Summary
Создание стабильной клеточная линия, экспрессирующих ген интереса для изучения функции гена могут быть сделаны стабильной трансфекции рудоразборка одного клонов после transfecting их через ретровирусной инфекции. Здесь мы покажем, что HT29-DR3 клеточных линий, созданных таким образом выяснить какой смертью рецептор 3 (DR3) способствует antimitotics индуцированного апоптоза механизмов.
Abstract
Изучая функции гена интереса может быть достиган манипулирования ее уровень выражения, например сокращения его выражение с нокдаун клеточных линий или увеличения его выражение с гиперэкспрессия клеточных линий. Переходных и стабильной трансфекции являются два метода, которые часто используются для выражения экзогенных генов. Переходных трансфекции полезен только для краткосрочных выражение, тогда как стабильная трансфекции позволяет экзогенных генов быть интегрированы в геном клетки принимающей где он будет выражаться непрерывно. В результате стабильной transfection обычно используется для исследования в долгосрочной генетического регулирования. Здесь мы опишем простой протокол для создания строки стабильной клеток, экспрессирующих Помеченный смертью рецептор 3 (DR3) для изучения DR3 функции. Мы выбрали один клонов после ретровирусной инфекции для поддержания однородности и чистоты стабильных клеточных линий. Стабильных клеточных линий, созданных с помощью этого протокола оказывают DR3-недостаточным HT29 клеток чувствительных к antimitotic препаратам, таким образом воссоздания апоптотической реакции в HT29 клетках. Кроме того тег флаг на DR3 компенсирует отсутствие хороших DR3 антитела и облегчает биохимические исследования молекулярный механизм, по которому antimitotic агентов индуцировать апоптоз.
Introduction
Экспрессии гетерологичных генов часто используется для изучения функции генов интерес. Два метода, переходных и стабильной трансфекции, преимущественно используются в клетки и молекулярной биологии для вставки сегмент ДНК или РНК в принимающей ячейки1,2. Временно transfected ДНК или РНК не может быть передана дочь клетки, поэтому генетические изменения могут храниться только на короткий период времени. С другой стороны в стабильно transfected клеток, экзогенных генов интегрированы в геном клетки хост, поддержания ее выражение в ячейку строки. Таким образом стабильной трансфекции является метод, который обычно резервируется для исследования долгосрочных генетического регулирования. Стабильные клеток линии также могут быть трансплантированы, как ксенотрасплантатов в модели мыши в vivo исследования3. Трансфекция стабильная можно разделить на две категории: вирусные и синцитиального. По сравнению с синцитиального трансфекции, вирусные инфекции могут передавать гены в более широкий спектр человеческих клеток с более высокой эффективности4,5,6,7. Кроме того стабильные клеточная линия от одного клона предлагает преимущество клоновых чистоты и однородности.
Неконтролируемое клеточный рост и деление являются наиболее отличительные черты рака. В клинических условиях antimitotic агенты являются первичного лечения для многих типов опухолей8. Однако нельзя игнорировать некоторые существенные ограничения antimitotic агентов. Во-первых эти химиотерапии может убить нормальные клетки вместе с нежелательным раковых клеток и, таким образом, может привести к серьезным побочным эффектам8. Во-вторых, антитубулиновые наркотики не являются эффективными против всех типов опухолей, несмотря на повсеместно тубулина в выражение в широкий спектр различных тканей как белок цитоскелета9,10. Неясно, почему антитубулиновые агентов показали многообещающие эффективность против яичников, лёгких и гематологические опухоли в клинического лечения, но не в почки, толстой кишки или рак поджелудочной11. Наконец даже пациенты с тем же типом опухоли может реагировать на antimitotics по-разному непредсказуемым образом. Там может быть ключевым эффекторные молекулы, которая влияет на чувствительность разных пациентов antimitotic агентов, что приводит к различных результатов, видели в клинического лечения12. Таким образом потенциальные дифференциального чувствительности больных к antimitotic лечению должны учитываться для того чтобы оптимизировать терапевтических вмешательств13.
Экран Библиотека высок объём всего генома siRNA продемонстрировал, что DR3 нокдаун может сделать чувствительные клетки устойчивы к antimitotic препаратам, подразумевающие роль для DR3 в химиотерапии индуцированного апоптоза14. Будучи членом надсемейства фактор некроза опухоли рецепторов (TNFR) сообщалось DR3 посредником апоптоз клеток в различных системах15,16,17,18. Таким образом мы отправились для установления стабильных клеточных линий, экспрессирующих DR3 изучение молекулярных механизмов, которые antimitotic наркотиков индуцировать апоптоз. Соответствующие ячейки модель для изучения DR3 гиперэкспрессия может обеспечиваться линии клетки рака толстой кишки человека HT29, который оказался DR3-недостаточным. Кроме того, в клинике рака толстой кишки не чувствительны к antimitotic препараты19.
В этой статье мы описываем метод, который позволяет генерировать стабильные клеточной линии HT29-DR3 через ретровирусной инфекции. Далее мы покажем, как проверить DR3 выражение в этих клетках, используя Западный blotting и как оценить чувствительность к antimitotic агентов, используя assay жизнеспособности клетки и морфологических наблюдения. Клетки усиливаются от одного клонов и, таким образом, имеют преимущество однородной генетический фон. Кроме того флаг метки на DR3 допускается для визуализации клеточных DR3 микроскопии и анализа взаимодействия выражения и белка гена путем биохимических подходов. Кроме того клетки может быть xenografted в мышах для дальнейшего анализа опухолевой прогрессии в ответ на antimitotics в vivo14.
Система HT29-DR3 клеток, представленные здесь предложили эффективным инструментом для изучения молекулярных механизмов как antimitotics убить клетки рака14. Поскольку общие инструменты для изучения функции гена гиперэкспрессия и бросовым клеточных линий, этот протокол можно легко адаптировать для других генов интерес или другие клеточные линии и, таким образом, превратилась в широко используется подход.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Пожалуйста, обратите внимание, что все мыши эксперименты, описанные здесь были утверждены и осуществляются в соответствии с институциональной животное уход и использование Комитет (IACUC) в Университете Цинхуа.
1. поколение DR3 гиперэкспрессия клеточных линий
- Построить плазмида DR3 выражение (pMXs-IRES-DR3-флаг), вставив полнометражного DR3 cDNA с 3 x флаг в C-terminus в антиретровирусной вектор pMXs-IRES-Blasticidin в места ограничения BamHI/XhoI.
- Рост клеток Plat-A блюдах 60 мм с 4 мл среды Дульбекко изменение орла (DMEM). На следующий день, когда клетки достигают 80% - 90% слияния, transfect клетки с 2 мкг плазмида pMXs-IRES-DR3-флага с помощью трансфекции реагента (см. Таблицу материалы) по данным производителя ручной20.
- После 72 ч собирать супернатанта, фильтрата СМИ, используя фильтр 0,45 мкм стерильным и держать вирусный подвеска в темноте при 4 ° C.
- Рост HT29 клеток в среде DMEM в блюдо 60 мм и инкубации клеток при 37 ° C с 5% CO2.
- На следующий день, когда клетки достигают 30% - 50% слияния, заразить клетки с 2 мл вирусных подвеска присутствии 8 мкг 1,5-диметил-1,5-diazaundecamethylene polymethobromide на миллилитр вирусных подвески. После 4-6 ч инкубации при 37 ° C аспирационная вирусный подвеска, добавить 4 мл свежего DMEM и возвращение блюдо в инкубаторе.
- Отменить СМИ от 24 h postinfection блюда и тщательно вымыть клетки с 2 мл подогретую PBS. Добавьте 1 mL трипсина-ЭДТА в клетки и инкубировать при 37 ° C на 3 мин.
- После наблюдения под микроскопом на 10 крат, что большинство клеток отдельный, остановите trypsinization с 2 мл полной DMEM, содержащие 10% плода бычьим сывороточным (ФБС). Собирать суспензию клеток в 15 мл трубку и центрифуги клетки на 200 x g 5 мин при комнатной температуре (RT).
- Удалить супернатант и Ресуспензируйте Пелле клеток в 10 мл DMEM. Смешайте хорошо аккуратно закупорить вверх и вниз. Разбавьте клетки факторами 30, 100 и 300. Заполнение ячеек в 150 мм блюда с 20 мл DMEM, содержащие 1 мкг/мл blasticidin. Инкубируйте на 37 ° C инкубатор с 5% CO2 ~ 1-2 недели.
- В этот период наблюдать колонии каждый день с инвертированным микроскопом при 10-кратном. Марк хорошо изолированные колонии в нижней части блюдо, когда колонии диаметр составляет около 1-2 мм.
- Аспирационная среднего и вымыть клетки с 3 мл подогретым PBS. Добавьте 2 миллилитров трипсина-ЭДТА в блюдо 60 мм. Используйте стерильный пинцет, чтобы забрать газобетона стерильные клонирования цилиндров и поместите их в блюдо 60 мм. Подобрать баллоны, содержащие трипсина ЭДТА и аккуратно разместить их над помеченной колоний. Убедитесь, что каждый клонирования цилиндра только содержит один из колонии и избежать загрязнения с близлежащих колоний.
- Возвращение блюдо в инкубатор на 3 минуты.
- После 3 минут Проверьте клетки под микроскопом при 10-кратном чтобы увидеть ли они отдельный. Когда клетки подняты, добавьте 70 мкл питательной среды для каждого цилиндра, чтобы инактивировать трипсина. Аккуратно перемешать суспензию клеток с 200 мкл пипетки. Убедитесь в том, не для перемещения баллона в ходе этого процесса.
- Передать суспензию клеток от каждой колонии двух 24-ну пластин, содержащие 1 мл DMEM на хорошо. Добавить 30 мкл суспензии клеток в колодец в пластине A и 70 мкл в соответствующем скважин в пластине B. Label пластины правильно и положить их обратно в инкубаторе.
2. Проверка DR3 гиперэкспрессия клеточной линии
- Когда клетки в плита B при впадении в 90%, удалите средства массовой информации и тщательно вымыть клетки с 1 мл раствора PBS. Полностью удалить PBS и лизировать клетки с 50 мкл 1 x SDS-PAGE загрузки буфера. Передача lysates клетки от 24-ну пластины для 1.5 мл пробирок и варить образцы для 10 минут при 100 ° C.
- Выполнение примеров на 10%, натрия Додециловый сульфат (SDS) гель при постоянном напряжении от 80 V для 15 мин и, затем, на 120 V на 1 ч.
- Передать винилидена фторида (PVDF) мембраны белка мокрых переводом в постоянный ток 400 мА 2 h.
- Тестовое выражение DR3 в различных клонов с антитела анти флаг, используя одичал тип HT29 клетки как отрицательный контроль (рис. 1). Разбавить Ослабленный первичный гуморальный фактор 5000 в 5% обезжиренное молоко, которое растворяется в TBST (трис буфер солевой раствор, содержащий 0.1% Tween-20). Проинкубируйте мембрану с флагом антитела на 4 ° C на ночь.
- Промойте мембрану с TBST, встряхивая его на decoloring шейкер на 200 об/мин на RT. Refresh TBST каждые 5 минут в общей сложности, мытье время 15 мин.
- Проинкубируйте мембрану с вторичного антитела анти мыши разбавленным с коэффициентом 10 000 в 5% обезжиренное молоко при температуре 4 ° C для 5-6 ч.
- Промойте мембрану снова, как описано в шаге 2.5.
- Обнаруживать флаг выражение с использованием западных увеличенная хемолюминесценция (ЭСЛ) субстрата и изображение мембраны с гель системы документации (см. Таблицу материалы). Идентифицировать клоны, выражая DR3 как положительные клонов.
- Передача клонов в плиты A, которые соответствуют позитивным клоны в плита B к пластине 6-Ну и продолжать усиливать клетки до их выращивания в 10 см блюд. Сделать замороженные запасы клеток, растущих из clones позитивные и хранить их в-80 ° C для использования в будущем.
3. Оценка ответа Apoptotic клеток Antimitotic агентов
Примечание: Diazonamide является новый класс морской натуральный продукт, который имеет замечательную деятельность в подавлении рост раковых клеток, которая отражает других дестабилизирующих тубулин агентов21. Однако его режим действий остается неясным. Для тестирования клеточный ответ клеток antimitotic агентам, паклитаксел и diazonamide были использованы для лечения одичал типа HT29 и HT29-DR3 ячейки. Наркотики были растворяют в диметилсульфоксида (ДМСО) чтобы сделать 10 мм запасов и, затем, далее разводят в различных концентрациях: 30 Нм, 100 Нм, 300 Нм, 1000 Нм, 3000 Нм и 10 000 Нм в ДМСО.
- Соберите HT29 и HT29-DR3 клетки trypsinization. Измерьте плотность клеток, используя счетчик автоматическое клеток. Затем семена клетки в 12-ну пластины в среде DMEM на плотности 3 х 104 клетки на хорошо. На следующий день добавьте 10 Нм diazonamide и использовать 1% ДМСО в качестве отрицательного контроля. После 48 часов лечения изображение клетки под микроскопом при 10-кратном (рис. 2).
- Семена HT29 и HT29-DR3 клетки в 96-луночных пластины в среде DMEM на плотности 3 x 103 клеток / Ну и дать им возможность расти на ночь при 37 ° C. Затем, добавьте эскалации дозы diazonamide концентрации 0,3 Нм, 1 Нм, 3 Нм, 10 Нм, 30 Нм и 100 Нм для каждой скважины, используя 1% ДМСО в качестве отрицательного контроля.
- После 48 часов лечения измерения жизнеспособности клеток с использованием комплекта пробирного жизнеспособность клеток на основе свечения согласно инструкции производителя.
- Вынуть пластину 96-луночных из инкубатора и пусть он стоять на RT приблизительно 30 мин. Затем добавьте 50 мкл пробирного реагентов для каждой скважины, встряхнуть пластину в РТ за 2 мин до Лизируйте клетки и инкубировать на табличке на RT еще 10 минут определить люминесценции каждой скважины с помощью читатель (рис. 3) микропланшетов.
Примечание: Жизнеспособность клеток представляет относительный люминесценции интенсивности каждого хорошо хорошо элемента управления обрабатывают 1% ДМСО.
- Вынуть пластину 96-луночных из инкубатора и пусть он стоять на RT приблизительно 30 мин. Затем добавьте 50 мкл пробирного реагентов для каждой скважины, встряхнуть пластину в РТ за 2 мин до Лизируйте клетки и инкубировать на табличке на RT еще 10 минут определить люминесценции каждой скважины с помощью читатель (рис. 3) микропланшетов.
- Используйте шесть недель старая женщина BALB/c обнаженной мышей в vivo исследования14.
Примечание: Мышей были сохранены при определенных условиях возбудителя бесплатно.- Trypsinize HT29 и HT29-DR3 клеток и, затем, остановить trypsinization, с помощью DMEM подогретую при 37 ° C. Собирать суспензию клеток в 50 мл трубки и центрифуги клетки на 1000 об/мин за 10 мин на RT. удалить супернатант и Ресуспензируйте Пелле клеток в среде DMEM без FBS. Центрифуга клетки снова и Ресуспензируйте Пелле клеток в PBS.
- Подсчитать ячейки, используя счетчик автоматическое клеток и разбавленных клетки к концентрации 2,5 x 107 кл/мл с помощью PBS. Генерировать опухоли через подкожные инъекции 200 мкл суспензии клеток HT29 или HT29-DR3 на правом фланге каждой мыши (5 х 106 клеток/мышь)22.
- Измерьте объем опухоли (ТВ), при помощи штангенциркуля каждые 2 d после трансплантации. Рассчитать телевизора с помощью следующей формулы: TV = 1 / 2L x W x W (здесь, W: ширина опухоли, L: длина опухоли). Когда объем средняя опухоль достигает около 100 мм3, рандомизировать мышей в элементе управления или обрабатываемой группы (n = 6 для каждой группы) и начать лечение.
- Готовят раствор паклитаксел следующим образом. Во-первых, распустить паклитаксел полностью в этанол на 5% от общего объема, а затем, добавить 5% от окончательного объема polyoxyl 35 гидрогенизированное касторовое масло. Наконец, составляют оставшиеся 90% от объема с D5W (5% декстрозы в воде, рН 7,4).
- Придать паклитаксел внутривенно в дозе 20 мг/кг 3 раза в неделю в течение двух недель. Измерьте опухоли объем и вес тела 3 x неделю14. Прекратить эксперимент и усыпить животных, если вес тела уменьшается на 20% или объем опухоли достигает около 2000 мм3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Характеристика HT29 клеток, стабильно выражая DR3 показан на рисунке 1. Клоны выражают различные уровни DR3, в то время как одичал тип клеток, которые служат в качестве отрицательного контроля, не показывать экспрессии экзогенных генов. Здесь мы показываем только пять клоны, среди которых клонировать 1 и 5 выражают высокий уровень DR3. Мы выбрали клон 1 и 5 для следующих экспериментов.
Морфология HT29 и HT29-DR3 клеток после отправления diazonamide наблюдалось инвертированным микроскопом при 10-кратном на рисунке 2. После 48 часов лечения с 10 diazonamide Нм HT29-DR3 показал очевидное апоптоз, с сломанной мембраны клетки и клетки мусора (Нижняя панель). Однако HT29 показали только митотическая арест с нетронутым клеток, экспонируется фигуру облавы клеток (верхняя группа).
Жизнеспособность клеток, клеток HT29 и HT29-DR3 после лечения с diazonamide показано на рисунке 3. После 48 часов лечения с 3 diazonamide Нм более 80% клеточной смерти был найден в HT29-DR3 клеток (красная кривая). Однако родительские клетки HT29 продемонстрировал только незначительные ответ на diazonamide в виде митотическая арест (синяя кривая). Таким образом гиперэкспрессия DR3 воссоздана путь diazonamide индуцированного апоптоза в этих клетках.
Результаты экспериментов ксенотрансплантата опухоли в vivo показали в предыдущем документе14. Успех опухоли имплантация для HT29 и HT29-DR3 составляет 100%. Гранулы ксенотрансплантата опухоли прогрессировала аналогичным образом в элементе управления транспортного средства; Однако HT29-DR3 ксенотрасплантатов отображается быстрее регрессии опухоли чем ксенотрасплантатов HT29 при обработке паклитаксел в дозе 20 мг/кг. Наши наблюдения лучше ответ опухолей HT29-DR3 паклитаксел чем HT29 опухоли в vivo далее подтвердил, что выражение внематочная DR3 оказывает опухолевые клетки более чувствительны к antimitotics.
Рисунок 1 : Анализ DR3 выражения в различных клонов. Уровни выражения DR3 были проанализированы Западный blotting с анти флаг (Верхняя панель) и бетой-актина антител (Нижняя панель, как внутренний контроль). Родительский HT29 клетки были использованы в качестве отрицательного контроля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Анализ морфологии клеток HT29 и HT29-DR3 после лечения с diazonamide. HT29 (Верхняя панель) и HT29-DR3 (Нижняя панель) лечили 10 Нм diazonamide за 48 ч. Масштаб баров = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Доза реакция кривых HT29 и HT29-DR3 клеток к diazonamide. Жизнеспособность клеток была измерена после 48 ч с последовательным концентрации diazonamide лечения. Планки погрешностей = стандартное отклонение (SD) экспериментальной triplicates. Да = diazonamide. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой рукописи мы описываем метод для создания HT29-DR3 стабильных клеточных линий. HT29-DR3 клетки обеспечивают модель для изучения молекулярных механизмов, которыми DR3 способствует апоптоз, antimitotic агентов. Этот подход является универсальным и повторяемости. Для обеспечения успеха процедуры, четыре ключевые шаги протокола должны рассматриваться. Во-первых для того чтобы произвести высокий достаточно титр вируса, рекомендуется выполнять трансфекции ДНК, когда клетки Plat-A при впадении в 80-90%. Во-вторых вирусный подвески должны храниться при температуре 4 ° C для больше чем 2 недели, не охватываемых от света. В-третьих когда разделение инфицированных клеток на 150 мм блюда, рекомендуется сделать серийных разведений получить хорошо разделенных колоний, как инфекции эффективность варьируется в разных клетках. Наконец когда собирание одной колонии, не следует любое загрязнение окружающих колоний.
Этот протокол работает хорошо с большинство клеточных линий, но потенциально может быть трудным для клеток, которые не стремятся образовать единый колоний. В таких случаях другие методы сортировки клеток, например антибиотики в сочетании с активированной флуоресценции клеток, сортируя (FACS), будут необходимы.
Трансфекция стабильная включает вирусных и не вирусные методы. В этом протоколе мы использовали ретровирусной инфекции для получения клеток, экспрессирующих DR3, рассуждая, что физические методы, такие как электропорация, более токсичны для клеток23 и химических методов, таких как липид опосредованной ДНК трансфекции, имеют низкий эффективность во многих типов клеток и имеют потенциальные последствия мимо24,25,26.
Эктопическая выражение является прямым и эффективным способом для уточнения функций генов. Таким образом этот протокол может использоваться для изучения других молекул-мишеней. Кроме того knockdown гена также имеет важное значение в функциональных исследований, и вполне возможно, что протокол может быть адаптирована к генов нокдаун систем. По сравнению с другими гена забивные и нокаут-подходы, такие как ТРИФОСФАТЫ-Cas9, протокол, представленные здесь легко применять и доступным для всех лабораторий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего объявить.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана от грантов 53110000117 (чтобы G.W.) и 043222019 (для X.W.) из университета Цинхуа.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | C11965500BT | Supplemented with 10% FBS and 1% Penicilin/Streptomycin |
| Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7571 | |
| Paclitaxel | Selleck | S1150 | |
| pMXs-IRES-Blasicidin | Cell Biolabs | RTV-016 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| PBS | Invitrogen | C14190500BT | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Invitrogen | 25200056 | |
| 1,5-Dimethyl-1,5-diazaundecamethylene polymethobromide | Santa Cruz | sc-134220 | |
| Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| Anti-mouse secondary antibody | Jackson ImmumoResearch | 115-035-166 | |
| anti-Flag antibody | Sigma | F-3165 | |
| HT29 cell line | ATCC | HTB-38 | |
| plat-A cell line | Cell Biolabs | RV-102 | |
| PVDF Immobilon-P | Millipore | IPVH00010 | |
| Cloning Cylinder | Sigma | C1059 | |
| Cell Imaging Multi-Mode Reader | Biotek | BTCYT3MV | |
| CKX53 Inverted Microscope | Olympus | CKX53 | |
| 12-well cell culture plates | Nest | 712001 | |
| 60 mm cell culture plates | Nest | 705001 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Nest | 601052 | |
| 0.22 μm steril filter | Millipore | SLGP033RB | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5810000327 | |
| 96 Well White Polystyrene Microplate | Corning | 3903 | |
| Western ECL Substrate | BIO-RAD | 1705060 | |
| ImageQuant LAS 4000 | GE Healthcare | ImageQuant LAS 4000 | |
| Decoloring Shaker | HINOTECH | TS-2000A | |
| Blasticidin | InvivoGen | ant-bl-1 | |
| Automated cell counter | BIO-RAD | TC 20 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985070 |
References
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Recillas-Targa, F. Multiple strategies for gene transfer, expression, knockdown, and chromatin influence in mammalian cell lines and transgenic animals. Molecular Biotechnology. 34 (3), 337-354 (2006).
- Daley, G. Q.
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. Sustained correction of X-linked severe combined immunodeficiency by ex vivo gene therapy. The New England. Journal of Medicine. 346 (16), 1185-1193 (2002).
- Roesler, J., et al. Third-generation, self-inactivating gp91(phox) lentivector corrects the oxidase defect in NOD/SCID mouse-repopulating peripheral blood-mobilized CD34+ cells from patients with X-linked chronic granulomatous disease. Blood. 100 (13), 4381-4390 (2002).
- Russell, W. C. Update on adenovirus and its vectors. Journal of General Virology. 81 (Pt 11), 2573-2604 (2000).
- Wasala, N. B., Shin, J. H., Duan, D. The evolution of heart gene delivery vectors. The Journal of Gene Medicine. 13 (10), 557-565 (2011).
- Zhou, J., Giannakakou, P. Targeting microtubules for cancer chemotherapy. Current Medicinal Chemistry - Anti-Cancer Agents. 5 (1), 65-71 (2005).
- Rovini, A., Savry, A., Braguer, D., Carre, M. Microtubule-targeted agents: when mitochondria become essential to chemotherapy. Biochimica et Biophysica Acta. 1807 (6), 679-688 (2011).
- Bhalla, K. N. Microtubule-targeted anticancer agents and apoptosis. Oncogene. 22 (56), 9075-9086 (2003).
- Jordan, M. A., Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nature Reviews Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).
- Bhat, K. M., Setaluri, V. Microtubule-associated proteins as targets in cancer chemotherapy. Clinical Cancer Research. 13 (10), 2849-2854 (2007).
- Bates, D., Eastman, A. Microtubule destabilising agents: far more than just antimitotic anticancer drugs. British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (2), 255-268 (2017).
- Qi, C., et al. Anti-mitotic chemotherapeutics promote apoptosis through TL1A-activated death receptor 3 in cancer cells. Cell Research. 28 (5), 544-555 (2018).
- Marsters, S. A., et al. Apo-3, a new member of the tumor necrosis factor receptor family, contains a death domain and activates apoptosis and NF-kappa B. Current Biology. 6 (12), 1669-1676 (1996).
- Chinnaiyan, A. M., et al. Signal transduction by DR3, a death domain-containing receptor related to TNFR-1 and CD95. Science. 274 (5289), 990-992 (1996).
- Xu, L. X., et al. Death receptor 3 mediates TNFSF15- and TNFalpha-induced endothelial cell apoptosis. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 55, 109-118 (2014).
- Wen, L., Zhuang, L., Luo, X., Wei, P. TL1A-induced NF-kappaB activation and c-IAP2 production prevent DR3-mediated apoptosis in TF-1 cells. Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 39251-39258 (2003).
- Nakayama, M., et al. Multiple pathways of TWEAK-induced cell death. Journal of Immunology. 168 (2), 734-743 (2002).
- Kitamura, T., et al. Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics. Experimental Hematology. 31 (11), 1007-1014 (2003).
- Wang, G., Shang, L., Burgett, A. W., Harran, P. G., Wang, X. Diazonamide toxins reveal an unexpected function for ornithine delta-amino transferase in mitotic cell division. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (7), 2068-2073 (2007).
- Hassan, M. S., von Holzen, U. Animal Model: Xenograft Mouse Models in Esophageal Adenocarcinoma. Methods in Molecular Biology. , 151-164 (2018).
- Potter, H., Heller, R.
- Jacobsen, L., Calvin, S., Lobenhofer, E. Transcriptional effects of transfection: the potential for misinterpretation of gene expression data generated from transiently transfected cells. Biotechniques. 47 (1), 617-624 (2009).
- Hagen, L., Sharma, A., Aas, P. A., Slupphaug, G. Off-target responses in the HeLa proteome subsequent to transient plasmid-mediated transfection. Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (1), 84-90 (2015).
- Omidi, Y., et al. Microarray analysis of the toxicogenomics and the genotoxic potential of a cationic lipid-based gene delivery nanosystem in human alveolar epithelial a549 cells. Toxicology Mechanisms and Methods. 18 (4), 369-378 (2008).
