Summary
Aqui, descrevemos um método de imagem de alto teor para quantificar o transporte dos mutantes rodopsina associado com retinite pigmentosa. Uma análise de múltiplos comprimentos de onda pontuação foi utilizada para quantificar proteína rodopsina na superfície da célula ou a célula inteira.
Abstract
Mutações misfolding rodopsina levam à morte de fotorreceptoras de haste que se manifesta como autossômica dominante retinite pigmentosa (RP), uma progressiva cegueira doença que não tem tratamento eficaz. Nós hypothesize que a citotoxicidade do mutante rodopsina misfolded pode ser atenuada por farmacologicamente a estabilizar a proteína mutante rodopsina. A mutação P23H, entre as outras mutações de rodopsina de classe II, codifica uma proteína mutante rodopsina estruturalmente instável que é acumulada no retículo endoplasmático (ER), Considerando que a rodopsina tipo selvagem é transportada para a membrana plasmática em mamíferos células. Anteriormente realizamos uma tela de alta produtividade baseada em luminescência (HTS) e identificou um grupo de acompanhantes farmacológicas que resgatou o transporte da rodopsina P23H de ER para a membrana plasmática. Aqui, usando um método de imunocoloração seguido por uma análise de imagens de alto teor, podemos quantificar a quantidade de proteína mutante rodopsina na célula inteira e na membrana plasmática. Esse método é eficaz para identificar o verdadeiras correspondências a partir de falsos positivos após HTS e informativo Além disso, a análise de imagem de alto teor nos permitiu quantificar vários parâmetros de uma única experiência para avaliar as propriedades farmacológicas de cada composto. Usando este teste, analisamos o efeito de 11 diferentes compostos para seis RP associado rodopsina mutantes, obtendo um perfil farmacológico de 2-D para uma compreensão quantitativa e qualitativa sobre a estabilidade estrutural desses mutantes rodopsina e a eficácia de diferentes compostos para esses mutantes.
Introduction
Enrolamento de proteínas está envolvido na distrofia muscular, neurais Espinocerebelares, bem como doenças cegantes, incluindo retinite pigmentosa (RP)1. RP é uma degeneração da retina herdada e progressiva, associada com mutações em mais de 60 genes que afetam a função e a homeostase dos FOTORRECEPTORES de haste ou os epitélios pigmentado da retina (RPEs)2,3. Não há tratamento eficaz está atualmente disponível para RP. Rhodopsin mutações representam cerca de 25-30% de autossômica dominante (ad) casos RP. Entre os mais de 150 rodopsina mutações4 (humano Gene mutação de banco de dados, http:/ www.hgmd.cf.ac.uk/), as mutações de classe II causam a instabilidade estrutural da proteína rodopsina que contribui para a morte de fotorreceptoras de haste e visão perda5,6,7,8. O P23H é a mutação mais frequente de rodopsina na América do Norte, que também é um exemplo típico da classe II rodopsina mutações9,10. Devido à sua inerente instabilidade estrutural, a rodopsina misfolded é acumulada no retículo endoplasmático (ER) em células de mamíferos, Considerando que a rodopsina tipo selvagem está localizada na membrana plasmática5. A rodopsina misfolded P23H exposições mutante dominante citotoxicidade negativa que não é devido a haploinsuficiência, mas está relacionada com a ativação de ER associado via de degradação de proteínas e a organização do segmento externo haste interrompido. Para aliviar o stress de células fotorreceptoras haste, uma estratégia é estabilizar o dobramento nativo da rodopsina mutante usando um acompanhante farmacológico.
Para atingir este objetivo, realizamos uma tela de alta produtividade baseada em célula (HTSs)11,12,13 usando um ensaio de complementação do fragmento de β-galactosidase para quantificar o mutante de rodopsina P23H transportado no plasma membrana. O protocolo robusto e simples deste ensaio HTS permitiu-nos explorar as atividades de cerca de 79.000 pequenas moléculas para cada tela. No entanto, porque este ensaio HTS lê sinais de luminescência, falsos positivos incluindo os inibidores de β-gal, compostos coloridos ou citotóxicos constam da lista à espera de ser identificado por um ensaio secundário.
O tradicional imunocoloração e métodos da imagem latente de fluorescência tenham usados por anos para estudar o transporte de rodopsina em células de mamíferos5,14,15,16. No entanto, estes métodos convencionais não podem ser usados para quantificar os efeitos farmacológicos de mais de 10 compostos para transporte de rodopsina, porque uma análise confiável de imagem requer um grande número de imagens tiradas sob uma condição altamente consistente, que é não alteráveis pelos métodos convencionais de imagem. Aqui, nós desenvolvemos um protocolo de imagem de alto teor de imunocoloração com base como um ensaio secundário para quantificar o transporte de superfície de célula de misfolded rodopsina mutantes11,13,17. Para rotular rodopsina na membrana plasmática, passámos a etapa de permeabilização da membrana celular e immunostained os mutantes rodopsina por um anticorpo monoclonal (B6-30) antirodopsina reconhecendo o epítopo do N-terminal da rodopsina ao lado extracelular da célula membrana de18. Para visualizar o rhodopsin mutante na célula inteira, nós fundidos rodopsina com a proteína de fluorescência de Venus. Pela quantificação das intensidades de fluorescência em canais de fluorescência diferentes, somos capazes de obter vários parâmetros de uma única experiência, incluindo a intensidade total rodopsina na célula inteira, na superfície da célula e a proporção de fluorescência de rodopsina na superfície da pilha, para que, na célula inteira. Aplicando esse método stable células expressando um total de seis mutantes de misfolded rodopsina, podemos gerar um perfil farmacológico de várias pequenas moléculas chaperones para esses mutantes. Neste protocolo, todas as células são immunostained em uma placa de 384 em fotografaram usando um sistema automatizado de imagens sob uma condição altamente consistente da imagem latente. Uma análise da imagem é realizada para cada poço, contendo imagens de mais de 600 células para reduzir a variação devido à heterogeneidade das células com diferentes a nível de expressão de forma e proteína de célula. O fluxo de trabalho do presente protocolo é resumido na Figura 1. A vantagem deste método é que obtemos imagens de alta resolução, bem como quantificações multi-parâmetros da análise baseada em imagem. Em geral, este protocolo pode ser modificado e aplicado para quantificar o transporte de qualquer membrana misfolded proteínas de interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Nota: O rodopsina transporte ensaio.
1. preparação e cultura de células
- Reviva a crio-preservados U2OS estáveis celulas que expressam o tipo selvagem (WT) ou proteínas de fusão de rodopsina-Venus rato mutante. Descongele as células a 37 ° C, até que somente os cristais de gelo pequenos são deixados no frasco.
Nota: As células U2OS são utilizadas neste protocolo porque não há nenhuma linhagem de células fotorreceptoras disponível para estudos em vitro e pre-ciliar biossíntese de rodopsina é regulada por mecanismos moleculares similares em células de mamíferos. Além disso, as células U2OS anexar firmemente a parte inferior da placa e tem grandes corpos celulares, então eles são ideais para o ensaio de transporte rodopsina. Sete U2OS estáveis células expressando o WT T4R, P23H, P53R, C110Y, D190N e P267L os mutantes rodopsina são utilizados aqui como um exemplo para mostrar a qualidade e a confiabilidade do ensaio. Células estáveis expressando outros mutantes de rodopsina ou outras proteínas de membrana podem ser usadas, dependendo do objetivo do ensaio. Células estáveis, expressando a rodopsina humana podem ser usadas neste ensaio, se disponível. A rodopsina rato foi usada aqui porque mouse e proteínas rodopsina humana compartilham homologia de 95%, e os compostos identificados por este ensaio será testado na vivo usando um modelo de rato adRP carregando a rodopsina P23H mutação8. As células estáveis foram geradas conforme descrito anteriormente,19. A WT e mutante rodopsina transcrições foram quantificadas por q-PCR, e os clones de células estáveis expressando níveis semelhantes de WT e mutante rodopsina transcrições foram selecionados para este ensaio. A expressão de proteínas de rodopsina foi confirmada por immunoblot e imunocoloração. A passagem de células utilizadas neste ensaio deve ser inferior a 20. - Transferi cada linha de células para um tubo cônico de 15 mL contendo 10 mL do meio de crescimento (glicose alta Dulbecco modificado do águia meio (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 5 µ g/mL Plasmocin).
- Centrifugar o tubo a 200 x g por 5 min. descartar o sobrenadante e ressuspender as células com 5 mL de meio de crescimento celular para cada linha de celular. Cada linha de suspensão de células de transferência em um prato de cultura de tecidos de 60mm e incubar a 37 ° C com 5% de CO2.
- As células quando o prato de cultura de tecidos atinge 90% confluência como descritas na referência12de subcultura.
2. células em 5.000 células por poço de semeadura
Nota: Execute os procedimentos a seguir em uma capa de cultura de tecidos.
- Trate a placa com poli-lisina.
- Um dia antes da semeadura das células, tratar de uma parede de preto e limpar a placa de 384-poço fundo com 20 µ l/poço de solução de poli-lisina por 30 min.
- Aspire o líquido e permitir que todos os poços secar por 1 h. colocar de volta a tampa da placa e armazenar a placa a 4 ° C durante a noite para a propagação de célula.
- Prepare a suspensão de eritrócitos.
- Cultura de cada linhagem de células em meio de crescimento em um prato de cultura de tecidos de 100 mm até confluência de 90%.
- Lavar cada prato com solução salina tamponada fosfato (PBS) e separar as células com 1 mL de 0.05% tripsina a 37 ° C.
- Resuspenda cada linha de células em 10 mL do meio de ensaio (alta-glicose DMEM com 10% FBS, 100 unidades/mL penicilina e estreptomicina 100 μg/mL).
- Contar as células e diluir cada linha de células para 1,25 x 105 células/mL com o doseamento.
- As células da semente.
- Use uma pipeta multicanal eletrônica ou um dispensador de reagente automatizado para dispensar a 40 µ l/poço de suspensão de células para três colunas por linha celular e preenchimento colunas 1-21 da placa de 384 (Figura 2).
- Adicionar 40 µ l/poço de U2OS (P23H-Rhodopsin-Vênus) para colunas 22-23 e 40 µ l/poço de U2OS (rodopsina-Venus) a coluna 24, como controles.
- Centrifugue a placa a 300 x g durante 30 s para derrubar todas as células para o fundo da placa a 384.
Nota: Evite choque físico a placa após a semeadura da célula. Caso contrário, as células serão esmagadas para um canto de cada poço, e a placa não será adequada para a imagem latente de alto teor. - Incube a placa de 384 a 37 ° C com 5% de CO2 para 3h para as células anexar a parte inferior da placa.
3. tratando as células com compostos
- Gere um mapa de placa com condições de tratamento, como mostrado na Figura 2.
- Prepare 300 µ l de 5 x soluções de trabalho de até 15 compostos em uma placa de 96 poços.
- Dilua o cps 1 a 15 com o doseamento de cinco vezes de suas concentrações finais de 96-poço em poços A1 para G2 da placa (Figura 2A). Adicione 300 µ l de doseamento em H2 bem.
Nota: A concentração final de cada composto é usada na concentração mais eficaz para resgatar o transporte de rodopsina a P23H pela HTS12,13. - Adicione 100 µ l por alvéolo de 2% de Dimetilsulfóxido (DMSO) e 25 µM 9 -cis-retinal que são diluídas no meio do ensaio de colunas 11 e 12, respectivamente. Adicionar 9 -cis-retinal com pouca luz.
- Dilua o cps 1 a 15 com o doseamento de cinco vezes de suas concentrações finais de 96-poço em poços A1 para G2 da placa (Figura 2A). Adicione 300 µ l de doseamento em H2 bem.
- Adicionar 10 µ l por alvéolo de 5x trabalhar soluções para a placa de 384 cultivadas com as células (Figura 2B).
- Use uma pipeta multicanal eletrônica para adicionar compostos 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 e 15 linhas A, C, E, G, eu, K, M e O de colunas 1 a 21 (Figura 2). Adicionar compostos 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 e M para linhas B, D, F, H, J, L, N e P de colunas 1 a 21.
- Adicione 10 µ l por alvéolo de 2% DMSO para colunas 22 e 24. Adicionar 10 µ l por alvéolo de 25 µM 9 -cis-retinal a coluna 23.
Nota: DMSO é usado como um controle do veículo, porque todos os compostos são inicialmente dissolvidos em DMSO como estoques. Coluna 22 contendo DMSO Tratado células expressando o P23H rodopsina é usada como o controle de 0%. 9 -Cis-retinais células tratadas expressando a rodopsina P23H é usado como o controle de 100%.
- Cobrir a placa de 384 com folha de alumínio e incubar a placa a 37 ° C por 24 h.
4. imunocoloração sem permeabilização da membrana para manchar a rodopsina proteína na superfície das células.
Nota: Evite qualquer detergente no processo inteiro de imunocoloração para manter a membrana celular intacta.
- Preparar o paraformaldeído 4% (PFA) diluindo os 16% PFA com PBS em uma relação de volume de 1:4 em uma coifa de química. A 4% de transferência PFA em um reservatório de reagente.
- Retire a placa de 384 em um quarto escuro com pouca luz vermelha. Use um aspirador de 8 canais ligado a uma garrafa de vácuo coleção para aspirar delicadamente o meio. Usar uma pipeta multicanal eletrônica para adicionar 20 µ l por bem preparadas 4% PFA para a placa inteira de 384 e incubar durante 20 min à temperatura ambiente. Para evitar o desprendimento de células, aponte sempre as dicas do aspirador para o mesmo lado de cada poço durante as aspirações. Não toque na área de meio fundo de cada poço. Quando a tomada de imagens, selecione campos para evitar a região tocada pelo aspirador. Para incubação do mais de 10min, cobrir a placa de 384 com a tampa para evitar evaporação.
Nota: As células são fixos em um quarto escuro para evitar fotobranqueamento do isorhodopsin regenerada que afetará o resultado do controle de 100%. Após a fixação da placa de 384 pode ser retirada sob luz normal. - Use um aspirador de 8 canais para aspirar o PFA em cada poço e usar uma pipeta multicanal eletrônica para adicionar 50 μL por poço de PBS. Repita mais duas vezes para executar três lavagens com PBS.
Cuidado: Os resíduos líquido contendo PFA são coletado em um frasco tampado e é para ser tratado como um desperdício de químico perigoso após a experiência. - Bloquear as células adicionando 20 µ l por alvéolo de 5% de soro de cabra para a placa inteira de 384 e incubar a temperatura ambiente por 30 min.
- Aspirar o soro de cabra de 5% e adicionar 15 µ l por alvéolo de 20 anticorpo de anti-rodopsina B6-30 alimentação de folhas µ g mL-1 em 1% de soro de cabra para linhas À. Adicionar 15 µ l por alvéolo de 1% de soro de cabra a linha P para o grupo controle somente anticorpo secundário.
- Incube a placa de 384 à temperatura de 90 min ou a 4 ° C durante a noite. Cubra a placa com folha de alumínio para evitar fotobranqueamento do fluorophores 384.
- Lave a placa 3 vezes com 50 μL por poço de PBS.
- Aspire PBS e adicionar 15 µ l por alvéolo de 5 µ g mL-1 de caprinos Cy3 conjugados anti-rato anticorpo IgG. Cobrir a placa de 384 com folha de alumínio e incubar à temperatura ambiente durante 1 h, ou a 4 ° C durante a noite.
- Lave a placa 3 vezes com 50 μL por poço de PBS. Adicione 50 μL por poço de PBS contendo 1 µ g mL-1 Hoechst 33342 manchar núcleos em temperatura ambiente por 15 min.
- Selo da placa de 384 com uma película transparente antes de imagem. Cobrir a placa de 384 com papel alumínio e armazene a 4 ° C por até uma semana se imagens são tomadas imediatamente.
5.. de imagem
Nota: Este procedimento de imagem de alto teor é adaptado para o sistema de imagens constantes da Tabela do Material. Os procedimentos podem ser diferentes se usando outros sistemas de imagem de alto teor.
- Retire a tampa e colocar a placa de 384 o tonalizador de alto teor com A1 posicionado no canto superior esquerdo da placa.
- Abra o software de aquisição de imagem para configurar parâmetros para aquisição de imagens.
- Abra a janela de configuração de aquisição de placa e criar nova configuração ou carregar um arquivo de configuração existente.
- Selecione o objetivo de 20x e configurar pixel binning como 2, então o tamanho do pixel calibrado é 0,80 x 0,80 µm. definir as linhas de varredura como 2.000 e o tamanho da imagem (W x H) como 1.000 x 1.000 pixels (800,00 x 800,00 µm) por site.
- Selecione o tipo de chapa a ser fotografada. Use as informações fornecidas pelo fabricante da placa de 384-bem para preencher as dimensões da placa.
- Selecione os poços para criação da imagem para a placa de 384.
- Selecione quatro sites para ser fotografada por bem. Evite o lado do bem tocado pelas pontas de aspiração.
- Selecione lasers de excitação como 405, 561 e 488 nm. Selecione Filtros de emissão para canais DAPI, FITC e Texas Red. Otimizar a potência do laser e os ganhos de cada canal para garantir o brilho das imagens tiradas dos poços de controle positivo são inferiores ao limiar de saturação.
- Selecione o foco a bem para focagem automática. Selecione o primeiro poço que adquiriu como o inicial bem para encontrar amostras. Definir o local autofocus para todos os sites.
- Selecione as quatro médias por linha para cada canal. Otimize o valor de Z-deslocamento para cada canal.
- Teste 2-3 poços nos cantos diagonais da placa bem 384 para certificar-se de que as imagens estão em foco para todos os poços testados, imagens de todos os sites por alvéolo têm células com mais de 40% de confluência e intensidades de fluorescência de todos os canais são cerca de metade saturada em 100% controle de poços.
- Salve o método de aquisição de imagem.
- Execute o prato inteiro. Cuidado com a câmera até que termine a captura de imagens da primeira coluna da placa para verificar a qualidade da imagem antes de deixar a câmera. Retire a placa de 384 e armazenar a 4 ° C para uso futuro.
Nota: Dependendo do número de sites seleccionados por bem e os canais de tomadas, demora 40 min até 3 h para terminar a imagem de uma placa de 384.
6. imagem análise.
- Pull dos dados de imagem usando um software de análise de imagem de alto teor. Selecione um dos poços para configurar parâmetros de controle de 100% (coluna, 23).
- Selecione o Comprimento de onda multi célula marcando como método de análise e começar a configurar as configurações.
- Defina os núcleos usando imagens do canal DAPI. Visualização para certificar-se de que as formas de núcleos definidos no selecionado bem se encaixa bem com as imagens de núcleos.
- Defina a forma da célula no canal FITC onde rodopsina-Venus é fotografada.
- Defina as áreas de superfície mancha de célula rodopsina no canal vermelho Texas.
- Teste o algoritmo atual em 5 poços para determinar se as configurações são otimizadas. Salvar as configurações e fechar a janela de configuração .
- Execute todos os poços com o método de análise otimizada.
- Exporte o Objeto número como número de célula intacta. Exporte a Intensidade média do canal FITC como intensidade Rhodopsin-Venus (rodopsina-Venus INT). Exporte a Intensidade média do canal vermelho Texas como intensidade de rodopsina na superfície das células (rodopsina INT na superfície das células).
- Abra os dados exportados em um software de planilha eletrônica. Divida a intensidade de rodopsina na superfície das células pela rodopsina-Venus INT como razão para MEM-total. Calcular o Z'-fatores para cada parâmetro para avaliar a qualidade do ensaio. Z′ = 1−3X (STDcontrolar 100%+STD0% controle) / | 100% controle−Meancontrole 0%|.
Nota: Um Z'-fator maior do que 0 indica um ensaio moderado suficiente para uma tela de alto teor e um Z' fator entre 0,5 e 1 sugere um excelente ensaio exigido para uma tela de alta produtividade de20,21. - Use o software de planilha para gerar um mapa de calor de duas cores para cada parâmetro. Organize o nome de linhas celulares no eixo x e os compostos no eixo y.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Caracteriza-se o transporte de rodopsina com três parâmetros: a intensidade da rodopsina-Venus na célula inteira (INT Rhodopsin-Venus), a intensidade de imunocoloração de rodopsina na membrana plasmática (rodopsina INT na superfície da célula) e a proporção de rodopsina mancha na superfície da célula, a intensidade de rodopsina-Venus na célula inteira (proporção de MEM-Total). Um resultado representativo do ensaio transporte rodopsina é mostrado na Figura 3 e Figura 4. Usando DMSO e 9 -cis-retinal tratados células expressando o P23H-rodopsina-Vênus como o 0 e controles de 100%, respectivamente, o Z'-fatores para estes três parâmetros são na faixa entre 0 a 0,5, sugerindo que o ensaio tem qualidade moderada, suficiente para geração de imagens de alto teor21. Apesar da Z otimizado '-fatores são inferiores a 0,5 devido seus procedimentos relativamente complexos, comparados a um ensaio do HTS, este ensaio ainda é robusto e confiável para uma análise baseada em imagem. Um composto ativo que resgata uma rodopsina misfolded deve mostrar valores mais elevados de rodopsina INT na superfície da célula e relação de MEM-Total de DMSO, com um valor de P inferior a 0,05. Três mapas de calor 2-D foram gerados a partir destes três parâmetros para comparar a quantidade média de rodopsina e localização por célula (Figura 4). Repetido em triplica, WT e seis mutantes rodopsina estão listados na horizontal, e os efeitos dos tratamentos compostos são comparados verticalmente. De acordo com estudos anteriores, a rodopsina INT na superfície da célula e a proporção de MEM-Total de são mais baixas para os seis mutantes em comparação com a rodopsina WT tratada com DMSO (Figura 4)5,22,23. Aumentam a rodopsina INT na superfície da célula e sua proporção para MEM-Total 9 -cis-retinal tratamento para a T4R, P23H, D190N e P267L, mas não os mutantes P53R ou C110Y, sugerindo que 9 -cis-retinal resgata o transporte do T4R, P23H, D190N e P267L os mutantes rodopsina. Todos o cps mostrou níveis variados de aumento na rodopsina INT na superfície das células de T4R, P23H e D190N. CPS-3, 4, 5, 7, 8 e 11 aumentou a rodopsina-Venus INT mas não a relação de MEM-ao Total desses mutantes rodopsina, sugerindo que estes compostos só aumentaram a quantidade de rodopsina. CPS 1, 2-6 e 9 aumentou significativamente a proporção de MEM-ao Total de mutantes de rodopsina T4R, P23H, D190N e P267L, sugerindo que estes compostos resgatar o transporte destes mutantes rodopsina a membrana plasmática. Os perfis 2D fornecem uma visão abrangente de transporte rodopsina afetado por estas mutações adRP associado que são atenuadas pelo tratamento farmacológico diferente.
Figura 1: O fluxo de trabalho do ensaio transporte rodopsina. Procedimentos de coloração da superfície celular de rodopsina sem permeabilização da membrana para o ensaio de transporte rodopsina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: ilustrações para a preparação de 5 x soluções de trabalho e a transferência de líquidos da placa de 96 poços para a placa de 384. (A) o layout da placa de 96 poços do 5 x soluções de trabalho. A1 de poços para G2 tem 300 µ l por alvéolo de até 15 5 x soluções de trabalho e doseamento (M), conforme ilustrado nas colunas 1 e 2. Compostos de 14 e 15 são 2% DMSO e 25 µM 9 -cis-retinal, respectivamente, para o tratamento das linhas de sete células expressando WT e mutante rodopsina. Além disso, colunas 11 e 12 têm 100 µ l por alvéolo de 2% DMSO e 25 µM 9 -cis-retinal controla, respectivamente, tratados com as células expressando a rodopsina P23H para o cálculo de Z'-fatores. (B) o layout de placa 384 para condições de tratamento e o tipo de célula. As células de U2OS, expressando o WT T4R, P23H, P53R, C110Y, D190N e P267L rodopsina-Venus são semeados conforme ilustrado. Condições de tratamento são rotuladas em azul. Dicas-de-rosa e azuis demonstram a transferência de líquidos para bem da placa de 96 poços à placa 384 usando uma pipeta multicanal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: imagens representativas e quantificações para os controles do ensaio transporte rodopsina. (A) fluorescência Venus (verde) e célula superfície immunostaining (vermelho) de células U2OS, expressando WT ou P23H rodopsina-Venus tratadocom com DMSO ou 5 µM 9 -cis-retinal. Barra de escala = 200 µm. (B) A coluna enredo de média intensidade de Venus por célula que representa a quantidade de rodopsina na célula inteira (rodopsina-Venus INT). p< 0,0001. Z'-fator é mostrado sob a linha preta. Barra de erro e o valor de coluna são a média e desvio-padrão (S.D.) de 16 repetições, respectivamente. Lote de coluna (C) um de dizer intensidade Cy3 por célula que representa a rodopsina manchada na superfície das células (rodopsina INT na superfície das células). (D) um lote de coluna da relação de intensidade cy3 média por célula significa intensidade de Venus por célula que representa a razão do nível de rodopsina na superfície da célula ao seu nível de célula inteira (relação de MEM-total). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: uma análise de alto teor representativa do ensaio transporte rodopsina mostrado mapas de calor como 2-cor. (A) o mapa de calor de significa intensidade de Venus por célula que representa o nível de células inteiras rodopsina (rodopsina-Venus INT). Cada bloco representa um ponto de dados e cada condição foi testada em triplicado. A lenda de cor é mostrada à esquerda. CP, composto. (B) o mapa de calor de dizer intensidade Cy3 por célula que representa a rodopsina manchada na superfície das células (rodopsina INT na superfície das células). (C) o mapa de calor da média intensidade Cy3 por célula da média intensidade de Venus por célula que representa a razão do nível de rodopsina na superfície da célula ao seu nível de célula inteira (relação de MEM-total). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aqui, nós mostramos um ensaio de alto teor de imagem usado para caracterizar sucessos identificados de um HTS A automação única envolvido nestes protocolos é o gerador de imagens de alto teor. A imunocoloração e imagem latente de fluorescência da rodopsina têm sido utilizados comumente para caracterizar a localização de rodopsina5,14,15,16. No entanto, a quantificação das imagens captadas pelos métodos tradicionais de imagem é limitada pela falta de imagens de células suficientes por condição, baixa capacidade de imagens por experiência e a falta de um parâmetro de controle de qualidade. Nós adaptou o protocolo tradicional imunocoloração para o formato de 384-bem e substituiu a tradicional imagem com alto teor imagem. Usando este protocolo de imagem de alto teor, conseguimos selecionado e caracteriza as atividades de hits, identificados por um HTS11,13,17. Comparado com o tradicional imunocoloração e métodos de imagem, este protocolo aumentou significativamente a consistência das condições de imagem, imagem de capacidade e poder de análise de imagem, o que permitiu comparar quantitativamente os efeitos farmacológicos de 11 compostos para o transporte de seis adRP associaram mutantes rodopsina.
As principais mudanças do presente protocolo em relação aos protocolos usados anteriormente para rodopsina imunocoloração e imagem são: (1) células crescendo e imunocoloração em uma placa de 384-bem claro-fundo; (2) imagens células usando um gerador de imagens de alto teor; e (3) analisando dados com um software de análise de imagem de alto teor. Devido a estas alterações, uma otimização inicial é necessária para encontrar o melhor número de semeadura de células, as concentrações de anticorpos, condições de imagem e algoritmos de análise de imagem.
Os passos críticos do protocolo incluem: (1) propagação de células que permitem que a confluência de 50-70% antes de fixação; (2) aspirações cuidadosos para evitar o desprendimento de células; (2) vários poços de imagem em toda a placa inteira para certificar-se de imagens estão em foco e fluorescem de todos os canais não exceda metade do limiar do tonalizador para os poços de controlo positivo antes de imagem a placa inteira; e (3) mantendo o Z'-fator maior do que 0 para garantir a confiabilidade do ensaio.
Os problemas mais comuns que podem ser encontrados para este protocolo são desprendimento celular e baixa Z'-fatores. Para evitar o problema primeiro, pré-tratamento a 384-placa com poli-L-lisina para facilitar a fixação da célula e evitar o uso de linhas celulares que separar facilmente como as células Hek293. Além disso, limite a ponta de aspiração para tocar apenas um lado de cada poço durante a aspiração e selecione o outro lado de cada bem para a imagem latente. Para melhorar o Z'-fator e a qualidade do ensaio, otimizar a célula de semeadura a imagem e o número de parâmetros de análise para certificar-se de que a célula forma ou a forma de núcleos definida pelo software se encaixa bem com cada objeto em cada canal de fluorescência.
Em comparação com outros métodos para quantificar o transporte rodopsina, tais como um ELISA de superfície celular, ou um ensaio de complementação de fragmento de β-galactosidase, que calculam o nível de proteína alvo na superfície das células em todas as células, este método de imagem de alto teor quantifica nível de proteína média por célula; e, esta característica única evita um fator crítico de variação, o número do celular que afeta as leituras finais em outros métodos. Além disso, devido ao grande número de células fotografado e quantificada pelo método de imagem de alto teor, os parâmetros média de todas as células por bem mostrou baixa variação entre repetições, aumentando assim a confiabilidade do ensaio.
Uma limitação do presente protocolo é que eles não são os melhores ensaios para HTS, devido ao seu procedimento relativamente complicado e a 2 h por placa de imagem tempo. Assim, recomendamos ensaios alternativos repórter para grandes bibliotecas da pequeno-molécula com mais de 5.000 compostos da seleção e usar este protocolo de imagem de alto teor para ensaios de caracterização foco limitados a menos de 100 compostos. A segunda limitação do presente protocolo é a falta de padrões para mostrar se a fluorescência de Venus ou as intensidades de fluorescência immunostaining são em uma correlação linear com a quantidade de quantidade de proteína rodopsina por célula. Para evitar saturação por imunocoloração, recomendamos que teste e traçando as intensidades de imunocoloração das células incubadas com diferentes concentrações de anticorpos primários e secundários. Selecione as concentrações de anticorpos dentro da escala linear da mudança de florescimento.
Expansão do aplicativo atual, irá quantificar transporte rodopsina de imagens de células transfectadas transitoriamente com 28 mutantes diferentes rodopsina sob tratamento com até 10 compostos para gerar um banco de dados farmacológico destes compostos dos atividade de orientação de potenciais tratamentos para pacientes adRP carregando essas mutações rodopsina. Este protocolo também pode ser facilmente adaptado para os ensaios de translocação de qualquer proteína de membrana de interesse que serão úteis para descobertas de drogas de outras doenças de enrolamento de proteínas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos o Dr. Mark E. Schurdak e Universidade de Pittsburgh Drug Discovery Institute para fornecer o sistema de imagem de alto teor e treinamentos iniciais. Dr. Krzysztof Palczewski (Case Western Reserve University) generosamente compartilhados B630 antianticorpos rodopsina e 4 a 1. O plasmídeo contendo o cDNA do rato rodopsina-Venus construção foi partilhado pelo Dr. Nevin Lambert (Universidade de Augusta). Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de saúde grant EY024992 YC e P30EY008098 de grant do núcleo de pesquisa de visão de Universidade de Pittsburgh.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| U2OS (rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (T4R-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P23H-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P53R-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (C110Y-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (D190N-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P267L-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| DMEM high glucose | Genesee Scientific | 25-500 | With L-Glutamine, sodium pyruvate |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16140071 | Heat inactivated |
| Plasmocin | InvivoGen | ant-mpt | Mycoplasma elimination reagent |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Gibco | 15140122 | 100X concentrated antibiotic solutions to prevent bacteria contamination of cell cultures |
| Trypsin-EDTA | Genesee Scientific | 25-510 | 0.25%, 1mM EDTA in HBSS without calcium and magnesium |
| Poly-L-lysine solution | Sigma-Aldrich | P4707-50ML | Mol wt 70,000-150,000, 0.01%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| CellCarrier-384 Ultra Microplates | PerkinElmer | 6057300 | 384-well tissue culutre-treated microplates with black well walls and an optically -clear cyclic olefin bottom for imaging cells in high content analysis |
| Sterile 96-well plate | Eppendorf | 30730119 | Tissue culture treated with lid flat bottom, sterile, free of detectable pyrogens, Rnase, DNase and DNA. Non-cytotoxic |
| Phosphate Buffered Sailine (PBS) | Invitrogen | AM9625 | 10 x PBS Buffer, pH 7.4 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D4540 | >99.5%, cell culture tested |
| 9-cis-retinal | Sigma-Aldrich | R5754 | |
| Compounds tested | Selleckchem/Life Chemicals/Custom synthesized | NA | Compounds were purchased from different vendors or custom synthesized |
| B6-30 anti-rhodopsin antibody | Novus | NBP2-25160 | Gift from Dr. Krzysztof Palczewski |
| Cy3-conjugated goat anti-mouse secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc | 115-165-146 | |
| 16% paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Methanol-free |
| 10% Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 50062Z | Blocking buffer |
| Hoechst 33342, Trihydroch | Invitrogen | H3570 | Nuclear staining solution |
| High-content imager | Molecular Devices | ImageXpress | ImageXpress® Micro Confocal High-Content Imaging System |
| MetaXpress high-content image acquisition and analysis software | Molecular Devices | MetaXpress | High-content image acquisition and analysis software |
| Multichannel pipette (0.5-10 µL) | Rainin | 17013802 | Manual 8-channel pipette, 0.5-10 µL |
| Multichannel pipette (0.5-10c | Rainin | 17013805 | Manual 8-channel pipette, 20-200 µL |
| Electronic multichannel pipette (10-200 μL) | Thermo Scientific | 14-3879-56BT | Electronic multichanenel pipette for 96- and 384-well microplate pipetting tasks |
| 50ml Reagent Reservoir | Genesee Scientific | 28-125 | Reagent reservior for multichannel pippte dispensing |
| 8-Channel aspirator | ABC Scientific | EV503 | 8-Channel stainless steel adaptor for aspirating liquids from 96- or 384-well plates |
| Excel spreadsheet software | Microsoft | Excel2016 | The spreadsheet software for data analysis and heatmap generation |
| Origin2018 scientific data analysis and graphing software | OriginLab | Origin2018 | The data analysis software for generating the dose response curves |
References
- Gregersen, N., Bross, P., Vang, S., Christensen, J. H.
- Daiger, S. P., Bowne, S. J., Sullivan, L. S. Perspective on genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Archives of Ophthalmology. 125 (2), 151-158 (2007).
- Daiger, S. P., Sullivan, L. S., Bowne, S. J. Genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Clinical Genetics. 84 (2), 132-141 (2013).
- Stenson, P. D., et al. The Human Gene Mutation Database: towards a comprehensive repository of inherited mutation data for medical research, genetic diagnosis and next-generation sequencing studies. Human Genetics. 136 (6), 665-677 (2017).
- Sung, C. H., Schneider, B. G., Agarwal, N., Papermaster, D. S., Nathans, J. Functional heterogeneity of mutant rhodopsins responsible for autosomal dominant retinitis pigmentosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (19), 8840-8844 (1991).
- Athanasiou, D., et al. The molecular and cellular basis of rhodopsin retinitis pigmentosa reveals potential strategies for therapy. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 1-23 (2018).
- Chiang, W. C., et al. Robust Endoplasmic Reticulum-Associated Degradation of Rhodopsin Precedes Retinal Degeneration. Molecular Neurobiology. 52 (1), 679-695 (2015).
- Sakami, S., et al. Probing mechanisms of photoreceptor degeneration in a new mouse model of the common form of autosomal dominant retinitis pigmentosa due to P23H opsin mutations. Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 10551-10567 (2011).
- Dryja, T. P., et al. Mutations within the rhodopsin gene in patients with autosomal dominant retinitis pigmentosa. New England Journal of Medicine. 323 (19), 1302-1307 (1990).
- Sohocki, M. M., et al. Prevalence of mutations causing retinitis pigmentosa and other inherited retinopathies. Human Mutation. 17 (1), 42-51 (2001).
- Chen, Y., et al. A novel small molecule chaperone of rod opsin and its potential therapy for retinal degeneration. Nature Communications. 9 (1), 1976 (2018).
- Chen, Y., Tang, H. High-throughput screening assays to identify small molecules preventing photoreceptor degeneration caused by the rhodopsin P23H mutation. Methods in Molecular Biology. 1271, 369-390 (2015).
- Chen, Y., et al. A High-Throughput Drug Screening Strategy for Detecting Rhodopsin P23H Mutant Rescue and Degradation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (4), 2553-2567 (2015).
- Noorwez, S. M., et al. Pharmacological chaperone-mediated in vivo folding and stabilization of the P23H-opsin mutant associated with autosomal dominant retinitis pigmentosa. Journal of Biological Chemistry. 278 (16), 14442-14450 (2003).
- Saliba, R. S., Munro, P. M., Luthert, P. J., Cheetham, M. E. The cellular fate of mutant rhodopsin: quality control, degradation and aggresome formation. Journal of Cell Science. 115, 2907-2918 (2002).
- Kaushal, S., Khorana, H. G. Structure and function in rhodopsin. 7. Point mutations associated with autosomal dominant retinitis pigmentosa. Biochemistry. 33 (20), 6121-6128 (1994).
- Chen, Y., Brooks, M. J., Gieser, L., Swaroop, A., Palczewski, K. Transcriptome profiling of NIH3T3 cell lines expressing opsin and the P23H opsin mutant identifies candidate drugs for the treatment of retinitis pigmentosa. Pharmacological Research. 115, 1-13 (2016).
- Adamus, G., et al. Anti-rhodopsin monoclonal antibodies of defined specificity: characterization and application. Vision Research. 31 (1), 17-31 (1991).
- Goodson, H. V., Dzurisin, J. S., Wadsworth, P. Generation of stable cell lines expressing GFP-tubulin and photoactivatable-GFP-tubulin and characterization of clones. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (9), pdb prot5480 (2010).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Bray, M. A., Carpenter, A., et al. Advanced Assay Development Guidelines for Image-Based High Content Screening and Analysis. Assay Guidance Manual. Sittampalam, G. S., et al. , Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. Bethesda (MD). (2004).
- Sung, C. H., Davenport, C. M., Nathans, J. Rhodopsin mutations responsible for autosomal dominant retinitis pigmentosa. Clustering of functional classes along the polypeptide chain. Journal of Biological Chemistry. 268 (35), 26645-26649 (1993).
- Krebs, M. P., et al. Molecular mechanisms of rhodopsin retinitis pigmentosa and the efficacy of pharmacological rescue. Journal of Molecular Biology. 395 (5), 1063-1078 (2010).
