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Chemistry

Un dosage de Transport rhodopsine par analyse de l’imagerie de haute teneur

Published: January 16, 2019 doi: 10.3791/58703
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Ophthalmology, University of Pittsburgh, 2McGowan Institute for Regenerative Medicine, University of Pittsburgh

Summary

Ici, nous avons décrit une méthode d’imagerie de haute teneur pour quantifier le transport des mutants de rhodopsine associée à une rétinite pigmentaire. Une analyse de notation d’onde multiples a été utilisée pour quantifier la protéine rhodopsin sur la surface de la cellule ou dans la cellule entière.

Abstract

Des mutations de rhodopsine pourrait conduisent à la mort de photorécepteur de tige qui se manifeste comme autosomique dominante rétinite pigmentaire (RP), un progressif aveuglante de maladie qui n’a pas de traitement efficace. Nous émettons l’hypothèse que la cytotoxicité du mutant rhodopsine mal repliées peut être atténuée en stabilisant pharmacologiquement la protéine mutante rhodopsine. La mutation de P23H, parmi les autres mutations de rhodopsine de classe II, code pour une protéine mutante rhodopsine structurellement instable qui s’accumule dans le réticulum endoplasmique (re), alors que la rhodopsine de type sauvage est transporté vers la membrane plasmique dans mammifères cellules. Précédemment, nous avons effectué un écran axée sur la luminescence de haut débit (HTS) et identifié un groupe de chaperons pharmacologiques qui a sauvé le transport de la rhodopsine P23H d’ER à la membrane plasmique. Ici, en utilisant une méthode d’immunomarquage suivie d’une analyse d’imagerie de haute teneur, nous avons mesuré la quantité de protéines mutantes rhodopsine dans la cellule entière et sur la membrane plasmique. Cette méthode est instructive et efficace pour identifier le vrais succès des faux positifs suite HTS En outre, l’analyse d’image haute teneur nous a permis de quantifier plusieurs paramètres d’une expérience unique pour évaluer les propriétés pharmacologiques de chaque composé. À l’aide de ce test, nous avons analysé l’effet de 11 différents composés vers six mutants de rhodopsine RP associé, obtention d’un profil pharmacologique 2D pour une compréhension quantitative et qualitative sur la stabilité structurelle de ces mutants rhodopsine et l’efficacité de différents composés vers ces mutants.

Introduction

Repliement est impliqué dans la dystrophie musculaire, dégénérescence neuronale, ainsi que des maladies aveuglantes, y compris une rétinite pigmentaire (RP)1. RP est une dégénérescence rétinienne héréditaire et progressive associée à des mutations dans plus de 60 gènes affectant la fonction et l’homéostasie des photorécepteurs de la tige ou les épithéliums pigmenté rétinien (RPE)2,3. Aucun traitement efficace n’est actuellement disponible pour RP. Les mutations de rhodopsine représentent environ 25-30 % d’autosomique dominante (ad) cas RP. Parmi les plus de 150 rhodopsine mutations4 (Human Gene Mutation Database, http:/ www.hgmd.cf.ac.uk/), les mutations de la classe II causent l’instabilité structurelle de la protéine de la rhodopsine qui contribue à la mort de photorécepteur de tige et vision perte5,6,7,8. Le P23H est la mutation de la rhodopsine plus fréquente en Amérique du Nord, qui est aussi un exemple typique de la classe II rhodopsine mutations9,10. En raison de son instabilité structurelle inhérente, la rhodopsine mal repliée s’accumule dans le réticulum endoplasmique (re) dans les cellules de mammifères, alors que la rhodopsine de type sauvage est situé sur la membrane plasmique5. La rhodopsine mal repliée P23H expositions mutant dominant négative cytotoxicité qui ne résulte pas de SIM1, mais est liée à l’activation d’ER associés voie de dégradation des protéines et l’organisation du segment externe tige interrompu. Pour atténuer le stress de cellules photoréceptrices tige, une stratégie consiste à stabiliser le pliage native de la rhodopsine mutant à l’aide d’un chaperon pharmacologique.

Pour atteindre cet objectif, nous avons réalisé un écran de haut débit basés sur les cellules (EMD)11,12,13 à l’aide d’une analyse de complémentation de fragment de β-galactosidase à quantifier le mutant de rhodopsine P23H transporté sur le plasma membrane. Le protocole simple et robuste de ce test HTS nous a permis d’explorer les activités d’environ 79 000 petites molécules pour chaque écran. Toutefois, parce que ce dosage HTS lit les signaux de luminescence, faux positifs, y compris les inhibiteurs de la β-gal, composés colorés ou cytotoxiques sont inclus dans la liste de résultats en attente d’être identifiés par une analyse secondaire.

L’immunomarquage traditionnel et méthodes d’imagerie de fluorescence ont été utilisés pour les années d’étudier le transport de la rhodopsine dans les cellules de mammifères5,14,15,16. Cependant, ces méthodes conventionnelles ne peuvent servir à quantifier les effets pharmacologiques des composés de plus de 10 vers le transport de la rhodopsine, parce qu’une analyse d’imagerie fiable requiert un grand nombre d’images prises dans des conditions très cohérente, qui est pas amendables par les méthodes d’imagerie conventionnelles. Ici, nous avons développé un protocole d’imagerie de haute teneur immunostaining basé comme test secondaire pour quantifier le transport de surface cellulaire de rhodopsine mal repliées mutants11,13,17. Pour étiqueter rhodopsine sur la membrane plasmique, nous avons sauté l’étape de la perméabilisation de la membrane cellulaire et immunomarquage des mutants de la rhodopsine par un anticorps monoclonal anti-rhodopsine de (B6-30) reconnaissant l’épitope N-terminale de la rhodopsine du côté extracellulaire de la cellule membrane18. Pour visualiser la rhodopsine mutant dans la cellule entière, nous fondue rhodopsine avec la protéine de fluorescence de Vénus. De quantifier les intensités de fluorescence dans les canaux de fluorescence différents, nous sommes en mesure d’obtenir plusieurs paramètres d’une expérience unique dont l’intensité totale rhodopsine dans la cellule entière, sur la surface de la cellule et le ratio de fluorescence de rhodopsine sur la surface de la cellule à celle de la cellule entière. En appliquant cette méthode pour stabiliser les cellules exprimant un total de six mutants rhodopsine mal repliées, nous pouvons générer un profil pharmacologique de plusieurs petites molécules chaperons vers ces mutants. Dans ce protocole, toutes les cellules sont immunocolorées dans une plaque 384 puits et photographié à l’aide d’un système automatisé d’imagerie sous condition d’imagerie très cohérent. Une analyse de l’image est effectuée pour chaque puits, contenant des images de plus de 600 cellules pour réduire la variation due à l’hétérogénéité des cellules avec des variables de niveau d’expression de forme et de la protéine cellulaire. Le flux de travail de ce protocole est résumée dans la Figure 1. L’avantage de cette méthode est que nous obtenons images haute résolution ainsi que multiparamétriques quantifications de l’analyse axée sur l’image. En général, le présent protocole peut être modifié et appliqué pour quantifier le transport d’une protéine de membrane mal repliées d’intérêt.

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Protocol

Remarque : La rhodopsine transport dosage.

1. préparation et la Culture de cellules

  1. Faire revivre cryoconservés U2OS stables cellules exprimant le type sauvage (WT) ou les protéines de fusion de rhodopsine-Vénus souris mutante. Décongeler les cellules à 37 ° C jusqu'à ce que seulement petits cristaux de glace sont laissés dans le flacon.
    Remarque : Les cellules U2OS sont utilisés dans le présent protocole parce qu’il n’y a aucune lignée de cellules photoréceptrices disponibles pour des études in vitro et la biosynthèse des cils de la rhodopsine est régulée par des mécanismes moléculaires similaires dans les cellules de mammifères. En outre, les cellules U2OS attachent fermement vers le bas de la plaque et ont grands corps cellulaires, donc elles sont idéales pour l’analyse de transport de la rhodopsine. Sept U2OS cellules stables exprimant la WT, T4R, P23H, P53R, C110Y, D190N et P267L des mutants de rhodopsine sont utilisés ici à titre d’exemple pour montrer la qualité et la fiabilité du test. Des cellules stables exprimant les autres mutants de la rhodopsine ou d’autres protéines de la membrane peuvent être utilisés, selon l’objectif de l’essai. Cellules stables exprimant la rhodopsine humaine peuvent être utilisés dans ce test si elles sont disponibles. La rhodopsine souris a été utilisé ici, car les souris et les protéines humaines rhodopsine partagent 95 % d’homologie, et les composés identifiés par cet essai sera testée in vivo utilisant un modèle de souris PACA transportant la rhodopsine P23H mutation8. Les cellules stables ont été produites comme décrit plus haut19. Le WT et les transcriptions de la rhodopsine mutant ont été quantifiées par q-PCR et les clones de cellules stables exprimant des niveaux similaires de WT et transcriptions de rhodopsine mutant ont été sélectionnés pour ce test. L’expression des protéines de la rhodopsine a été confirmée par immunoblot et immunostaining. Le passage de cellules utilisées dans ce test doit être inférieur à 20.
  2. Transférer chaque lignée de cellules dans un tube conique 15 mL contenant 10 mL de milieu de croissance (taux de glycémie élevé Dulbecco modifié de Eagle medium (DMEM) avec 10 % sérum fœtal (SVF) et 5 µg/mL Plasmocin).
  3. Centrifuger le tube à 200 g pendant 5 min. jeter le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire avec 5 mL de milieu de culture cellulaire pour chaque lignée cellulaire. Transférer chaque ligne de suspension cellulaire dans une boite de culture de tissus de 60 mm et incuber à 37 ° C, avec 5 % de CO2.
  4. Repiquer les cellules lorsque le plat de vitroplants atteint 90 % confluence comme décrit dans référence12.

2. ensemencement de cellules à 5 000 cellules / puits

Remarque : Exécutez les procédures suivantes dans une hotte de culture de tissus.

  1. Traiter la plaque avec poly-lysine.
    1. Un jour avant d’ensemencer les cellules, traiter un mur noir et clair plaque 384 puits avec 20 µL/puits de la solution de poly-lysine pendant 30 min.
    2. Aspirer le liquide et permettre à tous les puits à sec pour 1 h. Replacez le couvercle de la plaque et stocker la plaque à 4 ° C durant la nuit pour l’ensemencement de la cellule.
  2. Préparer la suspension cellulaire.
    1. La culture de chaque lignée cellulaire dans un milieu de croissance dans un plat de vitroplants de 100 mm jusqu’au confluent de 90 %.
    2. Lavez chaque plat avec du sérum physiologique tamponné au phosphate (PBS) et détacher les cellules avec 1 mL de 0.05 % trypsine à 37 ° C.
    3. Remettre en suspension dans chaque ligne de cellules dans 10 mL de milieu (haute-glucose DMEM avec 10 % FBS, 100 unités/mL de pénicilline et la streptomycine 100 μg/mL).
    4. Compter les cellules et diluer chaque lignée de cellules à 1,25 x 105 cellules/mL avec le milieu.
  3. Les cellules des graines.
    1. Utiliser une pipette multicanaux électronique ou un distributeur automatique de réactif pour distribuer 40 µL/puits de la suspension cellulaire à trois colonnes par lignée cellulaire et remplissage colonnes 1-21 de la plaque 384 puits (Figure 2).
    2. Ajouter 40 µL/puits de U2OS (P23H-rhodopsine-Venus) à colonnes 22-23 et 40 µL/puits de U2OS (rhodopsine-Venus) à colonne 24, comme témoins.
    3. Centrifuger la plaque à 300 x g pendant 30 s pour faire tomber toutes les cellules vers le bas de la plaque 384 puits.
      Remarque : Évitez les chocs physiques à la plaque après l’ensemencement de la cellule. Dans le cas contraire, les cellules seront écrasées à un coin de chaque puits et la plaque ne sera pas adaptée pour l’imagerie de haute teneur.
    4. Incuber les plaques 384 puits à 37 ° C, avec 5 % de CO2 pendant 3 h pour les cellules d’attacher au fond de la plaque.

3. traiter les cellules avec des composés

  1. Générer une carte de la plaque avec les conditions de traitement tel qu’illustré à la Figure 2.
  2. Préparer 300 µL de 5 x solutions de travail de jusqu'à 15 composés dans une plaque à 96 puits.
    1. Diluer le cps 1 à 15 avec le milieu à cinq reprises de leurs concentrations finales dans les puits A1 à G2 de le 96 puits sur plaque (Figure 2 a). Ajouter 300 µL de milieu en H2 bien.
      Remarque : La concentration finale de chaque composé est utilisée à la concentration la plus efficace pour sauver le transport de la rhodopsine P23H par le HTS12,13.
    2. Ajouter 100 µL / puits de 2 % de diméthyl sulfoxide (DMSO) et 25 µM 9 -cis-rétinal qui sont dilués dans le milieu à colonnes 11 et 12, respectivement. Ajouter 9 -cis-rétinien dans la pénombre.
  3. Ajout de 10 µL / puits de 5 x travaillant des solutions à la plaque 384 puits, cultivées avec les cellules (Figure 2 b).
    1. Une pipette multi-canaux électronique permet d’ajouter des composés 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 et 15 pour les lignes A, C, E, G, I, K, M et O de colonnes 1 à 21 (Figure 2). Ajouter des composés 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 et M pour les lignes B, D, F, H, J, L, N et P dans les colonnes 1 à 21.
    2. Ajouter 10 µL / puits de 2 % DMSO à colonnes 22 et 24. Ajouter 10 µL / puits de 25 µM 9 -cis-rétinien à colonne 23.
      NOTE : DMSO est utilisé comme un contrôle de véhicule, parce que tous les composés sont initialement dissous dans le DMSO comme des stocks. Colonne 22 contenant des cellules de DMSO traité exprimant le P23H rhodopsine est utilisée comme contrôle de 0 %. 9 -Cis-rétiniens cellules traitées exprimant la rhodopsine P23H est utilisée comme contrôle 100 %.
  4. Couvrir la plaque 384 puits avec du papier aluminium et incuber les plaques à 37 ° C pendant 24 h.

4. Immunostaining sans perméabilisation de la Membrane sur la tache de rhodopsine protéine à la Surface cellulaire.

Remarque : Évitez tout détergent dans le processus d’immunostaining ensemble pour préserver la membrane cellulaire.

  1. Préparer 4 % paraformaldéhyde (PFA) en diluant les 16 % PFA avec PBS dans un rapport 1:4 de volume sous une hotte chimique. Transférer les 4 % PFA dans un réservoir de réactif.
  2. Sortez la plaque 384 puits dans une pièce sombre avec une lumière rouge. Utilisez un aspirateur 8 canaux raccordée à une bouteille de collecte sous vide pour aspirer doucement le milieu. Utiliser une pipette multicanaux électronique pour ajouter 20 µL / puits de fraîchement préparés 4 % PFA à l’ensemble plaque 384 puits et incuber pendant 20 min à température ambiante. Pour éviter le détachement cellulaire, pointent toujours les conseils de l’aspirateur vers du même côté de chaque puits au cours des aspirations. Ne pas toucher la partie inférieure médiane de chaque puits. Lorsque vous prenez des images, sélectionnez les champs à éviter la région touchée par l’aspirateur. Pour plus de 10 minutes d’incubation, couvrir la plaque 384 puits avec son couvercle pour éviter l’évaporation.
    Remarque : Les cellules sont fixées dans une pièce sombre pour éviter le Photoblanchiment de l’isorhodopsin régénérée qui aura une incidence sur le résultat du contrôle 100 %. Après la fixation, la plaque 384 puits peut être souscrite sous une lumière normale.
  3. Utilisez un aspirateur 8 voies pour aspirer la PFA dans chaque puits et utilisez une pipette multi-canaux électronique pour ajouter 50 μL par puits de PBS. Répétez deux fois plus d’effectuer trois lavages avec du PBS.
    Attention : Les déchets liquide contenant PFA sont collecté dans une bouteille à capsule et doit être éliminé comme un déchet chimique dangereux après l’expérience.
  4. Bloquer les cellules en ajoutant 20 µL / puits de 5 % de sérum de chèvre à l’ensemble plaque 384 puits et incuber à température ambiante pendant 30 min.
  5. Aspirer le sérum de chèvre 5 % et ajouter 15 µL / puits de 20 µg mL-1 B6-30 anti-rhodopsine anticorps dans le sérum de chèvre de 1 % à lignes A à O. ajouter 15 µL / puits de 1 % de sérum de chèvre au rang P pour le groupe de contrôle seulement anticorps secondaires.
  6. Incuber les plaques 384 puits à température ambiante pendant 90 min ou à 4 ° C jusqu’au lendemain. Couvrir la plaque 384 puits avec du papier aluminium pour éviter le Photoblanchiment des fluorophores.
  7. Laver la plaque 3 fois avec 50 µL / puits de PBS.
  8. Aspirer les PBS et ajouter 15 µL / puits de 5 µg mL-1 chèvre Cy3 conjugué d’IgG anticorps anti-souris. Couvrir la plaque 384 puits avec du papier aluminium et incuber à température ambiante pendant 1 h ou à 4 ° C durant la nuit.
  9. Laver la plaque 3 fois avec 50 µL / puits de PBS. Ajouter 50 µL / puits de PBS contenant 1 µg mL-1 Hoechst 33342 pour colorer les noyaux à température ambiante pendant 15 min.
  10. Sceller la plaque 384 puits avec un film transparent avant de l’imagerie. Couvrir la plaque 384 puits avec du papier aluminium et conserver à 4 ° C pendant une semaine, si les images sont prises immédiatement.

5. l’imagerie.

Remarque : Cette procédure d’imagerie de haute teneur est adaptée au système d’imagerie répertorié dans la Table des matières. Procédures peuvent être différentes si vous utilisez d’autres systèmes d’imagerie de haute teneur.

  1. Retirez le couvercle et mettre la plaque 384 puits en l’imageur haute teneur avec A1 positionné dans le coin supérieur gauche de la plaque.
  2. Ouvrez le logiciel d’acquisition image pour définir les paramètres d’acquisition d’images.
    1. Ouvrez la fenêtre paramètres d’Acquisition plaque et créer nouveau réglage ou charger un fichier de configuration existant.
    2. Sélectionner l’objectif 20 x et mis en place pixel binning 2 donc la taille en pixels calibré est 0,80 x 0,80 µm. définir les lignes de balayage comme 2 000 et la taille de l’image (W x H) comme 1 000 x 1 000 pixels (800.00 x 800.00 µm) par site.
    3. Sélectionnez le type de plaque pour être photographié. Utilisez les informations fournies par le fabricant de la plaque 384 puits pour remplir les dimensions de la plaque.
    4. Sélectionnez les puits à être photographiée pour la plaque 384 puits.
    5. Sélectionnez les quatre sites à être photographié par puits. Éviter le côté de la bien touché par les embouts d’aspiration.
    6. Sélectionnez des lasers à excitation comme 405, 488 et 561 nm. Sélectionnez filtres d’émission pour les canaux DAPI, FITC et Texas Red. Optimiser la puissance du laser et des gains de chaque voie pour assurer la luminosité des images prises par les puits de contrôle positif sont inférieures au seuil de saturation.
    7. Sélectionnez les puits à puits focus pour l’autofocus. Sélectionnez le premier puits acquis comme l’initiale bien pour trouver des échantillons. Sur tous les sites de site autofocus.
    8. Sélectionnez les quatre moyennes par ligne pour chaque canal. Optimiser la valeur de Z-offset pour chaque canal.
    9. Test 2-3 puits dans les coins en diagonales de la plaque 384 puits pour s’assurer que les images sont sur la mise au point pour tous les puits testés, images de tous les sites / puits ont des cellules avec plus de 40 % confluence et intensités de fluorescence de tous les canaux sont environ la moitié saturée à 100 % puits de contrôle.
    10. Enregistrer la méthode d’acquisition de l’image.
  3. Exécutez la plaque entière. Regarder l’imageur jusqu'à ce qu’il termine à capturer des images de la première colonne de la plaque pour vérifier la qualité de l’image avant de quitter l’imageur. Retirez la plaque 384 puits et conserver à 4 ° C pour une utilisation future.
    Remarque : Selon le nombre de sites sélectionnés par les puits et les canaux de prise, il faut 40 min à 3 h pour finir une plaque 384 puits d’imagerie.

6. image Analysis.

  1. Extraire les données d’image à l’aide d’un logiciel d’analyse de haute teneur image. Sélectionnez l’un des puits de contrôle à 100 % (colonne 23) pour définir les paramètres.
  2. Sélectionner les Longueurs d’onde multiples cellule marquant comme la méthode d’analyse et de commencer à configurer les paramètres.
    1. Définir les noyaux à l’aide d’images de la chaîne DAPI. Obtenir un aperçu pour vous assurer que les formes de noyaux définis dans les sélectionnés bien cadre bien avec les images de noyaux.
    2. Définir la forme de cellule dans le chenal FITC où la rhodopsine-Vénus est imagé.
    3. Définir les zones de taches superficielles de cellules rhodopsine dans le chenal de Texas Red.
    4. Tester l’algorithme en cours dans 5 puits afin de déterminer si les paramètres sont optimisés. Enregistrer les paramètres et fermer la fenêtre de Configuration .
  3. Exécutez tous les puits avec la méthode d’analyse optimisée.
  4. L’exportation de Numéro d’objet comme le nombre de cellules intactes. Exporter l' Intensité moyenne du canal FITC comme intensité Rhodopsin-Venus (rhodopsine-Venus INT). Exporter l' Intensité moyenne du canal Texas Red comme l’intensité de la rhodopsine sur la surface de la cellule (rhodopsine INT sur la surface de la cellule).
  5. Ouvrez les données exportées dans un tableur. Diviser l’intensité de la rhodopsine sur la surface de la cellule par la rhodopsine-Vénus INT comme ratio de MEM-à-total. Calculer le Z'-facteurs pour chaque paramètre évaluer la qualité de l’analyse. Z′ = 1−3X (STDcontrôler 100 %+STDcontrol 0 %) / | Contrôle à 100 %−Mean0 % contrôle|.
    Remarque : Une Z'-facteur supérieur à 0 indique un dosage modéré suffisant pour un écran de haute teneur et un Z' facteur entre 0,5 et 1 suggère un dosage exceptionnel requis pour un écran de haut-débit20,21.
  6. Le logiciel permet de générer une carte de chaleur de deux couleurs pour chaque paramètre. Organiser le nom de lignées cellulaires sur l’axe des abscisses et les composés sur l’axe y.

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Representative Results

Nous avons caractérisé le transport de la rhodopsine avec trois paramètres : l’intensité de la rhodopsine-Venus dans la cellule entière (rhodopsine-Venus INT), l’intensité de l’immunomarquage de la rhodopsine sur la membrane plasmique (rhodopsine INT sur la surface des cellules) et le ratio de rhodopsin tache sur la surface de la cellule à l’intensité de la rhodopsine-Venus dans la cellule entière (Ratio de MEM-Total). Un résultat représentatif de l’essai de transport rhodopsine est montré dans la Figure 3 et Figure 4. En utilisant le DMSO et 9 -cis-rétinienne traitées les cellules exprimant la rhodopsine-P23H-Venus comme le 0 à 100 % des contrôles, respectivement, le Z'-facteurs pour ces trois paramètres sont dans la fourchette comprise entre 0 et 0,5, ce qui suggère que le test a une qualité moyenne, suffisante pour l' imagerie de haute teneur21. Même si le Z optimisé '-facteurs sont inférieures à 0,5 en raison de ses procédures relativement complexes par rapport à un dosage HTS, ce dosage est toujours solide et fiable pour une analyse axée sur l’image. Un composé actif qui sauve un mal repliée rhodopsine devrait montrer des valeurs plus élevées de la rhodopsine INT sur la surface de la cellule et le Ratio de MEM-Total de DMSO, avec une valeur de P inférieure à 0,05. Trois cartes 2D chaleur étaient issues de ces trois paramètres pour comparer le montant moyen de rhodopsine et localisation par cellule (Figure 4). Répété dans réanalysés, WT et six rhodopsine mutants sont répertoriés horizontalement, et les effets des traitements composés sont comparés verticalement. En accord avec les études antérieures, la rhodopsine INT sur la surface des cellules et le rapport entre les MEM-Total sont plus faibles pour les six mutants par rapport à la rhodopsine WT traitée avec le DMSO (Figure 4)5,22,23. La rhodopsine INT sur la surface de la cellule et son ratio de MEM-à-Total doivent être multipliées par 9 -cis-rétinien traitement pour le T4R, P23H, D190N et P267L, mais pas les mutants de P53R ou C110Y, en suggérant que 9 -cis-rétinal sauve le transport de la T4R, P23H, D190N et P267L des mutants de rhodopsine. Tous les PC ont montré différents niveaux d’augmentation dans l’INT rhodopsine sur la surface de la cellule de T4R, P23H et D190N. CPS 3, 4, 5, 7, 8 et 11 ont augmenté l’INT de la rhodopsine-Venus, mais pas le ratio de MEM-à-Total de ces mutants de la rhodopsine, suggérant que ces composés n’a pas augmenté le montant de la rhodopsine. CPS 1, 2 6 et 9 a considérablement augmenté le ratio de MEM-à-Total de mutants de rhodopsine T4R, P23H, D190N et P267L, ce qui suggère que ces composés secourir le transport de ces mutants rhodopsine vers la membrane plasmique. Les profils 2D donnent un aperçu complet du transport de rhodopsine touché par ces mutations PACA associé qui sont atténuées par un traitement pharmacologique différent.

Figure 1
Figure 1 : le flux de travail de l’analyse de transport rhodopsine. Procédures pour souiller surface cellulaire de la rhodopsine sans perméabilisation de la membrane pour l’analyse de transport de la rhodopsine. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Illustrations pour la préparation de 5 x solutions de travail et le transfert de liquide sur la plaque 384 puits de la plaque à 96 puits. (A) la disposition de la plaque à 96 puits de 5 x solutions de travail. Puits A1 à G2 ont 300 µL / puits jusqu'à 15 5 x solutions de travail et le milieu (M) comme indiqué dans les colonnes 1 et 2. Composés de 14 et 15 sont 2 % DMSO et 25 µM 9 -cis-rétinien, respectivement, pour le traitement pour les sept lignées exprimant WT et mutant rhodopsine. En outre, les colonnes 11 et 12 ont 100 µL / puits de 2 % DMSO et 25 µM 9 -cis-rétinal en commande, respectivement, traités aux cellules exprimant la rhodopsine P23H pour le calcul de Z'-facteurs. (B) la mise en page plaque 384 puits pour conditions de type et traitement cellulaire. Les cellules U2OS exprimant la WT, T4R, P23H, P53R, C110Y, D190N et P267L rhodopsin-Venus sont semés comme illustré. Conditions de traitement sont marquées en bleu. Trucs roses et bleues montrent le transfert liquid puits à puits de la plaque à 96 puits à la plaque de 384 à l’aide d’une pipette multicanaux. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : images représentatives et analyses quantitatives pour les contrôles de l’essai de transport rhodopsine. (A) fluorescence de Vénus (vert) et cellule surface immunostaining (rouge) des cellules U2OS exprimant la rhodopsine-Venus WT ou P23H traités avec DMSO ou 5µm 9 -cis-rétinal. Echelle = 200 µm. (B) un colonne emplacement d’intensité moyenne de Vénus par cellule représentant rhodopsine montant dans la cellule entière (rhodopsine-Venus INT). p< 0,0001. Z'-facteur apparaît sous la ligne noire. Barre d’erreur et la valeur de colonne sont de moyenne et écart-type (S.D.) de 16 répétitions, respectivement. (C) un emplacement de colonne de signifie Cy3 intensité par cellule représentant la rhodopsine coloré sur la surface de la cellule (rhodopsine INT sur la surface de la cellule). (D) une parcelle de colonne du ratio d’intensité moyenne cy3 par cellule à moyenne intensité Vénus par cellule correspondant au rapport entre niveau de rhodopsine sur la surface de la cellule à son niveau de cellules entières (ratio de MEM-à-total). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : une analyse de haute teneur représentative du dosage transport rhodopsine montré que 2 couleurs chaleur cartes. (A) la carte thermique de moyenne intensité Vénus par cellule représentant le niveau de la cellule entière rhodopsine (rhodopsine-Venus INT). Chaque bloc représente un point de données et chaque condition a été testée en triple exemplaire. La légende de couleur est indiquée sur la gauche. CP, composé. (B) la carte thermique de moyenne intensité Cy3 par cellule représentant la rhodopsine coloré sur la surface de la cellule (rhodopsine INT sur la surface de la cellule). (C) la carte thermique de la moyenne intensité Cy3 par cellule à la moyenne intensité Vénus par cellule correspondant au rapport entre niveau de rhodopsine sur la surface de la cellule à son niveau de cellules entières (ratio de MEM-à-total). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Ici, nous avons montré un test d’imagerie haute teneur utilisé pour caractériser les hits identifiés d’une HTS L’automatisation seule impliquée dans ces protocoles est l’imageur de haute teneur. L’immunomarquage et imagerie de fluorescence de la rhodopsine ont été utilisés couramment pour caractériser la localisation de la rhodopsine5,14,15,16. Cependant, la quantification des images prises par les méthodes d’imagerie traditionnelles est limitée par l’absence d’images de cellule suffisante par l’état, faible capacité d’images par expérience et l’absence d’un paramètre de contrôle de la qualité. Nous avons adapté le protocole immunostaining traditionnel au format 384 puits et remplacé l’imagerie traditionnelle avec l’imagerie de haute teneur. À l’aide de ce protocole d’imagerie de haute teneur, nous avons réussi sélectionné et caractérise les activités de succès identifiés par un HTS11,13,17. Par rapport aux méthodes d’imagerie et immunostaining traditionnel, ce protocole a augmenté significativement la consistance des conditions d’imagerie, imagerie capacité et puissance d’analyse image, qui nous a permis de comparer quantitativement les effets pharmacologiques de 11 composés vers le transport de six PACA associées à des mutants de rhodopsine.

Les principaux changements du présent protocole par rapport aux protocoles utilisés antérieurement pour immunostaining rhodopsine et imagerie sont : (1) de plus en plus et d’immunomarquage des cellules dans une plaque 384 puits de clear-fond ; (2) imagerie de cellules à l’aide d’un imageur haute teneur ; et (3) analyse les données avec un logiciel d’analyse de haute teneur image. En raison de ces changements, une optimisation initiale est nécessaire pour trouver le meilleur nombre de semis de cellules, concentrations d’anticorps, conditions d’imagerie et des algorithmes d’analyse image.

Les étapes critiques du protocole comprennent : (1) semis des cellules qui permettent la confluence de 50 à 70 % avant la fixation ; (2) des aspirations attention pour éviter le détachement cellulaire ; (2) plusieurs puits d’imagerie à travers une plaque entière à s’assurer que les images sont sur le focus et une fluorescence de tous les canaux ne dépasse pas la moitié du seuil de l’imageur pour les puits de contrôle positif avant d’imagerie de la plaque entière ; et (3) gardant le Z'-facteur supérieur à 0 pour s’assurer de la fiabilité du test.

Les problèmes les plus courants qui pourraient être rencontrées pour ce protocole sont détachement cellulaire et faible Z'-facteurs. Pour éviter le premier numéro, prétraitez la plaque 384 puits avec poly-L-lysine pour faciliter la fixation des cellules et évitez d’utiliser des lignées de cellules qui se détachement facilement comme les cellules Hek293. En outre, limiter l’embout d’aspiration à toucher qu’un seul côté de chaque puits pendant l’aspiration, puis sélectionnez l’autre côté de chaque puits pour l’imagerie. Pour améliorer le Z'-facteur et la qualité de l’analyse, optimiser la cellule ensemencement des paramètres d’analyse du nombre et de l’image pour s’assurer que la forme des cellules ou la forme de noyaux définie par le logiciel correspond bien à chaque objet dans chaque canal de fluorescence.

Par rapport aux autres méthodes pour quantifier le transport de rhodopsine, comme un ELISA de surface cellulaire, ou une analyse de complémentation de fragment de β-galactosidase, qui calculent le niveau cible de la protéine à la surface cellulaire dans toutes les cellules, cette méthode d’imagerie de haute teneur quantifie teneur en protéines moyenne par cellule ; et, cette caractéristique unique permet d’éviter un facteur de variation critique, le nombre de cellules qui affecte l’affichage final dans d’autres méthodes. En outre, en raison du grand nombre de cellules imagé et quantifié par la méthode d’imagerie de haute teneur, les paramètres en moyenne de toutes les cellules par a bien montre faible variation entre les répétitions, ajoutant ainsi à la fiabilité du test.

Une des limites de ce protocole sont qu’ils ne sont pas les meilleurs dosages pour HTS, en raison de sa procédure relativement compliquée et les 2 h par plaque d’imagerie temps. Donc, nous recommandons dosages de journaliste alternative pour les grandes bibliothèques de petites molécules avec plus de 5 000 composés de dépistage et utiliser ce protocole d’imagerie de haute teneur pour les essais de caractérisation ciblée limitées à moins de 100 composés. La deuxième limitation du présent protocole est son manque de normes pour montrer si la fluorescence de Vénus ou les intensités de fluorescence immunostaining sont dans une corrélation linéaire avec la quantité de la quantité de protéine rhodopsin par cellule. Pour éviter la saturation par immunomarquage, nous recommandons essais et traçant les intensités d’immunomarquage des cellules incubées en présence de différentes concentrations d’anticorps primaires et secondaires. Sélectionnez les concentrations d’anticorps dans la gamme linéaire du changement de la floraison.

Extension de l’application actuelle, nous quantifiera transport rhodopsine des images de cellules transfectées de manière transitoire avec 28 mutants différents rhodopsine sous traitement jusqu'à 10 composés pour générer une base de données pharmacologique de ces composés activité des conseils de traitements potentiels aux patients PACA porteuses de ces mutations de la rhodopsine. Ce protocole peut également être facilement adapté pour les dosages de translocation d’une protéine de membrane d’intérêt qui vous seront utile pour les découvertes de médicaments d’autres protéines mauvais repliement des maladies.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous remercions le Dr Mark E. Schurdak et l’Université de Pittsburgh Drug Discovery Institute for fournissant l’imageur haute teneur et des formations initiales. Dr. Krzysztof Palczewski (Case Western Reserve University) a généreusement partagé le 4 1 et des anticorps anti-rhodopsine B630. Le plasmide contenant le cDNA de souris rhodopsin-Venus construire était partagé par m. Nevin Lambert (Université de Augusta). Ce travail a été soutenu par l’Institut National d’octroi de santé EY024992 YC et P30EY008098 de grant de l’Université de Pittsburgh Vision Research Core.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
U2OS (rhodopsin-Venus) cells NA NA Stable cells generated from U2OS cells
U2OS (T4R-rhodopsin-Venus) cells NA NA Stable cells generated from U2OS cells
U2OS (P23H-rhodopsin-Venus) cells NA NA Stable cells generated from U2OS cells
U2OS (P53R-rhodopsin-Venus) cells NA NA Stable cells generated from U2OS cells
U2OS (C110Y-rhodopsin-Venus) cells NA NA Stable cells generated from U2OS cells
U2OS (D190N-rhodopsin-Venus) cells NA NA Stable cells generated from U2OS cells
U2OS (P267L-rhodopsin-Venus) cells NA NA Stable cells generated from U2OS cells
DMEM high glucose Genesee Scientific 25-500 With L-Glutamine, sodium pyruvate
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 16140071 Heat inactivated
Plasmocin InvivoGen ant-mpt Mycoplasma elimination reagent
Penicillin-Streptomycin (100X) Gibco 15140122 100X concentrated antibiotic solutions to prevent bacteria contamination of cell cultures
Trypsin-EDTA Genesee Scientific 25-510 0.25%, 1mM EDTA in HBSS without calcium and magnesium
Poly-L-lysine solution Sigma-Aldrich P4707-50ML Mol wt 70,000-150,000, 0.01%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
CellCarrier-384 Ultra Microplates PerkinElmer 6057300 384-well tissue culutre-treated microplates with black well walls and an optically -clear cyclic olefin bottom for imaging cells in high content analysis
Sterile 96-well plate Eppendorf 30730119 Tissue culture treated with lid flat bottom, sterile, free of detectable pyrogens, Rnase, DNase and DNA. Non-cytotoxic
Phosphate Buffered Sailine (PBS) Invitrogen AM9625 10 x PBS Buffer, pH 7.4
DMSO Sigma-Aldrich D4540 >99.5%, cell culture tested
9-cis-retinal Sigma-Aldrich R5754
Compounds tested Selleckchem/Life Chemicals/Custom synthesized NA Compounds were purchased from different vendors or custom synthesized
B6-30 anti-rhodopsin antibody Novus NBP2-25160 Gift from Dr. Krzysztof Palczewski
Cy3-conjugated goat anti-mouse secondary antibody Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc 115-165-146
16% paraformaldehyde Thermo Fisher Scientific 28908 Methanol-free
10% Normal Goat Serum Thermo Fisher Scientific 50062Z Blocking buffer
Hoechst 33342, Trihydroch Invitrogen H3570 Nuclear staining solution
High-content imager Molecular Devices ImageXpress ImageXpress® Micro Confocal High-Content Imaging System
MetaXpress high-content image acquisition and analysis software Molecular Devices MetaXpress High-content image acquisition and analysis software
Multichannel pipette (0.5-10 µL) Rainin 17013802 Manual 8-channel pipette, 0.5-10 µL
Multichannel pipette (0.5-10c Rainin 17013805 Manual 8-channel pipette, 20-200 µL
Electronic multichannel pipette (10-200 μL) Thermo Scientific 14-3879-56BT Electronic multichanenel pipette for 96- and 384-well microplate pipetting tasks
50ml Reagent Reservoir Genesee Scientific 28-125 Reagent reservior for multichannel pippte dispensing
8-Channel aspirator ABC Scientific EV503 8-Channel stainless steel adaptor for aspirating liquids from 96- or 384-well plates
Excel spreadsheet software Microsoft Excel2016 The spreadsheet software for data analysis and heatmap generation
Origin2018 scientific data analysis and graphing software OriginLab Origin2018 The data analysis software for generating the dose response curves

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References

  1. Gregersen, N., Bross, P., Vang, S., Christensen, J. H. Protein misfolding and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 7, 103-124 (2006).
  2. Daiger, S. P., Bowne, S. J., Sullivan, L. S. Perspective on genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Archives of Ophthalmology. 125 (2), 151-158 (2007).
  3. Daiger, S. P., Sullivan, L. S., Bowne, S. J. Genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Clinical Genetics. 84 (2), 132-141 (2013).
  4. Stenson, P. D., et al. The Human Gene Mutation Database: towards a comprehensive repository of inherited mutation data for medical research, genetic diagnosis and next-generation sequencing studies. Human Genetics. 136 (6), 665-677 (2017).
  5. Sung, C. H., Schneider, B. G., Agarwal, N., Papermaster, D. S., Nathans, J. Functional heterogeneity of mutant rhodopsins responsible for autosomal dominant retinitis pigmentosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (19), 8840-8844 (1991).
  6. Athanasiou, D., et al. The molecular and cellular basis of rhodopsin retinitis pigmentosa reveals potential strategies for therapy. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 1-23 (2018).
  7. Chiang, W. C., et al. Robust Endoplasmic Reticulum-Associated Degradation of Rhodopsin Precedes Retinal Degeneration. Molecular Neurobiology. 52 (1), 679-695 (2015).
  8. Sakami, S., et al. Probing mechanisms of photoreceptor degeneration in a new mouse model of the common form of autosomal dominant retinitis pigmentosa due to P23H opsin mutations. Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 10551-10567 (2011).
  9. Dryja, T. P., et al. Mutations within the rhodopsin gene in patients with autosomal dominant retinitis pigmentosa. New England Journal of Medicine. 323 (19), 1302-1307 (1990).
  10. Sohocki, M. M., et al. Prevalence of mutations causing retinitis pigmentosa and other inherited retinopathies. Human Mutation. 17 (1), 42-51 (2001).
  11. Chen, Y., et al. A novel small molecule chaperone of rod opsin and its potential therapy for retinal degeneration. Nature Communications. 9 (1), 1976 (2018).
  12. Chen, Y., Tang, H. High-throughput screening assays to identify small molecules preventing photoreceptor degeneration caused by the rhodopsin P23H mutation. Methods in Molecular Biology. 1271, 369-390 (2015).
  13. Chen, Y., et al. A High-Throughput Drug Screening Strategy for Detecting Rhodopsin P23H Mutant Rescue and Degradation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (4), 2553-2567 (2015).
  14. Noorwez, S. M., et al. Pharmacological chaperone-mediated in vivo folding and stabilization of the P23H-opsin mutant associated with autosomal dominant retinitis pigmentosa. Journal of Biological Chemistry. 278 (16), 14442-14450 (2003).
  15. Saliba, R. S., Munro, P. M., Luthert, P. J., Cheetham, M. E. The cellular fate of mutant rhodopsin: quality control, degradation and aggresome formation. Journal of Cell Science. 115, 2907-2918 (2002).
  16. Kaushal, S., Khorana, H. G. Structure and function in rhodopsin. 7. Point mutations associated with autosomal dominant retinitis pigmentosa. Biochemistry. 33 (20), 6121-6128 (1994).
  17. Chen, Y., Brooks, M. J., Gieser, L., Swaroop, A., Palczewski, K. Transcriptome profiling of NIH3T3 cell lines expressing opsin and the P23H opsin mutant identifies candidate drugs for the treatment of retinitis pigmentosa. Pharmacological Research. 115, 1-13 (2016).
  18. Adamus, G., et al. Anti-rhodopsin monoclonal antibodies of defined specificity: characterization and application. Vision Research. 31 (1), 17-31 (1991).
  19. Goodson, H. V., Dzurisin, J. S., Wadsworth, P. Generation of stable cell lines expressing GFP-tubulin and photoactivatable-GFP-tubulin and characterization of clones. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (9), pdb prot5480 (2010).
  20. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  21. Bray, M. A., Carpenter, A., et al. Advanced Assay Development Guidelines for Image-Based High Content Screening and Analysis. Assay Guidance Manual. Sittampalam, G. S., et al. , Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. Bethesda (MD). (2004).
  22. Sung, C. H., Davenport, C. M., Nathans, J. Rhodopsin mutations responsible for autosomal dominant retinitis pigmentosa. Clustering of functional classes along the polypeptide chain. Journal of Biological Chemistry. 268 (35), 26645-26649 (1993).
  23. Krebs, M. P., et al. Molecular mechanisms of rhodopsin retinitis pigmentosa and the efficacy of pharmacological rescue. Journal of Molecular Biology. 395 (5), 1063-1078 (2010).

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Chimie numéro 143 haute teneur d’imagerie pliée protéine rhodopsin rétinite pigmentaire chaperons pharmacologiques immunomarquage
Un dosage de Transport rhodopsine par analyse de l’imagerie de haute teneur
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Feng, B., Liu, X., Chen, Y. A… More

Feng, B., Liu, X., Chen, Y. A Rhodopsin Transport Assay by High-Content Imaging Analysis. J. Vis. Exp. (143), e58703, doi:10.3791/58703 (2019).

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