Summary
هنا، يمكننا وصف أسلوب تصوير عالية المحتوى التحديد الكمي لنقل طفرات رودوبسين المرتبطة بالتهاب الشبكية الصباغي. تحليل سجل متعددة-الطول الموجي استخدمت لتحديد كمية البروتين رودوبسين على سطح الخلية أو في الخلية كلها.
Abstract
رودوبسين misfolding الطفرات تؤدي إلى وفاة مستقبله رود أن يتجلى جسمية مهيمنة التهاب الشبكية الصباغي (RP)، متدرجة المسببة للعمى المرض الذي يفتقر إلى العلاج الفعال. نحن افترض أن سيتوتوكسيسيتي متحولة رودوبسين تجمعات يمكن تخفيفها باستقرار عقاقيري البروتين رودوبسين المسخ. الطفرة P23H، بين الطفرات رودوبسين "الثاني فئة" أخرى، يشفر بروتين متحولة رودوبسين هيكلياً غير مستقرة التي تراكمت في هيولى (ER)، بينما رودوبسين نوع البرية تنقل إلى غشاء البلازما في الثدييات الخلايا. نحن سابقا أداء شاشة الفائق على أساس التﻷلؤ (HTS)، وحددت مجموعة من مرافقين الدوائية التي أنقذت بنقل رودوبسين P23H من ER لغشاء البلازما. هنا، باستخدام أسلوب immunostaining متبوعة بتحليل تصوير عالية المحتوى، نحن كمياً مقدار البروتين رودوبسين المسخ في الخلية كلها وفي غشاء البلازما. هذه الطريقة مفيدة وفعالة لتحديد الزيارات الحقيقية من إيجابيات كاذبة عقب HTS. بالإضافة إلى ذلك، تحليل صورة عالية--محتوى مكنتنا من تحديد معلمات متعددة من تجربة واحدة لتقييم الخصائص الدوائية لكل مجمع. باستخدام هذا الفحص، قمنا بتحليل تأثير مركبات مختلفة 11 نحو ستة طفرات رودوبسين RP المرتبطة، الحصول على ملف تعريف دوائية 2-د لفهم الكمية والنوعية عن الاستقرار الهيكلي لهذه المسوخ رودوبسين وفعالية مركبات مختلفة تجاه هذه المسوخ.
Introduction
ويشارك misfolding البروتين في ضمور العضلات، تنكسات العصبية، فضلا عن الأمراض المسببة للعمى، بما في ذلك التهاب الشبكية الصباغي (RP)1. RP تنكس شبكية الموروثة والتدريجي المرتبطة بطفرات في ما يزيد على 60 من الجينات التي تؤثر على وظيفة والتوازن photoreceptors رود أو2،ابيثيليومس المصطبغة الشبكية (الرؤى)3. لا يوجد علاج فعال متوفر حاليا للبرنامج العادي. رودوبسين الطفرات تستأثر بحوالي 25-30% من جسمي المهيمنة (ad) الحالات RP. من بين أكثر من 150 رودوبسين الطفرات4 (الجينات البشرية الطفرة قاعدة، http:/www.hgmd.cf.ac.uk/)، تسبب طفرات "الفئة الثانية" عدم الاستقرار الهيكلي من البروتين رودوبسين يسهم في وفاة مستقبله رود و رؤية فقدان5،6،،من78. P23H هو طفرة رودوبسين الأكثر شيوعاً في أمريكا الشمالية، وأيضا مثال نموذجي "الفئة الثانية" رودوبسين الطفرات9،10. سبب في عدم الاستقرار الهيكلي الكامن، تراكمت رودوبسين تجمعات في هيولى (ER) في خلايا الثدييات، بينما يقع رودوبسين نوع البرية على غشاء البلازما5. رودوبسين تجمعات P23H المعارض متحولة المهيمنة سيتوتوكسيسيتي السلبية التي ليس بسبب هابلوينسوفيسينسي، ولكنه يرتبط بتنشيط ER المرتبطة مسار تدهور البروتين وتنظيم الجزء الخارجي قضبان تمت مقاطعتها. للتخفيف من حدة الإجهاد خلية مستقبله رود، استراتيجية واحدة لتحقيق استقرار الطي أصلي من رهودوبسن متحولة كوصي دوائية باستخدام.
ولتحقيق هذا الهدف، أجرينا12،11،شاشة الفائق المستندة إلى الخلية (هتس)13 استخدام مقايسة تكامل يفتت β-جالاكتوسيداسي للتحديد الكمي للمسخ رودوبسين P23H تنقل على البلازما غشاء. البروتوكول بسيطة وقوية لهذا الإنزيم HTS مكنتنا من استكشاف أنشطة حوالي 79,000 الجزيئات الصغيرة لكل شاشة. ومع ذلك، نظراً لأن هذا الإنزيم HTS يقرأ إشارات التﻷلؤ، المغلوطة بما في ذلك مثبطات بيتا-غال، المركبات الملونة أو السامة للخلايا مدرجة في قائمة انتظار التي تحددها تحليل ثانوي.
إيمونوستينينج التقليدية وأساليب التصوير fluorescence استخدمت لسنوات لدراسة النقل رودوبسين في خلايا الثدييات5،14،،من1516. ومع ذلك، لا يمكن استخدام هذه الأساليب التقليدية لقياس التأثيرات الدوائية أكثر من 10 مركبات نحو النقل رودوبسين لأنه يتطلب إجراء تحليل تصوير موثوق بها عدد كبير من الصور التي اتخذت تحت شرط متسقة عالية، لا تنظيمي بأساليب التصوير التقليدية. هنا، وضعنا بروتوكولا تصوير إيمونوستينينج على أساس محتوى عالية كتحليل ثانوي التحديد الكمي للنقل البري والبحري في خلية رودوبسين تجمعات طفرات11،،من1317. لتسمية رودوبسين في غشاء البلازما، علينا تخطي الخطوة permeabilization غشاء الخلايا وإيمونوستاينيد طفرات رودوبسين من رهودوبسن المضادة (B6-30) [مونوكلونل] الاعتراف حانمه الطرفي ن من رهودوبسن في الجانب خارج الخلية للخلية غشاء18. تصور رودوبسين المسخ في الخلية كلها، نحن تنصهر رودوبسين مع البروتين fluorescence فينوس. بالتحديد الكمي كثافات الأسفار في الأسفار مختلف القنوات، نحن قادرون على الحصول على معلمات متعددة من تجربة واحدة واحدة، بما في ذلك كثافة رودوبسين المجموع في الخلية كلها، على سطح الخلية، ونسبة رودوبسين الأسفار على سطح الخلية لأن في كل خلية. تطبيق هذا الأسلوب باستقرار الخلايا معربا عن ما مجموعة ستة تجمعات رودوبسين طفرات، أننا يمكن أن تولد لمحة دوائية لمرافقين جزيء صغيرة متعددة تجاه هذه المسوخ. في هذا البروتوكول، كافة الخلايا إيمونوستينيد في صفيحة 384-جيدا وتصويرها باستخدام نظام تصوير تحت شرط تصوير عالية متسقة. يتم إجراء تحليل صورة لكل بئر، التي تحتوي على صور لأكثر من 600 من الخلايا لتقليل التباين بسبب عدم تجانس الخلايا مع تفاوت مستوى التعبير الشكل والبروتين في الخلية. ويرد في الشكل 1سير العمل لهذا البروتوكول. وميزة هذا الأسلوب أن نحصل على صور عالية الدقة، فضلا عن كوانتيفيكيشنز معلمة متعددة من التحليل القائم على الصورة. بشكل عام، يمكن تعديل هذا البروتوكول وتطبيق على التحديد الكمي لنقل أي بروتين غشائي تجمعات للفائدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: تحليل النقل رودوبسين.
1-إعداد والثقافة للخلايا
- أحياء المحافظة cryo U2OS مستقرة الخلايا يعبر عن نوع البرية (WT) أو الماوس متحولة رودوبسين-فينوس الانصهار البروتينات. ذوبان الجليد في الخلايا عند 37 درجة مئوية حتى يتم ترك بلورات الثلج الصغيرة فقط في القنينة.
ملاحظة: يتم استخدام الخلايا U2OS في هذا البروتوكول لأنه لا تتوفر أي خط خلية مستقبله للدراسات في المختبر ، والتركيب الحيوي قبل الهدبية من رهودوبسن وينظم آليات جزيئية مماثلة في خلايا الثدييات. بالإضافة إلى ذلك، الخلايا U2OS إرفاق مشددة على الجزء السفلي من اللوحة ولديها هيئات خلية كبيرة، ولذلك مثالية للفحص النقل رودوبسين. سبع خلايا مستقرة U2OS التعبير عن وزن، T4R، P23H، P53R، C110Y، D190N و P267L من طفرات رودوبسين تستخدم هنا كمثال لإظهار نوعية وموثوقية المقايسة. يمكن استخدام خلايا مستقرة يعبر عن طفرات أخرى رودوبسين أو غيرها من البروتينات الغشاء، اعتماداً على الهدف المتمثل المقايسة. يمكن استخدام خلايا مستقرة معربا عن رودوبسين البشرية في هذا التحليل إذا كانت متوفرة. رودوبسين الماوس استخدم هنا لأن الماوس والبروتينات البشرية رودوبسين حصة 95 ٪ التماثل، والمركبات حددها هذا التحليل سيتم اختبارها في فيفو باستخدام نموذج أدرب ماوس يحمل رودوبسين P23H الطفرة8. وقد تولدت الخلايا مستقرة كما هو موضح سابقا19. WT والمستنسخات رودوبسين المسخ كانت كمياً فاء-بكر، واستنساخ خلايا مستقرة معربا عن مستويات مماثلة من وزن والمستنسخات رودوبسين متحولة اختيرت لهذا التحليل. وأكد التعبير عن البروتينات رودوبسين إيمونوبلوت وإيمونوستينينج. مرور الخلايا المستخدمة في هذا التحليل ينبغي أن يكون أقل من 20. - تحويل كل خط من الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي على 10 مل متوسط النمو (الجلوكوز عالية دولبيكو تعديل النسر المتوسطة (دميم) مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS) و 5 ميكروغرام/مل بلاسموسين).
- الطرد المركزي الأنبوب في 200 x ز لأدنى 5 تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه الخلية مع 5 مل من الخلية النمو المتوسط لكل خط الخلية. نقل كل سطر من تعليق خلية في طبق استنبات الأنسجة 60 ملم واحتضان في 37 درجة مئوية مع شركة 5%2.
- ثقافة فرعية الخلايا عندما طبق استنبات الأنسجة تصل إلى التقاء 90% المبين في المرجع12.
2-زرع الخلايا في الخلايا 5,000 كل بئر
ملاحظة: تنفيذ الإجراءات التالية في غطاء زراعة الأنسجة.
- التعامل مع اللوحة مع بولي-يسين.
- يوم واحد قبل البذر في الخلايا، وعلاج أسود-جدار ومسح أسفل لوحة 384-جيدا مع 20 ميليلتر/جيدا لحل بولي-يسين لمدة 30 دقيقة.
- نضح السائل والسماح لجميع الآبار الجافة حاء 1 إعادة وضع غطاء لوحة وتخزين اللوحة عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها لبذر الخلية.
- إعداد تعليق خلية.
- الثقافة كل خط الخلية في متوسط النمو في طبق استنبات الأنسجة 100 ملم حتى التقاء 90%.
- أغسل كل صحن مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) وفصل الخلايا مع 1 مل من 0.05% التربسين عند 37 درجة مئوية.
- ريسوسبيند كل سطر من الخلايا في 10 مل من مقايسة المتوسطة (دميم عالية-الجلوكوز مع 10% FBS و 100 وحدة/مل البنسلين والستربتوميسين 100 ميكروغرام/مل).
- عد الخلايا وتمييع كل سطر من الخلايا إلى 1.25 × 105 خلايا/مل مع المتوسطة المقايسة.
- بذور الخلايا.
- استخدم ماصة متعددة القنوات إلكترونية أو موزع كاشف الآلي للاستغناء عن 40 ميكروليتر/جيدا من تعليق خلية للأعمدة الثلاثة لكل خط الخلية وتعبئة الأعمدة 1-21 من لوحة 384-جيدا (الشكل 2).
- إضافة 40 ميكروليتر/بئر U2OS (P23H-رودوبسين-فينوس) للأعمدة 22-23 ومن U2OS 40 ميكروليتر/جيدا (رودوبسين-فينوس) لعمود 24، كعناصر تحكم.
- الطرد المركزي اللوحة في 300 x ز لمدة 30 ثانية لإسقاط كافة الخلايا الموجودة على الجزء السفلي من لوحة 384-جيدا.
ملاحظة: تجنب الصدمة الجسدية اللوحة بعد البذر الخلية. خلاف ذلك، سوف تسحق الخلايا إلى زاوية واحدة لكل بئر، واللوحة لن تكون مناسبة لتصوير عالية-المحتوى. - احتضان لوحة 384-جيدا في 37 درجة مئوية مع 5% CO2 ل 3 ح للخلايا التي تعلق على الجزء السفلي من اللوحة.
3-علاج الخلايا التي تحتوي على مركبات
- إنشاء مخطط لوحة مع ظروف المعاملة كما هو مبين في الشكل 2.
- إعداد 300 ميليلتر من 5 × حلول عمل مركبات تصل إلى 15 في لوحة 96-جيدا.
- تخفف من 1 إلى 15 من قانون العقوبات السويسري مع المتوسط المقايسة إلى لوحة خمس مرات على تركيزات نهائية في الآبار A1 إلى G2 96-البئر (الشكل 2A). إضافة 300 ميليلتر للمقايسة المتوسطة في H2 جيدا.
ملاحظة: يستخدم التركيز النهائي لكل مجمع في تركيز الأكثر فعالية لإنقاذ نقل رودوبسين P23H12،HTS13. - إضافة 100 ميليلتر الواحدة من 2% ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) جيدا وميكرومتر 25 9-رابطة الدول المستقلة-الشبكية التي هي إضعاف المتوسط المقايسة إلى أعمدة 11 و 12، على التوالي. إضافة 9-رابطة الدول المستقلة-الشبكية في الضوء الخافت.
- تخفف من 1 إلى 15 من قانون العقوبات السويسري مع المتوسط المقايسة إلى لوحة خمس مرات على تركيزات نهائية في الآبار A1 إلى G2 96-البئر (الشكل 2A). إضافة 300 ميليلتر للمقايسة المتوسطة في H2 جيدا.
- إضافة 10 ميليلتر كل بئر 5 × تعمل حلول للوحة 384-جيدا مثقف مع الخلايا (الشكل 2).
- استخدام ماصة متعدد القنوات إلكترونية إضافة مركبات 1 و 3، 5، 7، 9، 11، 13 و 15 إلى صفوف أ ج، ه، ز، أنا، ك، م ويا من الأعمدة 1 إلى 21 (الشكل 2). إضافة مركبات 2، 4، 6، 8، 10، 12، 14 وم للصفوف ب ود، و، ح، ي، ل، ن، وف من الأعمدة 1 إلى 21.
- إضافة 10 ميليلتر الواحدة من 2% [دمس] جيدا للأعمدة 22 و 24. إضافة 10 ميليلتر كل بئر من 25 ميكرومتر 9-رابطة الدول المستقلة-الشبكية للعمود 23.
ملاحظة: يتم استخدام [دمس] كعنصر تحكم سيارة لأن جميع المركبات تذاب في البداية في [دمس] كمخزون. العمود 22 التي تحتوي على خلايا [دمس] يعامل الإعراب عن P23H رودوبسين يستخدم كعنصر التحكم 0%. 9-رابطة الدول المستقلة--يتم استخدام الخلايا المعالجة الشبكية معربا عن رودوبسين P23H كعنصر تحكم 100%.
- تغطية لوحة 384-جيدا مع رقائق الألومنيوم واحتضان لوحة عند 37 درجة مئوية ح 24.
4-إيمونوستاينينج دون غشاء Permeabilization وصمة عار رودوبسين البروتين على سطح الخلية.
ملاحظة: تجنب أي المنظفات في عملية إيمونوستاينينج كامل للحفاظ على غشاء الخلية سليمة.
- إعداد بارافورمالدهيد 4% (PFA) بتمييع 16% منهاج العمل مع برنامج تلفزيوني في نسبة حجم 1:4 في غطاء الأبخرة كيميائية. نقل 4% منهاج عمل بيجين في خزان كاشف.
- إخراج لوحة 384-جيدا في غرفة مظلمة مع الضوء الأحمر الخافت. استخدام المضخة 8 قنوات متصلة بزجاجة جمع فراغ لنضح بلطف المتوسطة. استخدام ماصة متعددة القنوات إلكترونية إضافة 20 ميليلتر كل بئر طازجة 4% منهاج عمل بيجين إلى لوحة 384-جيدا كامل واحتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. لتجنب انفصال الخلية، تشير دائماً النصائح من المضخة على نفس الجانب من كل بئر خلال التطلعات. لا تلمس المنطقة السفلي الأوسط من كل بئر. عند التقاط الصور، حدد الحقول لتجنب المنطقة تأثرت المضخة. وبالنسبة إينكوبيشنز أطول من 10 دقائق، تغطي لوحة 384-جيدا مع غطاء لها لتجنب التبخر.
ملاحظة: يتم إصلاح الخلايا في غرفة مظلمة لتجنب فوتوبليتشينج إيسورهودوبسين المجددة التي سوف تؤثر على نتيجة لسيطرة 100%. بعد التثبيت، يمكن أخرج لوحة 384-البئر تحت الضوء الطبيعي. - استخدام الشافطة 8 قنوات نضح منهاج عمل بيجين في كل بئر واستخدام ماصة متعدد القنوات إلكترونية إضافة 50 ميكروليتر كل من برنامج تلفزيوني جيدا. كرر مرتين أخريين لأداء يغسل الثلاثة مع برنامج تلفزيوني.
تنبيه: النفايات السائلة التي تحتوي على منهاج عمل بيجين يتم جمعها في زجاجة توج وهو التخلص منها كنفايات كيميائية خطرة بعد التجربة. - كتلة الخلايا بإضافة 20 ميليلتر كل بئر مصل الماعز 5% إلى لوحة 384-جيدا كامل واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
- نضح المصل الماعز 5% وإضافة 15 ميليلتر كل بئر 20 ميكروغرام مل-1 B6-30 رودوبسين المضادة الأجسام المضادة في مصل الماعز 1% إلى صفوف A إلى سين إضافة 15 ميليلتر كل بئر من 1% عنزة المصل إلى صف ف لمجموعة مراقبة الأجسام المضادة فقط الثانوية.
- احتضان لوحة 384-جيدا في درجة حرارة الغرفة لمدة 90 دقيقة أو عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها. تغطية لوحة 384-جيدا مع رقائق الألومنيوم لتجنب فوتوبليتشينج فلوروفوريس.
- أغسل اللوحة 3 مرات مع 50 ميليلتر كل من برنامج تلفزيوني جيدا.
- نضح برنامج تلفزيوني وإضافة 15 ميليلتر الواحدة من 5 ميكروغرام مل-1 الماعز مترافق Cy3 الماوس المضادة مفتش جسم جيدا. تغطية لوحة 384-جيدا مع رقائق الألومنيوم واحتضان في درجة حرارة الغرفة ح 1 أو 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
- أغسل اللوحة 3 مرات مع 50 ميليلتر كل من برنامج تلفزيوني جيدا. إضافة 50 ميليلتر كل بئر من برنامج تلفزيوني يحتوي على 1 ميكروغرام مل-1 هويشت 33342 وصمة عار الأنوية في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
- إغلاق لوحة 384-جيدا مع فيلم شفاف قبل التصوير. تغطية لوحة 384-جيدا مع رقائق الألومنيوم وتخزينها في 4 درجات مئوية لتصل إلى أسبوع إذا أخذت الصور فورا.
5-التصوير.
ملاحظة: هذا الإجراء التصوير عالية المحتوى تكييف نظام التصوير المدرجة في الجدول للمواد. إجراءات يمكن أن تكون مختلفة في حالة استخدام نظم التصوير الأخرى عالية المحتوى.
- إزالة الغطاء ووضع لوحة 384-جيدا في تصوير عالية المحتوى مع A1 المتمركزة في الزاوية اليسرى العليا اللوحة.
- فتح برنامج اقتناء الصور لإعداد معلمات للحصول على الصور.
- فتح إطار "لوحة اقتناء الإعداد" وإنشاء إعداد جديد أو تحميل ملف إعداد موجود.
- حدد الهدف 20 x وإعداد binning بكسل ك 2 حتى لا يكون حجم بكسل معايرة 0.80 × 0.80 ميكرومتر. مجموعة خطوط المسح ك 000 2 وحجم الصورة (ث × ح) ك 1,000 x 1,000 بكسل (800.00 س 800.00 ميكرومتر) في الموقع الواحد.
- حدد نوع اللوحة تصويرها. استخدام المعلومات التي توفرها الشركة المصنعة للوحة 384-جيدا لملء في أبعاد اللوحة.
- تحديد الآبار تصويرها للوحة 384-جيدا.
- تحديد أربعة مواقع تصوير كل بئر. تجنب جانب كذلك تطرق بنصائح الطموح.
- حدد الليزر الإثارة ك 405، 488 و 561 شمال البحر الأبيض المتوسط. تحديد مرشحات الانبعاثات للقنوات DAPI وفيتك وتكساس الأحمر. تحسين قوة الليزر والمكاسب لكل قناة ضمان درجة سطوع الصور المأخوذة من آبار المراقبة الإيجابية أقل من عتبة الإشباع.
- حدد التركيز بئر لضبط تلقائي للصورة. حدد أول بئر المكتسبة الأولى أيضا للعثور على عينات. تعيين موقع ضبط تلقائي لكافة المواقع.
- حدد أربع متوسطات كل سطر لكل قناة. تحسين قيمة Z-إزاحة لكل قناة.
- اختبار الآبار 2-3 في زوايا قطرية لصفيحة 384 جيدا للتأكد من الصور هي في التركيز لكل اختبار الآبار، الصور من جميع المواقع كل بئر الخلايا التي تحتوي على أكثر من 40% التقاء، وكثافات الأسفار من جميع القنوات حوالي نصف المشبعة بنسبة 100% التحكم في الآبار.
- حفظ أسلوب الحصول على الصورة.
- قم بتشغيل لوحة كاملة. يشاهد في التصوير حتى ينتهي التقاط الصور من العمود الأول من لوحة للتحقق من جودة الصورة قبل مغادرته التصوير. إخراج لوحة 384-جيدا وتخزينها في 4 درجات مئوية لاستخدامها في المستقبل.
ملاحظة: اعتماداً على عدد المواقع المختارة للبئر والقنوات التي اتخذت، يأخذ 40 دقيقة إلى 3 ساعات لإنهاء التصوير لوح 384-بئر واحد.
6-صورة التحليل.
- سحب بيانات الصورة باستخدام برنامج تحليل صورة عالية المحتوى. حدد أحد الآبار السيطرة 100% (العمود 23) لإعداد المعلمات.
- حدد سجل خلية متعددة الطول الموجي كأسلوب التحليل وبدء تكوين الإعدادات.
- تعريف الأنوية باستخدام صور من قناة DAPI. معاينة للتأكد من تناسبها الأشكال أنوية محددة في المحدد جيدا جيدا مع الصور الأنوية.
- تحديد شكل الخلية في قناة فيتك حيث يتم تصويرها رودوبسين-فينوس.
- تحديد مجالات وصمة عار سطح الخلية رودوبسين في قناة "الأحمر تكساس".
- اختبار الخوارزمية الحالي في الآبار 5 لتحديد إذا كانت الإعدادات هي الأمثل. حفظ الإعدادات وقم بإغلاق إطار التكوين .
- تشغيل جميع الآبار باستخدام أسلوب التحليل الأمثل.
- تصدير الكائن عدد كعدد الخلايا سليمة. تصدير القناة فيتك متوسط كثافة "كثافة" رودوبسين-فينوس (INT رودوبسين-فينوس). تصدير قناة الأحمر تكساس متوسط كثافة ككثافة رودوبسين على سطح الخلية (INT رودوبسين على سطح الخلية).
- فتح البيانات التي تم تصديرها في برنامج جدول بيانات. القسمة كثافة رودوبسين على سطح الخلية رودوبسين-فينوس INT كنسبة MEM للمجموع. حساب Z '-العوامل لكل معلمة وذلك لتقييم نوعية التحليل. Z′ = 1−3X (STDالسيطرة 100%+STDالتحكم 0%)/| يعنيالتحكم 100%−Meanالتحكم 0%|.
ملاحظة: Z '-عامل أعلى من الإشارة إلى 0 مقايسة معتدلة كافية لشاشة عالية المحتوى، و Z' عامل يتراوح بين 0.5 و 1 يوحي مقايسة معلقة المطلوبة ل شاشة الفائق20،21. - استخدم برنامج جداول البيانات لإنشاء مخطط حرارة اللونين لكل معلمة. ترتيب اسم خطوط الخلايا على المحور السيني والمركبات على المحور ص.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نحن تتميز بنقل رودوبسين مع المعلمات الثلاث: كثافة رودوبسين-فينوس في الخلية كاملة (INT رودوبسين-فينوس)، كثافة immunostaining رودوبسين في غشاء البلازما (INT رودوبسين على سطح الخلية)، والنسبة رودوبسين وصمة عار على سطح الخلية لكثافة رودوبسين-فينوس في الخلية كاملة (MEM-إجمالي نسبة). ممثل نتيجة الفحص النقل رودوبسين يرد في الشكل 3 و 4 الشكل. استخدام [دمس] و 9-رابطة الدول المستقلة-الشبكية تعامل الخلايا معربا عن P23H-رودوبسين-فينوس 0 وضوابط 100%، على التوالي، Z '-العوامل لهذه المعايير الثلاثة في النطاق بين 0 و 0.5، مما يوحي بأن لديه المقايسة نوعية متوسطة، كافية ل التصوير عالية المحتوى21. حتى ولو ض الأمثل '-العوامل أقل من 0.5 بسبب إجراءاتها معقدة نسبيا مقارنة مقايسة HTS، وهذا التحليل ما زالت قوية وموثوق بها لتحليل يستند إلى صورة. مجمع نشطة التي تنقذ رودوبسين تجمعات ينبغي إظهار قيم أعلى من INT رودوبسين على سطح الخلية و "نسبة" إجمالي ذاكرة من [دمس]، مع قيمة P أقل من 0.05. تم إنشاء ثلاث خرائط الحرارة 2-د من هذه المعايير الثلاثة لمقارنة كمية رودوبسين متوسط والتعريب كل خلية (الشكل 4). المتكررة في تريبليكاتيس، يتم سرد WT وستة رودوبسين طفرات أفقياً، وتتم مقارنة آثار العلاجات المركبة عمودياً. باﻻتفاق مع الدراسات السابقة، رودوبسين INT على سطح الخلية، ونسبة إجمالي MEM أقل بالنسبة لستة طفرات مقارنة رودوبسين WT تعامل مع [دمس] (الشكل 4)5،،من2223. رودوبسين INT على سطح الخلية وبه نسبة الفنزويلية أن إجمالي نسبة 9-رابطة الدول المستقلة-علاج الشبكية T4R، P23H، D190N و P267L، ولكن لا P53R أو C110Y المسوخ، مما يوحي بأن 9-رابطة الدول المستقلة-الشبكية ينقذ نقل T4R، طفرات رودوبسين P23H و D190N و P267L. وأظهرت جميع البارافينات المكلورة مستويات متفاوتة من الزيادة في INT رودوبسين على سطح الخلية ل T4R و P23H و D190N. 3، 4، 5، 7 و 8 و 11 من قانون العقوبات السويسري زيادة INT رودوبسين-فينوس ولكن لا نسبة MEM لمجموع هذه طفرات رودوبسين، مما يوحي بأن هذه المركبات إلا بزيادة المبلغ رودوبسين. Cps 1 و 2 6 و 9 زيادة كبيرة في نسبة MEM لمجموع طفرات رودوبسين T4R، P23H، D190N، و P267L، مما يوحي بأن هذه المركبات الإنقاذ بنقل هذه طفرات رودوبسين لغشاء البلازما. التشكيلات الجانبية 2-د تقديم نظرة شاملة للنقل رودوبسين تتأثر هذه الطفرات أدرب المرتبطة التخفيف من آثارها بالعلاج الدوائي مختلفة.
رقم 1: سير العمل للمقايسة النقل رودوبسين- الإجراءات لتلطيخ الخلايا السطحية من رهودوبسن دون غشاء permeabilization للمقايسة النقل رودوبسين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: الرسوم التوضيحية لإعداد 5 × حلول العمل ونقل السائل من لوحة 96-جيدا إلى لوحة 384-جيدا- (أ) تخطيط لوحة 96-بئر 5 × حلول العامل. وقد A1 الآبار إلى G2 300 ميليلتر كل بئر ليصل إلى 15 في 5 × حلول العمل والتحليل المتوسط (م) كما هو موضح في العمودين 1 و 2. هي مركبات 14 و 15 [دمس] 2% و 25 ميكرومتر 9-رابطة الدول المستقلة-الشبكية، على التوالي، لعلاج خطوط الخلية سبع معربا عن وزن ورودوبسين المسخ. بالإضافة إلى ذلك، تحتوي الأعمدة 11 و 12 100 ميليلتر كل بئر [دمس] 2% و 25 ميكرومتر 9-رابطة الدول المستقلة-يتحكم الشبكية، على التوالي، تعامل بخلايا معربا عن رودوبسين P23H لحساب Z '-العوامل. (ب) تخطيط لوحة 384-جيدا لظروف العلاج ونوع الخلية. الخلايا U2OS التعبير عن وزن، T4R، P23H، P53R، C110Y، D190N و P267L رودوبسين-فينوس هي المصنف كما هو موضح. شروط العلاج المسماة باللون الأزرق. نصائح الوردي والأزرق تثبت نقل السائل بئر من لوحة 96-جيدا للوحة 384 استخدام ماصة متعددة القنوات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: الصور التمثيلية وكوانتيفيكاتيونس لعناصر التحكم للمقايسة النقل رودوبسين- (أ) كوكب الزهرة الأسفار (الأخضر) و immunostaining السطحية (أحمر) خلية من خلايا U2OS التعبير عن وزن أو P23H رودوبسين-فينوس تعامل مع [دمس] أو ميكرومتر 5 9-رابطة الدول المستقلة-الشبكية. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. (ب) ألف عمود الأرض من الكثافة فينوس يعني كل خلية تمثل المبلغ رودوبسين في الخلية كاملة (INT رودوبسين-فينوس). ف< 0.0001. Z '--يظهر عامل تحت الخط الأسود. شريط عمود القيمة والخطأ هي في المتوسط والانحراف المعياري (التنمية المستدامة) من replicates 16، على التوالي. يعني ارسم العمود (ج) لكثافة Cy3 كل خلية تمثل رودوبسين الملون على سطح الخلية (INT رودوبسين على سطح الخلية). (د) عمود قطعة من نسبة كثافة cy3 يعني كل خلية يعني كثافة فينوس كل خلية تمثل نسبة مستوى رودوبسين على سطح الخلية إلى مستوى كامل الخلية (MEM لمجموع نسبة). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: إجراء تحليل المحتوى السامي ممثل للمقايسة النقل رودوبسين أظهرت خرائط الحرارة لون موضعي 2- (أ) خريطة الحرارة يعني كثافة فينوس كل خلية تمثل مستوى رودوبسين كامل الخلية (INT رودوبسين-فينوس). كل كتلة تمثل نقطة بيانات وتم اختبار كل شرط في ثلاث نسخ. أسطورة اللون يظهر على اليسار. حزب المحافظين، مجمع. (ب) خريطة الحرارة يعني كثافة Cy3 كل خلية تمثل رودوبسين الملون على سطح الخلية (INT رودوبسين على سطح الخلية). (ج) خريطة الحرارة متوسط كثافة Cy3 كل خلية بمتوسط كثافة فينوس كل خلية تمثل نسبة مستوى رودوبسين على سطح الخلية إلى مستوى كامل الخلية (MEM لمجموع نسبة). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا، واظهرنا مقايسة تصوير عالية المحتوى المستخدمة لوصف عدد الزيارات المحددة من HTS. أتمتة فقط المشاركة في هذه البروتوكولات هو تصوير عالية-المحتوى. استخدمت إيمونوستاينينج وتصوير الأسفار من رهودوبسن في عادة لوصف توطين رودوبسين5،14،،من1516. إلا أن التحديد الكمي للصور الملتقطة بأساليب التصوير التقليدية محدودة بسبب عدم كافية صور الخلية الواحدة شرط، القدرة المنخفضة للصور للتجربة، وعدم وجود معامل مراقبة الجودة. علينا تكييف البروتوكول immunostaining التقليدية إلى تنسيق 384-جيدا والاستعاضة عن التصوير التقليدي مع التصوير عالية المحتوى. استخدام هذا البروتوكول التصوير عالية المحتوى، ونحن بنجاح المحدد وتتميز أنشطة يضرب حددها HTS11،،من1317. مقارنة مع إيمونوستينينج التقليدية وأساليب التصوير، هذا البروتوكول زيادة كبيرة وفقا لظروف التصوير وقدرات التصوير والصورة تحليل السلطة، مما مكننا من الناحية الكمية مقارنة التأثيرات الدوائية 11 المركبات نحو نقل أدرب الستة المرتبطة طفرات رودوبسين.
التغيرات الكبرى هذا البروتوكول مقارنة بالبروتوكولات المستخدمة سابقا immunostaining رودوبسين والتصوير هي: (1) الخلايا المتنامية وإيمونوستينينج في صفيحة 384-جيدا واضحة لأسفل؛ (2) تصوير الخلايا باستخدام تصوير عالية المحتوى؛ وبيانات تحليل (3) مع برمجيات تحليل عالية--محتوى صورة. بسبب هذه التغييرات، الأمثل أولية المطلوبة لإيجاد أفضل خلية بذر عدد وتركيزات الأجسام المضادة، وظروف التصوير، والصورة تحليل الخوارزميات.
وتشمل الخطوات الحاسمة للبروتوكول: (1) زرع الخلايا التي تسمح لالتقاء 50-70 في المائة قبل التثبيت؛ (2) أماني حذراً لتجنب الخلية المفرزة؛ (2) التصوير عدة آبار عبر لوحة كاملة للتأكد من أن الصور في التركيز وفلوريس من جميع القنوات لا يتجاوز نصف الحد الأدنى من التصوير لآبار مراقبة إيجابية قبل التصوير لوحة كاملة؛ و (3) الحفاظ Z '-عامل أعلى من 0 لضمان موثوقية المقايسة.
المشاكل الأكثر شيوعاً التي يمكن مواجهتها لهذا البروتوكول هي الخلية المفرزة و Z منخفضة '-العوامل. لتجنب هذه المسألة الأولى، بريتريت لوحة 384-جيدا مع بولي-L-يسين تيسير المرفق الخلية وتجنب استخدام خطوط الخلايا التي فصلها بسهولة مثل الخلايا Hek293. بالإضافة إلى ذلك، الحد من تلميح التطلع تلمس جانب واحد فقط من كل بئر أثناء الشفط وحدد الجانب الآخر من كل بئر للتصوير. لتحسين زي '-عامل ونوعية التحليل، تحسين الخلية البذر المعلمات تحليل عدد والصورة للتأكد من الشكل الخلية أو الشكل أنوية يحددها البرنامج يناسب تماما مع كل كائن في كل قناة الأسفار.
مقارنة بالأساليب الأخرى التحديد الكمي للنقل رودوبسين، مثل أليسا سطح من خلية، أو فحص تكامل يفتت β-جالاكتوسيداسي، حساب مستوى البروتين المستهدف على سطح الخلية في جميع خلايا، يوضحها هذا الأسلوب التصوير عالية-المحتوى مستوى متوسط من البروتين في الخلية؛ وتتجنب هذه الميزة الفريدة عامل تباين الحرجة، وعدد الخلايا التي تؤثر على قراءات النهائي في أساليب أخرى. بالإضافة إلى ذلك، نظراً للعدد الكبير من الخلايا المصورة وكمياً بطريقة التصوير عالية المحتوى، متوسط المعلمات من كافة الخلايا الواحدة وكذلك أظهرت تباين منخفضة بين replicates، مما يضيف إلى موثوقية المقايسة.
واحد الحد من هذا البروتوكول أنها ليست فحوصات أفضل ل HTS، بسبب إجراءاتها معقدة نسبيا وح 2 للوحة التصوير في المرة الواحدة. وبالتالي، نوصي بفحوصات مراسل البديل لفحص مكتبات جزيء صغير كبيرة مع المركبات أكثر من 5,000، واستخدام هذا البروتوكول التصوير عالية المحتوى لتوصيف مركزة فحوصات المحدودة للمركبات أقل من 100. والقيد الثاني من هذا البروتوكول هو عدم وجود معايير لإظهار ما إذا كانت الأسفار فينوس أو كثافات fluorescence immunostaining في علاقة خطية مع كمية كمية البروتين رودوبسين كل خلية. تجنب التشبع إيمونوستينينج، نوصي باختبار والتآمر كثافات immunostaining الخلايا المحتضنة بتركيزات مختلفة من الأجسام المضادة الأولية والثانوية. تحديد تركيزات الأجسام المضادة داخل نطاق خطي التغيير التنوير.
توسيع نطاق من التطبيق الحالي، أننا سوف كمياً النقل رودوبسين من الصور لخلايا عابر transfected مع 28 طفرات رودوبسين مختلفة تحت العلاج مع ما يصل إلى 10 مجمعات لإنشاء قاعدة بيانات دوائية لهذه المركبات نشاط لتوجيه علاجات المحتملة لمرضى أدرب تحمل هذه الطفرات رودوبسين. هذا البروتوكول يمكن أيضا تكييفها بسهولة لفحوصات إزفاء من أي بروتين غشائي من الفائدة التي سوف تكون مفيدة لاكتشافات العقاقير الأخرى البروتين ميسفولدينج من الأمراض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونشكر الدكتور مارك شورداك هاء، واكتشاف المخدرات جامعة بيتسبرغ معهد توفير تصوير محتوى عالية والتدريبات الأولية. سخاء يشارك الدكتور كريستوف بالكزيوسكي (حالة جامعة Western Reserve) 4 1 و B630 رودوبسين المضادة الأجسام المضادة. وشاطره بلازميد يحتوي على كدنا من الماوس رودوبسين-فينوس بناء الدكتور نيفين لامبرت (أوغوستا جامعة). وأيد هذا العمل المعهد الوطني للصحة منحة EY024992 للبطاقة الصفراء و P30EY008098 من منحة جامعة بيتسبرغ الرؤية الأساسية للبحث.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| U2OS (rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (T4R-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P23H-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P53R-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (C110Y-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (D190N-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P267L-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| DMEM high glucose | Genesee Scientific | 25-500 | With L-Glutamine, sodium pyruvate |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16140071 | Heat inactivated |
| Plasmocin | InvivoGen | ant-mpt | Mycoplasma elimination reagent |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Gibco | 15140122 | 100X concentrated antibiotic solutions to prevent bacteria contamination of cell cultures |
| Trypsin-EDTA | Genesee Scientific | 25-510 | 0.25%, 1mM EDTA in HBSS without calcium and magnesium |
| Poly-L-lysine solution | Sigma-Aldrich | P4707-50ML | Mol wt 70,000-150,000, 0.01%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| CellCarrier-384 Ultra Microplates | PerkinElmer | 6057300 | 384-well tissue culutre-treated microplates with black well walls and an optically -clear cyclic olefin bottom for imaging cells in high content analysis |
| Sterile 96-well plate | Eppendorf | 30730119 | Tissue culture treated with lid flat bottom, sterile, free of detectable pyrogens, Rnase, DNase and DNA. Non-cytotoxic |
| Phosphate Buffered Sailine (PBS) | Invitrogen | AM9625 | 10 x PBS Buffer, pH 7.4 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D4540 | >99.5%, cell culture tested |
| 9-cis-retinal | Sigma-Aldrich | R5754 | |
| Compounds tested | Selleckchem/Life Chemicals/Custom synthesized | NA | Compounds were purchased from different vendors or custom synthesized |
| B6-30 anti-rhodopsin antibody | Novus | NBP2-25160 | Gift from Dr. Krzysztof Palczewski |
| Cy3-conjugated goat anti-mouse secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc | 115-165-146 | |
| 16% paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Methanol-free |
| 10% Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 50062Z | Blocking buffer |
| Hoechst 33342, Trihydroch | Invitrogen | H3570 | Nuclear staining solution |
| High-content imager | Molecular Devices | ImageXpress | ImageXpress® Micro Confocal High-Content Imaging System |
| MetaXpress high-content image acquisition and analysis software | Molecular Devices | MetaXpress | High-content image acquisition and analysis software |
| Multichannel pipette (0.5-10 µL) | Rainin | 17013802 | Manual 8-channel pipette, 0.5-10 µL |
| Multichannel pipette (0.5-10c | Rainin | 17013805 | Manual 8-channel pipette, 20-200 µL |
| Electronic multichannel pipette (10-200 μL) | Thermo Scientific | 14-3879-56BT | Electronic multichanenel pipette for 96- and 384-well microplate pipetting tasks |
| 50ml Reagent Reservoir | Genesee Scientific | 28-125 | Reagent reservior for multichannel pippte dispensing |
| 8-Channel aspirator | ABC Scientific | EV503 | 8-Channel stainless steel adaptor for aspirating liquids from 96- or 384-well plates |
| Excel spreadsheet software | Microsoft | Excel2016 | The spreadsheet software for data analysis and heatmap generation |
| Origin2018 scientific data analysis and graphing software | OriginLab | Origin2018 | The data analysis software for generating the dose response curves |
References
- Gregersen, N., Bross, P., Vang, S., Christensen, J. H.
- Daiger, S. P., Bowne, S. J., Sullivan, L. S. Perspective on genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Archives of Ophthalmology. 125 (2), 151-158 (2007).
- Daiger, S. P., Sullivan, L. S., Bowne, S. J. Genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Clinical Genetics. 84 (2), 132-141 (2013).
- Stenson, P. D., et al. The Human Gene Mutation Database: towards a comprehensive repository of inherited mutation data for medical research, genetic diagnosis and next-generation sequencing studies. Human Genetics. 136 (6), 665-677 (2017).
- Sung, C. H., Schneider, B. G., Agarwal, N., Papermaster, D. S., Nathans, J. Functional heterogeneity of mutant rhodopsins responsible for autosomal dominant retinitis pigmentosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (19), 8840-8844 (1991).
- Athanasiou, D., et al. The molecular and cellular basis of rhodopsin retinitis pigmentosa reveals potential strategies for therapy. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 1-23 (2018).
- Chiang, W. C., et al. Robust Endoplasmic Reticulum-Associated Degradation of Rhodopsin Precedes Retinal Degeneration. Molecular Neurobiology. 52 (1), 679-695 (2015).
- Sakami, S., et al. Probing mechanisms of photoreceptor degeneration in a new mouse model of the common form of autosomal dominant retinitis pigmentosa due to P23H opsin mutations. Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 10551-10567 (2011).
- Dryja, T. P., et al. Mutations within the rhodopsin gene in patients with autosomal dominant retinitis pigmentosa. New England Journal of Medicine. 323 (19), 1302-1307 (1990).
- Sohocki, M. M., et al. Prevalence of mutations causing retinitis pigmentosa and other inherited retinopathies. Human Mutation. 17 (1), 42-51 (2001).
- Chen, Y., et al. A novel small molecule chaperone of rod opsin and its potential therapy for retinal degeneration. Nature Communications. 9 (1), 1976 (2018).
- Chen, Y., Tang, H. High-throughput screening assays to identify small molecules preventing photoreceptor degeneration caused by the rhodopsin P23H mutation. Methods in Molecular Biology. 1271, 369-390 (2015).
- Chen, Y., et al. A High-Throughput Drug Screening Strategy for Detecting Rhodopsin P23H Mutant Rescue and Degradation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (4), 2553-2567 (2015).
- Noorwez, S. M., et al. Pharmacological chaperone-mediated in vivo folding and stabilization of the P23H-opsin mutant associated with autosomal dominant retinitis pigmentosa. Journal of Biological Chemistry. 278 (16), 14442-14450 (2003).
- Saliba, R. S., Munro, P. M., Luthert, P. J., Cheetham, M. E. The cellular fate of mutant rhodopsin: quality control, degradation and aggresome formation. Journal of Cell Science. 115, 2907-2918 (2002).
- Kaushal, S., Khorana, H. G. Structure and function in rhodopsin. 7. Point mutations associated with autosomal dominant retinitis pigmentosa. Biochemistry. 33 (20), 6121-6128 (1994).
- Chen, Y., Brooks, M. J., Gieser, L., Swaroop, A., Palczewski, K. Transcriptome profiling of NIH3T3 cell lines expressing opsin and the P23H opsin mutant identifies candidate drugs for the treatment of retinitis pigmentosa. Pharmacological Research. 115, 1-13 (2016).
- Adamus, G., et al. Anti-rhodopsin monoclonal antibodies of defined specificity: characterization and application. Vision Research. 31 (1), 17-31 (1991).
- Goodson, H. V., Dzurisin, J. S., Wadsworth, P. Generation of stable cell lines expressing GFP-tubulin and photoactivatable-GFP-tubulin and characterization of clones. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (9), pdb prot5480 (2010).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Bray, M. A., Carpenter, A., et al. Advanced Assay Development Guidelines for Image-Based High Content Screening and Analysis. Assay Guidance Manual. Sittampalam, G. S., et al. , Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. Bethesda (MD). (2004).
- Sung, C. H., Davenport, C. M., Nathans, J. Rhodopsin mutations responsible for autosomal dominant retinitis pigmentosa. Clustering of functional classes along the polypeptide chain. Journal of Biological Chemistry. 268 (35), 26645-26649 (1993).
- Krebs, M. P., et al. Molecular mechanisms of rhodopsin retinitis pigmentosa and the efficacy of pharmacological rescue. Journal of Molecular Biology. 395 (5), 1063-1078 (2010).
