Summary
Her beskrev vi en høyt innhold bildebehandling metode for å kvantifisere transport av rhodopsin mutanter tilknyttet retinitis pigmentosa. En flere-bølgelengde scoring analyse ble brukt om å kvantifisere rhodopsin protein på cellens overflate eller i hele cellen.
Abstract
Rhodopsin misfolding mutasjoner føre til rod photoreceptor død som er manifestert som autosomal dominant retinitis pigmentosa (RP), en progressiv blendende sykdom som mangler effektiv behandling. Vi hypothesize at cytotoksisitet av misfolded rhodopsin muterte kan lindres ved farmakologisk stabilisere mutant rhodopsin protein. P23H mutasjon, blant andre klasse II rhodopsin mutasjoner, koder et strukturelt ustabil rhodopsin mutant protein som er akkumuleres i det endoplasmatiske retikulum (ER), mens det vill type rhodopsin transporteres til plasma membranen i pattedyr celler. Vi har tidligere utført en luminescence-baserte høy gjennomstrømming skjerm (HTS) og identifisert en gruppe farmakologiske chaperones som reddet transport av P23H rhodopsin fra ER til plasma membranen. Her kvantifisert bruker en immunostai-metoden etterfulgt av et høyt innhold tenkelig analyse, vi mutant rhodopsin protein mengden i hele cellen og på plasma membranen. Denne metoden er informativ og effektiv å identifisere ekte treff fra falske positiver etter HTS. I tillegg mulig høyt innhold bildeanalyser for oss å kvantifisere flere parametere fra ett enkelt eksperiment å evaluere Farmakologiske egenskaper for hver sammensatte. Bruker denne analysen, analyserte vi effekten av 11 forskjellige forbindelser mot seks RP forbundet rhodopsin mutanter, skaffe en 2D-farmakologiske profil for en kvantitative og kvalitative forståelse for strukturelle stabiliteten av disse rhodopsin mutanter og effekten av ulike forbindelser mot disse mutanter.
Introduction
Protein misfolding er involvert i muskeldystrofi, neural degenerations, samt blendende sykdommer, inkludert retinitis pigmentosa (RP)1. RP er en arvelig og progressive retinal degenerasjon tilknyttet mutasjoner i over 60 gener påvirker funksjon og homeostase av rod fotoreseptorer eller retinal pigmentert epitheliums (RPEs)2,3. Ingen effektiv behandling er tilgjengelig for RP. Rhodopsin mutasjoner utgjør ca 25-30% av autosomal dominant (ad) RP tilfeller. Blant de mer enn 150 rhodopsin mutasjoner4 (menneskelige gen mutasjon Database, http:/ www.hgmd.cf.ac.uk/), klasse II mutasjoner forårsake strukturell ustabilitet av rhodopsin protein som bidrar til at rod photoreceptor og visjonen tap5,6,7,8. P23H er de hyppigste rhodopsin mutasjonen i Nord-Amerika som er også et typisk eksempel på klasse II rhodopsin mutasjoner9,10. På grunn av dens iboende strukturelle ustabilitet, er misfolded rhodopsin akkumuleres i det endoplasmatiske retikulum (ER) i pattedyrceller, mens det vill type rhodopsin ligger på plasma membranen5. Den misfolded rhodopsin P23H mutant utstillinger dominerende negative cytotoksisitet som er ikke på grunn av haploinsufficiency, men er knyttet til aktivering av ER tilknyttet protein fornedrelse veien og avbrutt stang ytre segmentet organisasjonen. For å lindre rod photoreceptor celle stress, er en strategi å stabilisere innfødt folding av den muterte rhodopsin bruker en farmakologisk Anstandsdame.
For å oppnå dette målet, utført vi et cellebasert høy gjennomstrømming skjermen (HTSs)11,12,13 med en β-galactosidase fragment complementation analysen for å kvantifisere P23H rhodopsin mutant transporteres på plasma membran. Robust og enkel protokoll for denne HTS analysen mulig for oss å utforske aktiviteter om 79,000 små molekyler for hver skjerm. Men fordi denne HTS analysen leser luminescence signaler, er falske positiver inkludert β-gal-hemmere, farget eller cytotoksiske forbindelser inkludert i trefflisten venter identifiseres av en sekundær analysen.
Den tradisjonelle immunostai- og fluorescens tenkelig metoder har blitt brukt i år for å studere rhodopsin transport i pattedyrceller5,14,15,16. Men kan disse konvensjonelle metoder brukes å kvantifisere farmakologiske effekter av mer enn 10 forbindelser mot rhodopsin transport fordi en pålitelig tenkelig analyse krever et stort antall bilder tatt under en svært konsekvent tilstand, som er ikke amendable av konvensjonelle tenkelig metoder. Her har vi utviklet en immunostai-basert høyt innhold tenkelig protokoll som en sekundære analysen å kvantifisere cellen overflaten transport av misfolded rhodopsin mutanter11,13,17. Hvis etiketten rhodopsin på plasma membranen, hoppet vi trinn i cellemembranen permeabilization og immunostained rhodopsin mutanter av et monoklonalt (B6-30) anti-rhodopsin gjenkjenne N-terminal epitope av rhodopsin på ekstracellulære siden av cellen membran18. For å visualisere den muterte rhodopsin i hele cellen, smeltet vi rhodopsin med Venus fluorescens protein. Ved kvantifisering av fluorescens intensiteten i forskjellige fluorescens kanaler er vi i stand til å hente flere parametere i et enkelt eksperiment inkludert totale rhodopsin intensiteten i hele cellen på celleoverflaten og forholdet mellom rhodopsin fluorescens på celleoverflaten som i hele cellen. Bruk denne metoden til å stable celler uttrykke totalt seks misfolded rhodopsin mutanter, kan vi generere en farmakologisk profil av flere små molekyl chaperones mot disse mutanter. I denne protokollen, alle cellene er immunostained i en 384-vel plate og fotografert med et automatisert tenkelig system under en svært konsekvente bildebehandlingsprogrammer tilstand. En bildeanalyser utføres hver brønn, med bilder av mer enn 600 celler og reduserer variasjonen skyldes heterogenitet cellene med varierende form og protein uttrykk cellenivå. Arbeidsflyten denne protokollen summeres i figur 1. Fordelen med denne metoden er at vi får høy oppløsning samt flere parameter quantifications fra image-basert analyse. Generelt kan denne protokollen endres og brukes for å kvantifisere transport av noen misfolded membran proteiner av interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: Rhodopsin transport analysen.
1. forberedelse og kultur av celler
- Gjenopplive cryo bevarte U2OS stabile celler uttrykke det vill type (WT) eller mutant musen rhodopsin-Venus fusion proteiner. Tine cellene på 37 ° C før bare små iskrystaller er igjen i ampullen.
Merk: U2OS cellene er brukt i denne protokollen fordi det er ingen photoreceptor celle linje tilgjengelig for i vitro studier og pre ciliary biosyntesen av rhodopsin er regulert av lignende molekylære mekanismer i pattedyrceller. Dessuten U2OS cellene feste tett til bunnen av platen og har stor cellen legemer, så de er ideelle for rhodopsin transport analysen. Syv U2OS stabile celler uttrykke WT, T4R, P23H, P53R, C110Y, D190N og P267L rhodopsin mutanter brukes her som eksempel viser kvalitet og pålitelighet til analysen. Stabil celler uttrykke andre rhodopsin mutanter eller andre membran proteiner kan brukes, avhengig av målet for analysen. Stabil celler uttrykke menneskelige rhodopsin kan brukes i denne analysen hvis tilgjengelig. Musen rhodopsin ble brukt her fordi musen og menneskelige rhodopsin proteiner dele 95% homologi, og forbindelsene identifisert av denne analysen vil bli testet i vivo med en mus adRP modell bærer rhodopsin P23H mutasjon8. Stabil cellene ble generert som beskrevet tidligere19. WT og mutant rhodopsin transkripsjoner ble kvantifisert ved q-PCR og kloner av stabil celler uttrykke lignende nivåer av WT og mutant rhodopsin transkripsjoner ble valgt for denne analysen. Uttrykket av rhodopsin proteiner ble bekreftet av immunoblot og immunostai. Passering av celler som brukes i denne analysen bør være lavere enn 20. - Overføring av celler i et 15 mL konisk rør som inneholder 10 mL av oppblomstringen medium (høy glukose Dulbecco endret Eagle's medium (DMEM) med 10% fosterets bovin serum (FBS) og 5 µg/mL Plasmocin).
- Sentrifuge røret på 200 x g for 5 min. Forkast nedbryting og resuspend celle pellets med 5 mL av celle vekst medium for hver celle linje. Overføring av cellen suspensjon i en 60 mm vev kultur parabol og ruge på 37 ° C med 5% CO2.
- Subkultur cellene når vev kultur parabol når 90% samløpet som beskrevet i referanse12.
2. seeding cellene på 5000 celler per brønn
Merk: Utfør følgende fremgangsmåter i vev kultur hette.
- Behandle platen med poly-lysine.
- En dag før såing cellene, behandle en svart vegg og fjern 384-vel bunnplaten med 20 µL/godt av poly-lysine løsning for 30 min.
- Sug opp væske og la alle brønnene tørke for 1 h. sette tilbake plate lokket og lagre platen ved 4 ° C over natten i cellen seeding.
- Forberede celle suspensjon.
- Kultur hver celle linje i vekstmediet i en 100 mm vev kultur rett til 90% samløpet.
- Vask hver rett med fosfat bufret saltvann (PBS) og koble cellene med 1 mL av 0,05% Trypsin på 37 ° C.
- Resuspend av celler i 10 mL av analysen medium (høy-glukose DMEM med 10% FBS, 100 enheter/mL penicillin og 100 μg/mL streptomycin).
- Telle celler og fortynn hver linje celleområdet til 1,25 x 105 celler/mL med analysen mediet.
- Ætt cellene.
- Bruke en elektronisk flerkanals pipette eller en automatisert reagens dispenser til å dispensere 40 µL/vel av cellen suspensjon til tre kolonner per celle linje og fyll kolonner 1-21 384-vel platen (figur 2).
- Legge til 40 µL/godt av U2OS (P23H-Rhodopsin-Venus) kolonner 22-23 og 40 µL/godt av U2OS (Rhodopsin-Venus) til kolonne 24, som kontroller.
- Sentrifuge platen på 300 x g for 30 å få ned alle celler til bunnen av 384-vel platen.
Merk: Unngå fysisk støt til platen etter celle seeding. Ellers celler vil bli knust til ett hjørne av hver brønn, og platen kan ikke egnet for høyt innhold bildebehandling. - Inkuber 384-vel platen på 37 ° C med 5% CO2 for 3t for cellene å feste til bunnen av platen.
3. behandle cellene med forbindelser
- Generere kart plate med behandling forhold som vist i figur 2.
- Forberede 300 µL av 5 x arbeider løsninger av opptil 15 forbindelser i en 96-brønns plate.
- Fortynne cps 1-15 med analysen mediet til fem ganger for deres endelige i brønner A1 til G2 96-brønnen plate (figur 2A). Legg 300 µL av analysen medium i godt H2.
Merk: Den siste konsentrasjonen av hver sammensatte brukes på den mest effektive konsentrasjonen for redning transport av P23H rhodopsin av HTS12,13. - Legge til 100 µL per brønn av 2% dimethyl sulfoxide (DMSO) og 25 µM 9 -cis-retinal som er utvannet i analysen medium kolonner 11 og 12, henholdsvis. Legge til 9 -cis-netthinnen i svakt lys.
- Fortynne cps 1-15 med analysen mediet til fem ganger for deres endelige i brønner A1 til G2 96-brønnen plate (figur 2A). Legg 300 µL av analysen medium i godt H2.
- Legge 10 µL per brønn 5 x arbeider løsninger til 384-vel plate kultivert med celler (figur 2B).
- Bruke en elektronisk flerkanals pipette legge forbindelser 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 og 15 til rader A, C, E, G, I, K, M og O fra kolonner 1 til 21 (figur 2). Legge til forbindelser 2, 4, 6, 8, 10, 12: 14 og M til rader B, D, F, H, J, L, N og P fra kolonner 1 til 21.
- Legge til 10 µL per brønn av 2% DMSO kolonner 22 og 24. Legge til 10 µL per brønn på 25 µM 9 -cis-retinal kolonne 23.
Merk: DMSO brukes som et kjøretøy kontroll fordi alle forbindelser er utgangspunktet oppløst i DMSO som aksjer. Kolonnen 22 med DMSO behandlet celler uttrykke P23H rhodopsin brukes som kontrollen 0%. 9 -Cis-netthinnen behandlet celler uttrykke P23H rhodopsin brukes som 100% kontroll.
- Dekkramme 384-vel med aluminiumsfolie og ruge platen ved 37 ° C i 24 timer.
4. Immunostaining uten membran Permeabilization stain Rhodopsin Protein på cellens overflate.
Merk: Unngå alle vaskemiddel i hele immunostai-prosessen å holde cellemembranen intakt.
- Klargjør 4% paraformaldehyde (PFA) ved å fortynne 16% PFA med PBS i en 1:4 volumkontrollen i kjemisk avtrekksvifte. Overføre 4% PFA i en reagens reservoaret.
- Ta ut 384-vel platen i et mørkt rom med svak rødt lys. Bruk en 8-kanals aspirator koblet til en vakuum samling flaske forsiktig som inneholder mediet. Bruker en elektronisk flerkanals Pipetter til 20 µL per brønn av nylagde 4% PFA til hele 384-vel plate og Inkuber for 20 min ved romtemperatur. For å unngå celle avdeling, alltid pek tips av aspirator på samme side av hver brønn under ambisjoner. Berør ikke området midten nederst i hver brønn. Når du tar bilder, velge felt unngå regionen berørt av aspirator. I incubations lengre enn 10 min, dekke 384-vel platen med sin lokk for å unngå fordampning.
Merk: Celler er fast i et mørkt rom å unngå photobleaching av den gjenfødte isorhodopsin som vil påvirke resultatet av kontrollen 100%. Etter fiksering, kan 384-vel platen tas under vanlig lys. - Bruk en 8-kanals aspirator Sug opp PFA i hver brønn og bruke en elektronisk flerkanals Pipetter til 50 μL per brønn på PBS. Gjenta to ganger utføre tre vasker med PBS.
FORSIKTIG: Avfall flytende inneholder PFA er samlet i en avkortet flaske og skal behandles som en farlig kjemisk avfall etter eksperimentet. - Blokkere cellene ved å legge til 20 µL per brønn av 5% geit serum hele 384-vel platen og ruge ved romtemperatur for 30 min.
- Sug opp 5% geit serum og legge til 15 µL per brønn 20 µg mL-1 B6-30 anti-rhodopsin antistoff i 1% geit serum rader A O. legge 15 µL per brønn av 1% geit serum raden P for sekundær antistoff-bare kontrollgruppen.
- Inkuber 384-vel platen ved romtemperatur for 90 min eller 4 ° C over natten. Dekkramme 384-vel med aluminiumsfolie å unngå photobleaching av fluorophores.
- Vaske platen 3 ganger med 50 µL per brønn på PBS.
- Sug opp PBS og legge 15 µL per brønn 5 µg mL-1 Cy3-konjugerte geit anti-musen IgG antistoff. Dekkramme 384-vel med aluminiumsfolie og ruge ved romtemperatur 1t eller 4 ° C over natten.
- Vaske platen 3 ganger med 50 µL per brønn på PBS. Legge til 50 µL per brønn av PBS som inneholder 1 µg mL-1 Hoechst 33342 stain kjerner i romtemperatur i 15 min.
- Forsegle 384-vel platen med gjennomsiktige filmen før bildebehandling. Dekkramme 384-vel med aluminiumsfolie og lagre ved 4 ° C i opptil en uke hvis bilder er tatt umiddelbart.
5. imaging.
Merk: Denne høyt innhold tenkelig prosedyren er tilpasset tenkelig systemet oppført i Tabellen på materiale. Prosedyrer kan være forskjellige hvis bruker andre høyt innhold imaging-systemer.
- Fjern lokket og la 384-vel platen i høyt innhold imager med A1 plassert øverst i venstre hjørne av platen.
- Åpne bildet oppkjøpet programvaren til å definere parametere for bildeopptak.
- Åpne vinduet Plate oppkjøpet Setup og opprette ny innstilling eller laste inn en eksisterende installasjonsfil.
- Velg 20 x målsettingen og definere pixel binning 2 så den kalibrerte pikselstørrelsen er 0,80 x 0,80 µm. Angi av linjer som 2000 og bildestørrelsen (W x H) som 1000 x 1000 piksler (800.00 x 800.00 µm) per område.
- Velg platen til å avbildes. Bruk informasjonen fra produsenten av platen 384-og fylle ut platen dimensjonene.
- Velg brønnene til å avbildes for 384-vel plate.
- Velg fire områder til å avbildes per brønn. Unngå siden av den godt rørt av aspirasjon tips.
- Velg eksitasjon lasere som 405 488 og 561 nm. Velg utslipp filtre for DAPI, FITC og Texas rød kanaler. Optimalisere laser makt gevinster av hver kanal å sikre lysstyrken på bilder tatt fra positiv kontroll brønnene er mindre enn terskelverdien metning.
- Velg godt-å-godt fokus for autofokus. Velg den første brønnen ervervet som første for å finne eksempler. Angi området autofokus på alle områder.
- Velg fire gjennomsnitt per linje for hver kanal. Optimalisere Z-forskyvningsverdien for hver kanal.
- Testen 2-3 brønner på diagonale hjørner av 384 godt plate å sørge for at bildene er i fokus for alle testet brønner, bilder fra alle områder per brønn har celler med mer enn 40% samløpet og fluorescens intensiteter av alle kanaler er omtrent halvparten mettet i 100% kontrollere brønner.
- Lagre bilde anskaffelsesmetoden.
- Kjøre hele platen. Se imager til den er ferdig ta bilder fra den første kolonnen av platen dobbeltsjekke bildekvaliteten før avreise imager. Ta 384-vel plate og lagre på 4 ° C for fremtidig bruk.
Merk: Avhengig av antall områder i hver brønn og kanaler tatt, tar det 40 min til 3t til slutt imaging en 384-vel plate.
6. bildeanalyser.
- Trekk ut bildedataene bruker en høy-innhold analyseprogramvare. Velg ett av 100% kontroll (kolonne 23) til å definere parametere.
- Velg Flere bølgelengde celle Scoring som metoden analyse og konfigurere innstillingene.
- Definere kjerner bruker bilder fra DAPI kanalen. Forhåndsvise at definerte kjerner figurene i den valgte godt passer godt med kjerner bildene.
- Definere celle i FITC kanalen der rhodopsin-Venus er fotografert.
- Definere rhodopsin cellen overflaten flekken områdene i Texas røde channel.
- Test gjeldende algoritmen 5 brønner å avgjøre hvis innstillingene er optimalisert. Lagre innstillingene og lukke vinduet konfigurasjon .
- Kjør alle brønnene med metoden optimalisert analyse.
- Eksportere Objektnummeret som intakt celle nummer. Eksportere Gjennomsnittlig intensiteten av FITC kanalen som Rhodopsin-Venus intensitet (Rhodopsin-Venus INT). Eksportere Gjennomsnittlig intensiteten av Texas røde channel som rhodopsin intensitet på cellens overflate (Rhodopsin INT på cellens overflate).
- Åpne de eksporterte dataene i et regnearkprogram. Dele rhodopsin intensiteten på cellens overflate av rhodopsin-Venus INT som MEM-til-sum forhold. Beregne Z'-faktorer for hver parameter for å evaluere analysen kvaliteten. Z′ = 1−3X (STD100% kontroll+STD0% kontroll) / | Mener100% kontroll−Mean0% kontrollen|.
Merk: En Z "-faktor høyere enn 0 angir en moderat analysen tilstrekkelig for en høyt innhold skjerm, og en Z' faktor mellom 0,5 og 1 antyder en enestående analysen kreves for høy gjennomstrømming skjermen20,21. - Bruke regneark programvaren til å generere en tofarget varmekartet for hver parameter. Ordne navnet på cellelinjer på x-aksen og forbindelser på y-aksen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi preget rhodopsin transport med tre parametere: rhodopsin-Venus intensiteten i hele cellen (Rhodopsin-Venus INT), immunostai-intensiteten av rhodopsin på plasma membranen (Rhodopsin INT på cellens overflate), og forholdet mellom rhodopsin flekk på celleoverflaten til rhodopsin-Venus intensitet i hele cellen (MEM-sum Ratio). En representant resultatet av rhodopsin transport analysen er vist i Figur 3 og Figur 4. DMSO og 9 -cis-retinal behandlet celler uttrykke P23H-rhodopsin-Venus som 0 og 100% kontroller, henholdsvis Z'-faktorer for disse tre parametere er mellom 0 til 0,5, antyder at analysen har middels kvalitet, tilstrekkelig for høyt innhold tenkelig21. Selv om optimalisert Z'-faktorer er lavere enn 0,5 på grunn av dens relativt komplekse prosedyrer i forhold til en HTS-analysen, denne analysen er fortsatt robust og pålitelig for en avbildningsbasert analyse. En aktiv forbindelse som redder en misfolded rhodopsin skal vise høyere verdier av Rhodopsin INT på celleoverflaten og MEM-sum forhold enn DMSO med en P -verdi som er lavere enn 0,05. Tre 2D-varme kart ble generert fra disse tre parametre for å sammenligne gjennomsnittlig rhodopsin mengden og lokalisering per celle (Figur 4). Gjentatt i triplicates, WT og seks rhodopsin mutanter vises horisontalt, og virkningene av sammensatte behandlinger sammenlignes loddrett. Med tidligere studier av rhodopsin INT på celleoverflaten og MEM-sum forholdet er lavere for seks mutanter sammenlignet WT rhodopsin behandlet med DMSO (figur 4C)5,22,23. Rhodopsin INT på celleoverflaten og MEM-til-sum forholdet er økt med 9 -cis-retinal behandling for T4R, P23H, D190N og P267L, men ikke P53R eller C110Y mutanter, tyder på at 9 -cis-retinal redder transport av T4R, P23H, D190N og P267L rhodopsin mutanter. Alle cps viste varierende grad av økningen i Rhodopsin INT på cellens overflate for T4R, P23H og D190N. CPS 3, 4, 5, 7, 8 og 11 økt rhodopsin-Venus INT men ikke MEM-til-sum forholdet mellom disse rhodopsin mutanter, tyder på at disse forbindelsene bare økt hvor rhodopsin. CPS 1, 2-6 og 9 betydelig økt MEM-til-sum forholdet mellom T4R, P23H, D190N og P267L rhodopsin mutanter, tyder på at disse forbindelsene redde transport av disse rhodopsin mutanter til plasma membranen. 2D-profilene gir en omfattende oversikt av rhodopsin berørt av disse adRP tilknyttet mutasjoner som er motvirket av ulike farmakologisk behandling.
Figur 1: arbeidsflyten rhodopsin transport analysen. Prosedyrer til cellen overflaten farging av rhodopsin uten membran permeabilization for rhodopsin transport analysen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: illustrasjoner for utarbeidelse av 5 x arbeider løsninger og væske overføring fra 96-brønns platen til 384-vel plate. (A) 96-brønns plate oppsettet av 5 x arbeider løsninger. Wells A1 til G2 har 300 µL per brønn opptil 15 5 x arbeider løsninger og analysen medium (M) som vist i kolonne 1 og 2. Forbindelser 14 og 15 er 2% DMSO og 25 µM 9 -cis-netthinnen, henholdsvis for behandling til de syv cellelinjer uttrykke WT og mutant rhodopsin. I tillegg kolonner 11 og 12 har 100 µL per brønn 2% DMSO og 25 µM 9 -cis-retinal kontroller, henholdsvis behandlet til cellene uttrykke P23H rhodopsin for beregning av Z'-faktorer. (B) 384-vel plate oppsett for celle type og behandling forhold. U2OS celler uttrykke WT, T4R, P23H, P53R, C110Y, er D190N og P267L rhodopsin-Venus seeded som vist. Behandling forhold er merket i blått. Rosa og blå tips viser godt-å-godt væske overføring fra 96-brønns platen til 384 platen ved hjelp av en flerkanals pipette. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: representant bilder og quantifications for å kontrollere rhodopsin transport analysen. (A) Venus fluorescens (grønn) og celle overflaten immunostai-(rød) av U2OS celler uttrykke WT eller P23H rhodopsin-Venus behandlet med DMSO eller 5 µM 9 -cis-retinal. Skala bar = 200 µm. (B) A kolonnen tomt betyr Venus intensitet per celle representerer rhodopsin beløpet i hele cellen (Rhodopsin-Venus INT). p< 0,0001. Z "-faktor vises under den svarte linjen. Kolonnen verdi og feil bar er gjennomsnittet og standardavviket (SD) av 16 replikat, henholdsvis. (C) en kolonne tomt betyr Cy3 intensitet per celle representerer rhodopsin farget på cellens overflate (Rhodopsin INT på cellens overflate). (D) en kolonne tomt på forholdet mellom mener cy3 intensitet per celle betyr Venus intensitet per celle som representerer forholdet mellom rhodopsin nivå på celleoverflaten til hele celle nivået (MEM-til-sum ratio). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: en representant høyt innhold analyse av rhodopsin transport analysen vises som 2 farger varme kart. (A) varmekartet av mener Venus intensitet per celle som angir hele celle rhodopsin (Rhodopsin-Venus INT). Hver blokk representerer et datapunkt og hver betingelse ble testet i tre eksemplarer. Fargeforklaringen vises til venstre. CP, sammensatte. (B) varmekartet av mener Cy3 intensitet per celle representerer rhodopsin farget på cellens overflate (Rhodopsin INT på cellens overflate). (C) varmekartet betyr Cy3 intensitet per celle middelverdien Venus intensitet per celle som representerer forholdet mellom rhodopsin nivå på celleoverflaten til hele celle nivået (MEM-til-sum ratio). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her viste vi en høyt innhold tenkelig analysen brukt for å karakterisere treff identifisert fra en HTS. Bare automatisering involvert i disse protokollene er høyt innhold imager. Immunostai- og fluorescens avbilding av rhodopsin har blitt brukt ofte til å beskrive lokaliseringen av rhodopsin5,14,15,16. Men er kvantifisering av bilder tatt av tradisjonelle tenkelig metoder begrenset av mangel på tilstrekkelig celle bilder per betingelse, lavt antall bilder per eksperimentet, og mangel på kvalitet administrere parameter. Vi tilpasset tradisjonell immunostai-protokollen til 384-vel format og erstattet den tradisjonelle bildebehandling med høyt innhold bildebehandling. Bruker denne høyt innhold tenkelig protokollen, vi har valgt og preget aktiviteter treff identifisert av en HTS11,13,17. Sammenlignet med den tradisjonelle immunostai- og bildebehandling metoder, økt denne protokollen betydelig konsistens av tenkelig betingelser, tenkelig kapasitet og bildet analyse makt, som mulig for oss å sammenligne kvantitativt farmakologiske effekter 11 forbindelser mot transport av seks adRP tilknyttet rhodopsin mutanter.
De store endringene i denne protokollen i forhold til tidligere brukte protokollene rhodopsin immunostai-og bildebehandling: (1) økende og immunostai-celler i en klar bunn 384-vel plate; (2) imaging celler ved hjelp av et høyt innhold imager; og (3) analysere data med et høyt innhold analyseprogramvare. På grunn av disse endringene er en innledende optimalisering nødvendig å finne de beste celle seeding nummer, antistoff konsentrasjoner, bildebehandling og bildet analysealgoritmer.
De avgjørende skritt av protokollen inkluderer: (1) seeding celler at 50-70% samløpet før fiksering; (2) forsiktig ambisjoner å unngå celle avdeling; (2) imaging flere brønner over hele platen Kontroller at bildene er i fokus og fluoresce på alle stasjonene overstiger ikke halvparten av terskelen imager for positiv kontroll brønnene før imaging hele platen; og (3) holde Z "-faktor høyere enn 0 for å sikre at den analysen.
De vanligste problemene som kan oppstå for denne protokollen er cellen avdeling og lave Z "-faktorer. For å unngå den første utgaven, pretreat 384-vel platen med poly-L-lysine å lette celle vedlegget og unngå å bruke linjer som kobler enkelt som Hek293 cellene. I tillegg begrense aspirasjon tuppen berører bare en side av hver brønn under aspirasjon og velge den andre siden av hver brønn for bildebehandling. Forbedre Z "-faktor og analysen kvaliteten, optimalisere cellen seeding tall og bilde analyseparametrene sørge for den cellen figuren eller kjerner definert av programmet passer godt med hvert objekt i hver fluorescens kanal.
Sammenlignet med andre metoder for å kvantifisere rhodopsin transport, for eksempel en celle overflaten ELISA eller en β-galactosidase fragment complementation analysen, som beregner protein målnivået på cellens overflate i alle celler, kvantifiserer dette høyt innhold bildebehandling metode gjennomsnittlig protein nivå per celle; og denne unike funksjonen unngår en kritisk variant faktor, celle nummer som påvirker de endelige readouts i andre metoder. I tillegg, på grunn av det store antallet celler fotografert og kvantifisert ved metoden høyt innhold tenkelig, parameterne gjennomsnitt fra alle celler per godt viste lav variasjon mellom gjentak, dermed legge til påliteligheten av analysen.
En begrensning av denne protokollen er at de ikke er de beste analyser for HTS, på grunn av sin relativt komplisert prosedyre og 2 h per plate imaging tid. Dermed vi anbefaler alternative reporter analyser for screening store små molekyl biblioteker med mer enn 5000 forbindelser, og bruke denne høyt innhold tenkelig protokollen for fokusert karakterisering analyser begrenset til mindre enn 100 forbindelser. Andre begrensning av denne protokollen er dens mangel på standarder vise om Venus fluorescens eller immunostai-fluorescens intensiteten i en lineær sammenheng med antall rhodopsin protein beløp per celle. For å unngå metning av immunostaining, anbefaler vi testing og plotte immunostai-intensiteten av cellene inkubert med ulike konsentrasjoner av primære og sekundære antistoffer. Velg de antistoff konsentrasjonene innen lineær florescence endring.
Utvide fra programmet, vil vi kvantifisere rhodopsin transport fra bilder av celler transiently transfekterte med 28 forskjellige rhodopsin mutanter under behandling med opp til 10 forbindelser å generere en farmakologisk database av disse forbindelser' aktivitet for veiledning av mulige behandlinger til adRP pasienter bærer disse rhodopsin mutasjoner. Denne protokollen kan også lett tilpasses translokasjon analyser av noen membran proteiner av interesse som vil være nyttig for narkotikarelaterte funn av andre protein misfolding sykdommer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Mark E. Schurdak og University of Pittsburgh Drug Discovery Institute for høyt innhold imager og innledende opplæring. Dr. Krzysztof Palczewski (Case Western Reserve University) delte sjenerøst 1 d-4 og B630 anti-rhodopsin antistoffer. Plasmider som inneholder cDNA av musen rhodopsin-Venus konstruere ble delt av Dr. Nevin Lambert (Augusta University). Dette arbeidet ble støttet av National Institute of Health stipend EY024992 YC og P30EY008098 fra University of Pittsburgh visjon forskning Core grant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| U2OS (rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (T4R-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P23H-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P53R-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (C110Y-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (D190N-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P267L-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| DMEM high glucose | Genesee Scientific | 25-500 | With L-Glutamine, sodium pyruvate |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16140071 | Heat inactivated |
| Plasmocin | InvivoGen | ant-mpt | Mycoplasma elimination reagent |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Gibco | 15140122 | 100X concentrated antibiotic solutions to prevent bacteria contamination of cell cultures |
| Trypsin-EDTA | Genesee Scientific | 25-510 | 0.25%, 1mM EDTA in HBSS without calcium and magnesium |
| Poly-L-lysine solution | Sigma-Aldrich | P4707-50ML | Mol wt 70,000-150,000, 0.01%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| CellCarrier-384 Ultra Microplates | PerkinElmer | 6057300 | 384-well tissue culutre-treated microplates with black well walls and an optically -clear cyclic olefin bottom for imaging cells in high content analysis |
| Sterile 96-well plate | Eppendorf | 30730119 | Tissue culture treated with lid flat bottom, sterile, free of detectable pyrogens, Rnase, DNase and DNA. Non-cytotoxic |
| Phosphate Buffered Sailine (PBS) | Invitrogen | AM9625 | 10 x PBS Buffer, pH 7.4 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D4540 | >99.5%, cell culture tested |
| 9-cis-retinal | Sigma-Aldrich | R5754 | |
| Compounds tested | Selleckchem/Life Chemicals/Custom synthesized | NA | Compounds were purchased from different vendors or custom synthesized |
| B6-30 anti-rhodopsin antibody | Novus | NBP2-25160 | Gift from Dr. Krzysztof Palczewski |
| Cy3-conjugated goat anti-mouse secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc | 115-165-146 | |
| 16% paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Methanol-free |
| 10% Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 50062Z | Blocking buffer |
| Hoechst 33342, Trihydroch | Invitrogen | H3570 | Nuclear staining solution |
| High-content imager | Molecular Devices | ImageXpress | ImageXpress® Micro Confocal High-Content Imaging System |
| MetaXpress high-content image acquisition and analysis software | Molecular Devices | MetaXpress | High-content image acquisition and analysis software |
| Multichannel pipette (0.5-10 µL) | Rainin | 17013802 | Manual 8-channel pipette, 0.5-10 µL |
| Multichannel pipette (0.5-10c | Rainin | 17013805 | Manual 8-channel pipette, 20-200 µL |
| Electronic multichannel pipette (10-200 μL) | Thermo Scientific | 14-3879-56BT | Electronic multichanenel pipette for 96- and 384-well microplate pipetting tasks |
| 50ml Reagent Reservoir | Genesee Scientific | 28-125 | Reagent reservior for multichannel pippte dispensing |
| 8-Channel aspirator | ABC Scientific | EV503 | 8-Channel stainless steel adaptor for aspirating liquids from 96- or 384-well plates |
| Excel spreadsheet software | Microsoft | Excel2016 | The spreadsheet software for data analysis and heatmap generation |
| Origin2018 scientific data analysis and graphing software | OriginLab | Origin2018 | The data analysis software for generating the dose response curves |
References
- Gregersen, N., Bross, P., Vang, S., Christensen, J. H. Protein misfolding and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 7, 103-124 (2006).
- Daiger, S. P., Bowne, S. J., Sullivan, L. S. Perspective on genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Archives of Ophthalmology. 125 (2), 151-158 (2007).
- Daiger, S. P., Sullivan, L. S., Bowne, S. J. Genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Clinical Genetics. 84 (2), 132-141 (2013).
- Stenson, P. D., et al. The Human Gene Mutation Database: towards a comprehensive repository of inherited mutation data for medical research, genetic diagnosis and next-generation sequencing studies. Human Genetics. 136 (6), 665-677 (2017).
- Sung, C. H., Schneider, B. G., Agarwal, N., Papermaster, D. S., Nathans, J. Functional heterogeneity of mutant rhodopsins responsible for autosomal dominant retinitis pigmentosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (19), 8840-8844 (1991).
- Athanasiou, D., et al. The molecular and cellular basis of rhodopsin retinitis pigmentosa reveals potential strategies for therapy. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 1-23 (2018).
- Chiang, W. C., et al. Robust Endoplasmic Reticulum-Associated Degradation of Rhodopsin Precedes Retinal Degeneration. Molecular Neurobiology. 52 (1), 679-695 (2015).
- Sakami, S., et al. Probing mechanisms of photoreceptor degeneration in a new mouse model of the common form of autosomal dominant retinitis pigmentosa due to P23H opsin mutations. Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 10551-10567 (2011).
- Dryja, T. P., et al. Mutations within the rhodopsin gene in patients with autosomal dominant retinitis pigmentosa. New England Journal of Medicine. 323 (19), 1302-1307 (1990).
- Sohocki, M. M., et al. Prevalence of mutations causing retinitis pigmentosa and other inherited retinopathies. Human Mutation. 17 (1), 42-51 (2001).
- Chen, Y., et al. A novel small molecule chaperone of rod opsin and its potential therapy for retinal degeneration. Nature Communications. 9 (1), 1976 (2018).
- Chen, Y., Tang, H. High-throughput screening assays to identify small molecules preventing photoreceptor degeneration caused by the rhodopsin P23H mutation. Methods in Molecular Biology. 1271, 369-390 (2015).
- Chen, Y., et al. A High-Throughput Drug Screening Strategy for Detecting Rhodopsin P23H Mutant Rescue and Degradation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (4), 2553-2567 (2015).
- Noorwez, S. M., et al. Pharmacological chaperone-mediated in vivo folding and stabilization of the P23H-opsin mutant associated with autosomal dominant retinitis pigmentosa. Journal of Biological Chemistry. 278 (16), 14442-14450 (2003).
- Saliba, R. S., Munro, P. M., Luthert, P. J., Cheetham, M. E. The cellular fate of mutant rhodopsin: quality control, degradation and aggresome formation. Journal of Cell Science. 115, 2907-2918 (2002).
- Kaushal, S., Khorana, H. G. Structure and function in rhodopsin. 7. Point mutations associated with autosomal dominant retinitis pigmentosa. Biochemistry. 33 (20), 6121-6128 (1994).
- Chen, Y., Brooks, M. J., Gieser, L., Swaroop, A., Palczewski, K. Transcriptome profiling of NIH3T3 cell lines expressing opsin and the P23H opsin mutant identifies candidate drugs for the treatment of retinitis pigmentosa. Pharmacological Research. 115, 1-13 (2016).
- Adamus, G., et al. Anti-rhodopsin monoclonal antibodies of defined specificity: characterization and application. Vision Research. 31 (1), 17-31 (1991).
- Goodson, H. V., Dzurisin, J. S., Wadsworth, P. Generation of stable cell lines expressing GFP-tubulin and photoactivatable-GFP-tubulin and characterization of clones. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (9), pdb prot5480 (2010).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Bray, M. A., Carpenter, A., et al. Advanced Assay Development Guidelines for Image-Based High Content Screening and Analysis. Assay Guidance Manual. Sittampalam, G. S., et al. , Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. Bethesda (MD). (2004).
- Sung, C. H., Davenport, C. M., Nathans, J. Rhodopsin mutations responsible for autosomal dominant retinitis pigmentosa. Clustering of functional classes along the polypeptide chain. Journal of Biological Chemistry. 268 (35), 26645-26649 (1993).
- Krebs, M. P., et al. Molecular mechanisms of rhodopsin retinitis pigmentosa and the efficacy of pharmacological rescue. Journal of Molecular Biology. 395 (5), 1063-1078 (2010).
