Summary
Buraya, taşıma retinitis pigmentosa ile ilişkili rhodopsin mutantların ölçmek için bir yüksek-içerik görüntüleme yöntemi nitelendirdi. Bir çoklu dalga boyu Puanlama analiz rhodopsin protein hücre yüzeyine veya tüm cep telefonu ölçmek için kullanıldı.
Abstract
Rhodopsin misfolding mutasyonlar otozomal dominant retinitis pigmentosa (RP), etkili tedavi yoksun hastalığı kör bir ilerici kendini gösteren çubuk photoreceptor ölüme yol açar. Misfolded rhodopsin mutant sitotoksisite farmakolojik mutant rhodopsin protein sabitleme ile hafifletti öngörmekteyiz. Vahşi türü rhodopsin memeli plazma zarı için taşınır, ancak diğer sınıf II rhodopsin mutasyonlar arasında P23H mutasyon endoplazmik retikulum (ER), birikmiş bir yapısal olarak kararsız rhodopsin mutant protein kodlar hücreleri. Biz daha önce bir ışıldama tabanlı yüksek üretilen iş ekran (HTS) gerçekleştirilen ve ER üzerinden P23H rhodopsin plazma zarı için taşıma kurtarıldı farmakolojik chaperones bir grup tespit. Burada, bir yüksek-içerik görüntüleme analizi tarafından takip bir immunostaining yöntemini kullanarak, biz mutant rhodopsin protein miktarı tüm cep telefonu ve plazma zarı sayılabilir. Bu bilgilendirici ve yanlış pozitif HTS. takip üzerinden gerçek sayısı tanımlamak etkili bir yöntemdir Ayrıca, yüksek-içerik görüntü analizi bize birden çok parametre her bileşik farmakolojik özellikleri değerlendirmek için tek bir deneme ölçmek etkinleştirilmiş. Bu tahlil kullanılarak, biz bu rhodopsin mutantların yapısal kararlılık ilgili nicel ve nitel bir anlayış için bir 2-B farmakolojik profil alma altı ilişkili RP rhodopsin mutantlar doğru 11 farklı bileşiklerin etkisi analiz ve bu mutant doğru farklı bileşiklerin etkinliği.
Introduction
Protein misfolding retinitis pigmentosa (RP)1de dahil olmak üzere, kör edici hastalıklar gibi kas distrofisi, sinirsel dejenerasyonlar içinde yer almaktadır. RP devralınan ve ilerici Retina dejenerasyonu işlev ve çubuk photoreceptors veya Retina pigmentli hücreleri (RPEs)2,3homeostazı etkileyen 60 genlerdeki mutasyonlar ile ilişkili olduğunu. Etkili bir tedavi RP için şu anda mevcuttur. Rhodopsin mutasyonlar otozomal dominant (reklam) yaklaşık % 25-30 RP durumlarda hesaba. 150'den fazla rhodopsin mutasyonlar4 arasında (insan gen mutasyon veritabanı, http:/ www.hgmd.cf.ac.uk/), sınıf II mutasyonlar çubuk photoreceptor ölümüne katkıda rhodopsin protein yapısal kararsızlığına neden ve Vizyon kaybı5,6,7,8. P23H da sınıf II rhodopsin mutasyonlar9,10tipik bir örneği ile Kuzey Amerika'da en sık rhodopsin mutasyon var. Vahşi türü rhodopsin plazma zarı5üzerinde yer alır, ancak onun doğasında yapısal istikrarsızlık nedeniyle memeli hücrelerinde endoplazmik retikulum (ER) içinde misfolded rhodopsin birikmiş. Misfolded rhodopsin haploinsufficiency nedeniyle değil, ama ER harekete geçirmek için ilgili P23H mutant sergiler baskın olumsuz sitotoksisite protein yıkımı yolu ve kesilen çubuk dış segment organizasyon ilişkili. Çubuk photoreceptor hücre stresi hafifletmek için bir strateji yerel farmakolojik bir koruyucuya kullanarak mutant rhodopsin katlama stabilize etmektir.
Bu hedefe ulaşmak için biz gerçekleştirilen plazma üzerinde taşınan P23H rhodopsin mutant ölçmek için bir β-galaktozidaz parçası uluslara tahlil kullanarak bir hücre tabanlı yüksek üretilen iş ekran (HTSs)11,12,13 membran. Güçlü ve basit iletişim kuralı bu HTS testin bize her ekran için yaklaşık 79.000 küçük moleküller faaliyetlerinin keşfetmek etkin. Çünkü bu HTS tahlil ışıldama sinyalleri okur, ancak, yanlış pozitif β-gal inhibitörleri dahil olmak üzere renkli ya da sitotoksik bileşikler tarafından ikincil bir tahlil tespit edilmesi için bekleyen bulunanlar listesinde dahil.
Geleneksel immunostaining ve floresan görüntüleme yöntemleri yıllardır memeli hücreleri5,14,15,16rhodopsin taşımada eğitim için kullanılmaktadır. Ancak, geleneksel yöntemlerin güvenilir bir görüntüleme analizi çok sayıda olduğunu son derece tutarlı bir koşul altında çekilen görüntüler gerektirdiğinden rhodopsin taşıma doğru 10'dan fazla bileşiklerin farmakolojik etkileri ölçmek için kullanılamaz konvansiyonel görüntüleme yöntemleri tarafından değil iyileştirilebilir. Burada, bir immunostaining göre yüksek içerik görüntüleme Protokolü hücre yüzey taşıma misfolded rhodopsin mutantlar11,13,17ölçmek için ikincil bir tahlil olarak geliştirdi. Plazma zarı üzerinde rhodopsin etiketlemek için hücre zarının permeabilization ve immunostained adımında rhodopsin mutantlar rhodopsin hücre hücre dışı kenarındaki N-terminal epitope tanıma monoklonal (B6-30) Anti-rhodopsin tarafından atladık membran18. Tüm cep telefonu mutant rhodopsin görselleştirmek için rhodopsin Venüs floresans protein ile erimiş. Tarafından miktar farklı floresan kanalları floresans yoğunluklarını, biz bir tek deneme her hücresinde, hücre yüzeyine ve oranı toplam rhodopsin yoğunluğu da dahil olmak üzere birden çok parametre elde edebiliyoruz Tüm cep telefonu için bu hücre yüzeyinde rhodopsin floresan. Toplam altı misfolded rhodopsin mutantlar ifade hücreleri kararlı için bu yöntemi uygulayarak, biz bu mutant doğru birden çok küçük molekül chaperones farmakolojik bir profil oluşturabilirsiniz. Bu iletişim kuralı, tüm hücreleri immunostained 384-şey plaka vardır ve son derece tutarlı bir görüntüleme koşulu altında otomatik görüntüleme sistemi kullanarak yansıma. Bir görüntü analizi görüntüleri heterojenite nedeniyle değişim hücre şekil ve protein ifade düzey değişen hücre azaltmak için 600'den fazla hücre içeren her şey yapılır. İş akışını bu iletişim kuralı, Şekil 1' de özetlenmiştir. Bu yöntemin avantajı biz yansıma tabanlı analiz çok parametreli quantifications yanı sıra yüksek çözünürlüklü görüntüleri elde var. Genel olarak, bu iletişim kuralı değiştirilmiş ve herhangi bir misfolded membran protein ilgi taşımacılığının ölçmek için uygulanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: Rhodopsin taşıma tahlil.
1. hazırlık ve hücre kültürü
- Vahşi türü (WT) veya mutant fare rhodopsin-Venus füzyon protein ifade cryo korunmuş U2OS istikrarlı hücreleri canlandırmak. Sadece küçük buz kristalleri şişede terk edene kadar 37 ° C'de hücreler çözülme.
Not: U2OS hücreler vitro çalışmalar için kullanılabilir hiçbir photoreceptor hücre kültürünü ve rhodopsin önceden silier biyosentezi memeli hücrelerinde benzer moleküler mekanizmaları tarafından düzenlenir çünkü bu protokol için kullanılır. Ayrıca, U2OS hücreleri sıkıca plaka altına ekleyin ve büyük hücre cisimler, var rhodopsin taşıma tahlil için idealdir. Yedi U2OS istikrarlı hücreler, ifade WT, T4R, P23H, P53R, C110Y D190N ve P267L rhodopsin mutantlar kullanılır burada tahlil güvenilirliğini ve kalitesini göstermek için örnek olarak. İstikrarlı hücreler diğer rhodopsin mutantlar veya diğer membran proteinlerinin ifade, tahlil hedef bağlı olarak kullanılabilir. İstikrarlı hücreleri insan rhodopsin ifade bu tahlil varsa kullanılabilir. Fare rhodopsin burada fare ve insan rhodopsin proteinlerin % 95 Homoloji paylaşmak ve bu tahlil tarafından tanımlanan bileşikler test in vivo rhodopsin P23H mutasyon8taşıyan bir fare adRP modeli kullanarak olacak çünkü kullanıldı. İstikrarlı hücreleri19daha önce açıklandığı gibi üretildi. WT ve mutant rhodopsin transkript q-PCR tarafından sayısal ve benzer düzeyde WT ve mutant rhodopsin transkript ifade istikrarlı Hücre klonlar bu tahlil için seçildi. Ifade rhodopsin proteinlerin immunoblot ve immunostaining tarafından doğrulandı. Bu tahlil kullanılan hücre geçirilmesi 20 düşük olmalıdır. - Hücreleri her satırının (kartal'ın orta (DMEM) ile % 10 fetal Sığır serum (FBS) ve 5 µg/mL Plasmocin yüksek glikoz Dulbecco'nın değiştirilmiş) büyüme ortamının 10 mL içeren 15 mL konik tüp aktarın.
- 200 x g 5 dk. atmak için de tüp süpernatant santrifüj kapasitesi ve hücre Pelet her hücre satırı için hücre büyüme ortamının 5 mL ile resuspend. Hücre süspansiyon her satırının bir 60 mm doku kültürü kabına aktarın ve % 5 CO237 ° C'de kuluçkaya.
- Doku kültürü çanak olarak % 90 izdiham ulaştığında hücre başvurusu12' açıklanan alt kültür.
2. iyi başına 5000 hücre hücreleri tohumlama
Not: bir doku kültürü mahallede aşağıdaki yordamları gerçekleştirin.
- Poli-lizin plakalı tedavi.
- Hücreleri, tohum önce bir gün siyah duvar tedavi ve alt 384-şey plaka 20 µL/iyi 30 dk için poli-lizin çözümü ile temizleyin.
- Sıvı Aspire edin ve bütün kuyu 1 h. geri plaka kapak koymak kurumasını sağlar ve plaka 4 ° C'de gecede hücre tohum için saklayın.
- Hücre süspansiyon hazırlamak.
- Her hücre satır 100 mm doku kültürü tabak içinde büyüme orta, % 90 izdiham kadar kültür.
- Her yemeğin fosfat tamponlu tuz (PBS) ile yıkama ve 1 mL %0,05 hücrelerle ayırmak tripsin 37 ° C'de
- Her satır tahlil Orta (yüksek glikoz DMEM %10 FBS, 100 adet/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisin) 10 mL hücrelerinin resuspend.
- Hücreleri saymak ve her satırının başına 1,25 x 105 hücre/mL tahlil orta ile hücrelere oranında seyreltin.
- Tohum hücreleri.
- Elektronik bir çok kanallı pipet veya bir otomatik reaktif dağıtıcı 40 µL/iyi hücre süspansiyon hücre satır ve dolgu sütunlar 1-21 (Şekil 2) 384-şey plaka başına üç sütun için dağıtmak için kullanın.
- 40 µL/iyi U2OS Ekle (P23H-Rhodopsin-Venüs) sütunları 22-23 ve U2OS 40 µL/kuyu (Rhodopsin-Venüs) sütuna denetimleri olarak 24.
- 300 x g 30 için plaka santrifüj kapasitesi 384-şey plaka altına tüm hücreleri aşağı getirmek için s.
Not: hücre tohum sonra plaka fiziksel şok kaçının. Aksi takdirde, hücreleri her şey bir köşesinde ezilmiş ve plaka yüksek içerik görüntüleme için uygun olmayabilir. - 384-şey plaka %5 CO2 plaka altına eklemek hücrelerin 3 h için 37 ° C'de kuluçkaya.
3. bileşikler hücrelerle tedavi
- Şekil 2' de gösterildiği gibi tedavi koşulları ile bir tabak harita oluşturmak.
- 5 çalışma çözümleri bir 96-şey plaka 15 bileşiklerin x 300 µL hazırlayın.
- CPS 1-15 (Şekil 2A) onların son konsantrasyonları 96-iyi Wells A1 G2 için beş kez plaka için tahlil orta ile sulandırmak. 300 µL tahlil orta iyi H2 ekleyin.
Not: Her bileşik son konsantrasyonu en etkili konsantrasyon P23H rhodopsin taşımacılığının kurtardığın için HTS12,13tarafından kullanılır. - 100 µL % 2 dimetil sülfoksit (DMSO) kuyu başına ekleyin ve 25 µM 9 -CIS-11 ve 12, sütun için tahlil orta sırasıyla seyreltilmiş retina. 9 - eklemekCIS-Retina loş ışıkta.
- CPS 1-15 (Şekil 2A) onların son konsantrasyonları 96-iyi Wells A1 G2 için beş kez plaka için tahlil orta ile sulandırmak. 300 µL tahlil orta iyi H2 ekleyin.
- Hücrelerle (Şekil 2B) kültürlü 384-şey plaka çözümleri çalışma x 5 kuyu başına 10 µL ekleme.
- Elektronik bir çok kanallı pipet bileşikleri 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 ve 15 satır A, C, E, G, ı, K, M ve O için 1-21 (Şekil 2) sütunları eklemek için kullanın. Bileşikler Ekle 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 ve 1-21 sütunlarından satırlara B, D, F, H, J, L, N ve P M.
- 10 µL % 2 DMSO kuyu başına 22 ve 24 sütunları ekleyin. 25 µM 9 - kuyu başına 10 µL eklemekCIS-Retina sütuna 23.
Not: tüm bileşikleri başlangıçta stokları DMSO içinde çözülür çünkü DMSO araç denetimi olarak kullanılır. Sütun tedavi DMSO hücreleri içeren 22 P23H ifade rhodopsin % 0 denetimi olarak kullanılır. 9 -CIS-P23H rhodopsin ifade Retina tedavi hücreleri % 100 kontrol kullanılır.
- Alüminyum folyo ile 384-şey plaka kapak ve plaka 24 h 37 ° C'de kuluçkaya.
4. membran Permeabilization Rhodopsin Protein hücre yüzeyinde leke olmadan Immunostaining.
Not: hücre zarının sağlam tutmak için tüm immunostaining sürecinde herhangi bir deterjan kaçının.
- %4 paraformaldehyde (PFA) % 16 sulandrarak hazırlamak PFA PBS 1:4 birim oranında bir kimyasal duman Hood ile. %4 aktarım PFA reaktif Reservoir.
- Loş kırmızı ışık ile karanlık bir odada 384-şey plaka çıkarmak. Yavaşça orta Aspire için bir vakum koleksiyonu biberondan bağlı bir 8-kanal aspiratör kullanın. Taze hazırlanmış %4 kuyu başına 20 µL eklemek için elektronik bir çok kanallı pipet kullanın PFA tüm 384-şey plaka ve oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya. Hücre dekolmanı önlemek için her zaman aspiratör uçları her şey aynı tarafına özlemleri sırasında işaret. Her şey orta alt alan dokunmayın. Fotoğraf çekerken, aspiratör tarafından dokundu bölge önlemek için alanı seçin. 10 dakika uzun incubations için buharlaşma önlemek için kapağı ile 384-şey plaka kapak.
Not: Hücreleri % 100 kontrol sonucu etkileyecek rejenere isorhodopsin photobleaching önlemek için karanlık bir odada sabitlenir. Fiksasyon sonra 384-şey plaka normal ışık altında çekilen. - Bir 8-kanal aspiratör her iyi PFA Aspire edin elektronik bir çok kanallı pipet PBS kuyu başına 50 μL eklemek için kullanırsınız. PBS ile üç yıkama gerçekleştirmek için iki kez daha tekrarlayın.
Dikkat: Atık sıvı içeren PFA kaplama bir şişede toplanan ve deneyden sonra tehlikeli bir kimyasal atık olarak bertaraf edilecek. - Hücreleri tüm 384-şey plakasına %5 keçi serum kuyu başına 20 µL ekleyerek engellemek ve 30 dk için oda sıcaklığında kuluçkaya.
- %5 keçi serum Aspire edin ve 20 µg mL-1 B6-30 Anti-rhodopsin antikor kuyu başına 15 µL % 1 keçi serum içinde satır A O. eklemek 15 µL iyi ücret için % 1 keçi serum ikinci salt antikor kontrol grubu için satır P için ekleyin.
- 384-şey plaka 90 dakika oda sıcaklığında veya 4 ° C'de gecede kuluçkaya. Fluorophores photobleaching önlemek için alüminyum folyo ile 384-şey plaka kapak.
- 3 kez ile 50 µL plaka PBS kuyu yıkayın.
- PBS Aspire edin ve 5 µg mL-1 Cy3-Birleşik keçi Anti-fare IgG antikor kuyu başına 15 µL ekleyin. Alüminyum folyo ile 384-şey plaka kapak ve 1 h için oda sıcaklığında veya 4 ° C'de gecede kuluçkaya.
- 3 kez ile 50 µL plaka PBS kuyu yıkayın. 1 µg mL-1 çekirdek 15 dakika oda sıcaklığında leke Höchst 33342 içeren PBS kuyu başına 50 µL ekleyin.
- Görüntüleme önce şeffaf bir film ile 384-şey plaka mühür. Alüminyum folyo ile 384-şey plaka kapak ve görüntüleri hemen alınır 4 ° C'de için bir hafta kadar saklayabilirsiniz.
5. görüntüleme.
Not: Bu yüksek-içerik görüntüleme yordam Malzeme tablodalistelenen görüntüleme sistemi adapte olacaktır. Yordamlar diğer yüksek-içerik görüntüleme sistemleri kullanıyorsanız farklı olabilir.
- Kapağı çıkarın ve 384-şey plaka plaka sol üst köşesine yerleştirilmiş A1 ile yüksek içerikli Imager koydu.
- Resim alma parametrelerini ayarlamak için görüntü alma yazılımını açın.
- Plaka satın alma Kurulumu penceresini açın ve yeni ayarı oluşturmanız veya varolan bir kurulum dosyasını yüklemek.
- 20 x hedefi seçin ve kalibre edilmiş piksel boyutu 0,80 x 0,80 bu yüzden 2 olarak piksel binning ayarla µm. tarama çizgileri 2.000 ve görüntü boyutu ayarla (G x Y) site başına 1000 x 1000 piksel (800,00 800.00 µm x) olarak.
- Yansıması için plaka türü seçin. Plaka boyutları doldurmak için 384-şey plaka üreticisi tarafından sağlanan bilgileri kullanın.
- Kuyu 384-şey plaka yansıması seçin.
- İyi yansıması için dört site seçin. Aspirasyon ipuçları ile de dokundu tarafında kaçının.
- 405 uyarma lazerler seçin 488 ve 561 nm. Emisyon filtreler, DAPI, FITC ve Texas kırmızı kanalları için seçin. Lazer gücü optimize etmek ve kazanç görüntüleri olumlu denetim kuyulardan alınan parlaklığını emin olmak için her kanalının doygunluk eşik değerinden daha az olan.
- Otofokus iyi Peki odağının seçin. İyi örnekler bulmak için ilk olarak edinilen ilk şey seçin. Site Otofokus tüm sitelere ayarlayın.
- Her kanal için her satırda dört ortalamalar seçin. Her kanal için Z-kaydırma değeri en iyi duruma getirme.
- Test 2-3 kuyu çapraz köşe 384 iyi plaka görüntüleri emin olmak için tüm test wells, iyi başına tüm sitelerden görüntüler fazla % 40 izdiham ve floresan yoğunluklarda tüm kanalları içeren hücreler için odak yaklaşık yarısı % 100 doygun Kuyu kontrol.
- Görüntü alma yöntemi kaydedin.
- Tüm plaka çalıştırın. Esir alma imge görüntü kalitesi Imager ayrılmadan önce iki kez kontrol plaka ilk sütundan bitene kadar Imager dikkat et. 384-şey plaka çıkar ve ileride kullanmak üzere 4 ° C'de depolayın.
Not: iyi ve alınan kanal seçilen siteler sayısına bağlı olarak, bu bir 384-şey plaka Imaging bitirmek için 3 h için 40 dakika sürer.
6. görüntü analizi.
- Bir yüksek-içerik görüntü analiz yazılımı kullanarak görüntü verilerini çekin. Parametreleri ayarlamak için % 100 kontrol wells (sütun 23) birini seçin.
- Çoklu dalga boyu hücre Puanlama analiz yöntemi olarak ve başlangıç ayarlarını yapılandırma.
- DAPI kanalındaki görüntüleri kullanarak çekirdekler tanımlayın. Seçili tanımlanmış çekirdek şekillerde de çekirdek görüntülerle uydu emin olmak için Önizleme.
- Hücre şeklinde nerede rhodopsin-Venus görüntüsü FITC kanal tanımlayın.
- Texas kırmızı kanal rhodopsin hücre yüzey leke alanlarını tanımlayın.
- Geçerli algoritması 5 kuyu ayarlarını optimize edilmiş belirlemek için sınayın. Ayarları kaydetmek ve yapılandırma penceresini kapatın.
- Bütün wells ile en iyi duruma getirilmiş analiz yöntemini çalıştırın.
- Nesne numarası bozulmamış hücre sayı olarak dışa aktarın. Ortalama Yoğunluk FITC kanal Rhodopsin-Venus yoğunluğu (Rhodopsin-Venus INT) dışa aktarın. Texas kırmızı kanal Ortalama yoğunluğu rhodopsin yoğunluğu hücre yüzeyinde (hücre yüzeyinde Rhodopsin INT) olarak dışa aktarın.
- Dışa aktarılan verileri bir elektronik tablo yazılımı açın. Hücre yüzeyinde rhodopsin yoğunluğu rhodopsin-Venüs INT tarafından MEM toplam oranı olarak bölün. Z hesaplamak '-faktörler tahlil kalitesini değerlendirmek üzere her parametre için. Z′ 1−3X = (STD+% 100 kontrolSTD% 0 kontrol) / | % 100 kontrol−Mean% 0 kontroldemek |.
Not: Bir Z'-faktörü 0 orta tahlil yüksek içeriği ekran ve bir Z için yeterli gösterir daha yüksek ' faktörü 0,5 ile 1 arasında üstün bir tahlil için bir yüksek üretilen iş ekran20,21gerekli öneriyor. - Her parametre için bir iki renkli ısı haritası oluşturmak için elektronik tablo yazılımı kullanın. Hücre hatları x ekseni ve y ekseni üzerinde bileşikler adını düzenleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Biz rhodopsin taşıma üç parametre ile karakterize: tüm cep telefonu (Rhodopsin-Venus INT), rhodopsin plazma zarı (hücre yüzeyinde Rhodopsin INT) üzerinde immunostaining yoğunluğu ve oranı rhodopsin-Venus yoğunluğu Tüm cep telefonu (MEM-toplam oranı) rhodopsin-Venus yoğunluğu için hücre yüzeyinde rhodopsin leke. Temsilcisi rhodopsin taşıma tahlil sonucunda Şekil 3 ve Şekil 4gösterilir. DMSO ve 9 - kullanarakCIS-Retina tedavi P23H rhodopsin Venüs 0 ve %100 denetimleri sırasıyla ifade hücreleri Z'-Bu üç parametre 0-0.5, düşündüren tahlil orta kalite vardır arasında arasındadır için faktörler yüksek-içerik görüntüleme21için yeterli. Olsa bile en iyi duruma getirilmiş Z'-faktörler 0,5 HTS tahlil için karşılaştırıldığında, oldukça karmaşık işlemleriyle nedeniyle daha düşük, hala sağlam ve güvenilir bir yansıma tabanlı analiz için bu tahlil olduğunu. Misfolded rhodopsin kurtarır etkin bir bileşik Rhodopsin int daha yüksek değerler hücre yüzeyine ve MEM-toplam oranı DMSO, P değeri 0,05 düşük daha göstermelidir. Üç 2-B ısı haritaları ortalama rhodopsin tutar ve yerelleştirme hücre (Şekil 4) başına karşılaştırmak için bu üç parametre oluşturulan. Triplicates içinde tekrarlanan, WT ve altı rhodopsin mutantlar yatay olarak listelenir ve bileşik tedavilerinin etkileri dikey olarak karşılaştırılır. Önceki çalışmalar ile anlaşma rhodopsin INT hücre yüzeyine ve MEM-toplam oranı altı mutantlar DMSO (Şekil 4 c)5,22,23ile tedavi WT rhodopsin kıyasla daha düşük. Hücre yüzeyine ve onun MEM toplam oranı rhodopsin INT arttı 9 -CIS-T4R, P23H, D190N ve P267L, ama ima değil P53R veya C110Y mutantlar, Retina tedavisinde 9 -CIS-Retina kurtarır T4R, taşıma P23H, D190N ve P267L rhodopsin mutantlar. Tüm cps artış düzeyleri değişen hücre yüzeyinde Rhodopsin INT T4R, P23H ve D190N için gösterdi. CPS 3, 4, 5, 7, 8 ve 11 rhodopsin-Venus INT ama değil bu bileşiklerin sadece rhodopsin miktarı artmış düşündüren bu rhodopsin mutant MEM toplam oranı arttı. CPS 1, 2 6 ve 9 T4R, P23H, D190N ve P267L rhodopsin mutantlar, bu bileşiklerin bu rhodopsin mutant plazma zarı için taşıma kurtarmak düşündüren MEM toplam oranı önemli ölçüde arttı. 2-B profilleri farklı farmakolojik tedavi ile hafifletilmiş bu ilişkili adRP mutasyonlar etkilenen rhodopsin taşıma kapsamlı bir genel bakış sağlar.
Şekil 1: iş akışı rhodopsin taşıma testin. Yordamlar rhodopsin membran permeabilization rhodopsin taşıma tahlil için olmadan, hücre yüzey boyama için. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: 5 x çalışma çözümleri ve 96-şey plaka sıvı aktarma 384-şey plaka için hazırlanması için illüstrasyonlar. (A) 5 çalışma çözümleri x 96-şey plaka düzeni. Wells A1 G2 için var 300 µL ilâ 15 5 x çalışma çözümleri ve tahlil Orta (M) kuyu başına sütun 1 ve 2 gösterildiği gibi. 14 ve 15 bileşiklerdir % 2 DMSO ve 25 µM 9 -CIS-Retina, sırasıyla, WT ve mutant rhodopsin ifade yedi hücre hatları için tedavi için. Ayrıca, 11 ve 12 100 µL % 2 DMSO ve 25 µM 9 - kuyu sütunlarınızınCIS-Retina denetler, sırasıyla, P23H rhodopsin Z hesaplanması için ifade hücreleri tedavi '-faktörler. (B) hücre türü ve tedavi koşulları için 384-şey plaka düzeni. U2OS hücreleri ifade WT, T4R, P23H, P53R, C110Y, D190N ve P267L rhodopsin Venüs numaralı seribaşı gösterildiği gibi. Tedavi koşulları mavi olarak etiketlenir. Pembe ve mavi ipuçları iyi şey sıvı aktarma 96-şey tabaktan çok kanallı pipet kullanarak 384 plakasına göstermektedir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: temsilcisi görüntüler ve rhodopsin taşıma tahlil kontrollerin quantifications. (A) Venüs Floresan (yeşil) ve hücre yüzey immunostaining (kırmızı) WT veya P23H rhodopsin Venüs ifade U2OS hücrelerinin tedavi DMSO veya 5 mikron 9 -CIS-retina. Ölçek çubuğu 200 µm. (B) A sütun Arsa rhodopsin tutarı tüm cep telefonu (Rhodopsin-Venus INT) temsil eden hücre başına ortalama Venüs yoğunluk =. p< 0,0001. Z'-faktör altında siyah çizgi gösterilir. Sütun değeri ve hata çubuğu are ortalama ve standart sapma (SD) 16 çoğaltır, anılan sıraya göre. (C) A sütun Arsa Cy3 yoğunluğu (hücre yüzeyinde Rhodopsin INT) hücre yüzeyinde lekeli rhodopsin temsil eden hücre başına demek. (D) Venüs yoğunluğu rhodopsin düzeyi hücre yüzeyi oranını temsil eden onun bütün hücre yüzey (MEM toplam oranı) hücre başına demek için bir sütun Arsa hücre başına ortalama cy3 yoğunluk oranı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: bir temsilcisi yüksek içerik analizi olarak 2 renk ısı haritaları gösterilen rhodopsin taşıma testin. (A) ısı haritası Venüs yoğunluğu bütün hücreli rhodopsin düzeyi (Rhodopsin-Venus INT) temsil eden hücre başına demek. Her blok bir veri noktasını temsil eder ve her koşul nüsha test edildi. Renkli gösterge solda gösterilir. CP, bileşik. (B) ısı haritası Cy3 yoğunluğu (hücre yüzeyinde Rhodopsin INT) hücre yüzeyinde lekeli rhodopsin temsil eden hücre başına demek. (C) Cy3 yoğunluk Venüs yoğunluğu rhodopsin düzeyi hücre yüzeyi oranını temsil eden onun bütün hücre yüzey (MEM toplam oranı) hücre başına ortalama hücre başına ortalama ısı harita. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, bir HTS. tespit sayısı karakterize için kullanılan bir yüksek-içerik görüntüleme tahlil ortaya Bu iletişim kuralları dahil tek Otomasyon yüksek içerikli Imager var. İmmunostaining ve floresan görüntüleme rhodopsin rhodopsin5,14,15,16lokalizasyonu karakterize etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Ancak, geleneksel görüntüleme yöntemleri tarafından çekilen görüntüleri miktar koşul, deney başına görüntü düşük kapasite ve kalite kontrol parametre eksikliği başına yeterli hücre görüntülerini eksikliği ile sınırlıdır. Biz geleneksel immunostaining Protokolü 384-şey biçimine adapte ve geleneksel görüntüleme yüksek içerik görüntüleme ile değiştirilir. Bu yüksek-içerik görüntüleme iletişim kuralını kullanan, biz başarıyla seçilen ve bir HTS11,13,17tarafından tanımlanan sayısı faaliyetleri ile karakterizedir. Geleneksel immunostaining ve görüntüleme yöntemleri ile karşılaştırıldığında, bu protokol önemli ölçüde kıvamı görüntüleme koşulları, görüntüleme kapasitesi ve kantitatif farmakolojik etkileri karşılaştırmak için bize etkin görüntü analiz gücü artar altı adRP taşımacılığının doğru 11 bileşiklerin rhodopsin mutantlar ilişkili.
Bu protokol rhodopsin immunostaining ve görüntüleme için daha önce kullanılan protokollere göre önemli değişiklikler: (1) büyüyen ve immunostaining hücrelerinde bir açık-alt 384-şey plaka; (2) yüksek-içerik Görüntüleyici kullanarak hücreleri görüntüleme; ve bir yüksek-içerik görüntü analiz yazılımı ile (3) çözümlenirken veri. Bu değişiklikler nedeniyle, ilk bir optimizasyon en iyi hücre tohum sayısı, antikor konsantrasyonları, görüntüleme koşulları ve görüntü analiz algoritmaları bulmak için gereklidir.
Protokolü'nün önemli adımlar şunlardır: (1) % 50-70 izdiham fiksasyonu önce; izin hücreleri tohumlama (2) dikkatli özlemleri hücre dekolmanı önlemek için; (2) Imaging çeşitli wells görüntü odak üstünde olduğundan emin olun ve tüm kanallarını bulabilsem bütün plaka arasında Imager olumlu denetim kuyuları için eşik yarısı bütün tabağı Imaging önce geçmez; ve (3) koruma Z'-faktör tahlil güvenilirliğini sağlamak için 0'dan daha yüksek.
Bu iletişim kuralı için karşılaştı en yaygın sorunları hücre dekolmanı ve düşük Z vardır '-faktörler. İlk sorunu önlemek için hücre eki kolaylaştırılması ve ayır hücre hatları kolayca Hek293 hücreleri gibi kullanmaktan kaçının için poli-L-lizin ile 384-şey plaka pretreat. Ayrıca, her şey sadece bir yüzü aspirasyon sırasında dokunmak ve diğer yüzdeki her iyi görüntüleme için aspirasyon ucu sınırı. Z geliştirmek için '-faktör ve hücrenin hücre şekil veya yazılım tarafından tanımlanan çekirdek şekli uygun her floresans kanaldaki her nesne ile iyi olduğundan emin olmak için sayı ve görüntü analiz parametrelerini tohum optimize tahlil kalitesi.
Hangi tüm hücreleri hücre yüzey üzerinde hedef protein düzeyinin hesaplanması, rhodopsin aktarım türünü, bir hücre yüzey ELISA veya β-galaktozidaz parçası uluslara tahlil ölçmek için diğer yöntemlerine göre quantifies bu yüksek-içerik görüntüleme yöntemi hücre başına ortalama protein seviyesi; ve bu benzersiz özellik önler bir kritik değişim faktörü, diğer yöntemleri son çıktıları etkiler cep numarası. Ayrıca, yansıma ve yüksek-içerik görüntüleme yöntemi tarafından sayısal hücreleri çok sayıda nedeniyle, parametreleri tüm hücreleri arasında çoğaltır, böylece tahlil güvenilirliğini ekleyerek de gösterdi düşük varyasyon başına ortalama olarak.
Bu iletişim kuralı bir sınırlama onlar dolay iden onun nispeten karmaşık bir prosedür ve zaman Imaging plaka başına 2 h için HTS, deneyleri en iyi değildir. Bu sayede büyük küçük molekül kütüphaneleri 5.000'den fazla bileşikler ile süzmek için alternatif muhabir deneyleri tavsiye ve odaklı karakterizasyonu deneyleri için 100 bileşikler sınırlı için bu yüksek-içerik görüntüleme iletişim kuralını kullanın. İkinci bu protokol standartları Venüs floresan veya immunostaining floresan yoğunluklarda rhodopsin protein miktar hücre başına miktarı ile doğrusal bir ilişki içinde olup olmadığını göstermek için eksikliğine kısıtlamasıdır. Doygunluk immunostaining tarafından önlemek için test ve immunostaining yoğunluklarda birincil ve ikincil antikorları farklı konsantrasyonları ile inkübe hücre komplo öneririz. Antikor konsantrasyonları Variety değişimin doğrusal Aralık içinde seçin.
Geçerli uygulamadan genişleterek, biz rhodopsin taşıma geçici bu bileşiklerin farmakolojik bir veritabanı oluşturmak için 28 farklı rhodopsin mutantlarla kadar 10 bileşikler ile tedavi altında transfected hücre görüntülerden ölçmek rehberlik adRP hastalara bu rhodopsin mutasyonlar taşıyan olası tedaviler için etkinlik. Bu iletişim kuralı da kolayca herhangi bir membran protein diğer protein hastalıkları misfolding uyuşturucu keşifler için yararlı olacağını ilgi translocation deneyleri için adapte edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Biz Dr Mark E. Schurdak teşekkür ve Pittsburgh Üniversitesi ilaç Discovery Enstitüsü için-mek şartıyla yüksek-içerik Imager ve ilk eğitimler. Dr. Krzysztof Palczewski (Case Western Reserve Üniversitesi) cömertçe 1 d 4 ve B630 Anti-rhodopsin antikorlar paylaştı. Fare rhodopsin-Venus yapı cDNA içeren plazmid Dr. Nevin Lambert (Augusta Üniversitesi) tarafından paylaşıldı. Bu eser Pittsburgh Üniversitesi vizyon araştırma çekirdek grant YC ve P30EY008098 sağlık hibe EY024992 Ulusal Enstitüsü tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| U2OS (rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (T4R-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P23H-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P53R-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (C110Y-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (D190N-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P267L-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| DMEM high glucose | Genesee Scientific | 25-500 | With L-Glutamine, sodium pyruvate |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16140071 | Heat inactivated |
| Plasmocin | InvivoGen | ant-mpt | Mycoplasma elimination reagent |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Gibco | 15140122 | 100X concentrated antibiotic solutions to prevent bacteria contamination of cell cultures |
| Trypsin-EDTA | Genesee Scientific | 25-510 | 0.25%, 1mM EDTA in HBSS without calcium and magnesium |
| Poly-L-lysine solution | Sigma-Aldrich | P4707-50ML | Mol wt 70,000-150,000, 0.01%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| CellCarrier-384 Ultra Microplates | PerkinElmer | 6057300 | 384-well tissue culutre-treated microplates with black well walls and an optically -clear cyclic olefin bottom for imaging cells in high content analysis |
| Sterile 96-well plate | Eppendorf | 30730119 | Tissue culture treated with lid flat bottom, sterile, free of detectable pyrogens, Rnase, DNase and DNA. Non-cytotoxic |
| Phosphate Buffered Sailine (PBS) | Invitrogen | AM9625 | 10 x PBS Buffer, pH 7.4 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D4540 | >99.5%, cell culture tested |
| 9-cis-retinal | Sigma-Aldrich | R5754 | |
| Compounds tested | Selleckchem/Life Chemicals/Custom synthesized | NA | Compounds were purchased from different vendors or custom synthesized |
| B6-30 anti-rhodopsin antibody | Novus | NBP2-25160 | Gift from Dr. Krzysztof Palczewski |
| Cy3-conjugated goat anti-mouse secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc | 115-165-146 | |
| 16% paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Methanol-free |
| 10% Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 50062Z | Blocking buffer |
| Hoechst 33342, Trihydroch | Invitrogen | H3570 | Nuclear staining solution |
| High-content imager | Molecular Devices | ImageXpress | ImageXpress® Micro Confocal High-Content Imaging System |
| MetaXpress high-content image acquisition and analysis software | Molecular Devices | MetaXpress | High-content image acquisition and analysis software |
| Multichannel pipette (0.5-10 µL) | Rainin | 17013802 | Manual 8-channel pipette, 0.5-10 µL |
| Multichannel pipette (0.5-10c | Rainin | 17013805 | Manual 8-channel pipette, 20-200 µL |
| Electronic multichannel pipette (10-200 μL) | Thermo Scientific | 14-3879-56BT | Electronic multichanenel pipette for 96- and 384-well microplate pipetting tasks |
| 50ml Reagent Reservoir | Genesee Scientific | 28-125 | Reagent reservior for multichannel pippte dispensing |
| 8-Channel aspirator | ABC Scientific | EV503 | 8-Channel stainless steel adaptor for aspirating liquids from 96- or 384-well plates |
| Excel spreadsheet software | Microsoft | Excel2016 | The spreadsheet software for data analysis and heatmap generation |
| Origin2018 scientific data analysis and graphing software | OriginLab | Origin2018 | The data analysis software for generating the dose response curves |
References
- Gregersen, N., Bross, P., Vang, S., Christensen, J. H.
- Daiger, S. P., Bowne, S. J., Sullivan, L. S. Perspective on genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Archives of Ophthalmology. 125 (2), 151-158 (2007).
- Daiger, S. P., Sullivan, L. S., Bowne, S. J. Genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Clinical Genetics. 84 (2), 132-141 (2013).
- Stenson, P. D., et al. The Human Gene Mutation Database: towards a comprehensive repository of inherited mutation data for medical research, genetic diagnosis and next-generation sequencing studies. Human Genetics. 136 (6), 665-677 (2017).
- Sung, C. H., Schneider, B. G., Agarwal, N., Papermaster, D. S., Nathans, J. Functional heterogeneity of mutant rhodopsins responsible for autosomal dominant retinitis pigmentosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (19), 8840-8844 (1991).
- Athanasiou, D., et al. The molecular and cellular basis of rhodopsin retinitis pigmentosa reveals potential strategies for therapy. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 1-23 (2018).
- Chiang, W. C., et al. Robust Endoplasmic Reticulum-Associated Degradation of Rhodopsin Precedes Retinal Degeneration. Molecular Neurobiology. 52 (1), 679-695 (2015).
- Sakami, S., et al. Probing mechanisms of photoreceptor degeneration in a new mouse model of the common form of autosomal dominant retinitis pigmentosa due to P23H opsin mutations. Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 10551-10567 (2011).
- Dryja, T. P., et al. Mutations within the rhodopsin gene in patients with autosomal dominant retinitis pigmentosa. New England Journal of Medicine. 323 (19), 1302-1307 (1990).
- Sohocki, M. M., et al. Prevalence of mutations causing retinitis pigmentosa and other inherited retinopathies. Human Mutation. 17 (1), 42-51 (2001).
- Chen, Y., et al. A novel small molecule chaperone of rod opsin and its potential therapy for retinal degeneration. Nature Communications. 9 (1), 1976 (2018).
- Chen, Y., Tang, H. High-throughput screening assays to identify small molecules preventing photoreceptor degeneration caused by the rhodopsin P23H mutation. Methods in Molecular Biology. 1271, 369-390 (2015).
- Chen, Y., et al. A High-Throughput Drug Screening Strategy for Detecting Rhodopsin P23H Mutant Rescue and Degradation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (4), 2553-2567 (2015).
- Noorwez, S. M., et al. Pharmacological chaperone-mediated in vivo folding and stabilization of the P23H-opsin mutant associated with autosomal dominant retinitis pigmentosa. Journal of Biological Chemistry. 278 (16), 14442-14450 (2003).
- Saliba, R. S., Munro, P. M., Luthert, P. J., Cheetham, M. E. The cellular fate of mutant rhodopsin: quality control, degradation and aggresome formation. Journal of Cell Science. 115, 2907-2918 (2002).
- Kaushal, S., Khorana, H. G. Structure and function in rhodopsin. 7. Point mutations associated with autosomal dominant retinitis pigmentosa. Biochemistry. 33 (20), 6121-6128 (1994).
- Chen, Y., Brooks, M. J., Gieser, L., Swaroop, A., Palczewski, K. Transcriptome profiling of NIH3T3 cell lines expressing opsin and the P23H opsin mutant identifies candidate drugs for the treatment of retinitis pigmentosa. Pharmacological Research. 115, 1-13 (2016).
- Adamus, G., et al. Anti-rhodopsin monoclonal antibodies of defined specificity: characterization and application. Vision Research. 31 (1), 17-31 (1991).
- Goodson, H. V., Dzurisin, J. S., Wadsworth, P. Generation of stable cell lines expressing GFP-tubulin and photoactivatable-GFP-tubulin and characterization of clones. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (9), pdb prot5480 (2010).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Bray, M. A., Carpenter, A., et al. Advanced Assay Development Guidelines for Image-Based High Content Screening and Analysis. Assay Guidance Manual. Sittampalam, G. S., et al. , Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. Bethesda (MD). (2004).
- Sung, C. H., Davenport, C. M., Nathans, J. Rhodopsin mutations responsible for autosomal dominant retinitis pigmentosa. Clustering of functional classes along the polypeptide chain. Journal of Biological Chemistry. 268 (35), 26645-26649 (1993).
- Krebs, M. P., et al. Molecular mechanisms of rhodopsin retinitis pigmentosa and the efficacy of pharmacological rescue. Journal of Molecular Biology. 395 (5), 1063-1078 (2010).
