Summary
Aquí, describimos un método de imagen de alto contenido para cuantificar el transporte de los mutantes de la rodopsina asociada con retinitis pigmentosa. Un análisis de puntuación de múltiple longitud de onda se utilizó para cuantificar la proteína rodopsina en la superficie celular o en la célula entera.
Abstract
Rhodopsin causa mutaciones conducen a la muerte de fotorreceptores de varilla que se manifiesta como un autosoma dominante pigmentosa de la retinitis (RP), una progresiva ceguera que carece de tratamiento eficaz. Presumimos que la citotoxicidad de los mutantes de la rodopsina mal plegadas puede ser aliviada por farmacológicamente estabilización de la proteína rodopsina mutante. La mutación P23H, entre las otras mutaciones de la rodopsina de clase II, codifica una proteína mutante de rodopsina estructuralmente inestables que se acumula en el retículo endoplásmico (ER), mientras que la rodopsina de tipo salvaje es transportada a la membrana plasmática en mamíferos células. Realizamos previamente una pantalla basada en la luminiscencia de alto rendimiento (HTS) e identificó un grupo de chaperonas farmacológicas que rescató el transporte de la rodopsina P23H de ER a la membrana plasmática. Aquí, usando un método de immunostaining seguido de un análisis de proyección de imagen de alto contenido, cuantificar la cantidad de la proteína rodopsina mutante en la célula entera y en la membrana plasmática. Este método es informativo y eficaz para identificar los verdaderos éxitos de falsos positivos después de HTS Además, el análisis de imágenes de alto contenido permitió cuantificar parámetros múltiples de un solo experimento para evaluar las propiedades farmacológicas de cada compuesto. Usando este análisis, se analizó el efecto de 11 diferentes compuestos hacia seis mutantes de rodopsina RP asociada, obteniendo un perfil farmacológico del 2-D para una comprensión cuantitativa y cualitativa acerca de la estabilidad estructural de estos mutantes de la rodopsina y eficacia de los diferentes compuestos a estos mutantes.
Introduction
Mal plegamiento de la proteína está implicada en la distrofia muscular, degeneraciones neuronales, así como enfermedades cegadoras, incluida la retinitis pigmentosa (RP)1. RP es una degeneración retiniana hereditaria y progresiva asociada a mutaciones en más de 60 genes que afectan a la función y la homeostasis de los fotorreceptores de la barra o la retina pigmentada epitheliums (RPEs)2,3. No hay tratamiento eficaz está disponible para RP. Rhodopsin mutaciones representan alrededor del 25-30% de autosómica dominante (ad) casos RP. Entre los más de 150 rodopsina mutaciones4 (humano Gene mutación de base de datos, http:/ www.hgmd.cf.ac.uk/), las mutaciones clase II causan la inestabilidad estructural de la proteína rodopsina que contribuye a la muerte de fotorreceptores de varilla y pérdida visión5,6,7,8. El P23H es la mutación más frecuente de la rodopsina en América del norte, que también es un ejemplo típico de la clase II la rodopsina mutaciones9,10. Debido a su inestabilidad estructural inherente, la rodopsina mal plegada se acumula en el retículo endoplásmico (ER) en células de mamíferos, mientras que el tipo salvaje la rodopsina se encuentra en la membrana plasmática5. La rodopsina misfolded P23H exposiciones mutante dominante negativo citotoxicidad no por haploinsufficiency, pero se relaciona con la activación de ER asociados vía de degradación de proteínas y la organización del segmento externo de varilla interrumpida. Para aliviar el estrés de barra fotorreceptor de la célula, una estrategia es estabilizar el plegamiento nativo de la rodopsina mutante con un chaperonas farmacológicas.
Para lograr este objetivo, se realizó una pantalla de alto rendimiento basado en la célula (HTSs)11,12,13 utilizando un ensayo de complementación de fragmento de β-galactosidasa para cuantificar al mutante de rodopsina P23H transportado en el plasma membrana. El Protocolo simple y robusto de este ensayo HTS nos permitió explorar las actividades de unos 79.000 moléculas pequeñas para cada pantalla. Sin embargo, dado que este ensayo HTS Lee las señales de luminiscencia, falsos positivos, incluyendo los inhibidores de β-gal, compuestos coloreados o citotóxicos están incluidos en la lista esperando ser identificado por un análisis secundario.
El immunostaining tradicional y métodos de proyección de imagen de fluorescencia han utilizado durante años para estudiar el transporte de la rodopsina en las células mamíferas5,14,15,16. Sin embargo, estos métodos convencionales no pueden utilizarse para cuantificar los efectos farmacológicos de más de 10 compuestos hacia transporte de rodopsina porque un análisis fiable de imágenes requiere un gran número de imágenes tomadas bajo una condición altamente consistente, que es no modificable por los métodos convencionales de la proyección de imagen. Aquí, hemos desarrollado un protocolo de imagen de alto contenido de immunostaining basado en como un análisis secundario para cuantificar el transporte de superficie de célula de misfolded rodopsina mutantes11,13,17. Para etiqueta de rodopsina en la membrana de plasma, nos hemos saltado el paso de permeabilización de la membrana de la célula y immunostained los mutantes de la rodopsina por una monoclonal (B6-30) contra la rodopsina reconoce el epitopo del N-terminal de la rodopsina en el lado extracelular de la célula membrana18. Para visualizar la rodopsina mutante en la célula entera, nos fundió rodopsina con la proteína de la fluorescencia de Venus. Por la cuantificación de las intensidades de fluorescencia en canales diferentes de la fluorescencia, que son capaces de obtener varios parámetros de un experimento único, incluyendo la intensidad total de la rodopsina en las células enteras, sobre la superficie de la célula y la relación de fluorescencia de la rodopsina en la superficie celular para en la célula entera. Aplicar este método para estabilizar las células expresan un total de seis mutantes de rodopsina mal plegadas, podemos generar un perfil farmacológico de varias pequeñas moléculas chaperonas hacia estos mutantes. En este protocolo, todas las células son immunostained en una placa de 384 pozos y reflejada usando un sistema automatizado de proyección de imagen bajo una condición de proyección de imagen altamente consistente. Se realiza un análisis de la imagen a cada pocillo, que contiene imágenes de más de 600 celdas para reducir variación debido a la heterogeneidad de las células con diferentes nivel de expresión de proteína y forma celular. El flujo de trabajo de este protocolo se resume en la figura 1. La ventaja de este método es que obtenemos imágenes de alta resolución así como cuantificaciones de múltiples parámetros del análisis basado en imágenes. En general, este protocolo puede ser modificado y aplicado para cuantificar el transporte de cualquier proteína de la membrana mal plegadas de interés.
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Protocol
Nota: El rodopsina transporte ensayo.
1. preparación y cultivo de células
- Revivir el crio-preservado U2OS estable las células que expresan el tipo salvaje (WT) o proteínas de fusión de Venus de la rodopsina de ratón mutante. Descongelar las células a 37 ° C hasta que quedan sólo los cristales de hielo en el frasco.
Nota: Las células U2OS se utilizan en este protocolo porque no se dispone de ninguna línea de células del fotorreceptor para estudios en vitro y la biosíntesis de la ciliar de la rodopsina está reglamentada por mecanismos moleculares similares en células de mamíferos. Además, las células U2OS Fije firmemente a la parte inferior de la placa y tienen grandes cuerpos de la célula, por lo que son ideales para el análisis de transporte de la rodopsina. Siete U2OS estable las células que expresan el peso T4R P23H, P53R, C110Y, D190N y P267L mutantes rhodopsin se utilizan aquí como un ejemplo para mostrar la calidad y fiabilidad de la prueba. Células estables que expresan otros mutantes de la rodopsina u otras proteínas de membrana se pueden utilizar, dependiendo el objetivo del ensayo. Células estables que expresan la rodopsina humana pueden ser utilizadas en este ensayo si está disponible. La rodopsina de ratón fue utilizada aquí porque ratón y proteínas de la rodopsina humana comparten el 95% de homología, y los compuestos identificados por este ensayo será probado en vivo utilizando un modelo de ratón adRP llevando la rodopsina P23H mutación8. Las células estables fueron generadas como se ha descrito anteriormente19. La WT y rodopsina mutante transcripciones fueron cuantificadas por la q-PCR, y los clones de células estables que expresan niveles similares de WT y transcripciones de rodopsina mutante fueron seleccionados para este análisis. La expresión de proteínas de rodopsina fue confirmada por inmunoblot y el immunostaining. El paso de células utilizadas en este ensayo debe ser inferior a 20. - Transferencia de cada línea de células en un tubo cónico de 15 mL que contiene 10 mL de medio de cultivo (glucosa alta Dulbecco modificado Eagle (DMEM) con 10% suero bovino fetal (FBS) y 5 μg/mL Plasmocin).
- Centrifugar el tubo a 200 x g durante 5 min descartar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular con 5 mL de medio de crecimiento celular para cada línea celular. Transferir cada línea de la suspensión celular en una placa de cultivo de tejidos de 60 mm e incubar a 37 ° C con 5% CO2.
- Subcultivo de las células cuando el plato de cultivo de tejidos alcanza el 90% de confluencia como se describen en la referencia12.
2. siembra de células en 5.000 células por pozo
Nota: Realice el siguiente procedimiento en una campana de cultivo de tejidos.
- Tratar la placa con poli-lisina.
- Un día antes de sembrar las células, tratar una pared de negro y claro placa de 384 pozos inferior con 20 μL/pocillo de solución poli-lisina durante 30 minutos.
- Aspirar el líquido y permitir que todos los pocillos se seque por 1 h. volver a la tapa de la placa y la placa a 4 ° C durante la noche para la siembra de la célula.
- Preparar la suspensión de células.
- La cultura de cada línea celular en medio de cultivo en una placa de cultivo de tejido de 100 mm hasta 90% de confluencia.
- Lave cada plato con tampón fosfato salino (PBS) y separar las células con 1 mL de 0.05% tripsina a 37 ° C.
- Resuspender cada línea de células en 10 mL del medio de ensayo (alta glucosa DMEM con 10% FBS, 100 unidades/mL de penicilina y estreptomicina 100 μg/mL).
- Contar las células y diluir cada línea de 1.25 x 105 células/mL con el medio de ensayo de las células.
- Las células de la semilla.
- Use una pipeta multicanal electrónica o un dispensador de reactivo automatizado para despachar 40 μL/pocillo de la suspensión celular en tres columnas por línea celular y llenar columnas 1-21 de la placa de 384 pozos (figura 2).
- Agregar 40 μL/pocillo de U2OS (P23H-rodopsina-Venus) columnas 22-23 y 40 μL/pocillo de U2OS (rodopsina-Venus) a la columna 24, como controles.
- Centrifugar la placa a 300 x g durante 30 s a todas las células en la parte inferior de la placa de 384 pozos.
Nota: Evitar golpes físicos al plato después de la siembra de células. De lo contrario, las células serán aplastadas a una de las esquinas de cada pocillo y la placa no será adecuada para la proyección de imagen de alto contenido. - Incubar la placa de 384 pozos a 37 ° C con 5% CO2 para 3 h de las células a sujetar a la base de la placa.
3. tratamiento de las células con compuestos
- Generar un mapa de la placa con condiciones de tratamiento tal como se muestra en la figura 2.
- Preparar 300 μL de 5 x soluciones de trabajo de hasta 15 compuestos en una placa de 96 pocillos.
- Diluir 1 a 15 cps con el medio de ensayo para cinco veces de su concentración final en los pozos A1 para G2 de los 96 pocillos de la placa (figura 2A). Añadir 300 μL del medio de ensayo en H2 bien.
Nota: La concentración final de cada compuesto es utilizada en la concentración más efectiva para rescatar el transporte de la rodopsina P23H por HTS12,13. - Añada 100 μl por pocillo de 2% de dimetilsulfóxido (DMSO) y 25 μm 9 -cis-retinal que se diluyen en el medio de ensayo a las columnas 11 y 12, respectivamente. Añadir 9 -cis-retinal en luz dévil.
- Diluir 1 a 15 cps con el medio de ensayo para cinco veces de su concentración final en los pozos A1 para G2 de los 96 pocillos de la placa (figura 2A). Añadir 300 μL del medio de ensayo en H2 bien.
- La adición de 10 μl por pocillo de 5 x trabajo soluciones a la placa de 384 pozos con las células (figura 2B).
- Utilice una pipeta multicanal electrónica para agregar compuestos 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 y 15 a filas A, C, E, G, I, K, M y O de las columnas 1 a 21 (figura 2). Añadir compuestos de 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 y M a las filas de B, D, F, H, J, L, N y P de las columnas 1 a 21.
- Añadir 10 μl por pocillo de 2% DMSO a columnas de 22 y 24. Añadir 10 μl por pocillo de 25 μm 9 -cis-retinal a la columna 23.
Nota: El DMSO se utiliza como un control del vehículo porque todos los compuestos son inicialmente disuelto en DMSO como acción. Columna 22 tratado DMSO células expresando el P23H rhodopsin es utilizada como control 0%. 9 -Cis-retinianas células tratadas expresando la rodopsina P23H se utiliza como el control del 100%.
- Cubrir la placa de 384 pozos con papel de aluminio e incubar la placa a 37 ° C durante 24 h.
4. Immunostaining sin permeabilización de la membrana a manchar la proteína rodopsina en la superficie celular.
Nota: Evite cualquier detergente en el proceso de inmunotinción todo para mantener intacta la membrana de la célula.
- Preparar 4% paraformaldehido (PFA) diluyendo el 16% PFA con PBS en una proporción de volumen 1:4 en una campana de humos químicos. El 4% de transferencia PFA en un reservorio de reactivo.
- Sacar la placa de 384 pozos en un cuarto oscuro con luz roja tenue. Utilice un aspirador de 8 canales conectado a una botella de colección vacío para aspirar suavemente el medio. Utilice una pipeta multicanal electrónica para añadir 20 μl por pocillo del 4% recién preparado PFA a toda la placa de 384 pocillos e incubar por 20 min a temperatura ambiente. Para evitar el desprendimiento de células, siempre punto los consejos del aspirador para el mismo lado de cada bien durante las aspiraciones. No toque el área de medio fondo de cada pozo. Al tomar imágenes, seleccione los campos para evitar que la región afectada por el aspirador. Para incubaciones más de 10 minutos, cubrir la placa de 384 pozos con su tapa para evitar evaporación.
Nota: Las células se fijan en un cuarto oscuro para evitar el fotoblanqueo de la isorhodopsin regenerada que afectará el resultado del control de 100%. Después de la fijación, la placa de 384 pozos se puede sacar bajo luz normal. - Utilice un aspirador de 8 canales para aspirar la PFA en cada pozo y utilizar una pipeta multicanal electrónica para añadir 50 μL por pocillo de PBS. Repetir dos veces más para realizar tres lavados con PBS.
PRECAUCIÓN: Los residuos PFA que contiene líquido se recogen en un frasco tapado y debe desecharse como un residuos químicos peligrosos después de la experiencia. - Bloquear las células añadiendo 20 μl por pocillo de suero de cabra de 5% a toda la placa de 384 pocillos e incubar a temperatura ambiente durante 30 min.
- Aspire el suero de cabra 5% y añadir 15 μl por pocillo de 20 μg mL-1 B6-30 la rodopsina de anticuerpo en el suero de cabra de 1% a filas A O. Añadir 15 μl por pocillo de suero de cabra de 1% a fila P para el grupo control sólo anticuerpo secundario.
- Incubar la placa de 384 pocillos a temperatura ambiente durante 90 minutos o a 4 ° C durante la noche. Cubrir la placa de 384 pozos con papel de aluminio para evitar el fotoblanqueo de los fluoróforos.
- Lave la placa 3 veces con 50 μL por pocillo de PBS.
- Aspire PBS y añadir 15 μl por pocillo de 5 μg mL-1 conjugado con Cy3 cabra anti-ratón IgG anticuerpo. Cubra la placa 384-bien con papel de aluminio e incubar a temperatura ambiente durante 1 h o a 4 ° C durante la noche.
- Lave la placa 3 veces con 50 μL por pocillo de PBS. Añadir 50 μL por pocillo de PBS que contenga 1 μg mL-1 Hoechst 33342 para teñir los núcleos a temperatura ambiente durante 15 minutos.
- Sellar la placa de 384 pozos con una película transparente antes de la proyección de imagen. Cubrir la placa de 384 pozos con papel de aluminio y almacenar a 4 ° C por hasta una semana si imágenes son tomadas inmediatamente.
5. proyección de imagen de.
Nota: Este procedimiento de proyección de imagen de alto contenido está adaptado para el sistema de imágenes listado en la Tabla de materiales. Procedimientos pueden ser diferentes si utiliza otros sistemas de proyección de imagen de alto contenido.
- Retire la tapa y poner la placa de 384 pozos en el reproductor de imágenes de alto contenido con A1 ubicado en la esquina superior izquierda de la placa.
- Abra el software de adquisición de imagen para configurar los parámetros para la adquisición de la imagen.
- Abra la ventana Configuración de adquisición de la placa y crear nuevo valor o cargar un archivo de configuración existente.
- Seleccione el objetivo 20 x y configurar pixel binning 2 así que el tamaño de píxel calibrado es 0.80 x 0.80 μm. establecer las líneas de exploración como 2.000 y el tamaño de la imagen (W x H) como 1.000 x 1.000 píxeles (800.00 x 800.00 μm) por sitio.
- Seleccione el tipo de placa a ser reflejada. Utilice la información proporcionada por el fabricante de la placa de 384 pozos para llenar en las dimensiones de la placa.
- Seleccione los pozos a ser fotografiada para la placa de 384 pozos.
- Seleccione cuatro sitios a ser reflejada por pozo. Evitar el lado del bien tocado por las puntas de aspiración.
- Seleccione láseres de excitación como 405, 488 y 561 nm. Seleccione filtros de emisión para los canales rojo Texas, DAPI y FITC. Optimizar la potencia del láser y ganancias de cada canal para asegurar el brillo de imágenes tomadas de los pozos de control positivo están menor que el umbral de saturación.
- Seleccionar el foco de bien a bien para el enfoque automático. Seleccione el primer pozo adquirido como el inicial para encontrar las muestras. Sistema autofocus de sitio a todos los sitios.
- Seleccione cuatro promedios por línea para cada canal. Optimizar el valor de Z-offset para cada canal.
- Prueba del 2-3 pozos en las esquinas diagonales de la placa de la pozo 384 para asegurarse de que las imágenes son en enfoque para todos los pozos muestreados, imágenes de todos los sitios por pozo tienen células con más de 40% confluencia e intensidades de fluorescencia de todos los canales están cerca de la mitad saturada en el 100% control de pozos.
- Excepto el método de adquisición de imagen.
- Ejecutar toda la placa. Ver el reproductor de imágenes hasta que termine la captura de imágenes de la primera columna de la placa para comprobar la calidad de imagen antes de salir del sensor. Saque la placa de 384 pozos y almacenar a 4 ° C para su uso futuro.
Nota: Dependiendo del número de sitios seleccionados por bien y los canales de toma, se tarda 40 min a 3 h para terminar la imagen de una placa de 384 pozos.
6. imagen análisis.
- Extraer los datos de imagen utilizando un software de análisis de imagen de alto contenido. Seleccione uno de los pozos de control del 100% (columna 23) para configurar los parámetros.
- Seleccione la Onda celular que como el método de análisis y empezar a configurar.
- Definir los núcleos usando imágenes del canal del DAPI. Escuchar para asegurarse de que las formas de los núcleos definidos en el seleccionado bien encaja bien con las imágenes de núcleos.
- Definir la forma de la célula en el canal FITC donde está reflejada la rodopsina-Venus.
- Definir las áreas de tinción de superficie celular de rodopsina en el canal rojo de Texas.
- Probar el algoritmo actual en 5 pozos para determinar si los ajustes están optimizados. Guardar la configuración y cerrar la ventana de configuración .
- Ejecute todos los pozos con el método de análisis optimizado.
- Exportación Objeto número como número de células intactas. Exportar la Intensidad media del canal FITC como intensidad de rodopsina-Venus (Venus de rodopsina INT). Exportar la Intensidad media del canal rojo de Texas como intensidad de la rodopsina en la superficie de la célula (INT de la rodopsina en la superficie celular).
- Abra los datos exportados en un software de hoja de cálculo. Dividir la intensidad de la rodopsina en la superficie celular por la rodopsina-Venus INT como cociente del MEM a total. Calcular el Z'-factores para cada parámetro evaluar la calidad del ensayo. Z′ = 1−3X (STD100% control+STD0% control) / | Significacontrol del 100%−Mean0% control.
Nota: A Z'-mayor que 0 indica un ensayo moderado suficiente para una pantalla de alto contenido y un Z factor' factor de entre 0,5 y 1 sugiere un análisis excepcional para una pantalla de alto rendimiento20,21. - Utilice el software de hoja de cálculo para generar un mapa de calor de dos colores para cada parámetro. Coloque el nombre de líneas celulares en el eje x y los compuestos en el eje y.
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Representative Results
Nos caracteriza el transporte rodopsina con tres parámetros: la intensidad de la rodopsina-Venus en la célula entera (rodopsina-Venus INT), la intensidad de la inmunotinción de la rodopsina en la membrana plasmática (INT de la rodopsina en la superficie celular) y la relación de mancha de rodopsina en la superficie de la célula a la intensidad de la rodopsina-Venus en la célula entera (cociente de MEM-Total). Un resultado representativo del ensayo de transporte rhodopsin se muestra en la figura 3 y figura 4. Con DMSO y 9 -cis-retiniano tratados las células que expresan la Venus-rodopsina-P23H como el 0 y 100% controles, respectivamente, el Z'-factores para estos tres parámetros están en el rango entre 0 a 0,5, lo que sugiere que el ensayo tiene calidad moderada, suficiente para la proyección de imagen de alto contenido21. A pesar de que la Z optimizada '-factores son menores que 0.5 debido a sus procedimientos relativamente complejas en comparación con un ensayo HTS, este ensayo es todavía robusto y fiable para un análisis basado en imágenes. Un compuesto activo que rescata una rodopsina mal plegada debería mostrar los valores más altos de la rodopsina en la superficie de la célula y el cociente de la MEM-Total de DMSO, con un valor de P inferior a 0.05. Se generaron mapas de calor de 2-D tres de estos tres parámetros para comparar la cantidad promedio de la rodopsina y la localización por la célula (figura 4). Repite en triplicado, WT y seis mutantes de rhodopsin se enumeran horizontalmente, y los efectos de tratamientos compuestos se comparan verticalmente. De acuerdo con estudios previos, la rodopsina INT en la superficie de la célula y la relación Total de MEM son menores para los seis mutantes en comparación con la rodopsina peso tratada con DMSO (figura 4)5,22,23. Aumentan la rodopsina INT en la superficie de la célula y su cociente de MEM-Total 9 -cis-tratamiento retiniano de la T4R, P23H, D190N y P267L, pero no los mutantes P53R o C110Y, lo que sugiere que 9 -cis-retiniano rescata el transporte de la T4R Mutantes de rodopsina P23H, D190N y P267L. El cps mostraron diferentes niveles de aumento en el INT de la rodopsina en la superficie celular para T4R, P23H y D190N. CPS 3, 4, 5, 7, 8 y 11 aumentó la rodopsina-Venus INT pero no la relación de la MEM-Total de estos mutantes de rodopsina, sugiriendo que estos compuestos sólo incrementó la cantidad de rodopsina. CPS 1, 2 6 y 9 aumentó significativamente la proporción de MEM al Total de los mutantes de rodopsina T4R, P23H, D190N y P267L, lo que sugiere que estos compuestos rescatar el transporte de estos mutantes de la rodopsina en la membrana plasmática. Los perfiles de 2-D proporcionan una visión completa de la rodopsina transporte afectado por estas mutaciones adRP asociado que son mitigadas por diferente tratamiento farmacológico.
Figura 1: flujo de trabajo del ensayo rodopsina transporte. Procedimientos para celular tinción superficial de la rodopsina sin permeabilización de membrana para el análisis de transporte de la rodopsina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: ilustraciones para la preparación de 5 x soluciones de trabajo y la transferencia de líquidos de la placa de 96 pocillos de la placa de 384 pozos. (A) el diseño de la placa de 96 pocillos de 5 x soluciones de trabajo. Pozos A1 a G2 tienen 300 μL por pocillo de hasta 15 5 x soluciones de trabajo y el medio de ensayo (M) como se muestra en las columnas 1 y 2. Compuestos de 14 y 15 son 2% DMSO y 25 μm 9 -cis-retinal, respectivamente, para el tratamiento a las líneas de siete células expresando WT y rodopsina mutante. Además, las columnas 11 y 12 tienen 100 μl por pozo de 2% DMSO y 25 μm 9 -cis-retiniano controles, respectivamente, tratados a las células expresando el rhodopsin P23H para el cálculo de Z'-factores. (B) el diseño de la placa de 384 pozos para condiciones de tratamiento y tipo de celular. El U2OS expresando la WT T4R P23H, P53R, C110Y, D190N y P267L rodopsina-Venus se siembran las células tal como se ilustra. Condiciones de tratamiento están marcadas en azul. Consejos de rosas y azules demuestran a la transferencia líquida de pozo a pozo de la placa de 96 pocillos para la placa 384 utilizando una pipeta multicanal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: imágenes representativas y cuantificaciones de los controles del ensayo de transporte rhodopsin. (A) Venus fluorescencia (verde) y célula superficial inmunotinción (rojo) de U2OS células expresando WT o P23H rodopsina-Venus trataron con DMSO o 5 μm 9 -cis-retinal. Barra de escala = 200 μm. (B) A columna trama de media intensidad de Venus por la célula que representa cantidad de rodopsina en las células enteras (INT rodopsina-Venus). p< 0.0001. Z'-factor se muestra en la línea negra. Barra de error y el valor de columna son promedio y desviación estándar (D.E.) de 16 repeticiones, respectivamente. Parcela de columna (C) una de media intensidad Cy3 por la célula que representa el rhodopsin manchado en la superficie celular (INT de la rodopsina en la superficie celular). (D) una parcela de la columna de la relación de intensidad de la medias cy3 por la célula significa intensidad de Venus por la célula que representa la relación entre nivel de rodopsina en la superficie de la célula a su nivel de célula entera (cociente del MEM a total). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: un análisis de alto contenido representativo del ensayo de transporte rhodopsin se muestra mapas de calor, 2-color. (A) el mapa de calor de media intensidad de Venus por la célula que representa el nivel de célula entera rhodopsin (rodopsina-Venus INT). Cada bloque representa un punto de datos y cada condición se analizó por triplicado. La leyenda de color aparece en la izquierda. CP, compuesto. (B) el mapa de calor de media intensidad Cy3 por la célula que representa el rhodopsin manchado en la superficie celular (INT de la rodopsina en la superficie celular). (C) el mapa de calor de media intensidad Cy3 por la célula a la media intensidad de Venus por la célula que representa la relación entre nivel de rodopsina en la superficie de la célula a su nivel de célula entera (cociente del MEM a total). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aquí, mostramos un análisis de imagen de alto contenido utilizado para caracterizar hits identificados de un HTS La automatización única en estos protocolos es el reproductor de imágenes de alto contenido. El immunostaining y proyección de imagen de la fluorescencia de la rodopsina se han utilizado comúnmente para caracterizar la localización de la rodopsina5,14,15,16. Sin embargo, la cuantificación de imágenes tomadas por los métodos tradicionales de la proyección de imagen está limitada por la falta de suficientes imágenes de celular por condición, baja capacidad de imágenes por el experimento y la falta de un parámetro de control de calidad. Adaptar el protocolo de immunostaining tradicional al formato de 384 pozos y sustituye la imagen tradicional con la proyección de imagen de alto contenido. Utilizando este protocolo de imagen de alto contenido, correctamente seleccionado y caracterizado las actividades de aciertos identificados por un HTS11,13,17. En comparación con la inmunotinción tradicional y métodos de proyección de imagen, este protocolo aumentó significativamente la consistencia de las condiciones de proyección de imagen, capacidad de proyección de imagen y poder de análisis de imagen, que nos permitió comparar cuantitativamente los efectos farmacológicos de 11 compuestos hacia el transporte de seis adRP asociaron a mutantes de rodopsina.
Los cambios principales de este protocolo en comparación con los protocolos previamente usados para la inmunotinción de la rodopsina y la proyección de imagen son: (1) las células creciendo y el immunostaining en una placa de 384 pocillos fondo claro; (2) de las células utilizando a un toner de alto contenido; y (3) analizar los datos con un software de análisis de imagen de alto contenido. Debido a estos cambios, una optimización inicial es necesaria para encontrar el mejor número de siembra de células, las concentraciones de anticuerpo, condiciones de proyección de imagen y algoritmos de análisis de imagen.
Los pasos críticos del protocolo incluyen: (1) siembra de las células que permiten la confluencia de 50-70% antes de la fijación; (2) aspiraciones cuidadosos para evitar el desprendimiento de la célula; (2) la proyección de imagen varios pozos en la placa entera para asegurarse de que las imágenes son en enfoque y fluorescencia de todos los canales no exceda de la mitad del umbral de lo toner para los pozos de control positivo antes de la proyección de imagen la placa entera; y (3) el Z'-factor superior a 0 para asegurar la confiabilidad de la prueba.
Los problemas más comunes que podrían encontrar para este protocolo son la separación de la célula y bajo Z'-factores. Para evitar el primer problema, use la placa de 384 pozos con poli-L-lisina para facilitar el accesorio de celular y evitar el uso de líneas celulares que desprenden fácilmente como las células Hek293. Además, limitar la punta de aspiración para tocar solamente un lado de cada bien durante la aspiración y seleccione el otro lado de cada pozo para la proyección de imagen. Para mejorar el Z'-factor y la calidad del ensayo, optimizar la célula siembra imagen y número de parámetros de análisis para asegurarse de que la célula forma o forma núcleos definidos por el software se adapta bien con cada objeto en cada canal de fluorescencia.
En comparación con otros métodos para cuantificar el transporte de la rodopsina, tales como un ELISA de superficie de la célula, o un ensayo de complementación de fragmento β-galactosidasa, que calcula el nivel de proteína en la superficie celular en todas las células, este método de proyección de imagen de alto contenido cuantifica nivel promedio de la proteína por la célula; y esta particularidad evita un factor de variación importante, número de celular que afecta las lecturas finales en otros métodos. Además, debido al gran número de células reflejada y cuantificada por el método de proyección de imagen de alto contenido, un promedio de los parámetros de todas las células por bien mostraron baja variación entre repeticiones, aumentando la fiabilidad del ensayo.
Una limitación de este protocolo es que no son los mejores ensayos para HTS, debido a su relativamente complicado procedimiento y 2 h por el tiempo de la proyección de imagen de la placa. Por lo tanto, recomendamos ensayos reportero alternativo para la detección de grandes moléculas pequeñas bibliotecas con más de 5.000 compuestos y utilizar este protocolo de imagen de alto contenido para los ensayos de caracterización enfocada limitados a menos de 100 compuestos. La segunda limitación de este protocolo es su falta de estándares para mostrar si la fluorescencia de Venus o las intensidades de fluorescencia de immunostaining están en una correlación lineal con la cantidad de cantidad de la proteína rodopsina por la célula. Para evitar la saturación por inmunotinción, recomendamos pruebas y trazar las intensidades immunostaining de las células incubadas con concentraciones de anticuerpos primarios y secundarios. Seleccionar las concentraciones de anticuerpos dentro de la gama lineal de cambio florescence.
Ampliación de la aplicación actual, se cuantificar transporte rhodopsin de imágenes de células transfectadas transitoriamente con 28 mutantes diferentes rodopsina bajo tratamiento con hasta 10 compuestos para generar una base de datos farmacológica de estos compuestos actividad para la dirección de tratamientos potenciales para adRP pacientes portadores de estas mutaciones de rodopsina. Este protocolo también puede ser fácilmente adaptado a las pruebas de desplazamiento de cualquier proteína de membrana de interés que serán útil para descubrimientos de drogas de otra proteína mal plegamiento de las enfermedades.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos al Dr. Mark E. Schurdak y descubrimiento de fármacos de la Universidad de Pittsburgh para proporcionar las imágenes de alto contenido y formación inicial. Dr. Krzysztof Palczewski (Case Western Reserve University) generosamente compartida la 4 1 y los anticuerpos anti-rodopsina B630. El plásmido que contiene el cDNA del constructo de Venus rodopsina de ratón fue compartido por el Dr. Nevin Lambert (Universidad de Augusta). Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de concesión de la salud EY024992 YC y P30EY008098 de grant de la Universidad de Pittsburgh visión investigación base.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| U2OS (rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (T4R-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P23H-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P53R-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (C110Y-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (D190N-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P267L-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| DMEM high glucose | Genesee Scientific | 25-500 | With L-Glutamine, sodium pyruvate |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16140071 | Heat inactivated |
| Plasmocin | InvivoGen | ant-mpt | Mycoplasma elimination reagent |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Gibco | 15140122 | 100X concentrated antibiotic solutions to prevent bacteria contamination of cell cultures |
| Trypsin-EDTA | Genesee Scientific | 25-510 | 0.25%, 1mM EDTA in HBSS without calcium and magnesium |
| Poly-L-lysine solution | Sigma-Aldrich | P4707-50ML | Mol wt 70,000-150,000, 0.01%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| CellCarrier-384 Ultra Microplates | PerkinElmer | 6057300 | 384-well tissue culutre-treated microplates with black well walls and an optically -clear cyclic olefin bottom for imaging cells in high content analysis |
| Sterile 96-well plate | Eppendorf | 30730119 | Tissue culture treated with lid flat bottom, sterile, free of detectable pyrogens, Rnase, DNase and DNA. Non-cytotoxic |
| Phosphate Buffered Sailine (PBS) | Invitrogen | AM9625 | 10 x PBS Buffer, pH 7.4 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D4540 | >99.5%, cell culture tested |
| 9-cis-retinal | Sigma-Aldrich | R5754 | |
| Compounds tested | Selleckchem/Life Chemicals/Custom synthesized | NA | Compounds were purchased from different vendors or custom synthesized |
| B6-30 anti-rhodopsin antibody | Novus | NBP2-25160 | Gift from Dr. Krzysztof Palczewski |
| Cy3-conjugated goat anti-mouse secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc | 115-165-146 | |
| 16% paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Methanol-free |
| 10% Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 50062Z | Blocking buffer |
| Hoechst 33342, Trihydroch | Invitrogen | H3570 | Nuclear staining solution |
| High-content imager | Molecular Devices | ImageXpress | ImageXpress® Micro Confocal High-Content Imaging System |
| MetaXpress high-content image acquisition and analysis software | Molecular Devices | MetaXpress | High-content image acquisition and analysis software |
| Multichannel pipette (0.5-10 µL) | Rainin | 17013802 | Manual 8-channel pipette, 0.5-10 µL |
| Multichannel pipette (0.5-10c | Rainin | 17013805 | Manual 8-channel pipette, 20-200 µL |
| Electronic multichannel pipette (10-200 μL) | Thermo Scientific | 14-3879-56BT | Electronic multichanenel pipette for 96- and 384-well microplate pipetting tasks |
| 50ml Reagent Reservoir | Genesee Scientific | 28-125 | Reagent reservior for multichannel pippte dispensing |
| 8-Channel aspirator | ABC Scientific | EV503 | 8-Channel stainless steel adaptor for aspirating liquids from 96- or 384-well plates |
| Excel spreadsheet software | Microsoft | Excel2016 | The spreadsheet software for data analysis and heatmap generation |
| Origin2018 scientific data analysis and graphing software | OriginLab | Origin2018 | The data analysis software for generating the dose response curves |
References
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