Summary
פרוטוקול זה מתאר את הייצור של polycaprolactone (PCL) נימה עם microspheres חומצה (PLA) polylactic מוטבע אשר מכילים decellularized מטריצות (DM) עבור הדפסת תלת-ממד של רקמות מבניות הנדסת מבנים.
Abstract
Bioprinting תלת-ממד שואפת ליצור מותאם אישית פיגומים פעילים ביולוגית, להתאים את הגודל הרצוי ואת הגיאומטריה. שדרה גומי סינתטי אשר בהתקשותו יכול לספק יציבות מכנית דומה רקמה מקורית סוכנים וחיסונים מציעים רמזים ההלחנה כדי ובתאים, המוביל שלהם ההעברה, התפשטות של בידול כדי לשקם את רקמות המקורי / האיברים1,2. למרבה הצער, רבים תואמת הדפסת תלת-ממד, bioresorbable פולימרים (כגון חומצה polylactic, פלה) הם מודפסים בטמפרטורה של 210 ° C ומעלה - טמפרטורות אשר פוגמים תכשירים. מצד שני, הוא polycaprolactone (PCL), סוג אחר של פוליאסטר, bioresorbable, חומר להדפסה תלת-ממד בעל עדינה ההדפסה לטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס. לכן, זה היה שיערו הזה decellularized מטריצה חוץ-תאית (DM) הנכלל מחסום PLA הגנה תרמית יכול להדפיס תוך PCL פילמנט ולהישאר קונפורמציה פונקציונלי שלה. בעבודה זאת, תיקון osteochondral היה היישום שעבורו נבחנה ההשערה. ככזה, סחוס חזירי היה decellularized, במארז polylactic חומצה microspheres (PLA) אשר היו אז extruded עם polycaprolactone (PCL) לתוך פילמנט לייצר מבנים תלת-ממד באמצעות התמזגו התצהיר דוגמנות. המבנה עם או בלי microspheres את (PLA-DM/PCL ו- PCL(-), בהתאמה) הוערכו ההבדלים תכונות פני השטח.
Introduction
טכניקות הנדסה הנוכחי של רקמות ליישומים קליניים כגון שחזור עצמות, סחוס, גיד, רצועה השתמש אוטומטית - allografts לתיקון רקמות שנפגעו. כל אחת מהטכניקות הללו מתבצע באופן שגרתי כמו "תקן הזהב" הקלינית על ידי קודם קצירת רקמה או מן המטופל או התאמה cadaveric, ולאחר מכן מציבים הרקמה לתוך האתר פגם2. עם זאת, אסטרטגיות אלו מוגבלים על ידי תורם אתר תחלואה, התורם מחסור לאתר פגמים גדולים, הסיכון לזיהום, ולא מצליח למצוא שתלי התואמים את הגיאומטריה הרצוי. בנוסף, מחקרים הראו כי allografts המשמש עבור שחזור לצמצם תכונות מכניות וחיסונים בהשוואה רקמות יליד3. עם שיקולים אלה בחשבון, מהנדסי רקמה לאחרונה פנו שלושה bioprinting תלת-ממדי (3D) כדי לייצר גיאומטריות מותאם אישית, מורכבים פעילים ביולוגית, נועד להכיל פגם בגודל וצורה תוך מתן מספיק תכונות מכניות עד שיפוץ וחיסונים תושלם.
באופן אידיאלי, לפיגום מודפס 3D מקובעים על עמוד השדרה פולימריים, באפשרותך לשמור את היציבות הנדרשת מכני של רקמה מקורית תכשירים incorporated מציעים רמזים הביוכימי הסמוכים תאים, שמוביל את ההגירה שלהם, התפשטות, בידול, רקמת ייצור2,5. למרבה הצער, רוב המבנים אשר מכילים רכיבים ביולוגיים נעשים עם ג'לים או פולימרים חלשים מכדי לעמוד ויוו כוחות מנוסים על ידי הרקמות ממוקד עבור שחזור אוטומטי/להשתלת. פולימרים אחרים כגון חומצה polylactic (PLA) הם bioresorbable, 3D להדפסה, מבחינה מבנית נשמע, אבל מודפסות ב והטמפרטורה מעל 210 ° C - עושה את זה בלתי אפשרי עבור תכשירים להיות מודפס במשותף במהלך ייצור. Polycaprolactone (PCL) הוא עוד אישר ה-FDA, bioresorbable פולימר שניתן 3D מודפס בטמפרטורה נמוכה יותר (65 ° C), אשר הפך פופולרי יותר ויותר בבדיית החולה הספציפי שתלים עם מורכבות מורפולוגיות5,6 ,-7,-8,-9. עם זאת, רוב bioprinters באמצעות טכנולוגיית פנאומטיים שיקשה להדפסת PCL בטמפרטורות נמוכות שבו פעילויות ביולוגיות יכול להישאר ללא פגע. עד כה, השתלבותם של פולימרים אלה עם אוטומטי/allografts biomaterial להדפסה הרומן טרם להתבצע. בהיעדר חומר כזה, סביר בגישה האמיתית רקמות מהונדסים רקמות השיקום. לכן, יש ביקשו לשלב ה-PLA, PCL, ואנו decellularized להשתלת מטריצות (DM) כדי לנצל את היתרונות של כל חומר כדי לייצר מבנה קיימא מסוגלת שיחזור רקמות מורכבות. תהליך זה יספק חוזק מכני ראשוני צורך להתנגד ויוו כוחות, יציבות תרמית כדי להכיל כתוסף בייצור מבנה המשרה כלפי היווצרות של הרקמה הרצויה.
בניסיון האחרונות כתובת הקשיים הנ ל, הראינו כי זה ריאלי כדי לתמצת סחוס decellularized מטריצה חוץ-תאית בתוך מכשול PLA הגנה תרמית יכול להיות extruded בתוך PCL חוטים, שמירה על היכולת של מיט להשפיע על התאים שמסביב מארח2. זה נתן השראה אותנו לחפש את גישות קליניות יעיל עבור שיקום הרקמה. במחקר הנוכחי, אנו מנצלים את הטכנולוגיה פלטפורמה לבנות פיגומים all-in-one זה כוללים את ה-PLA, מיט PCL (PLA-DM/PCL).
המטרה שלנו היא כדי לשפר את היעילות ואת התועלת של allografts בטכניקה biofabrication הרומן המוצע כדי לסכם באופן מדויק יותר רקמה מקורית, בסופו של דבר להשתמש בהם ביישומים שונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. קבלת ו Preprocessing Microspheres
- תוצרת microspheres עם המטריצה הרצוי אנקפסולציה (PLA-מיט)2.
הערה: זה הכרחי כי microspheres הם בגודל אחיד. מסיבה זו, ניפוי המנזר microspheres לשימוש חיוני. למרות decellularization מטריקס וכימוס יש כבר מפורט פרסומים קודמים2, להלן סיכום קצר של התהליך.- ראשית, למסוק את הסחוס פקקים של הגפיים האחוריות חזירי. Decellularize הסחוס בסדרה של שוטף עם 0.05% טריפסין/0.5 מ מ tetrasodium ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA), המתואמת Dulbecco של הנשר בינוני (DMEM) ו- 1.5% חומצה peracetic ו- 2.0% טריטון X-100 במשך 4 שעות כל אחד עם מים מזוקקים שוטף לפני ואחרי כל שלב2.
- מסננים את המטריצה decellularized, תקפיא את התמונה, lyophilize, לטחון, להמיס בתוך תמיסת פפסין. בעקבות פירוק, מערבבים את הפתרון פפסין עם פלה אשר מומס דיכלורומתאן.
- להוסיף את התערובת dropwise 3% אלכוהול בתמיסה של מים. Centrifuge microspheres וכתוצאה מכך, שטיפה, ניקוז, lyophilize שוב.
הערה: לקבלת פרטים מלאים על התהליך ראה את פרוטוקול שפורסמו בעבר2.
- ניפוי microspheres.
- להבטיח כי כל הצלחות מסננת נוקו ביסודיות, יבשים לפני השימוש. אם נחוץ, נקי sieves באמצעות אולטראסאונד מנקה כדי להבטיח כי בכל התחומים יוסרו המסננת.
- להרכיב את המסננת בשייקר עם המגש מסננת מיקרומטר 106 בחלק העליון, המגש מיקרומטר 53 אחרי זה, וגם המסננת פאן בחלק התחתון.
- מקום יבש microspheres במגש העליון מסננת ומניחים את המכסה על המגש העליון. הפעל ניפוי גס במשך 8 עד 10 דקות חוזר בסדר למשך 8-10 דקות.
הערה: טיימס מסננת ייתכן שתצטרך להיות גדל או קטן בהתאם האצווה. - בזהירות להסיר את הלוחות מסננת אחד ולמקם אותם במהופך על נייר שוקלים גדולים. הקש על הצדדים בעדינות כדי להבטיח כי רוב הכדורים נפלו מתוך המסננת, על הנייר.
- למחוק את הכדורים מנופחים (> 106 מיקרומטר), מוחקים הספירות (< מיקרומטר 53). הוספת ספירות הן בטווח גודל 53 ל 106 מיקרומטר כדי שפופרת צנטרפוגה שכותרתו עם מספר אצווה וסוג ומניחים במקפיא-20 ° C עד להמשך השימוש.
2. הערכות בקרת איכות ננו-ספירה
הערה: ראה איור 1.
- ביצוע הערכת מאקרוסקופית-ויזואלית כדי לבדוק כי microspheres הם מדים כדורית, עם אין אגרגטים הנוכחי.
- להעריך את microspheres באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה (SEM).
- בשביל זה, המקום microspheres על גבי SEM צ'אק, להתיז בחוטי זהב-פלדיום באווירה ארגון באמצעות עם coater לרעוד. להוציא לעובי 4 nm.
- ציית תכונות פני השטח, מורפולוגיה, קטרים של microspheres באמצעות 10 kV האצת מתח ומרחק עבודה 10 מ מ כדי להבטיח את הייצור, ניפוי של microspheres היה מוצלח.
3. נימה יצירה עבור הדפסת תלת-ממד
- שיא, מדידת המסה של microspheres המתקבל שלבים 2 ו- 3; יש צורך לפחות 25 גרם.
- להוסיף אבקת polycaprolactone (PCL) microspheres עבור יחס משקל 1:4 של microspheres כדי PCL.
- לערבב את תערובת אבקה על מיניאטורי מתגלגל מערבל-סל ד 20 למשך 5 דקות ולאחר מכן להפוך את המיכל ומערבבים ב rpm 20 עבור 5 דקות נוספות (ראה איור 2).
- רבים extruders זמינים מסחרית (ראה את הטבלה של חומרים) יש מעילים בידוד כיוון טמפרטורות עבודה המיועד שלהם הם עבור התצהיר מאוחה מסורתי דוגמנות (FDM) חוטים. לשנות את מכבש (במקרה הצורך) על-ידי הסרת החומר בידודית, להשתמש בו בשילוב עם מאווררים שולחניים (אשר לנשוף אויר extruder ועל פילמנט מעוקם) לשימוש של המתקן בטמפרטורות נמוכות.
הערה: מאווררים שולחניים אשר לנשוף אויר כדי לקרר את מכבש ואת הלהט שימושיים עבור הליך זה. - תוכנית ההתקנה ההתקנה ציוד לשחול. ראו איור 3.
- תוכנית ההתקנה המתקן כך שקע שלה היא ~ 60 ס מ מן הים למנגנון ההדפסה ברקע, עם נתיב ישיר מהשפך ההבלטה לים ברקע.
הערה: מנגנון יכולים באופן אופציונלי לגדול 3-4 ס מ מהספסל אם יימצא כי הסיב הוא שמוט עד לנקודה של נגיעה benchtop. - למקם מאוורר שולחני ~ 15 ס מ הז'קט חימום וישיר אותו לעבר הז'קט חימום להציע קירור עם אויר לאורך כל פילמנט הייצור. מקום למאוורר הקירור השנייה בערך באמצע הדרך בין extruder ברקע, להפנות. את זה לכיוון extrudate כדי לסייע קירור הלהט עם אויר.
- להתאים את מיקום כנדרש לאורך כל התהליך.
- תוכנית ההתקנה המתקן כך שקע שלה היא ~ 60 ס מ מן הים למנגנון ההדפסה ברקע, עם נתיב ישיר מהשפך ההבלטה לים ברקע.
- הגדרת המתקן ששונה חימום רכיב 52 ° C, להפעיל את שולחן העבודה קירור האוהדים, ולאפשר המכשיר לבוא שיווי משקל במשך 20-30 דק. ודא כי הצינור המתאים מחובר אל המתקן.
- לפני ההתחלה, מלא הופר extruder עם התערובת ננו-ספירה/PCL מהשלב 3.3. להפעיל את מנגנון ההדפסה ברקע, אוז'ה extruder ליזום ההבלטה של נימה.
- כאשר חוט הלהט הראשוני הנמתח, באופן ידני למשוך את extrudate מהשפך ההבלטה עם מלקחיים ואאכיל אותו מנגנון נימה.
- חוט הלהט הרצוי ייקח קצת זמן לצאת מנגנון ההדפסה ברקע. באמצעות מאגרים נפרדים או קלטת, בבירור לסמן כאשר הרכב פילמנט חזותית מופיע אחיד.
- לפקח מקרוב על התהליך ולשנות פרמטרים לפי הצורך. התאם את מכבש חום ההבלטה אוז'ה מהירות, מהירות ההדפסה ברקע כדי להשיג 1.75 מ מ קוטר פילמנט כפי שהיא נמדדת מחוגה. להתאים את האוהדים לפי הצורך כדי לקרר את הסיב כראוי כדי למנוע חתכים פילמנט שאינו עגול. לערבב ולמלא את הופר לפי הצורך.
הערה: תשומת לב נדרש במהלך תהליך זה כדי להשיג פילמנט נאותה להדפסה תלת-ממד עוקבות. הפרמטרים לעיל ישתנה בהתאם לתנאי הסביבה, מילוי רמת אחידות של תערובת במכרז, תרמודינמיקה וזרימה דינמיקת קבוצות ספציפיות של PCL, microspheres. - המשך הבלטת ממד עד כל האבקה שימש הופר הוא כמעט ריק. להוסיף אבקת PCL (ללא microspheres) הופר לחשוף את התערובת ננו-ספירה שנמצא כעת בתוך המתקן. המשך להוסיף אבקת PCL כדי הופר עד לא microspheres יותר גלויים ב- extrudate.
- הקפד לתייג והוא נפרד הסיב אשר מכיל את microspheres בריכוז הרצוי, כמו לאחר הסיב הוא מקורר זה קשה יותר להבחין בין חוט הלהט אחיד לבין נימה לא אחידה.
- המשך הבלטת ממד עד שיש אבקת מינימלי עזב במכרז, ולאחר מכן כבה את מנגנון ההדפסה ברקע, אוז'ה extruder, גוף החימום extruder, ואת האוהדים.
4. הדפסה עם נימה
- עיצוב גיאומטריית הצורה הרצויה וליצור משתמש במחשב בעזרת תוכנת עיצוב. לאחר מכן לחתוך את הדגם, להכתיב את toolpath באמצעות תוכנה עם פרוסות התואמת מכונת הדפסה 3D בשימוש.
- לטעון את הסיב משלב 3 על גבי כל מדפסת FDM סטנדרטי, מצוידים עם חרירי סטנדרטי לקוטר הרצוי (בדרך כלל 0.4 מ מ). מתחילים את הקטנות (בדרך כלל 65-70 ° C ו-300 מ מ/דקה מהירות קווית) נימה אישית הוא הפקיד--שכבה על ע י המכונה.
- ודא להקדיש תשומת לב מיוחדת השכבה הראשונה ולהתאים הגדרות לפי הצורך כדי לקבל הדפסה באיכות טובה.
הערה: ניתן לבצע התאמות מהירות הדפסה, הדפסה טמפרטורה, פלטפורמה טמפרטורה, מכפיל ההבלטה של פרמטרים אחרים. עיין המדפסת ומדריך לפתרון בעיות עם פרוסות של היצרן לקבלת סיוע נוסף.
5. בקרת איכות הערכה
- למקם את המבנה מודפס ב- SEM חריטה, להתיז בחוטי זהב-פלדיום באווירה ארגון באמצעות עם coater לרעוד. להוציא לעובי 4 nm.
- להתבונן במיקרוסקופ באמצעות 10 kV האצת מתח ומרחק עבודה 10 מ מ לבדוק תכונות פני השטח עבור נוכחות או היעדרות של microspheres אם הוא ישים.
6. בדיקות פונקציונליות של המבנה מודפס
הערה: phosphatase אלקליין (ALP) יכול לשמש פונדקאית עבור מטריצה decellularized כדי לקבוע אם חלבונים שעברו אנקפסולציה הם פעילים ביולוגית לאחר תהליך הייצור נימה. ALP משמש כי זה מזרז תגובה מצע, p-nitrophenyl פוספט, כדי לשנות צבע צהוב תוצרי לוואי, p-nitrophenol, פוספט אורגניים, אבל רק אם ALP קונפורמציה פונקציונלי.
- להדפיס גיאומטריה (n = 3) יש לזה של מסה קצה לפחות 400 מ"ג עם חוט הלהט ננו-ספירה ALP (PLA-ALP/PCL) באמצעות פרמטרים ההדפסה זהה כמו פיגומים PLA-DM/PCL. גם להדפיס PCL-היחידה (PCL(-)) פיגומים של הגיאומטריה אותו כמו פיגומים PLA-ALP/PCL. להטביע אותם במאגר טריס-HCl 1 מ"ל, תקופת דגירה של 24 שעות ביממה-סיבוב 37 ° C ו 110 סל ד כדי לאפשר דיפוזיה אנזים.
- להוסיף 1 מ"ל של 1 מ"ג/מ"ל p-nitrophenyl פוספט, ניתרן hexahydrate, טריס-HCl. Incubate ב 37 מעלות צלזיוס, 110 סל ד עבור מתכוון 10 נוספים לקרוא את ספיגת supernatant-415 ננומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לאחר ניפוי, microspheres צריך להופיע במדים, להשתחרר מן אגרגטים. תחת SEM, microspheres sieved ייתכן נקבוביות קטנות על פני השטח, אבל אחרת יהיה כדורית וחלק, כפי שמוצג באיור1. חוטים הבלטת כל צריך להיות של קוטר אחיד, חתך מעגלי. פילמנט המכיל microspheres (PLA-DM/PCL) יהיו מעט יותר מט תוך PCL בלבד (PCL(-)) פילמנט ייראה מבריק יותר. חוט הלהט PLA-DM/PCL גם ארגיש גסה למגע בהרבה הסיב PCL(-). פיגומים יודפס בגיאומטריה הרצויה אשר הוכתב על ידי תוכנת בשלב 4.1. איכות לגרדום והצורה צריך להיות הדיר מדים. של הדפס אחד למשנהו. לאחר ההדפסה, פיגומים עם ובלי microspheres יהיה קשה להבחין בעין בלתי מזוינת, אך תחת SEM, microspheres צריך להיות גלוי על פני השטח ברחבי המבנה. תחת SEM, הלהט PCL(-) יופיעו חלק, עם כמה לקווקוו כלכלוך של תהליך ההבלטה (איור 4B). Microspheres אמורה להיות מוצגת הן בולטות דרך, מתחת לפני השטח של פיגומים PLA-DM/PCL (ראה איור 4C). בעת שימוש ALP פונדקאית עבור DM, לשמור על הפונקציונליות של האנזים בתוך לגרדום עם ספיגת גבוה משמעותית (t-לבדוק, p < 0.05)-415 nm מאלה של PCL(-) ריק פיגומים, 0.297 ± ± 0.023 ו 0.166 0.012, בהתאמה, איור 5.
איור 1 . נציג מאקרוסקופית (משמאל) ותמונות (מימין) SEM של microspheres לאחר ניפוי והכנה 2. שימו לב כי microspheres כדורית, בטווח גודל המתאים (53-106 מיקרומטר קוטר). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 . אישית שנעשו מיקסר מתגלגל. מיקסר מתגלגל בהזמנה אישית משמש המשלב את microspheres עם אבקת PCL. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 . פילמנט ייצור ההתקנה. השקע של המתקן שוכן כ 60 ס מ מן הים של מנגנון ההדפסה ברקע. מאווררים שולחניים ממוקמות ליד גוף החימום, בערך במחצית הדרך בין extruder ברקע. ברקע ניתן לחלופין מוגברות 3-4 ס מ מעל benchtop. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 . הערכות איכות. (א) PCL(-) (משמאל) PLA-DM/PCL פיגומים (מימין) הם קשה להבחין בעין בלתי מזוינת. (B) מתחת SEM, לגרדום PCL(-) מופיעה בעיקר חלקה, עם כמה לקווקוו כלכלוכים תהליך ההדפסה. (ג) תחת SEM, microspheres גלויים הדגימות PLA-DM/PCL. חלק microspheres מסומנים באמצעות החצים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 . תוצאות נציג assay ערכי צבע מוחלטים ALP. ספיגת של פיגומים המכילות ALP (PLA-ALP/PCL) גבוה משמעותית מזה של PCL בלבד (PCL(-)) פיגומים, המציין כי האנזים ALP מזורז מהתגובה השקופה p-nitrophenyl פוספט ל p-nitrophenol ואנאורגניים פוספט. זה מדגים היכולת להדפיס חלבונים פונקציונליים עם התהליך המתואר בכתב היד. * משמעותית שונה (p < 0.05) מקבוצות אחרות. קווי שגיאה מציינות סטיית תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שניהם decellularized מטריצות, פיגומים PCL מודפס 3D הוכחו באופן עצמאי כדי לאפשר הדבקה ותיקון התפשטות של תאים, אימות והשימוש osteochondral10,11,12. השימוש של מטריקס decellularized ב גישות הנדסת רקמות תיקון היה נושא של עניין הרבה הצלחה של האחרונים עברו2,3,14,15. בעבר שציינו את ההעברה מוגברת, אדהזיה, התפשטות ותחזוקה הכולל של רקמות הנוצרת כאשר לעומת טכניקות מסורתיות2,15,16,17 ,18. רבים יש לייחס את תוצאות רצויות אלו תהליך דינמי הדדיות שדרכו התאים מארח לקבל רמזים מתוך מטריצת decellularized להגיב באופן דינמי, לשכפל הותאם עבור תאים חדשים על ידי הנחת מטריצה חוץ-תאית יותר זה בדרך כלל דומה מהו כבר נוכח19,20,21,22. בזמן זה נחקרה עבור יישומים רבים, רבים מהתהליכים אינם קלים לשכפל ואין אפשרות מותאם לשימושים שונים, מסוגלים ליצור בהצלחה בונה מאוד ספציפי לחולה, אין אפשרות ליצור מורכבות מורפולוגיות, ואינו מסוגל לעמוד ויוו כוחות2,3,4,13,14,15,16.
הגישה החדשנית המוצע במסמך זה מונע חשיפה ממושכת והן ארעי לטמפרטורות גבוהות בדרך כלל הנדרשים על ידי הדפסת תלת-ממד בעת השימוש המסורתי מדפסות FDM מכני מבוססי ההבלטה עם רכב נושא חדש. יתר על כן, הרכב המוביל (PLA microspheres) מסייע בהגנה על שעברו אנקפסולציה וחיסונים לתקופה קצרה יחסית של זמן הוא חשוף לחום ומספק אפשרות טיפול ה-all-in-one עבור תחלופת מהירה במרפאה2. השיטות בזאת מדגימים כיצד ליצור פעילים ביולוגית חוטים עבור הדפסת תלת-ממד ופיגומים באמצעות הדפסת תלת-ממד שלב קריטי איפה ההבלטה של חוט הלהט, ההדפסה של חוטים אלה בטמפרטורות נמוכות (65 ° C). היכולת של החלבונים שעברו אנקפסולציה להישאר פונקציונלי הודגם באמצעות ALP בתור פונדקאית עבור מיט לאורך כל התהליך. ALP שימש גם האנזים צריך להיות קונפורמציה פונקציונלי מאוד ספציפי כדי לעודד את התגובה ערכי צבע מוחלטים העריכו את פרוטוקול23. אם הסיב הנמתח לא בתשומת לב זהירה קוטר, טמפרטורה, מהירות, פעילות וחיסונים ואת השירות עבור הדפסת תלת-ממד צריכים להיות מוקרבים
פרוטוקול זה, microspheres המכיל decelluarized מטריצות (PLA-מיט) היו co-extruded עם PCL להכין חוטים להדפסה תלת-ממד, פיגומים מודפס 3D עבור osteochondral לתקן (PLA-DM/PCL). כאמור בשלבים פרוטוקול, ניטור רציף של תהליך הייצור פילמנט חיוני לאיכות גבוהה של חוט הלהט. יש לבצע התאמות ההבלטה מהירות, מהירות ההדפסה ברקע של שחול בטמפרטורה על מנת לשמור על הקוטר פילמנט הרצוי (בדרך כלל 1.75 מ מ). הנוכחות של microspheres ב פיגומים אושר על-ידי הדמיה SEM ותחזוקה של אנזים פונקציונליות מומחש וזמינותו phosphatase אלקליין. שימו לב כי פרוטוקול זה מוגבל על ידי כמות גדולה של microspheres הדרושים עבור ייצור, ברזולוציה נמוכה יותר יחסית של התצהיר מאוחה מידול כדי באופנים הדפסת תלת-ממד. בכל זאת, פעילות מוגברת וחיסונים היא לקידום המשמעותי. אמנם לא המוקד של פרוטוקול זה, מחקרים מאוחרים יותר יתרכז השפעת microspheres על חוזק מכני, נדידת תאים של בידול, אפיוני נוספת של פיגומים. בסך הכל, בטכניקה המתוארת במסמך זה מאפשר מטריקס decellularized וחלבונים אחרים שיודפס בטמפרטורה נמוכה יותר מהמותר בעבר, מחסומי הגנה תרמית על מנת לשמור על חוזק מכני2, ותפקוד 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
הפרויקט מומן באופן חלקי על ידי מענק מ רפואת ילדים אורטופדיים החברה של צפון אמריקה (POSNA) ולהעניק מכוני הבריאות הלאומיים NIBIB R21EB025378-01 (מענק מחקר בביו-הנדסה גישוש).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sieve machine | Haver & Boecker Tyler | Ro-Tap RX 29-E Pure | |
| Sieve 90 um | Fisherbrand | 170328156 | No. 170 |
| Sieve 53 um | Fisherbrand | 162513588 | No. 270 |
| Sieve 106 um | Fisherbrand | 162018121 | No. 140 |
| Sputter coater | Leica | n/a | |
| Scanning Electron Microscope | Hitachi, USA | n/a | |
| Filabot EX2 | Filabot.com | FB00061 | |
| Filabot Spooler | Filabot.com | FB00073 | |
| CAPA 6506 | Perstorp | 24980-41-4 | |
| Phosphate buffered saline, PBS | Gibco | 10010023 | |
| 6" Fan | Comfort Zone, Amazon | n/a | |
| Ultrasonic Water Bath | Cole Parmer | SK-08895-13 | |
| Dreamer | FlashForge | n/a | |
| Drum Mixer | Custom made | n/a | Similar piece of equipment: https://www.coleparmer.com/i/argos-technologies-flexiroll-digital-tube-roller-shaker-120-vac/0439744?PubID=UX&persist=true&ip= no&gclid=CjwKCAjw- dXaBRAEEiwAbwCi5khGDMz0 dTjsraEsBGfhMEH7ytx LQWGUPNgUJYQ1p3vj_yxkYoI_ ixoC9GwQAvD_BwE |
| Micro Balance | Mettler Toledo, Fisher Scientific | 01-913-851 | |
| Simplify3D | Simplify3D | n/a | |
| SolidWorks | SolidWorks | n/a | |
| Microspheres | Produced in-house, see concurrently submitted JoVE submission | ||
| p-nitrophenyl phosphate, disodium salt, hexahydrate | Millipore | 4876-5GM | |
| Phosphatase, alkaline | Roche Diagnostics GmbH | 10 713 023 001 | |
| Absorbance Reader | Tecan | Sunrise | |
| Tris-HCl Buffer | Sigma-Aldrich | T6455-100ML | |
| Heated shaker | New Brunswick Scientific | Excella E24 |
References
- Hutchmaker, D., Teoh, S., Zein, I., Ng, K. W., Schantz, J. -T., Leahy, J. C. Design and Fabrication of a 3D Scaffold for Tissue Engineering Bone. Synthetic Bioabsorbable Polymers and Implants. 15 (2), 845-847 (1988).
- Ghosh, P., Gruber, S. M. S., Lin, C. -Y., Whitlock, P. Microspheres containing decellularized cartilage induce chondrogenesis and remain functional after incorporation within a poly(caprolactone) filament useful for fabricating a 3D scaffold. Biofabrication. , (2018).
- Partington, L., et al. Biochemical changes caused by decellularization may compromise mechanical integrity of tracheal scaffolds. Acta Biomaterialia. 9 (2), 5251-5261 (2013).
- Hutmacher, D. W. Scaffolds in tissue engineering bone and cartilage. Biomaterials. 21 (24), 2529-2543 (2000).
- Kang, H., Hollister, S. J., La Marca, F., Park, P., Lin, C. -Y. Porous biodegradable lumbar interbody fusion cage design and fabrication using integrated global-local topology optimization with laser sintering. Journal of biomechanical engineering. 135 (10), 101013-101018 (2013).
- Kang, H., Lin, C. Y., Hollister, S. J. Topology optimization of three dimensional tissue engineering scaffold architectures for prescribed bulk modulus and diffusivity. Structural and Multidisciplinary Optimization. 42 (4), 633-644 (2010).
- Lin, C. -Y., et al. Functional bone engineering using ex vivo. gene therapy and topology-optimized, biodegradable polymer composite scaffolds. Tissue Engineering. 11 (9-10), 1589-1598 (2005).
- Lin, C. -Y., Hsiao, C. -C., Chen, P. -Q., Hollister, S. J. Interbody Fusion Cage Design Using Integrated Global Layout and Local Microstructure Topology Optimization. Spine. 29 (16), 1747-1754 (2004).
- Zopf, D., Hollister, S., Nelson, M., Ohye, R., Green, G. Bioresorbable Airway Splint Created with a Three-Dimensional Printer. New England Journal of Medicine. 368 (21), 2043-2045 (2013).
- Pati, F., Song, T. H., Rijal, G., Jang, J., Kim, S. W., Cho, D. W. Ornamenting 3D printed scaffolds with cell-laid extracellular matrix for bone tissue regeneration. Biomaterials. 37, 230-241 (2015).
- Zhang, W., et al. The effect of interface microstructure on interfacial shear strength for osteochondral scaffolds based on biomimetic design and 3D printing. Materials Science and Engineering C. 46, 10-15 (2015).
- Williams, J. M., et al. tissue engineering using polycaprolactone scaffolds fabricated via. selective laser sintering. Biomaterials. 26 (23), 4817-4827 (2005).
- Monibi, F. A., Cook, J. L. Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioscaffolds: Emerging Applications in Cartilage and Meniscus Repair. Tissue Engineering Part B: Reviews. , (2017).
- Wiles, K., Fishman, J., Coppi, P., Birchall, M. The Host Immune Response to Tissue-Engineered Organs: Current Problems and Future Directions. Tissue Engineering Part B: Reviews. 22 (3), (2016).
- Sutherland, A. J., Detamore, M. S. Bioactive Microsphere-Based Scaffolds Containing Decellularized Cartilage. Macromolecular Bioscience. , (2015).
- Whitlock, P. W., Smith, T. L., Poehling, G. G., Shilt, J. S., Van Dyke, M. A naturally derived, cytocompatible, and architecturally optimized scaffold for tendon and ligament regeneration. Biomaterials. , (2007).
- Whitlock, P. W., et al. Effect of cyclic strain on tensile properties of a naturally derived, decellularized tendon scaffold seeded with allogeneic tenocytes and associated messenger RNA expression. Journal of surgical orthopaedic advances. 22 (3), 224-232 (2013).
- Whitlock, P. W., et al. A novel process for optimizing musculoskeletal allograft tissue to improve safety, ultrastructural properties, and cell infiltration. Journal of Bone and Joint Surgery - Series A. 94 (16), 1458-1467 (2012).
- Schultz, G. S., Davidson, J. M., Kirsner, R. S., Herman, I. M. Dynamic Reciprocity in the Wound Microenvironment. Wound Repair Regeneration. 19 (2), 134-148 (2012).
- Benders, K. E. M., van Weeren, P. R., Badylak, S. F., Saris, D. B. F., Dhert, W. J. A., Malda, J. Extracellular matrix scaffolds for cartilage and bone regeneration. Trends in Biotechnology. 31 (3), 169-176 (2013).
- Crapo, P., Gilbert, T., Badylak, S. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Guan, Y., et al. Porcine kidneys as a source of ECM scaffold for kidney regeneration. Materials Science and Engineering C. 56, 451-456 (2015).
- Dean, R. L. Kinetic studies with alkaline phosphatase in the presence and absence of inhibitors and divalent cations. Biochemistry and Molecular Biology Education. 30 (6), 401-407 (2002).
