности флуоресценции в каналах различных флуоресцирования мы в состоянии получить несколько параметров из одного одного эксперимента, включая общее родопсин интенсивности в целом ячейке, на поверхности клеток и соотношение Родопсин флуоресцирования на поверхности клеток, в целом ячейке. Применяя этот метод, чтобы стабильные клетки, выражая в общей сложности шести смятых родопсин мутантов, мы можем создать профиль фармакологических нескольких сопровождающих малые молекулы к этих мутантов. В этом протоколе все клетки immunostained в пластине 384-Ну и образы с использованием автоматизированной системы обработки изображений под условие весьма последовательной обработки изображений. Анализ изображений выполняется для каждой скважины, содержащие изображения более чем 600 клеток, чтобы уменьшить вариации из-за гетерогенности клеток с различной клетки форму и белка выражение уровня. Процесс этот протокол приводится на рисунке 1. Преимуществом этого метода является, что мы получить изображения с высоким разрешением, а также количественной Многопараметрический от анализа на основе образа. В общем этот протокол может быть модифицировать и применять для количественного определения перевозки любой смятых мембраной протеина интереса.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Примечание: Транспорт родопсин assay.

1. Подготовка и культура клетки

  1. Возродите крио сохранились U2OS стабильной клеток выразить дикого типа (WT) или мутант мыши родопсин Венера синтеза белков. Оттепель клетки при 37 ° C, до тех пор, пока в ампулу остались только небольшие ледяные кристаллы.
    Примечание: U2OS клетки используются в настоящем Протоколе, поскольку для исследования в vitro имеется не фоторецепторных клеток линии и предварительно цилиарной биосинтеза родопсин регулируется аналогичными молекулярных механизмов в mammalian клетках. Кроме того U2OS клетки плотно прикрепить к нижней части пластины и имеют крупные клетки тела, поэтому они идеально подходят для assay транспорта родопсина. Семь U2OS стабильной клетки выражая WT, T4R, P23H, P53R, C110Y, D190N и P267L родопсина мутантов используются здесь как пример, чтобы показать качество и надежность анализа. Стабильные клетки, выражая другие мутанты родопсин или других мембранных белков может использоваться, в зависимости от цели исследования. Стабильные клетки, выражая человеческие родопсина может использоваться в этот assay, если доступно. Родопсин мыши был использован здесь, потому что мышь и белки человека родопсин долю 95% гомологии, и соединений, выявленных этот assay будет протестированных в естественных условиях с помощью мыши adRP модели, перевозящих родопсин P23H мутации8. Стабильные клетки были созданы как описано ранее,19. WT и мутантов родопсин стенограммы были количественно q-ПЦР, и клоны стабильной клеток, выражая аналогичные уровни WT и мутантов родопсин стенограммы были отобраны для этого анализа. Выражение родопсин белков был подтвержден immunoblot и иммуноокрашивания. Прохождение ячеек, которые используются в этом assay должно быть меньше 20.
  2. Каждая линия клеток передачи в 15 мл Конические трубки, содержащие 10 мл среднего роста (высокие глюкоза Дульбекко изменение средних (DMEM) с 10% плода бычьим сывороточным (ФБС) и 5 мкг/мл Plasmocin орла).
  3. Центрифуга трубки на 200 x g для 5 минут удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки лепешка с 5 мл средний рост клеток для каждой ячейки строки. Передачи каждой строки суспензию клеток в культуре ткани блюдо 60 мм и инкубировать при 37 ° C с 5% CO2.
  4. Субкультура клетки когда тканевой культуры блюдо достигает 90% слияния, как описано в ссылка12.

2. Заполнение клеток на 5000 ячеек на колодец

Примечание: Выполните следующие процедуры в культуре ткани капюшоном.

  1. Относитесь к пластине с поли лизин.
    1. Один день перед посевом клетки, лечить черная стена и снимите днище 384-колодец с 20 мкл/хорошо поли лизин решения для 30 мин.
    2. Аспирационная жидкости и разрешить все скважины для просушки на 1 ч. положить обратно крышку плита и хранить пластину на 4 ° C на ночь для заполнения ячейки.
  2. Готовят суспензию клеток.
    1. Культура каждой ячейки строки среднего роста в тканевой культуры блюдо 100 мм до 90% слияния.
    2. Вымойте каждое блюдо с-фосфатный буфер (PBS) и отсоединить клеток в 1 мл 0,05% трипсина в 37 ° C.
    3. Ресуспензируйте каждой линии клеток в 10 мл пробирного среды (DMEM высокой глюкозы с 10% FBS, 100 единиц/мл пенициллина и стрептомицина 100 мкг/мл).
    4. Подсчитать количество ячеек и разбавленных каждой линии клеток до 1.25 x 105 клеток/мл с Пробирной среднего.
  3. Семя клетки.
    1. Использование электронных многоканальные пипетки или Дозатор автоматизированный реагент обойтись 40 мкл/колодец суспензию клеток для трех столбцов в клеточной линии и заливки колонки 1-21 384-ну пластины (рис. 2).
    2. Добавить 40 мкл/хорошо U2OS (P23H-родопсин-Венера) столбцы 22-23 и 40 мкл/хорошо U2OS (родопсин-Венера) столбцу 24, как элементы управления.
    3. Центрифуга пластину на 300 x g 30 s, чтобы сбить все клетки в нижней части пластины 384-хорошо.
      Примечание: Избегайте физического шока к плите после заполнения ячейки. В противном случае клетки будут раздавлены в одном углу каждой скважины, и пластины не будет подходящим для отображения с высоким содержанием.
    4. Инкубируйте 384-ну пластины при 37 ° C с 5% CO2 на 3 ч для клетки, чтобы прикрепить к нижней части пластины.

3. Лечение клетки с соединениями

  1. Создание карты пластины с условия лечения, как показано на рисунке 2.
  2. Подготовка 300 мкл 5 x рабочие решения до 15 соединений в 96-луночных пластине.
    1. Разбавьте cps 1 до 15 с Пробирной среднего в пять раз их окончательного концентраций в скважинах A1 для G2 96-луночных пластины (рисунок 2A). Добавьте 300 мкл пробирного среды в хорошо H2.
      Примечание: Конечная концентрация каждого соединения используется в наиболее эффективной концентрации для спасения транспортного P23H родопсина HTS12,13.
    2. 100 мкл на хорошо 2% диметилсульфоксида (ДМСО) и 25 мкм 9 -СНГ-сетчатки, которые разводят в Пробирной средне колонках 11 и 12, соответственно. Добавить 9 -СНГ-сетчатки в тусклом свете.
  3. Добавление 10 мкл на хорошо 5 x работает решения пластину 384-ну культивируемых клеток (рис. 2B).
    1. Используйте электронные многоканальные пипетки для добавления строки A, C, E, G, I, K, M и O соединениями 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 и 15 из столбцов 1 до 21 (рис. 2). Добавить соединениями 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 и M строкам B, D, F, H, J, L, N и P от столбцов 1 до 21.
    2. Добавьте 10 мкл на хорошо 2% ДМСО в столбцы 22 и 24. 10 мкл на хорошо 25 мкм 9 -СНГ-сетчатки к столбцу 23.
      Примечание: ДМСО используется как элемент управления автомобиля потому, что все соединения первоначально растворяются в ДМСО как запасы. Колонка, 22, содержащие клетки ДМСО лечение выражая P23H родопсина используется как элемент 0%. 9 -СНГ-обработанные клетки сетчатки, выражая P23H родопсина используется как элемент 100%.
  4. Крышка 384-колодец с алюминиевой фольгой и инкубировать пластины при 37 ° C в течение 24 ч.

4. иммуноокрашивания без мембраны Permeabilization пятно родопсин белка на поверхности клеток.

Примечание: Избегайте любых моющих средств в процессе всей иммуноокрашивания держать клеточной мембраны неповрежденными.

  1. Подготовить параформальдегида 4% (PFA) путем разбавления 16% PFA с PBS в соотношении 1:4 тома в химической зонта. Передача 4% ПФА в водоеме реагента.
  2. Выньте пластину 384-Ну в темной комнате с тусклый красный свет. Используйте 8-канальный аспиратор, подключенных к бутылке вакуума коллекции для нежно аспирационная среды. Использование электронных многоканальные пипетки для добавления 20 мкл на хорошо свежеприготовленные 4% PFA всего 384-ну пластины и проинкубируйте втечение 20 мин при комнатной температуре. Чтобы избежать мобильный отряд, всегда укажите советы Аспиратор той же стороне каждой скважины во время чаяния. Не прикасайтесь к области середине нижней каждой скважины. При съемке изображений, выберите поля, чтобы избежать региона тронут Аспиратор. Для инкубаций длиннее 10 минут крышка 384-хорошо с ее крышкой, чтобы избежать испарения.
    Примечание: Клетки фиксируются в темной комнате, чтобы избежать Фотообесцвечивание восстановленный isorhodopsin, которые будут влиять на результат 100% контроля. После фиксации 384-ну пластина может быть вывезены под нормальный свет.
  3. Используйте 8-канальный Аспиратор аспирационная ПФА в каждой скважине и использовать электронные многоканальные пипетки для добавьте 50 мкл на хорошо PBS. Повторите еще два раза для выполнения трех автомойки с PBS.
    Предупреждение: Отходы жидкости содержащие PFA собраны в бутылке ограничен и должен быть утилизирован в качестве опасных химических отходов после эксперимента.
  4. Заблокировать ячейки, добавив 20 мкл на хорошо 5% козьего сыворотки пластину всего 384-Ну и инкубации при комнатной температуре за 30 мин.
  5. Аспирационная 5% козьего сыворотки и мкл 15 за хорошо 20 мкг-1 мл B6-30 анти родопсин антител в сыворотке крови козла 1% для строки A O. Добавить 15 мкл за хорошо 1% козьего сыворотки для строки P для вторичных антител только контрольной группы.
  6. Инкубируйте 384-ну пластины при комнатной температуре за 90 минут или при температуре 4 ° C на ночь. Крышка 384-колодец с алюминиевой фольгой, чтобы избежать Фотообесцвечивание флуорофоров.
  7. Промойте пластины 3 раза с 50 мкл на хорошо PBS.
  8. Аспирационная PBS и 15 мкл на хорошо 5 мкг мл-1 Cy3-конъюгированных коза анти мыши IgG антитела. Крышка 384-колодец с алюминиевой фольгой и инкубации при комнатной температуре в течение 1 ч или при температуре 4 ° C на ночь.
  9. Промойте пластины 3 раза с 50 мкл на хорошо PBS. Добавьте 50 мкл на хорошо PBS, содержащие 1 мкг мл-1 Hoechst 33342 пятно ядер при комнатной температуре в течение 15 мин.
  10. Уплотнение 384-ну пластины с прозрачной пленки до изображений. Крышка 384-колодец с алюминиевой фольгой и хранить при 4 ° C на срок до недели, если изображения принимаются немедленно.

5. Визуализация.

Примечание: Эта процедура обработки изображений высоким содержанием приспособлен к тепловизионной системы, перечисленные в Таблице материал. Процедуры могут быть различными, если с помощью других систем тепловидения высоким содержанием.

  1. Снимите крышку и положить 384-ну пластины в высоким содержанием Тепловизор с A1 расположен в верхнем левом углу плиты.
  2. Открываете изображение приобретение программного обеспечения для настройки параметров для захвата изображений.
    1. Откройте окно пластины приобретение установки и создать новый параметр или загрузить существующий файл установки.
    2. Выберите цель 20 x и созданы пиксель биннинга как 2 таким образом откалиброванные пикселей размер 0,80 x 0,80 мкм. Установите линии сканирования как 2000 и размер изображения (W x H) как 1000 x 1000 пикселей (800.00 x 800.00 мкм) на сайте.
    3. Выберите тип пластины к записи образа. Используйте информацию, предоставленную изготовителем 384-ну пластины для заполнения размеров плиты.
    4. Выберите скважин для отображаемого 384-ну пластины.
    5. Выберите четыре сайты, чтобы быть imaged за хорошо. Избегайте стороне хорошо тронут стремление советы.
    6. Выберите возбуждения лазеры как 405, 488 и 561 Нм. Выберите Фильтры выбросов для DAPI, FITC и Техас красный каналы. Оптимизировать мощность лазера и выгоды каждого канала для обеспечения яркость изображения, взятые из скважин положительный контроль меньше чем порог насыщения.
    7. Установите фокус на скважины для автофокусировки. Выбор первой скважины, приобретенных как первоначальный хорошо для поиска образцов. Набор сайт автофокусом для всех сайтов.
    8. Выберите четыре средние значения в строке для каждого канала. Оптимизируйте значением Z-смещения для каждого канала.
    9. Теста, который 2-3 скважины на диагонали углах 384 хорошо пластины, чтобы убедиться, что изображения на фокус для всех протестированных скважин, изображения со всех сайтов в хорошо иметь ячейки с более чем 40% слияния и интенсивностью флюоресценции всех каналов, около половины насыщены в 100% контроль скважины.
    10. Сохраните метод приобретения изображений.
  3. Выполните всю тарелку. Смотрите томографа, до тех пор, пока он закончит, захват изображений из первого столбца пластины перепроверить качество изображения перед отъездом томографа. Вынуть пластину 384-хорошо и хранить при 4 ° C для использования в будущем.
    Примечание: В зависимости от количества объектов, выбранных в колодец и каналы получения, занимает 40 мин до 3 ч до конца изображений одной пластины 384-хорошо.

6. изображения анализ.

  1. Извлеките данные изображения, с помощью программного обеспечения для анализа изображений высоким содержанием. Выберите один из 100% контроля скважин (графа 23) для настройки параметров.
  2. Выберите Мульти волны клеток забил как метод анализа и настройки.
    1. Определите ядер, используя изображения из DAPI канала. Предварительный просмотр, чтобы убедиться, что определенные ядер фигуры в выбранной хорошо подходит хорошо с образами ядра.
    2. Определите форму ячейки в FITC канала, где образы родопсин Венера.
    3. Определите области поверхности пятен родопсин клеток в Техас красный канал.
    4. Проверьте текущий алгоритм в 5 скважинах для определения, если параметры оптимизированы. Сохранить настройки и закрыть окно настройки .
  3. Выполните все скважины с методом оптимизации анализа.
  4. Экспортируйте Объект номер нетронутыми мобильный номер. Экспортируйте Средней интенсивности FITC канала родопсин-Венера интенсивности (родопсин-Венера INT). Экспортируйте Средней интенсивности Техас красный канал родопсин интенсивности на поверхности клеток (родопсин INT на поверхности клеток).
  5. Откройте экспортированные данные в программу электронных таблиц. Разделите родопсин интенсивности на поверхности клеток родопсин Венера INT как MEM-общее соотношение. Рассчитать Z'-факторов для каждого параметра, чтобы оценить качество анализа. Z′ = 1−3X (STD100% контроль+STD0% управления) / | Означает100% контроль−Meanуправления 0%|.
    Примечание: Z'-фактор превышает 0 указывает умеренной пробирного достаточно высоким содержанием экрана и Z' фактор между 0,5 и 1 предлагает выдающиеся assay для высокой пропускной способности экрана20,21.
  6. Используйте программу электронной таблицы для создания двух цветные тепловую карту для каждого параметра. Организовать имя клеточных линий на оси x и соединений на оси y.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Мы были характерны родопсин транспорта с тремя параметрами: интенсивность родопсин Венера в клеточных (родопсин-Венера INT), интенсивность иммуноокрашивания родопсина на плазматической мембране (родопсин INT на поверхности клеток) и соотношение Родопсин пятно на поверхности клеток к интенсивности родопсин Венера в клеточных (MEM-всего отношение). Представитель результат анализа транспорта родопсин показан на рис. 3 и рис. 4. С помощью ДМСО и 9 -СНГ-лечение сетчатки клетки выражения P23H-родопсин Венера как 0 и 100% контроль, соответственно, Z'-факторы для этих трех параметров находятся в диапазоне от 0 до 0.5, предполагая, что assay имеет среднего качества, достаточно высоким содержанием изображений21. Хотя оптимизация Z'-факторы являются ниже, чем 0.5 из-за его относительно сложных процедур, по сравнению с Пробирной HTS, этот assay еще прочной и надежной для анализа на основе образа. Активное соединение, которое спасает смятых родопсин должен показать высокие значения INT родопсин на поверхности клетки и MEM-общее соотношение, чем ДМСО, значение P меньше 0,05. Три 2-D тепловые карты были получены из этих трех параметров для сравнения средний родопсина сумма и локализации в ячейку (рис. 4). Повторяется в triplicates, WT и шесть родопсин мутантов перечислены по горизонтали, и последствия составных лечения сравниваются по вертикали. Согласна с предыдущими исследованиями родопсин INT на поверхности клеток и MEM-общее соотношение ниже для шести мутантов, по сравнению с WT родопсина, относились с ДМСО (рис. 4 c)5,22,23. Родопсин INT на поверхности клеток и соотношение его MEM-к сумма увеличилась на 9 -СНГ-сетчатки лечение для T4R, P23H, D190N и P267L, но не P53R или C110Y мутантов, предполагая, что 9 -СНГ-ретиналь спасает транспорта T4R, P23H, D190N и P267L родопсина мутантов. Все cps показали различные уровни увеличения в родопсин INT на поверхности клеток для T4R, P23H и D190N. CPS 3, 4, 5, 7, 8 и 11 увеличилась INT родопсин Венера, но не MEM-общее соотношение этих мутантов родопсина, предполагая, что эти соединения только увеличил сумму родопсина. CPS 1, 2-6 и 9 значительно увеличили соотношение MEM-всего T4R, P23H, D190N и P267L родопсина мутантов, предполагая, что эти соединения спасения перевозки этих мутантов родопсин к плазматической мембраны. 2-D профили обеспечивают всесторонний обзор транспорта родопсина, пострадавших от этих связанных adRP мутации, которые затрудняются различных медикаментозное лечение.

Figure 1
Рисунок 1: процесс транспорта пробирного родопсина. Процедуры для клеток поверхности окраски родопсина без мембраны permeabilization для assay транспорта родопсина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: иллюстрации для подготовки 5 x рабочих растворов и жидких передачи от 96-луночных пластины 384-ну пластина. (A) 96-луночных пластины макет 5 x рабочие решения. Уэллс А1-G2 имеют 300 мкл за хорошо до 15 5 x рабочих растворов и пробирного средний (M), как показано в колонках 1 и 2. 14 и 15 являются 2% ДМСО и 25 мкм 9 -СНГ-сетчатки, соответственно, для обращения к семи клеточных линий, выражая WT и мутантов родопсина. Кроме того, столбцы, 11 и 12 имеют 100 мкл в колодец 2% ДМСО и 25 мкм 9 -СНГ-ретиналь контролирует, соответственно, относились к клеткам, выражая P23H родопсина для расчета Z'-факторов. (B 384-ну пластины макет для ячейки типа и лечения условий. U2OS клетки выражая WT, T4R, P23H, P53R, C110Y, D190N и P267L родопсина Венера являются семенами, как показано на рисунке. Условия лечения помечены синим цветом. Розовый и голубой советы продемонстрировать для скважины жидкость передачи от 96-луночных пластины 384 пластину, используя многоканальные пипетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: представитель изображения и количественной для элементов управления assay транспорта родопсина. (A) Венера флуоресценции (зеленый) и клеток поверхности иммуноокрашивания (красный) U2OS клеток, выражая WT или P23H родопсина Венера относиться с ДМСО или 5 мкм 9 -СНГ-сетчатки. Шкалы бар = 200 µm. (B) A колонка участок средней интенсивности Венеры в клетку, представляющие родопсин сумма в клеточных (родопсин-Венера INT). p< 0,0001. Z'-фактор проявляется под черной линией. Столбец значение и ошибка бар являются среднее и стандартное отклонение (с.д.) 16 реплицирует, соответственно. Участок (C) A столбца означает Cy3 интенсивности в клетку, представляющих родопсина, витражи на поверхности клеток (родопсин INT на поверхности клеток). (D) столбец участок отношение средней cy3 интенсивности на ячейку означает Венера интенсивности в клетку, представляющий отношение уровня родопсин на поверхности клеток до уровня поклеточного (MEM-общее соотношение). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: представитель высокого контент-анализ родопсин транспорта анализа показано как 2-цветный тепловые карты. (A) тепла карта означает Венера интенсивности в клетку, представляющий уровень поклеточного родопсина (родопсин-Венера INT). Каждый блок представляет точку данных, и каждое условие был испытан в трех экземплярах. Обозначения цветов отображается слева. CP, составные. (B) тепла карта означает Cy3 интенсивности в клетку, представляющих родопсина, витражи на поверхности клеток (родопсин INT на поверхности клеток). (C) тепла карта средней интенсивности Cy3 на ячейку на основе средней интенсивности Венеры в клетку, представляющий отношение уровня родопсин на поверхности клеток до уровня поклеточного (MEM-общее соотношение). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь мы показали высоким содержанием изображений пробирного используется для квалификации хитов от Хайтс Только автоматизации, участвующих в этих протоколах является высоким содержанием томографа. Иммуноокрашивания и флуоресценции изображений родопсина обычно используются характеризовать локализации родопсин5,14,,1516. Однако количественная оценка изображений, снятых традиционными методами обработки изображений ограничивается отсутствием достаточных клеток изображений на условие, низкий потенциал изображений на эксперимент и отсутствие контроля качества параметра. Мы адаптировать традиционные иммуноокрашивания протокол в 384-ну формат и заменить традиционные изображений с высоким содержанием изображений. Используя этот протокол высоким содержанием изображений, мы успешно выбран и охарактеризовал деятельность определенных HTS11,,1317хитов. По сравнению с традиционными иммуноокрашивания и методов обработки изображений, этот протокол значительно увеличили консистенции изображений условий, изображений потенциала и изображения анализа власти, что позволило нам количественно сравнить фармакологические эффекты 11 соединений к перевозке шести adRP связанные родопсин мутантов.

Основные изменения настоящего Протокола, по сравнению с ранее используемые протоколы для иммуноокрашивания родопсина и изображений являются: (1) растет и иммуноокрашивания клеток в ясно-384-ну днище; (2) визуализации ячеек с помощью томографа высоким содержанием; и (3) анализ данных с высоким содержанием образ программного обеспечения для анализа. Вследствие этих изменений первоначальный оптимизация не требуется найти лучший мобильный номер посева, концентрации антитела, визуализации условия и алгоритмы анализа изображений.

Важнейшие шаги протокола включают в себя: (1) заполнение клеток, которые позволяют слияния 50-70% до фиксации; (2) тщательно стремления избежать ячейки отряда; (2) визуализации несколько скважин через целую тарелку, чтобы убедиться, что изображения на фокус и флуоресцировать всех каналов не превышает половины порога томографа для положительный контроль скважины до визуализации целую тарелку; и (3) Z'-фактор превышает 0, чтобы обеспечить надежность assay.

Наиболее распространенные проблемы, которые могут возникнуть для этого протокола являются клетки отряда и низким Z'-факторов. Чтобы избежать первый выпуск, предварительной обработки 384-ну пластины с поли L-Лизин для облегчения вложение клеток и избегать использования клеточных линий, которые отсоединить легко например Hek293 клетки. Кроме того Ограничьте кончик стремление прикоснуться только одной стороне каждой скважины при аспирации и выберите другой стороне каждой скважины для воображения. Для улучшения Z'-фактор и анализа качества, оптимизировать посева номер и изображения параметры анализа, чтобы убедиться, что клетки форму или форму ядер определяется программное обеспечение хорошо сочетается с каждого объекта в каждом канале флуоресценции клеток.

По сравнению с другими методами для количественного определения родопсин транспорта, такие как ELISA поверхности клетки, или β-галактозидазы фрагмент дополнения анализа, которые вычисляют целевого уровня белка на поверхности клеток во всех клетках, этот метод визуализации высоким содержанием количественно уровень Средний белка в клетку; и эта уникальная особенность избегает критические изменения фактора, мобильный номер, который влияет на окончательный индикацию в других методов. Кроме того из-за большого числа клеток образы и количественно методом визуализации высоким содержанием, параметры среднем от всех клеток на хорошо показал низкий различия между реплицирует, тем самым увеличивая надежность assay.

Одно ограничение этого протокола является, что они не являются лучшим анализов для HTS, из-за его довольно сложная процедура и 2 h на пластину, визуализации времени. Таким образом мы рекомендуем альтернативных репортер анализов для проверки крупных библиотек мелкомолекулярных с более чем 5000 соединений и использовать этот протокол высоким содержанием изображений для целенаправленного характеристика анализов ограничивается менее чем 100 соединений. Второй недостаток этого протокола является отсутствие стандартов, чтобы показать ли Венера флуоресценции или иммуноокрашивания интенсивности флуоресценции в линейной корреляции с количеством родопсин сумма белка в ячейке. Чтобы избежать насыщения иммуноокрашивания, мы рекомендуем тестирование и построение иммуноокрашивания интенсивности клетки инкубировали с различных концентрациях первичных и вторичных антител. Выберите концентрации антител в пределах диапазона линейной цветения изменения.

Расширение из текущего приложения, мы будет количественно родопсин транспорта от изображения клеток временно transfected с 28 различных родопсин мутантов под лечение с до 10 соединений для создания фармакологических базы данных этих соединений деятельность для ознакомления потенциальных методов лечения больных adRP, перевозящих эти мутации родопсина. Этот протокол также может быть легко адаптирована для анализов транслокации белка любой мембранных интерес, которые будут полезны для наркотиков открытия других белков сворачиванию заболеваний.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Мы благодарим д-р Марк э. Schurdak и обнаружения наркотиков университета Питтсбурга институт высоким содержанием тепловизор и начального обучения. Д-р Krzysztof Palczewski (Университет Кейс Вестерн Резерв) щедро поделился 4 1 d и B630 антитела анти родопсина. Плазмиды, содержащие cDNA мыши родопсин Венера конструкции разделяют доктор Невин Ламберт (Augusta университет). Эта работа была поддержана Национальным институтом здравоохранения грант EY024992 ус и P30EY008098 из Питтсбургского университета видение исследования основных грант.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
U2OS (rhodopsin-Venus) cells NA NA Stable cells generated from U2OS cells
U2OS (T4R-rhodopsin-Venus) cells NA NA Stable cells generated from U2OS cells
U2OS (P23H-rhodopsin-Venus) cells NA NA Stable cells generated from U2OS cells
U2OS (P53R-rhodopsin-Venus) cells NA NA Stable cells generated from U2OS cells
U2OS (C110Y-rhodopsin-Venus) cells NA NA Stable cells generated from U2OS cells
U2OS (D190N-rhodopsin-Venus) cells NA NA Stable cells generated from U2OS cells
U2OS (P267L-rhodopsin-Venus) cells NA NA Stable cells generated from U2OS cells
DMEM high glucose Genesee Scientific 25-500 With L-Glutamine, sodium pyruvate
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 16140071 Heat inactivated
Plasmocin InvivoGen ant-mpt Mycoplasma elimination reagent
Penicillin-Streptomycin (100X) Gibco 15140122 100X concentrated antibiotic solutions to prevent bacteria contamination of cell cultures
Trypsin-EDTA Genesee Scientific 25-510 0.25%, 1mM EDTA in HBSS without calcium and magnesium
Poly-L-lysine solution Sigma-Aldrich P4707-50ML Mol wt 70,000-150,000, 0.01%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
CellCarrier-384 Ultra Microplates PerkinElmer 6057300 384-well tissue culutre-treated microplates with black well walls and an optically -clear cyclic olefin bottom for imaging cells in high content analysis
Sterile 96-well plate Eppendorf 30730119 Tissue culture treated with lid flat bottom, sterile, free of detectable pyrogens, Rnase, DNase and DNA. Non-cytotoxic
Phosphate Buffered Sailine (PBS) Invitrogen AM9625 10 x PBS Buffer, pH 7.4
DMSO Sigma-Aldrich D4540 >99.5%, cell culture tested
9-cis-retinal Sigma-Aldrich R5754
Compounds tested Selleckchem/Life Chemicals/Custom synthesized NA Compounds were purchased from different vendors or custom synthesized
B6-30 anti-rhodopsin antibody Novus NBP2-25160 Gift from Dr. Krzysztof Palczewski
Cy3-conjugated goat anti-mouse secondary antibody Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc 115-165-146
16% paraformaldehyde Thermo Fisher Scientific 28908 Methanol-free
10% Normal Goat Serum Thermo Fisher Scientific 50062Z Blocking buffer
Hoechst 33342, Trihydroch Invitrogen H3570 Nuclear staining solution
High-content imager Molecular Devices ImageXpress ImageXpress® Micro Confocal High-Content Imaging System
MetaXpress high-content image acquisition and analysis software Molecular Devices MetaXpress High-content image acquisition and analysis software
Multichannel pipette (0.5-10 µL) Rainin 17013802 Manual 8-channel pipette, 0.5-10 µL
Multichannel pipette (0.5-10c Rainin 17013805 Manual 8-channel pipette, 20-200 µL
Electronic multichannel pipette (10-200 μL) Thermo Scientific 14-3879-56BT Electronic multichanenel pipette for 96- and 384-well microplate pipetting tasks
50ml Reagent Reservoir Genesee Scientific 28-125 Reagent reservior for multichannel pippte dispensing
8-Channel aspirator ABC Scientific EV503 8-Channel stainless steel adaptor for aspirating liquids from 96- or 384-well plates
Excel spreadsheet software Microsoft Excel2016 The spreadsheet software for data analysis and heatmap generation
Origin2018 scientific data analysis and graphing software OriginLab Origin2018 The data analysis software for generating the dose response curves

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gregersen, N., Bross, P., Vang, S., Christensen, J. H. Protein misfolding and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 7, 103-124 (2006).
  2. Daiger, S. P., Bowne, S. J., Sullivan, L. S. Perspective on genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Archives of Ophthalmology. 125 (2), 151-158 (2007).
  3. Daiger, S. P., Sullivan, L. S., Bowne, S. J. Genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Clinical Genetics. 84 (2), 132-141 (2013).
  4. Stenson, P. D., et al. The Human Gene Mutation Database: towards a comprehensive repository of inherited mutation data for medical research, genetic diagnosis and next-generation sequencing studies. Human Genetics. 136 (6), 665-677 (2017).
  5. Sung, C. H., Schneider, B. G., Agarwal, N., Papermaster, D. S., Nathans, J. Functional heterogeneity of mutant rhodopsins responsible for autosomal dominant retinitis pigmentosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (19), 8840-8844 (1991).
  6. Athanasiou, D., et al. The molecular and cellular basis of rhodopsin retinitis pigmentosa reveals potential strategies for therapy. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 1-23 (2018).
  7. Chiang, W. C., et al. Robust Endoplasmic Reticulum-Associated Degradation of Rhodopsin Precedes Retinal Degeneration. Molecular Neurobiology. 52 (1), 679-695 (2015).
  8. Sakami, S., et al. Probing mechanisms of photoreceptor degeneration in a new mouse model of the common form of autosomal dominant retinitis pigmentosa due to P23H opsin mutations. Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 10551-10567 (2011).
  9. Dryja, T. P., et al. Mutations within the rhodopsin gene in patients with autosomal dominant retinitis pigmentosa. New England Journal of Medicine. 323 (19), 1302-1307 (1990).
  10. Sohocki, M. M., et al. Prevalence of mutations causing retinitis pigmentosa and other inherited retinopathies. Human Mutation. 17 (1), 42-51 (2001).
  11. Chen, Y., et al. A novel small molecule chaperone of rod opsin and its potential therapy for retinal degeneration. Nature Communications. 9 (1), 1976 (2018).
  12. Chen, Y., Tang, H. High-throughput screening assays to identify small molecules preventing photoreceptor degeneration caused by the rhodopsin P23H mutation. Methods in Molecular Biology. 1271, 369-390 (2015).
  13. Chen, Y., et al. A High-Throughput Drug Screening Strategy for Detecting Rhodopsin P23H Mutant Rescue and Degradation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (4), 2553-2567 (2015).
  14. Noorwez, S. M., et al. Pharmacological chaperone-mediated in vivo folding and stabilization of the P23H-opsin mutant associated with autosomal dominant retinitis pigmentosa. Journal of Biological Chemistry. 278 (16), 14442-14450 (2003).
  15. Saliba, R. S., Munro, P. M., Luthert, P. J., Cheetham, M. E. The cellular fate of mutant rhodopsin: quality control, degradation and aggresome formation. Journal of Cell Science. 115, 2907-2918 (2002).
  16. Kaushal, S., Khorana, H. G. Structure and function in rhodopsin. 7. Point mutations associated with autosomal dominant retinitis pigmentosa. Biochemistry. 33 (20), 6121-6128 (1994).
  17. Chen, Y., Brooks, M. J., Gieser, L., Swaroop, A., Palczewski, K. Transcriptome profiling of NIH3T3 cell lines expressing opsin and the P23H opsin mutant identifies candidate drugs for the treatment of retinitis pigmentosa. Pharmacological Research. 115, 1-13 (2016).
  18. Adamus, G., et al. Anti-rhodopsin monoclonal antibodies of defined specificity: characterization and application. Vision Research. 31 (1), 17-31 (1991).
  19. Goodson, H. V., Dzurisin, J. S., Wadsworth, P. Generation of stable cell lines expressing GFP-tubulin and photoactivatable-GFP-tubulin and characterization of clones. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (9), pdb prot5480 (2010).
  20. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  21. Bray, M. A., Carpenter, A., et al. Advanced Assay Development Guidelines for Image-Based High Content Screening and Analysis. Assay Guidance Manual. Sittampalam, G. S., et al. , Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. Bethesda (MD). (2004).
  22. Sung, C. H., Davenport, C. M., Nathans, J. Rhodopsin mutations responsible for autosomal dominant retinitis pigmentosa. Clustering of functional classes along the polypeptide chain. Journal of Biological Chemistry. 268 (35), 26645-26649 (1993).
  23. Krebs, M. P., et al. Molecular mechanisms of rhodopsin retinitis pigmentosa and the efficacy of pharmacological rescue. Journal of Molecular Biology. 395 (5), 1063-1078 (2010).

Tags

Химия выпуск 143 высоким содержанием изображений денатурации белков родопсин пигментный ретинит фармакологические сопровождающий иммуноокрашивания
Родопсин транспорта пробирного анализа изображений высоким содержанием
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Feng, B., Liu, X., Chen, Y. A… More

Feng, B., Liu, X., Chen, Y. A Rhodopsin Transport Assay by High-Content Imaging Analysis. J. Vis. Exp. (143), e58703, doi:10.3791/58703 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter