Summary
Estabelecer uma linha de celular estável superexpressão de um gene de interesse para estudar a função do gene pode ser feito por estável do transfection-colheita única clones, depois transfecting-los através de infecção retroviral. Aqui nós mostramos que linhas de célula HT29-DR3 geradas desta forma elucidar os mecanismos pelos qual morte receptor 3 (DR3) contribui para a apoptose induzida por antimitotics.
Abstract
Estudar a função de um gene de interesse pode ser conseguido manipulando o seu nível de expressão, tais como diminuindo sua expressão com linhagens celulares "knockdown" ou aumentando a sua expressão com linhas de células de superexpressão. Transfecção transiente e estável são dois métodos que são usados frequentemente para a expressão dos genes exógenos. Transfecção transiente é útil somente para expressão de curto prazo, Considerando que transfection estável permite que genes exógenos ser integrado no genoma da célula de acolhimento onde ele será continuamente expressa. Como resultado, transfection estável é geralmente empregado para pesquisa em regulamento genético a longo prazo. Aqui descrevemos um protocolo simples para gerar uma linha de celular estável superexpressão do receptor de morte marcou 3 (DR3) para explorar a função DR3. Nós escolhemos o único clones após uma infecção retroviral a fim de manter a homogeneidade e a pureza das linhas celulares estável. As linhas de célula estável geradas usando este protocolo processam DR3-deficiente HT29 células sensíveis às drogas antimitóticas, assim, reconstituir a resposta de apoptose em células HT29. Além disso, o tag da bandeira no DR3 compensa a indisponibilidade de bom anticorpo DR3 e facilita o estudo bioquímico do mecanismo molecular pelo qual agentes antimitóticos induzem apoptose.
Introduction
Expressão gênica heteróloga é frequentemente usado para estudar a função dos genes de interesse. Dois métodos, transfecção transiente e estável, são predominantemente utilizados em células e biologia molecular para inserir um segmento de DNA ou RNA em uma célula de acolhimento1,2. Transitoriamente transfectadas DNA ou RNA não pode ser passado às células, para que a alteração genética só pode ser retida por um curto período de tempo. Por outro lado, nas células transfectadas estàvel, genes exógenos são integrados no genoma da célula de acolhimento, sustentando a sua expressão na linhagem celular. Assim, transfection estável é um método que é geralmente reservado para a investigação em regulamento genética a longo prazo. A linha celular estável também pode ser transplantada como xenografts em modelos do rato in vivo estudo3. Transfection estável pode ser dividido em duas categorias: nonviral e virais. Comparado a nonviral transfecção, infecção viral pode transferir genes para uma ampla variedade de células humanas com uma maior eficiência4,5,6,7. Além disso, uma linha de celular estável de um único clone oferece a vantagem de homogeneidade e pureza clonal.
Divisão e crescimento descontrolado de células são as características de câncer. Em ambientes clínicos, agentes antimitóticos são os tratamentos primários para muitos tipos de tumores8. No entanto, algumas limitações significativas de agentes antimitóticos não podem ser ignoradas. Em primeiro lugar, esses agentes quimioterápicos também podem matar células normais juntamente com as células cancerosas indesejáveis e, assim, podem resultar em efeitos colaterais graves8. Segunda, antitubulin de drogas não são eficazes contra todos os tipos de tumores, apesar da expressão de onipresente da tubulina em uma grande variedade de tecidos diferentes, como uma proteína do citoesqueleto9,10. Não está claro por que agentes antitubulin mostraram promissor eficácia contra ovário, pulmão e cancros hematológicos no tratamento clínico, mas não no rim, cólon ou cânceres pancreáticos11. Finalmente, mesmo os pacientes com o mesmo tipo de tumor podem responder para os antimitotics diferente de forma imprevisível. Pode haver uma molécula efetora chave que afeta a sensibilidade dos pacientes diferentes agentes antimitóticos, resultando em diversos resultados vistos no tratamento clínico12. Assim, as potenciais sensibilidades diferenciais dos pacientes ao tratamento antimitóticos devem ser tomadas em consideração para otimizar intervenções terapêuticas13.
Uma tela de biblioteca do elevado-throughput do inteiro-genoma siRNA demonstrou que o knockdown DR3 poderia render sensíveis células resistentes a drogas antimitóticas, implicando um papel para DR3 na apoptose induzida por quimioterapia14. Como um membro da superfamília do receptor (TNFR) de fator de necrose tumoral, DR3 tem sido relatado para mediar a apoptose celular em diversos sistemas15,16,17,18. Assim, partimos para estabelecer linhas de célula estável superexpressão DR3 para estudar os mecanismos moleculares pelos quais Medicamentos antimitóticos induzem apoptose. Um modelo de célula apropriada para o estudo DR3 superexpressão pode ser fornecido pela linha de celular de câncer de cólon humano HT29, que foi encontrado para ser DR3-deficiente. Além disso, na clínica, cancros do cólon são insensíveis a medicamentos antimitóticos19.
Neste artigo, descrevemos um método que permite a geração de uma linhagem de células estáveis de HT29-DR3 através de infecção retroviral. Ainda mais, nós mostramos como validar a expressão DR3 nestas células usando a mancha ocidental e como avaliar a sensibilidade aos agentes antimitóticos usando um ensaio da viabilidade celular e observação morfológica. As células são amplificadas de clones único e, assim, têm a vantagem de um fundo genético homogênea. Além disso, o tag da bandeira no DR3 permitido para a visualização de DR3 celular por microscopia e análise da interação de expressão e da proteína do gene por abordagens bioquímicas. Além disso, as células podem ser xenografted em ratos para analisar mais a progressão do tumor em resposta a antimitotics no vivo14.
O sistema de célula de HT29-DR3 apresentado aqui ofereceu uma ferramenta eficaz para estudar os mecanismos moleculares de como antimitotics matar células de câncer14. Desde superexpressão e linhas celulares "knockdown" são ferramentas comuns para estudar a função do gene, este protocolo pode ser facilmente adaptado para outros genes de interesse ou outras linhas de células e, assim, transformou-se uma abordagem amplamente utilizada.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Por favor, note que todos os experimentos de rato aqui descritos foram aprovados e efectuados de acordo com o cuidado de Animal institucional e uso Comité (IACUC) na Universidade de Tsinghua.
1. geração de linhas de células de superexpressão DR3
- Construir o plasmídeo de expressão DR3 (pMXs-IRES-DR3-bandeira), inserindo cDNA de DR3 completo com 3 x bandeira no C-terminal em vetor retroviral pMXs-IRES-Blasticidin dos locais de restrição de BamHI/XhoI.
- Desenvolvem-se células Plat-A em pratos de 60 mm com 4 mL de meio da águia modificados de Dulbecco (DMEM). No dia seguinte, quando as células atingem 80% - 90% confluência, transfect as células com 2 μg de plasmídeo pMXs-IRES-DR3-bandeira usando o reagente de transfeccao (ver Tabela de materiais) de acordo com manual20 do fabricante.
- Depois de 72 h, recolher o sobrenadante, a mídia usando um filtro de estéril 0,45 μm do filtrado e manter a suspensão viral no escuro a 4 ° C.
- Desenvolvem-se células HT29 em DMEM em um prato de 60 mm e incubar a 37 ° C com 5% CO2células.
- No dia seguinte, quando as células atingem 30% - 50% de confluência, infectar as células com 2 mL de vírus em suspensão na presença de 8 μg de 1,5-dimetil-1,5-diazaundecamethylene polymethobromide por mililitro de suspensão viral. Após 4-6 h de incubação a 37 ° C, aspirar a suspensão viral, adicione 4 mL de DMEM fresco e devolver o prato para a incubadora.
- Descartar os meios de comunicação de postinfection de 24 h a pratos e lavar cuidadosamente as células com 2 mL de PBS escaldadas. Adicionar 1 mL de tripsina-EDTA para as células e incubar a 37 ° C por 3 min.
- Depois de observar ao microscópio com ampliação de 10x que a maioria das células têm destacado, pare a tripsinização com 2 mL de DMEM completo contendo 10% de soro fetal bovino (FBS). Recolher a suspensão de células em um tubo de 15 mL e centrifugar as células a 200 x g durante 5 min à temperatura ambiente (RT).
- Remover o sobrenadante e ressuspender as células em 10 mL de DMEM. Misture bem delicadamente pipetagem para cima e para baixo. Dilua as células de fatores de 30, 100 e 300. As células em pratos de 150 mm com 20 mL de DMEM contendo 1 µ g/mL blasticidin de sementes. Incube a uma incubadora de 37 ° C com 5% de CO2 por ~ 1-2 semanas.
- Durante este período, as colônias observe todos os dias com um microscópio invertido na ampliação de 10x. Marca as colônias bem isoladas no fundo do prato quando o diâmetro da colônia é cerca de 1-2 mm.
- Aspire o meio e lavar as células com 3 mL de PBS pré-aquecido. Adicione 2 ml de EDTA-tripsina em um prato de 60 mm. Use pinça estéril para pegar autoclavados cilindros clonagem estéril e colocá-los no prato 60 mm. Pegue os cilindros contendo tripsina-EDTA e delicadamente, coloque-os sobre as colônias marcadas. Certifique-se de cada cilindro clonagem só contém uma colônia e evitar a contaminação com colônias vizinhas.
- Devolver o prato para a incubadora durante 3 minutos.
- Depois de 3 min, verificar as células sob o microscópio com ampliação de 10x para ver se eles têm destacado. Quando as células têm levantado, adicione 70 μL de meio de cultura para cada cilindro para inactivar a tripsina. Misture suavemente a suspensão de células com uma pipeta de 200 μL. Certifique-se de não se mover o cilindro durante este processo.
- Transferi a suspensão de células de cada colônia para duas placas de 24 poços contendo 1 mL de DMEM por alvéolo. Adicionar 30 μL da suspensão de células por poço na placa A e 70 μL no correspondente poços na placa B. Label as placas corretamente e colocá-los de volta na incubadora.
2. verificação da linha DR3 Overexpression celular
- Quando as células na placa B estão na confluência de 90%, remova a mídia e lavar cuidadosamente as células com 1 mL de PBS. Completamente remover PBS e lyse as pilhas com 50 μL de tampão de carregamento SDS-PAGE 1x. Transferir os lisados celulares da placa de 24 para tubos de centrífuga de 1,5 mL e ferva as amostras durante 10 minutos a 100 ° C.
- Execute as amostras no gel de sulfato de sódio (SDS) de dodecil de sódio 10% em uma tensão constante de 80 V por 15 min e, em seguida, em 120 V por 1h.
- A proteína de transferência para uma membrana (PVDF) de fluoreto de polivinilideno por transferência molhada em uma corrente constante de 400 mA por 2 h.
- Teste a expressão DR3 em diferentes clones com anticorpo anti-FLAG, usando as selvagem-tipo pilhas HT29 como um controle negativo (Figura 1). Diluir o anticorpo primário por um fator de 5.000 em 5% leite desnatado que é dissolvido em TBST (Tris salino contendo 0,1% Tween-20). Incube a membrana com anticorpos de bandeira a 4 ° C durante a noite.
- Lave a membrana com TBST sacudindo um agitador decoloring a 200 rpm no RT. Refresh a cada 5 min para um total de tempo de 15 min de lavagem TBST.
- Incube a membrana com anti-rato anticorpo secundário diluído por um fator de 10.000 em 5% de leite desnatado a 4 ° C, durante 5-6 h.
- Lave a membrana novamente como descrito na etapa 2.5.
- Detectar a expressão bandeira usando substrato de quimioluminescência reforçada ocidental (ECL) e a membrana com um sistema de documentação do gel de imagem (consulte a Tabela de materiais). Identifica os clones expressando DR3 como os clones positivos.
- Transferi os clones na placa A que correspondem aos clones positivos na placa B para uma placa de 6 e continuam a amplificar as células até cultivá-las em pratos de 10 cm. Faça estoques congelados das células de crescimento de clones positivos e armazená-los a-80 ° C para uso futuro.
3. avaliação da resposta a agentes antimitóticos Apoptotic de células
Nota: Diazonamide é uma nova classe de produto natural marinho que tem notável atividade em inibir o crescimento de células de câncer, que espelha a outros agentes de tubulina-desestabilizando21. No entanto, seu modo de ação ainda não está claro. Para testar a resposta celular das células aos agentes antimitóticos, paclitaxel e diazonamide foram usados para tratar o selvagem-tipo HT29 pilhas e pilhas HT29-DR3. As drogas foram dissolvidas em dimetilsulfóxido (DMSO), existências de 10 mM e, depois, mais diluídas para diferentes concentrações: 30 nM, 100 nM, 300 nM, 1.000 nM, 3.000 nM e 10.000 nM em DMSO.
- Recolha pilhas HT29 e HT29-DR3 por tripsinização. Medir a densidade de células usando um contador automático de células. Em seguida, as sementes das células em placas de 12-poços em DMEM com uma densidade de 3 x 104 células por poço. No dia seguinte, adicionar 10 nM diazonamide e usar 1% DMSO como controlo negativo. Após 48 h de tratamento, as células sob um microscópio com ampliação de 10x (Figura 2) da imagem.
- HT29 sementes e HT29-DR3 células em placas de 96 poços em DMEM com uma densidade de 3 x 103 células por poço e permitir-lhes a crescer durante a noite a 37 ° C. Em seguida, adicione cada dose maiores concentrações de diazonamide de 0,3 nM, 1 nM, 3 nM, 10 nM, 30 nM e 100 nM para cada poço, usando 1% DMSO como controlo negativo.
- Após 48 h de tratamento, medir a viabilidade celular usando um kit de ensaio de viabilidade celular baseado em luminescência de acordo com o manual do fabricante.
- Retire a placa de 96 poços da incubadora e deixá-lo ficar em RT por aproximadamente 30 min. Em seguida, adicione 50 µ l de reagentes de ensaio para cada poço, agitar a placa no RT por 2 min para lisar as células e incube a placa na RT para outro 10 min. Determine a luminescência de cada poço usando um leitor de microplacas (Figura 3).
Nota: A viabilidade celular representa a intensidade de luminescência relativa de cada um para o controle bem tratada com 1% de DMSO.
- Retire a placa de 96 poços da incubadora e deixá-lo ficar em RT por aproximadamente 30 min. Em seguida, adicione 50 µ l de reagentes de ensaio para cada poço, agitar a placa no RT por 2 min para lisar as células e incube a placa na RT para outro 10 min. Determine a luminescência de cada poço usando um leitor de microplacas (Figura 3).
- Use camundongos BALB/c seis semanas de idade fêmeas nuas para na vivo estudo14.
Nota: Os ratos foram mantidos sob condições específicas isentos de organismos patogénicos.- Trypsinize HT29 e HT29-DR3 célula e, em seguida, pare a tripsinização usando DMEM pré-aquecido a 37 ° C. Recolher a suspensão de células em um tubo de 50 mL e centrifugar as células a 1.000 rpm durante 10 minutos a RT. descartar o sobrenadante e ressuspender as células em meio DMEM sem FBS. Centrifugar as células novamente e ressuspender as células em PBS.
- Contar as células usando um contador automático de células e diluir as células a uma concentração de 2,5 x 107 células/mL usando PBS. Gere tumores através de uma injeção subcutânea de 200 µ l de suspensão de célula HT29 ou HT29-DR3 no flanco direito de cada rato (5 x 106 células/mouse)22.
- Medir o volume do tumor (TV) usando compassos cada 2 d após o transplante. Calcular a TV usando a seguinte fórmula: TV = 1 / 2L x W x W (aqui, w: largura de tumor, l: comprimento do tumor). Quando o volume do tumor médio atinge cerca de 100 mm3, randomizar os ratos para o controle ou grupo tratado (n = 6 por grupo) e iniciar o tratamento.
- Prepare a solução de paclitaxel como segue. Primeiro, dissolver o paclitaxel completamente em etanol a 5% do volume total e, em seguida, adicione o óleo de mamona 5% do volume final de polioxilo 35 hidrogenados. Finalmente, compõem os restantes 90% do volume com D5W (5% dextrose em água, pH 7,4).
- Injetar o paclitaxel por via intravenosa na dose de 20 mg/kg 3 x por semana, durante duas semanas. Medir o tumor volume e corpo peso 3 x uma semana14. Encerrar o experimento e eutanásia dos animais, se o peso do corpo diminui em 20% ou o volume do tumor atinge cerca de 2.000 mm3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Uma caracterização das pilhas HT29 estàvel expressando DR3 é mostrada na Figura 1. Os clones expressam níveis variados de DR3, enquanto as células do tipo selvagem, que serve como um controle negativo, não mostram a expressão dos genes exógenos. Aqui mostramos apenas cinco clones, entre os quais clonar 1 e 5 expressam o alto nível de DR3. Nós escolhemos o clone 1 e 5 para os experimentos seguintes.
A morfologia das células HT29 e HT29-DR3 após a administração de diazonamide foi observada por um microscópio invertido na ampliação de 10x na Figura 2. Após um tratamento de 48 h com 10 nM diazonamide, HT29-DR3 mostrou apoptose óbvia, com um partido da membrana celular e detritos celulares (painel inferior). No entanto, HT29 mostrou somente detenção mitótica com células intactas, exibindo uma forma de reunir celular (painel superior).
A viabilidade celular de células HT29 e HT29-DR3 após tratamento com diazonamide é mostrado na Figura 3. Após 48 h de tratamento com diazonamide de nM 3, sobre a morte celular de 80% foi encontrada em HT29-DR3 células (curva vermelha). No entanto, as células HT29 parentais demonstraram apenas uma ligeira resposta para diazonamide sob a forma de detenção mitótica (curva azul). Assim, a superexpressão de DR3 reconstituído o pathway apoptotic induzida por diazonamide nestas células.
Foram mostrados os resultados para os experimentos de transplante de tumor na vivo em um anterior de papel14. A taxa de sucesso de implantação de tumor para HT29 e HT29-DR3 é 100%. Os tumores de enxerto heterólogo progrediram da mesma forma o controle do veículo; no entanto, os HT29-DR3 xenografts exibido regressão de tumor mais rápido do que os xenografts HT29 quando tratados com paclitaxel na dose de 20 mg/kg. Nossa observação de uma resposta melhor de tumores HT29-DR3 ao paclitaxel do que a de HT29 tumores na vivo mais confirmou que uma expressão ectópica de DR3 processa células tumorais mais sensíveis à antimitotics.
Figura 1 : Análise da expressão de DR3 em diferentes clones de. Níveis de expressão de DR3 foram analisados pela mancha ocidental com anti-FLAG (painel superior) e anticorpos anti-beta-actina (parte inferior do painel, como um controle interno). Parental HT29 células foram utilizadas como controle negativo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Análise da morfologia das células HT29 e HT29-DR3 após o tratamento com diazonamide. HT29 (painel superior) e HT29-DR3 (painel inferior) foram tratados com 10 nM diazonamide por 48 h. As barras de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Curvas dose-resposta de células HT29 e HT29-DR3 para diazonamide. Viabilidade celular foi mensurada após 48 h de tratamento com concentrações seriais de diazonamide. As barras de erro = o desvio padrão (SD) de experimental triplica. DA = diazonamide. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Este manuscrito, descrevemos um método para gerar linhas de célula estável HT29-DR3. HT29-DR3 células fornecem um modelo para estudar os mecanismos moleculares pelos quais DR3 contribui para a apoptose induzida por agentes antimitóticos. Esta abordagem é versátil e repetíveis. Para garantir o sucesso do procedimento, quatro etapas-chave do protocolo precisam ser considerados. Em primeiro lugar, a fim de produzir uma alta suficiente concentração de vírus, recomenda-se realizar a transfeccao de DNA quando as células Plat-A estão na confluência de 80-90%. Em segundo lugar, a suspensão viral deve ser armazenada a 4 ° C para não mais de 2 semanas, coberto de luz. Em terceiro lugar, quando dividindo as células infectadas em pratos de 150 mm, recomenda-se fazer diluições em série para obter colônias bem separadas, como a eficiência de infecção varia em diferentes células. Finalmente, quando pegar uma única colônia, não deve haver qualquer contaminação com as colônias vizinhas.
Este protocolo funciona bem com a maioria das linhas de celular, mas potencialmente pode ser difícil para as células que não tendem a formar colônias única. Em tais casos, serão necessárias outras técnicas de ordenação de células, tais como antibióticos combinados com fluorescência-ativado da pilha (FACS), de classificação.
Transfection estável inclui métodos virais e não virais. Neste protocolo, usamos uma infecção retroviral para gerar células superexpressão DR3, raciocínio que métodos físicos, tais como electroporation, são mais tóxicos para células23 e químico métodos, tais como DNA-transfecção mediada por lipídios, têm uma baixa eficiência em muitos tipos de células e tem potenciais efeitos fora do alvo24,25,26.
Expressão ectópica é uma maneira direta e eficiente para elucidar as funções do gene. Portanto, este protocolo pode ser usado para estudar outras moléculas alvo. Além disso, knockdown do gene também é importante em estudos funcionais, e é possível que o protocolo pode ser adaptado para sistemas "knockdown" gene. Comparado a outras gene knock-no e nocaute abordagens, tais como CRISPR-Cas9, o protocolo aqui apresentado é fácil de aplicar e acessível para todos os laboratórios.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a declarar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por subsídios 53110000117 (a G.W.) e 043222019 (para X.W.) da Universidade de Tsinghua.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | C11965500BT | Supplemented with 10% FBS and 1% Penicilin/Streptomycin |
| Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7571 | |
| Paclitaxel | Selleck | S1150 | |
| pMXs-IRES-Blasicidin | Cell Biolabs | RTV-016 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| PBS | Invitrogen | C14190500BT | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Invitrogen | 25200056 | |
| 1,5-Dimethyl-1,5-diazaundecamethylene polymethobromide | Santa Cruz | sc-134220 | |
| Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| Anti-mouse secondary antibody | Jackson ImmumoResearch | 115-035-166 | |
| anti-Flag antibody | Sigma | F-3165 | |
| HT29 cell line | ATCC | HTB-38 | |
| plat-A cell line | Cell Biolabs | RV-102 | |
| PVDF Immobilon-P | Millipore | IPVH00010 | |
| Cloning Cylinder | Sigma | C1059 | |
| Cell Imaging Multi-Mode Reader | Biotek | BTCYT3MV | |
| CKX53 Inverted Microscope | Olympus | CKX53 | |
| 12-well cell culture plates | Nest | 712001 | |
| 60 mm cell culture plates | Nest | 705001 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Nest | 601052 | |
| 0.22 μm steril filter | Millipore | SLGP033RB | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5810000327 | |
| 96 Well White Polystyrene Microplate | Corning | 3903 | |
| Western ECL Substrate | BIO-RAD | 1705060 | |
| ImageQuant LAS 4000 | GE Healthcare | ImageQuant LAS 4000 | |
| Decoloring Shaker | HINOTECH | TS-2000A | |
| Blasticidin | InvivoGen | ant-bl-1 | |
| Automated cell counter | BIO-RAD | TC 20 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985070 |
References
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Recillas-Targa, F. Multiple strategies for gene transfer, expression, knockdown, and chromatin influence in mammalian cell lines and transgenic animals. Molecular Biotechnology. 34 (3), 337-354 (2006).
- Daley, G. Q.
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. Sustained correction of X-linked severe combined immunodeficiency by ex vivo gene therapy. The New England. Journal of Medicine. 346 (16), 1185-1193 (2002).
- Roesler, J., et al. Third-generation, self-inactivating gp91(phox) lentivector corrects the oxidase defect in NOD/SCID mouse-repopulating peripheral blood-mobilized CD34+ cells from patients with X-linked chronic granulomatous disease. Blood. 100 (13), 4381-4390 (2002).
- Russell, W. C. Update on adenovirus and its vectors. Journal of General Virology. 81 (Pt 11), 2573-2604 (2000).
- Wasala, N. B., Shin, J. H., Duan, D. The evolution of heart gene delivery vectors. The Journal of Gene Medicine. 13 (10), 557-565 (2011).
- Zhou, J., Giannakakou, P. Targeting microtubules for cancer chemotherapy. Current Medicinal Chemistry - Anti-Cancer Agents. 5 (1), 65-71 (2005).
- Rovini, A., Savry, A., Braguer, D., Carre, M. Microtubule-targeted agents: when mitochondria become essential to chemotherapy. Biochimica et Biophysica Acta. 1807 (6), 679-688 (2011).
- Bhalla, K. N. Microtubule-targeted anticancer agents and apoptosis. Oncogene. 22 (56), 9075-9086 (2003).
- Jordan, M. A., Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nature Reviews Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).
- Bhat, K. M., Setaluri, V. Microtubule-associated proteins as targets in cancer chemotherapy. Clinical Cancer Research. 13 (10), 2849-2854 (2007).
- Bates, D., Eastman, A. Microtubule destabilising agents: far more than just antimitotic anticancer drugs. British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (2), 255-268 (2017).
- Qi, C., et al. Anti-mitotic chemotherapeutics promote apoptosis through TL1A-activated death receptor 3 in cancer cells. Cell Research. 28 (5), 544-555 (2018).
- Marsters, S. A., et al. Apo-3, a new member of the tumor necrosis factor receptor family, contains a death domain and activates apoptosis and NF-kappa B. Current Biology. 6 (12), 1669-1676 (1996).
- Chinnaiyan, A. M., et al. Signal transduction by DR3, a death domain-containing receptor related to TNFR-1 and CD95. Science. 274 (5289), 990-992 (1996).
- Xu, L. X., et al. Death receptor 3 mediates TNFSF15- and TNFalpha-induced endothelial cell apoptosis. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 55, 109-118 (2014).
- Wen, L., Zhuang, L., Luo, X., Wei, P. TL1A-induced NF-kappaB activation and c-IAP2 production prevent DR3-mediated apoptosis in TF-1 cells. Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 39251-39258 (2003).
- Nakayama, M., et al. Multiple pathways of TWEAK-induced cell death. Journal of Immunology. 168 (2), 734-743 (2002).
- Kitamura, T., et al. Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics. Experimental Hematology. 31 (11), 1007-1014 (2003).
- Wang, G., Shang, L., Burgett, A. W., Harran, P. G., Wang, X. Diazonamide toxins reveal an unexpected function for ornithine delta-amino transferase in mitotic cell division. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (7), 2068-2073 (2007).
- Hassan, M. S., von Holzen, U. Animal Model: Xenograft Mouse Models in Esophageal Adenocarcinoma. Methods in Molecular Biology. , 151-164 (2018).
- Potter, H., Heller, R.
- Jacobsen, L., Calvin, S., Lobenhofer, E. Transcriptional effects of transfection: the potential for misinterpretation of gene expression data generated from transiently transfected cells. Biotechniques. 47 (1), 617-624 (2009).
- Hagen, L., Sharma, A., Aas, P. A., Slupphaug, G. Off-target responses in the HeLa proteome subsequent to transient plasmid-mediated transfection. Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (1), 84-90 (2015).
- Omidi, Y., et al. Microarray analysis of the toxicogenomics and the genotoxic potential of a cationic lipid-based gene delivery nanosystem in human alveolar epithelial a549 cells. Toxicology Mechanisms and Methods. 18 (4), 369-378 (2008).
