Summary
Bir gen gen işlev eğitim ilgi overexpressing bir istikrarlı hücre kültürünü kuran istikrarlı transfection-toplama tek klonlar tarafından via retroviral enfeksiyon transfecting sonra yapılabilir. İşte bu şekilde oluşturulan HT29-DR3 hücre hatları tarafından hangi ölüm reseptör 3 (DR3) antimitotics kaynaklı apoptosis katkıda mekanizmaları aydınlatmak göstermektedir.
Abstract
Işlev bir genin ilgi eğitim seviyesine ifadenin, ifadesini devirme hücre hatları ile azalan veya artan ifadesini overexpression hücre hatları ile gibi manipüle ederek elde edilebilir. Geçici ve istikrarlı transfection eksojen gen ekspresyonu için sık sık kullanılan iki yöntem vardır. İse nerede sürekli olarak belirtilecektir konak hücre genomu entegre olmak eksojen genler istikrarlı transfection sağlar geçici transfection sadece kısa vadeli ifade için yararlıdır. Sonuç olarak, istikrarlı transfection genellikle araştırma için uzun vadeli genetik düzenleme istihdam edilmektedir. Burada etiketli ölüm reseptör 3 (DR3 DR3 işlevi keşfetmek için) overexpressing bir istikrarlı hücre satırı oluşturmak için basit bir protokol açıklayın. Tek klonlar retroviral bir enfeksiyondan sonra homojenliği ve istikrarlı hücre hatları saflığı korumak için aldık. Bu iletişim kuralı kullanılarak oluşturulan istikrarlı hücre hatları DR3-eksik HT29 hücreleri hassas antimitotic ilaçlara, böylece HT29 hücreleri apoptotik yanıtta başlamaktan render. Ayrıca, DR3 bayrak etiketinde iyi DR3 antikor kullanılamamasıdır için dengeler ve hangi tarafından apoptosis antimitotic ajanlar neden moleküler mekanizması biyokimyasal çalışma kolaylaştırır.
Introduction
Kapaklı gen ekspresyonu kez ilgi genlerin fonksiyonun çalışmaya istihdam edilmektedir. İki yöntem, geçici ve istikrarlı transfection, hücre ve moleküler biyoloji DNA veya RNA bir parçasını bir konak hücre1,2eklemek için yüksekokul kullanılır. Genetik değişiklik yalnızca kısa bir süre için muhafaza edilebilir böylece geçici transfected DNA veya RNA kızı hücrelere geçirilemez. Öte yandan, stabil transfected hücrelerde eksojen genler ifadesini hücre içinde sürdürülmesi konak hücre genomu içine entegre edilmiştir. Böylece, istikrarlı transfection genellikle ayrılmış bir araştırma içine uzun vadeli genetik düzenleme yöntemidir. Xenografts in vivo modellerinde fare içine3çalışma olarak istikrarlı hücre kültürünü de nakledilen. Kararlı transfection iki kategoriye ayrılabilir: viral ve nonviral. Nonviral transfection için karşılaştırıldığında, viral enfeksiyon genler bir daha yüksek verimlilik4,5,6,7ile insan hücreleri daha çok içine aktarabilirsiniz. Ayrıca, tek bir klon istikrarlı hücre satırından homojenliği ve klonal saflık avantajı sunar.
Kontrolsüz hücre büyümesi ve bölünme kanser en ayırt edici özellikleri vardır. Klinik ayarları'nda, adl tip-in tümör8için birincil tedavi antimitotic ajanlardır. Ancak, bazı önemli kısıtlamalar antimitotic ajanların göz ardı edilemez. İlk olarak, bu chemotherapies istenmeyen kanserli hücreleri ile birlikte normal hücreleri de öldürebilir ve böylece, ciddi yan etkileri8' de neden olabilir. İkinci, antitubulin ilaçların tümörler, tübülin'ın her yerde ifade birçok farklı dokuların bir hücre iskeleti protein9,10olarak rağmen her türlü karşı etkili değildir. Antitubulin ajanlar karşı umut verici etkinlik gösterdi neden o belirsizdir yumurtalık, akciğer ve hematolojik kanser klinik tedavi, ancak değil böbrek, iki nokta üst üste ya da pankreas kanserlerinin11. Son olarak, hatta hastalarda tümör aynı tip antimitotics için farklı beklenmedik bir şekilde yanıt verebilirsiniz. Farklı hastaların klinik tedavi12' görülen farklı sonuçlar elde antimitotic ajanlara duyarlılığını etkiler bir anahtar efektör molekül olabilir. Böylece, potansiyel fark hassasiyetleri antimitotic tedaviye hastaların tedavi müdahaleler13en iyi duruma getirmek için dikkate alınmalıdır.
Bir yüksek-den geçerek tüm-genom siRNA kitaplık ekranı DR3 nakavt hassas hücreler bir rol DR3 için kemoterapi kaynaklı apoptosis14' te göstermek için antimitotic ilaçlara dirençli hale gösterdi. Tümör nekroz faktör reseptör (TNFR) süper bir üyesi olarak, hücre apoptosis çeşitli sistemleri15,16,17,18arabuluculuk DR3 bildirilmiştir. Böylece, biz kararlı hücre hatları DR3 hangi apoptosis antimitotic uyuşturucu neden moleküler mekanizmaları incelemek için overexpressing kurmak için yola çıktı. DR3 overexpression çalışmak için bir uygun hücre modeli insan kolon kanseri hücre satırı DR3 eksikliği bulundu HT29 ile sağlanabilir. Ayrıca, klinikte, Kolon kanserlerinin duyarsız antimitotic uyuşturucu19.
Bu makalede, bir HT29-DR3 istikrarlı cep hattından retroviral enfeksiyon nesil sağlayan bir yöntem açıklanmaktadır. Biz daha fazla western Blot kullanarak bu hücrelerde DR3 ifade doğrulamak ve antimitotic ajanlara duyarlılık bir hücre canlılığı tahlil ve morfolojik gözlem kullanarak değerlendirmek gösterir. Hücreler tek klonlar güçlendirilmiş ve böylece, homojen bir genetik arka plan avantajına sahip. Buna ek olarak, DR3 bayrak etiketinde hücresel DR3 görselleştirme için mikroskobu ve gen ifade ve protein etkileşim analizi tarafından biyokimyasal yaklaşım izin. Ayrıca, hücreler tümör ilerleme antimitotics vivo içinde14yanıt olarak daha ileri düzeyde çözümlemek farelerde xenografted olabilir.
Burada sunulan HT29-DR3 hücre sistemi nasıl antimitotics kanser hücreleri14öldürmek moleküler mekanizmaları eğitim için etkili bir araç teklif etti. Overexpression ve devirme hücre hatları gen fonksiyon türleri çalışmak için yaygın araçları olduğundan, bu iletişim kuralı kolayca adapte faiz veya diğer hücre satırları diğer genler ve böylece, yaygın olarak kullanılan bir yaklaşım döndü.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada açıklanan tüm fare deneyleri kabul ve uygun olarak kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Tsinghua Üniversitesi'nde gerçekleştirilen lütfen unutmayın.
1. nesil DR3 Overexpression hücre hatları
- 3 tam uzunlukta DR3 cDNA ekleyerek plazmid DR3 ifade (pMXs-IRES-DR3-bayrak) için inşa x C-terminus retroviral vektör pMXs-IRES-Blasticidin BamHI/XhoI kısıtlama sitelerdeki içine bayrak.
- 60 mm yemekleri ile Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal Orta (DMEM) 4 mL hücrelerde Plat-A büyümek. Hücrelerin % 80 - % 90 izdiham ulaştığınız zaman, ertesi gün transfect 2 μg plazmid pMXs-IRES-DR3-bayrağının bulunduğu hücreleri transfection reaktif kullanarak ( Tablo malzemelerigörmek) göre üreticinin el ile20.
- 72 h sonra süpernatant toplamak, 0,45 mikron steril filtre kullanarak ortamın filtrate ve viral süspansiyon karanlıkta 4 ° C'de bırakın.
- DMEM 60 mm tabak HT29 hücrelerin büyümesine ve % 5 CO237 ° C'de hücreler kuluçkaya.
- Hücreleri % 30 - % 50 izdiham ulaştığınız zaman, ertesi gün 1,5-dimetil-1,5-diazaundecamethylene polymethobromide viral süspansiyon mililitre başına 8 μg huzurunda viral süspansiyon 2 mL hücrelerle bulaştırmak. Sonra 4-6 h, kuluçka 37 ° C'de, viral süspansiyon Aspire edin, taze DMEM 4 mL ekleyin ve bulaşık kuluçka makinesi için dönmek.
- Yemekler 24 h postinfection medyadan atın ve dikkatli bir şekilde hücreleri prewarmed PBS 2 mL ile yıkayın. Tripsin-EDTA 1 mL hücrelere ekleyin ve 3 dk 37 ° C'de kuluçkaya.
- Hücrelerin çoğu ayırdıktan 10 X büyütme, mikroskop altında gözlemleyerek sonra 2 mL ile trypsinization tam DMEM % 10 fetal Sığır serum (FBS) içeren, kes. 15 mL tüp hücre süspansiyon toplamak ve hücreleri 200 x g (RT) Oda sıcaklığında 5 min için de santrifüj kapasitesi.
- Süpernatant kaldırmak ve hücre Pelet 10 mL DMEM resuspend. De hafifçe yukarı ve aşağı pipetting tarafından karıştırın. Hücreleri tarafından 30, 100 ve 300 faktörler sulandırmak. Tohum DMEM 1 µg/mL blasticidin içeren 20 mL 150 mm yemeklerin hücrelerde. %5 CO2 37 ° C inkübatör, ~ 1-2 hafta kuluçkaya.
- Bu dönemde, koloniler 10 X büyütme, ters bir mikroskop ile her gün gözlemlemek. Koloni çapı yaklaşık 1-2 mm olduğunda iyi izole kolonileri tabak dibinde işaret.
- Orta Aspire edin ve önceden ısıtılmış PBS 3 mL hücrelerle yıkayın. Tripsin-EDTA 2 mililitre bir 60 mm çanak ekleyin. Autoclaved steril klonlama silindir kadar almak için steril forseps kullanın ve 60 mm çanak yerleştirin. Tripsin-EDTA içeren silindir al ve yavaşça onları üzerinde işaretli kolonilere yerleştirin. Klonlama her silindir sadece bir koloni içerir ve yakındaki koloniler ile kirlenmesini önlemek emin olun.
- Çanak da kuluçka için 3 dakika geri.
- 3 dakika sonra ilişkisi kesildi olup olmadığını görmek için 10 X büyütme, mikroskop altında hücreleri denetleyin. Hücreleri kaldırdın, kültür orta 70 μL tripsin devre dışı bırakabilirsiniz için her silindir için ekleyin. Hücre süspansiyon 200 μL pipet ile karışımı yavaşça. Bu işlem sırasında silindir oynatmamaya emin olun.
- Hücre süspansiyon DMEM 1 mL de başına içeren iki 24-şey tabak her koloni aktarın. Hücre süspansiyon iyi başına 30 μL plaka A ekleyin ve ilgili, 70 μL plaka B. etiket tabakları düzgün kuyuları ve bunları da kuluçka makinesine koy.
2. DR3 Overexpression hücre kültürünü doğrulanması
- Plaka B hücreleri % 90 izdiham olduğunda, medyayı çıkarın ve dikkatle PBS 1 mL hücrelerle yıkayın. Tamamen PBS kaldırmak ve SDS-sayfa yükleme arabellek x 1 50 μL içeren hücreleri parçalayıcı. Hücre lysates 24-şey plaka 1,5 mL santrifüj tüpleri için aktarmak ve örnekleri için 100 ° C'de 10 dakika kaynatın
- Örnekleri % 10 Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) jel 80 V 15dk için sabit bir gerilim ve sonra 120 V 1 h için çalıştırın.
- Islak transfer 400 sürekli mevcut sırasında tarafından bir polivinilidin florid (PVDF) membran protein aktarım mA 2 h için.
- DR3 ifade ile Anti-bayrak antikor, bir negatif kontrol (Şekil 1) vahşi tipli HT29 hücreleri kullanarak farklı klonlar test. TBST içinde çözünmüş 5.000 %5 bardakyağsız süt bir faktörle birincil antikor seyreltik (% 0,1 içeren Tris arabelleğe alınmış serum ara-20). Membran ile bayrak antikor 4 ° C'de gecede kuluçkaya.
- Bu decoloring bir shaker RT. yenileme, 200 devirde üzerinde TBST her 5 dk 15 dk zaman yıkama toplam sallayarak membran TBST ile yıkayın.
- Membran ile Anti-fare ikincil antikor 10.000 %5 bardakyağsız süt için 5-6 h 4 ° C'de bir faktörle seyreltilmiş kuluçkaya.
- Membran adım 2.5 açıklandığı gibi tekrar yıkayın.
- Batılı gelişmiş Kemiluminesan (ECL) substrat kullanarak bayrak ifade algılamak ve membran bir jel dokümantasyon sistemi ile görüntü ( Tablo malzemelerigörmek). Pozitif klonlar DR3 ifade klonlar tanımlayın.
- 6-şey plaka plaka B pozitif klonlar için karşılık gelen ve 10 cm yemekleri büyüyen kadar hücreleri yükseltmek devam klonlar plaka A aktarın. Pozitif klonlar büyüyen hücre donmuş hisse senetleri yapmak ve bunları-80 ° c ileride kullanmak üzere saklamak.
3. Antimitotic ajanlar hücre apoptotik cevaben değerlendirilmesi
Not: Diazonamide tübülin kararsız hale diğer ajanlar21aynalar kanser hücre büyümesini inhibe olağanüstü etkinliğini vardır deniz doğal ürünün yeni bir sınıftır. Ancak, eylem onun modu belirsizdir. Antimitotic ajanlar hücre hücresel yanıt sınamak için paklitaksel ve diazonamide vahşi tipli HT29 hücreleri ve HT29-DR3 hücreleri tedavi etmek için kullanılmıştır. Uyuşturucu dimetil sülfoksit (10 mM stokları yapmak DMSO) çözünmüş ve, sonra daha fazla için farklı konsantrasyonlarda seyreltilmiş: 30 nM, 100 nM, 300 nM, 1.000 nM, 3000 nM ve 10.000 DMSO nM.
- HT29 ve HT29-DR3 hücreleri tarafından trypsinization toplamak. Bir otomatik hücre sayaç kullanarak hücre yoğunluğu ölçmek. O zaman, iyi başına 3 x 104 hücre yoğunluğu, DMEM 12-şey levha hücrelerde tohum. Ertesi gün 10 nM diazonamide ekleyip %1 DMSO bir negatif kontrol kullanabilirsiniz. Tedavi 48 saat sonra 10 X büyütme (resim 2), mikroskop altında hücreler görüntü.
- Tohum HT29 ve HT29-DR3 DMEM 96-şey levha şey başına 3 x 103 hücre yoğunluğu, hücreleri ve 37 ° C'de gecede büyümeye izin Sonra eklemek diazonamide konsantrasyonları doz tırmanan 0,3 nM, 1 nM, 3 nM, 10 nM, 30 nM ve 100 nM % 1 DMSO bir negatif kontrol kullanarak her şey için.
- Tedavi 48 saat sonra üreticinin kılavuzuna göre bir ışıldama tabanlı hücre canlılığı tahlil kit kullanarak hücre canlılığı ölçmek.
- Kuluçka makinesi 96-şey plaka çıkarmak ve RT yaklaşık 30 dakika standı bırakın. Daha sonra her şey için tahlil reaktifler 50 µL plaka hücreleri parçalayıcı 2 min için RT sallamak ve başka bir 10 dk. belirleme ışıldama Mikroplaka Okuyucu (Şekil 3) kullanarak her iyi RT, plaka kuluçkaya ekleyin.
Not: Hücre canlılığı her göreli ışıldama yoğunluğu için gösterir bu denetimin de % 1 DMSO ile tedavi.
- Kuluçka makinesi 96-şey plaka çıkarmak ve RT yaklaşık 30 dakika standı bırakın. Daha sonra her şey için tahlil reaktifler 50 µL plaka hücreleri parçalayıcı 2 min için RT sallamak ve başka bir 10 dk. belirleme ışıldama Mikroplaka Okuyucu (Şekil 3) kullanarak her iyi RT, plaka kuluçkaya ekleyin.
- 6-hafta-yaşlı kadın BALB/c Çıplak fareler bir in vivo çalışmada14için kullanın.
Not: Fareler patojen-Alerjik belirli koşullarda muhafaza.- HT29 ve HT29-DR3 hücre trypsinize ve o zaman, 37 ° C'de prewarmed DMEM kullanarak trypsinization bırak Hücre süspansiyon 50 mL tüp içinde toplamak ve hücreler için 10 dk RT. atma süpernatant az 1000 devirde santrifüj kapasitesi ve hücre Pelet FBS olmadan DMEM ortamda resuspend. Hücreleri tekrar santrifüj kapasitesi ve hücre Pelet PBS içinde resuspend.
- Bir otomatik hücre sayaç kullanarak hücreleri saymak ve 2.5 x 10 bir konsantrasyon hücrelere seyreltik7 hücre/mL PBS kullanarak. Tümör HT29 veya HT29-DR3 hücre süspansiyon 200 μL subkutan enjeksiyon yoluyla her fare (5 x 106 hücreler/fare)22sağ kanat oluşturmak.
- Çap pergeli her 2 d sonra nakli kullanarak tümör birimi (TV) ölçmek. Aşağıdaki formülü kullanarak TV hesaplamak: TV = 1/2 L x g x G (burada, W: tümör genişliği, L: tümör uzunluk). Ortalama tümör hacmi yaklaşık 100 mm3ulaştığında, fareler ve denetimi veya tedavi grubu rastgele (n = 6 grup başına) ve tedavi başlatmak.
- Paklitaksel çözüm aşağıdaki gibi hazırlayın. İlk olarak, paklitaksel tamamen etanol toplam hacminin % 5 içinde dağıtılması ve daha sonra %5 polyoxyl 35 son hacminin hidrojene Hint yağı ekleyin. Son olarak, D5W birimle kalan % 90 makyaj (%5 Dekstroz sudaki pH 7,4).
- Paklitaksel 20 mg/kg 3 doz, intravenöz enjekte her iki hafta boyunca. Tümör cilt ve vücut ağırlığı 3 x hafta14ölçmek. Deneme bitirmek ve vücut ağırlığının % 20 oranında azalır veya tümör hacmi yaklaşık 2000 mm3ulaşır hayvanlara ötenazi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Stabil DR3 ifade HT29 hücrelerin karakterizasyonu Şekil 1' de gösterilen. Bir negatif kontrol hizmet, vahşi-türü hücre eksojen gen ekspresyonu gösterme iken klonlar DR3, çeşitli düzeylerde hızlı. Burada sadece beş klonlar, göstermek aralarında 1 clone ve 5 DR3 en üst düzeyde ifade eder. Klon 1 ve 5 aşağıdaki deneyler için seçtik.
Diazonamide yönetim sonra HT29 ve HT29-DR3 hücre morfolojisi 10 X büyütme Şekil 2' de ters bir mikroskop tarafından gözlenmiştir. 10 nM diazonamide ile 48 h tedaviden sonra HT29-DR3 kırık hücre zarı ve hücre artıkları (alt paneli) ile belirgin apoptozis gösterdi. Ancak, HT29 sadece bir yuvarlak-up hücre şekli (üst panel) sergilenmesi sağlam hücrelerle mitotik tutuklama gösterdi.
Diazonamide ile tedavi Şekil 3' te gösterilen sonra HT29 ve HT29-DR3 hücreleri hücre canlılığı. 3 nM diazonamide ile tedavi 48 saat sonra % 80 hücre ölümü HT29-DR3 içinde bulundu over (kırmızı eğri) hücreleri. Ancak, ebeveyn HT29 hücre diazonamide mitotik tutuklama (mavi eğri) şeklinde sadece hafif bir tepki gösterdi. Böylece, DR3 overexpression bu hücrelerde diazonamide kaynaklı apoptotik yolu yeniden düzenlendi.
Vivo tümör xenograft deneyler için sonuçları bir önceki kağıt14' te gösterilmiştir. HT29 ve HT29-DR3 tümör implantasyonu başarı oranı % 100 olduğunu. Xenograft tümör benzer şekilde araç denetiminde ilerledi; Bununla birlikte, HT29-DR3 xenografts 20 mg/kg doz, paklitaksel ile tedavi ederken HT29 xenografts daha hızlı tümör regresyon görüntülenir. Bizim gözlem daha iyi yanıt bir HT29-DR3 tümörlerin paklitaksel bilgisayarınkine HT29 tümör vivo içinde daha fazla ektopik ifadesiyle DR3 tümör hücreleri antimitotics daha hassas işler doğruladı.
Resim 1 : Farklı klonlar DR3 ifade analizi. DR3 ifade düzeyleri Anti-bayrak (üst panel) ve beta-aktin antikorlar (alt paneli, bir iç kontrol olarak) ile western Blot tarafından analiz edildi. Ebeveyn HT29 hücreleri bir negatif kontrol kullanılmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : HT29 ve HT29-DR3 hücre diazonamide ile tedavi sonrası morfoloji analizi. HT29 (üst panel) ve HT29-DR3 (alt paneli) 48 h için 10 nM diazonamide ile tedavi. Ölçek çubukları 100 mikron =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Diazonamide HT29 ve HT29-DR3 hücrelere doz-yanıt eğrileri. Hücre canlılığı sonra tedavi 48 h seri diazonamide konsantrasyonları ile ölçüldü. Hata çubukları deneysel triplicates standart sapma (SD) =. DA diazonamide =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makale, HT29-DR3 istikrarlı hücre satırlarını oluşturmak için bir yöntem açıklanmaktadır. HT29-DR3 hücreleri bir moleküler mekanizmaları tarafından antimitotic aracıları tarafından indüklenen apoptosis DR3 katkıda çalışmak için sağlar. Bu yaklaşım çok yönlü ve tekrarlanabilir. Yordamın başarılı olmasını sağlamak için Protokolü'nün dört anahtar adımlar dikkate alınması gerekir. İlk olarak, bir yüksek üretmek için yeterli virüs titresi bu Plat-A hücreleri % 80 - % 90 izdiham ne zaman DNA transfection gerçekleştirmek için tavsiye edilir. İkinci olarak, viral süspansiyon artık daha 2 hafta, ışıktan kaplı için 4 ° C de saklanmalıdır. Üçüncü olarak, 150 mm yemeklerin enfekte hücre bölünmesi geçirirken, enfeksiyon verimliliği farklı hücrelerde değişir gibi iyi ayrılmış koloniler, almak için seri dilutions yapmak önerilir. Son olarak, bir koloni seçilmesinde olmamalıdır herhangi bir kirlenme ile çevre koloniler.
Bu iletişim kuralı de çoğu hücre hatları ile çalışır ancak potansiyel olarak tek kolonileri kurmaya uğraşmıyorlar hücreler için zor olabilir. Bu gibi durumlarda, (FACS), sıralama floresans aktif hücre ile kombine antibiyotik gibi diğer hücre-ayırma teknikleri gerek.
Kararlı transfection viral ve non-viral yöntemleri içerir. Bu protokol için biz kullanılan DR3 çoğalmasıyla gibi fiziksel yöntemler daha lipid-aracılı DNA-transfection gibi hücreleri23 ve kimyasal yöntemler için zehirlidir akıl yürütme, overexpressing hücreler üretmek için düşük bir retroviral enfeksiyonu verimlilik birçok türleri hücre ve potansiyel hedef kapalı etkileri24,25,26var.
Ektopik ifade gen fonksiyonları aydınlatmak için doğrudan ve verimli bir yoldur. Bu nedenle, bu iletişim kuralı diğer hedef molekülleri eğitim için kullanılabilir. Ayrıca, gene nakavt da fonksiyonel çalışmalar önemlidir ve protokol gen devirme sistemleri için adapte edilebilir mümkündür. Diğer gen çakma ve knock-out yaklaşımlar, CRISPR-Cas9 gibi burada sunulan iletişim kuralı uygulamak kolay ve ekonomik tüm laboratuarlar için karşılaştırılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar bildirmek için bir şey yok.
Acknowledgments
Bu eser hibe 53110000117 (GW için) ve Tsinghua Üniversitesi'nden (X.W. için) 043222019 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | C11965500BT | Supplemented with 10% FBS and 1% Penicilin/Streptomycin |
| Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7571 | |
| Paclitaxel | Selleck | S1150 | |
| pMXs-IRES-Blasicidin | Cell Biolabs | RTV-016 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| PBS | Invitrogen | C14190500BT | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Invitrogen | 25200056 | |
| 1,5-Dimethyl-1,5-diazaundecamethylene polymethobromide | Santa Cruz | sc-134220 | |
| Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| Anti-mouse secondary antibody | Jackson ImmumoResearch | 115-035-166 | |
| anti-Flag antibody | Sigma | F-3165 | |
| HT29 cell line | ATCC | HTB-38 | |
| plat-A cell line | Cell Biolabs | RV-102 | |
| PVDF Immobilon-P | Millipore | IPVH00010 | |
| Cloning Cylinder | Sigma | C1059 | |
| Cell Imaging Multi-Mode Reader | Biotek | BTCYT3MV | |
| CKX53 Inverted Microscope | Olympus | CKX53 | |
| 12-well cell culture plates | Nest | 712001 | |
| 60 mm cell culture plates | Nest | 705001 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Nest | 601052 | |
| 0.22 μm steril filter | Millipore | SLGP033RB | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5810000327 | |
| 96 Well White Polystyrene Microplate | Corning | 3903 | |
| Western ECL Substrate | BIO-RAD | 1705060 | |
| ImageQuant LAS 4000 | GE Healthcare | ImageQuant LAS 4000 | |
| Decoloring Shaker | HINOTECH | TS-2000A | |
| Blasticidin | InvivoGen | ant-bl-1 | |
| Automated cell counter | BIO-RAD | TC 20 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985070 |
References
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Recillas-Targa, F. Multiple strategies for gene transfer, expression, knockdown, and chromatin influence in mammalian cell lines and transgenic animals. Molecular Biotechnology. 34 (3), 337-354 (2006).
- Daley, G. Q.
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. Sustained correction of X-linked severe combined immunodeficiency by ex vivo gene therapy. The New England. Journal of Medicine. 346 (16), 1185-1193 (2002).
- Roesler, J., et al. Third-generation, self-inactivating gp91(phox) lentivector corrects the oxidase defect in NOD/SCID mouse-repopulating peripheral blood-mobilized CD34+ cells from patients with X-linked chronic granulomatous disease. Blood. 100 (13), 4381-4390 (2002).
- Russell, W. C. Update on adenovirus and its vectors. Journal of General Virology. 81 (Pt 11), 2573-2604 (2000).
- Wasala, N. B., Shin, J. H., Duan, D. The evolution of heart gene delivery vectors. The Journal of Gene Medicine. 13 (10), 557-565 (2011).
- Zhou, J., Giannakakou, P. Targeting microtubules for cancer chemotherapy. Current Medicinal Chemistry - Anti-Cancer Agents. 5 (1), 65-71 (2005).
- Rovini, A., Savry, A., Braguer, D., Carre, M. Microtubule-targeted agents: when mitochondria become essential to chemotherapy. Biochimica et Biophysica Acta. 1807 (6), 679-688 (2011).
- Bhalla, K. N. Microtubule-targeted anticancer agents and apoptosis. Oncogene. 22 (56), 9075-9086 (2003).
- Jordan, M. A., Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nature Reviews Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).
- Bhat, K. M., Setaluri, V. Microtubule-associated proteins as targets in cancer chemotherapy. Clinical Cancer Research. 13 (10), 2849-2854 (2007).
- Bates, D., Eastman, A. Microtubule destabilising agents: far more than just antimitotic anticancer drugs. British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (2), 255-268 (2017).
- Qi, C., et al. Anti-mitotic chemotherapeutics promote apoptosis through TL1A-activated death receptor 3 in cancer cells. Cell Research. 28 (5), 544-555 (2018).
- Marsters, S. A., et al. Apo-3, a new member of the tumor necrosis factor receptor family, contains a death domain and activates apoptosis and NF-kappa B. Current Biology. 6 (12), 1669-1676 (1996).
- Chinnaiyan, A. M., et al. Signal transduction by DR3, a death domain-containing receptor related to TNFR-1 and CD95. Science. 274 (5289), 990-992 (1996).
- Xu, L. X., et al. Death receptor 3 mediates TNFSF15- and TNFalpha-induced endothelial cell apoptosis. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 55, 109-118 (2014).
- Wen, L., Zhuang, L., Luo, X., Wei, P. TL1A-induced NF-kappaB activation and c-IAP2 production prevent DR3-mediated apoptosis in TF-1 cells. Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 39251-39258 (2003).
- Nakayama, M., et al. Multiple pathways of TWEAK-induced cell death. Journal of Immunology. 168 (2), 734-743 (2002).
- Kitamura, T., et al. Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics. Experimental Hematology. 31 (11), 1007-1014 (2003).
- Wang, G., Shang, L., Burgett, A. W., Harran, P. G., Wang, X. Diazonamide toxins reveal an unexpected function for ornithine delta-amino transferase in mitotic cell division. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (7), 2068-2073 (2007).
- Hassan, M. S., von Holzen, U. Animal Model: Xenograft Mouse Models in Esophageal Adenocarcinoma. Methods in Molecular Biology. , 151-164 (2018).
- Potter, H., Heller, R.
- Jacobsen, L., Calvin, S., Lobenhofer, E. Transcriptional effects of transfection: the potential for misinterpretation of gene expression data generated from transiently transfected cells. Biotechniques. 47 (1), 617-624 (2009).
- Hagen, L., Sharma, A., Aas, P. A., Slupphaug, G. Off-target responses in the HeLa proteome subsequent to transient plasmid-mediated transfection. Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (1), 84-90 (2015).
- Omidi, Y., et al. Microarray analysis of the toxicogenomics and the genotoxic potential of a cationic lipid-based gene delivery nanosystem in human alveolar epithelial a549 cells. Toxicology Mechanisms and Methods. 18 (4), 369-378 (2008).
