Summary
Dit protocol beschrijft de productie van polycaprolactone (PCL) gloeidraad met ingesloten polylactic acid (PLA) microsferen waarin decellularized matrices (DM) voor afdrukken in 3D van structurele weefsel engineering constructies.
Abstract
3D bioprinting beoogt te creëren van aangepaste steigers die biologisch actief zijn en geschikt voor de gewenste grootte en geometrie. Een kunststof ruggengraat kan zorgen voor mechanische stabiliteit vergelijkbaar met eigen weefsel terwijl biologische agenten compositorische signalen naar voorlopercellen bieden, leidt tot hun migratie, proliferatie en differentiatie te reconstrueren van het oorspronkelijke weefsel / organen1,2. Helaas, veel 3D compatibel is met afdrukken, bioresorbable polymeren (zoals polylactic acid, PLA) worden afgedrukt bij een temperatuur van 210 ° C of hoger - temperaturen die schadelijk zijn voor biologics. Aan de andere kant, is polycaprolactone (PCL), een ander type van polyester, een bioresorbable, een 3D-printbaar materiaal dat een zachter afdrukken temperatuur van 65 ° C. heeft Daarom was het veronderstelde dat decellularized extracellulaire matrix (DM) deel uitmaakt van een thermisch barrièrebescherming PLA binnen PCL gloeidraad kan worden afgedrukt en blijven in haar functionele bevleesdheid. In dit werk was osteochondrale reparatie de toepassing waarvoor de hypothese werd getest. Als zodanig was varkens kraakbeen decellularized en ingekapseld in polylactic acid (PLA) microsferen, die vervolgens werden geëxtrudeerd met polycaprolactone (PCL) in gloeidraad voor de productie van 3D constructies via fused deposition modeling. De constructies met of zonder de microsferen (PLA-DM/PCL- en PCL(-), respectievelijk) werden geëvalueerd voor verschillen in oppervlaktekenmerken.
Introduction
Huidige weefsel engineering technieken voor klinische toepassingen zoals bot, kraakbeen, pezen en gewrichtsbanden wederopbouw auto- en allografts gebruiken voor het herstellen van beschadigd weefsel. Elk van deze technieken wordt uitgevoerd routinematig als een "gouden standaard" in de klinische praktijk door eerst het oogsten van de donorweefsel van de patiënt of een dode foetussen match, en dan het plaatsen van de donorweefsel in het defect site2. Deze strategieën zijn echter beperkt door de donor site morbiditeit, donor site schaarste voor grote gebreken, risico van infectie, en moeite met het vinden van protheses die overeenkomen met de gewenste geometrie. Bovendien, hebben studies aangetoond dat allografts gebruikt voor wederopbouw mechanische en biologische eigenschappen wanneer vergeleken met inheemse weefsel3hebben verminderd. Met deze overwegingen in het achterhoofd, hebben onlangs weefsel ingenieurs aan drie dimensionale (3D) bioprinting voor de productie van aangepaste, complexe geometrieën die biologisch actief zijn en ontworpen voor defect grootte en vorm terwijl het verstrekken van voldoende gedraaid mechanische eigenschappen tot biologische remodelleren voltooid is.
Ideaal, een 3D-gedrukte schavot zou bestaan uit een polymere backbone die de vereiste mechanische stabiliteit van inheemse weefsel behouden kan terwijl de opgenomen biologics biochemische signalen bieden naar de omringende cellen, wat leidt tot hun migratie, proliferatie, differentiatie en weefsel productie2,5. Helaas, meeste constructies die de biologische bestanddelen zijn gemaakt met gels of polymeren die te zwak zijn om te weerstaan in vivo krachten ervaren door de gerichte weefsels voor auto/allograft wederopbouw. Andere polymeren zoals polylactic acid (PLA) zijn bioresorbable, 3D afdrukbare en structureel klinken, maar bij temperaturen op of boven 210 ° C - maken het onmogelijk voor biologics mede gedrukte worden tijdens fabricage worden afgedrukt. Polycaprolactone (PCL) is een ander FDA-uitgeschakeld, bioresorbable polymeer dat afgedrukt op een lagere temperatuur (65 ° C), die wordt steeds populairder worden kan in het fabriceren van patiënt-specifieke implantaten met complexe morphologies5,6 3D ,7,8,9. Echter maken de meeste bioprinters met behulp van pneumatische technologie onmogelijk afdrukken PCL bij lagere temperaturen waar biologische activiteit ongedeerd blijven kunnen. Tot op heden heeft nog niet de integratie van deze polymeren met een auto/allografts in een roman afdrukbare biomaterial worden bereikt. Bij gebrek aan dergelijk materiaal is een benadering waar weefsel ontworpen weefsel wederopbouw onwaarschijnlijk. Wij hebben daarom wilde combineren van PLA, PCL, en decellularized allograft matrices (DM) gebruik maken van de voordelen van elk materiaal voor de vervaardiging van een levensvatbare construct staat op de wederopbouw van complexe weefsels. Dit proces zou zorgen voor de eerste mechanische stevigheid nodig zijn om in vivo krachten en de thermische stabiliteit voor additive manufacturing in een constructie die induceert de vorming van het gewenste weefsel te verzetten.
In een recente poging om het adres van de bovengenoemde horden, bleek we dat het haalbaar is om in te kapselen de extracellulaire matrix decellularized kraakbeen binnen een thermisch beschermende barrière van PLA, die kan worden geëxtrudeerd binnen PCL-filamenten, behoud van het vermogen van DM te beïnvloeden van omliggende host cellen2. Dit heeft inspireerde ons om klinisch effectieve benaderingen voor de wederopbouw van het weefsel. In de huidige studie, wij gebruiken het platformtechnologie om te bouwen van steigers van de all-in-one die PLA, DM en PCL (PLA-DM/PCL) bevatten.
Ons doel is het verbeteren van de doeltreffendheid en het nut van allografts nauwkeuriger recapituleren inheemse weefsel, uiteindelijk om ze te gebruiken in diverse toepassingen met de voorgestelde nieuwe biofabrication techniek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. verkrijgen en voorbewerken microsferen
- Microbolletjes van de producten met de gewenste matrix ingekapseld (PLA-DM)2.
Opmerking: Het is noodzakelijk dat de microsferen van uniforme grootte zijn. Om deze reden is het van essentieel belang de microsferen vóór gebruik zeven. Hoewel matrix decellularization en inkapseling hebben al gedetailleerd in eerdere publicaties2, volgt een korte samenvatting van het proces.- Ten eerste oogst kraakbeen stekkers van varkens hind ledematen. Decellularize van het kraakbeen in een reeks wasbeurten met 0,05% trypsine/0,5 mm tetrasodium ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA), Dulbecco gewijzigd van Eagle's medium (DMEM), en 1,5% Perazijnzuur zuur en 2,0% Triton X-100 voor 4 uur met gedestilleerd water wast vóór en na elke stap2.
- Afvoer van de decellularized matrix, bevriezen, lyophilize, slijpen en ontbinden in pepsine-oplossing. Meng de pepsine-oplossing met PLA die is ontbonden in dichloormethaan na ontbinding.
- Voeg het mengsel ontkleuring in een 3% polyvinyl alcohol in water oplossing. Centrifugeer het resulterende microsferen, spoelen, afvoer en lyophilize weer.
Opmerking: Zie de eerder gepubliceerde protocol2voor alle bijzonderheden op het proces.
- Zeef de microsferen.
- Zorgen dat alle zeef platen grondig gereinigde en droge voorafgaand aan gebruik. Indien nodig, schone zeef met behulp van ultrasone reiniger om ervoor te zorgen dat alle gebieden worden verwijderd uit de zeef.
- Monteer de zeef shaker met de 106 µm zeef lade aan de bovenkant, de 53 µm lade na dat, en de zeef onderaan de pan.
- Droge microsferen plaats in het Dienblad van de bovenste zeef en plaats de deksel op de bovenste lade. Inschakelen grof conventioneel-het zeven voor 8 tot 10 min. herhalen op boete voor 8 à 10 min.
Opmerking: De zeef tijden wellicht worden verhoogd of verlaagd afhankelijk van de partij. - Verwijder de zeef platen één voor één voorzichtig en leg ze ondersteboven op een papier van de grote wegen. Tik op de zijkanten voorzichtig om ervoor te zorgen dat de meeste van de bollen zijn gedaald uit de zeef en op het papier.
- Negeren van de extra grote bollen (> 106 µm) en ondermaatse bollen (< 53 µm). Voeg bollen die zich in de groottewaaier van 53 tot en met 106 µm aan een gelabelde centrifugebuis met het type en de batch nummer dan plaats in een vriezer van-20 ° C tot verder gebruik.
2. microsfeer kwaliteitscontrole evaluaties
Opmerking: Zie Figuur 1.
- Uitvoeren van macroscopische/visuele beoordeling om te controleren of de microsferen uniforme en sferisch, met geen aggregaten aanwezig.
- Beoordelen de microsferen met behulp van een scanning electron opname (SEM).
- Hiervoor plaats microsferen op een SEM chuck en sputter jas met goud-palladium in argon sfeer met behulp van een sputter coater met een dikte van 4 nm.
- Observeren van oppervlaktekenmerken, morfologie en diameters van de microsferen met behulp van een 10 kV om spanning en een 10 mm afstand te versnellen om ervoor te zorgen dat de productie en zeven van de microsferen was succesvol.
3. de gloeidraad creatie voor afdrukken in 3D
- Meten en registreren van de massa van de microsferen verkregen uit stap 2 en 3; ten minste 25 g nodig is.
- Polycaprolactone (PCL) poeder toevoegen aan de microsferen voor een 1:4-gewichtsverhouding van microsferen aan PCL.
- Meng het mengsel van de poeder op een miniatuur rollende mixer bij 20 omwentelingen per minuut gedurende 5 min. dan flip de container en meng bij 20 omwentelingen per minuut gedurende een extra 5 minuten (Zie Figuur 2).
- Vele verkrijgbare extruders (Zie de Tabel van materialen) hebben isolerende jassen omdat hun beoogde werking temperaturen voor traditionele fused deposition modeling (FDM) filamenten zijn. Wijzigen van de extruder (indien nodig) door het verwijderen van het isolatiemateriaal en gebruik het in combinatie met bureauventilatoren (die blazen de lucht op de extruder en geëxtrudeerde gloeidraad) tot het gebruik van de extruder bij lagere temperaturen.
Opmerking: Bureauventilatoren die de lucht blazen voor het koelen van de extruder en de gloeidraad zijn handig voor deze procedure. - Setup de installatie van de apparatuur voor extrusie. Zie Figuur 3.
- Setup de extruder zodat de uitlaat ~ 60 cm vanaf de inlaat naar de spooler, met een directe pad van de extrusie uitlaat naar de inlaat van de spooler is.
Opmerking: De spooler kan eventueel worden verhoogd 3-4 duim van de Bank als wordt geconstateerd dat de gloeidraad is hangend aan het punt van het aanraken van de benchtop. - Plaats een bureaublad fan ~ 15 cm vanaf de verwarming jas en het richten van de jas van de verwarming te bieden koeling met de buitenlucht in de gehele productie van de gloeidraad. Plaats een tweede koelventilator ongeveer halverwege tussen de extruder en de spooler en het richten van de extrudate om te helpen in de koeling van de gloeidraad met de buitenlucht.
- Pas de positionering zo nodig gedurende het hele proces.
- Setup de extruder zodat de uitlaat ~ 60 cm vanaf de inlaat naar de spooler, met een directe pad van de extrusie uitlaat naar de inlaat van de spooler is.
- Instellen van de gemodificeerde extruder verwarmingselement tot 52 ° C, zet op het bureaublad koelventilatoren, en laat het instrument om te komen tot evenwicht voor 20 tot 30 min., zorg ervoor dat de juiste mondstuk aan de extruder is gekoppeld.
- Net voordat u begint, door de extruder hopper te vullen met het mengsel van de microsfeer/PCL uit stap 3.3. Inschakelen van de spooler en de extruder auger, tot inleiding van de extrusie van de gloeidraad.
- Wanneer de eerste gloeidraad warm geperst is, handmatig Trek de extrudate uit het stopcontact extrusie met een tang en voeden het naar de spooler van de gloeidraad.
- De gewenste gloeidraad duurt enige tijd te komen uit de spooler. Met behulp van afzonderlijke spoelen of tape, duidelijk markeren wanneer de samenstelling van de gloeidraad wordt visueel weergegeven uniform.
- Het proces volgen en parameters te wijzigen als dit nodig is. Aanpassen van de extruder temperatuur, de extrusie auger snelheid, en de snelheid van de spooler te verkrijgen van een gloeidraad van 1,75 mm diameter, zoals gemeten door de remklauwen. Pas de fans zo nodig om af te koelen van de gloeidraad correct om te voorkomen dat niet-cirkelvormige gloeidraad dwarsdoorsneden. Meng en vullen van de trechter als dit nodig is.
Opmerking: Aandacht vereist is tijdens dit proces te verkrijgen van voldoende gloeidraad voor latere 3D printen. De bovenstaande parameters verandert afhankelijk van de omgevingsomstandigheden, de vulhoogte en de uniformiteit van het mengsel in de hopper en de thermodynamica en stroom dynamiek van de specifieke batches van PCL en microsferen. - Blijven diepte tot al het poeder is gebruikt en de hopper bijna leeg is. PCL-poeder (zonder microbolletjes) toevoegen aan de bak te spoelen van de microsfeer mengsel dat momenteel in de extruder. Blijven PCL-poeder toe te voegen aan de hopper, zolang geen meer microsferen niet zichtbaar in de extrudate zijn.
- Zorg om te etiketteren en aparte de gloeidraad waarin de microsferen in de gewenste concentratie, als nadat de gloeidraad wordt gekoeld het is moeilijker om te onderscheiden van de uniforme gloeidraad van niet-uniforme gloeidraad.
- Blijven diepte totdat er minimale poeder links in de hopper is en uitschakelen van de spooler, extruder auger extruder verwarmingselement en fans.
4. printen met de gloeidraad
- Ontwerp een geometrie van de gewenste vorm en vorm met behulp van een computer aided ontwerpsoftware. Vervolgens snijd van het model en dicteren de toolpath met behulp van segmenteringshulplijnen software die compatibel is met de 3D drukmachine wordt gebruikt.
- Laden van de gloeidraad vanaf stap 3 op elke standaard FDM printer, uitgerust met standaard sproeiers van de gewenste diameter (doorgaans 0,4 mm). Beginnen de lettertjes (doorgaans op 65-70 ° C en 300 mm/min lineaire snelheid) zoals de aangepaste gloeidraad gedeponeerd laag-voor-laag door de machine is.
- Zorg ervoor dat bijzondere aandacht besteden aan de eerste laag en pas instellingen zoals die nodig zijn om een goede kwaliteit print.
Opmerking: Aanpassingen kunnen worden aangebracht in de afdruksnelheid, print temperatuur platform temperatuur, extrusie vermenigvuldiger en andere parameters. Verwijzen naar de printer en de probleemoplossing van het snijden van de fabrikant voor verdere ondersteuning.
5. kwaliteitscontrole beoordeling
- Plaats de afgedrukte constructies op SEM Opspansystemen en sputter jas met goud-palladium in argon sfeer met behulp van een sputter coater met een dikte van 4 nm.
- Observeren onder de microscoop met behulp van een 10 kV versnellen van spanning en een 10 mm afstand te controleren van oppervlaktekenmerken en voor de aanwezigheid of afwezigheid van microsferen indien van toepassing.
6. functionele testen van de afgedrukte constructies
Opmerking: Alkalisch fosfatase (ALP) kan worden gebruikt als een surrogaat voor decellularized matrix om te bepalen als encapsulated eiwitten biologisch actieve na het productieproces van de gloeidraad zijn. ALP wordt gebruikt omdat het een reactie van een substraat, p-nitrofenyl fosfaat, veranderen van kleurloos naar gele bijproducten, p-nitrofenol en anorganisch fosfaat, katalyseert, maar alleen als ALP in de functionele bevleesdheid.
- Afdrukken van een geometrie (n = 3) die heeft een einde massa van ten minste 400 mg met de ALP microsfeer gloeidraad (PLA-ALP/PCL) met behulp van identieke print parameters als de PLA-DM/PCL-steigers. Ook afdrukken PCL-enige (PCL(-)) steigers van de dezelfde geometrie als de PLA-ALP/PCL-steigers. Dompelen hen in 1 mL Tris-HCl buffer en incubeer gedurende 24 uur bij 37 ° C en 110 rpm rotatie toe enzym diffusie.
- Voeg 1 mL 1 mg/mL p-nitrofenyl fosfaat, Dinatrium-hexahydraat in Tris-HCl. Incubate bij 37 ° C, 110 rpm voor een extra 10 h. Lees het supernatant absorptie bij 415 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na zeven, moet de microsferen worden weergegeven uniform en vrij zijn van aggregaten. Onder SEM, de gezeefde microsferen wellicht kleine poriën op hun oppervlak, maar anders zal zijn bolvormig en glad, zoals afgebeeld in Figuur 1. Alle geëxtrudeerde filamenten moet uniform diameter en een cirkelvormige dwarsdoorsnede. Een gloeidraad waarin microbolletjes (PLA-DM/PCL) zal hebben een iets meer matte afwerking terwijl een PCL-alleen (PCL(-)) gloeidraad zou kijken meer glanzend. De PLA-DM/PCL gloeidraad zou ook voelen ruwer aanvoelt dan de gloeidraad van de PCL(-). Steigers moeten worden afgedrukt in de gewenste geometrie die was ingegeven door de software in stap 4.1. De kwaliteit van de steiger en de vorm moeten herhaalbaar en uniform uit één prent naar de andere. Na het afdrukken zal steigers met en zonder microsferen moeilijk te onderscheiden macroscopisch, maar onder SEM, microsferen moet zichtbaar op het oppervlak en de rest van de constructies. Bij SEM, PCL(-) gloeidraad worden glad, met enkele strepen als een artefact van het extrusieproces (Figuur 4B) weergegeven. Microbolletjes zichtbaar moeten zijn beide uitstekende door en onder de oppervlakte van de PLA-DM/PCL-steigers (Zie Figuur 4C). Wanneer u ALP als een surrogaat voor DM, de functionaliteit van het enzym binnen de steiger moet worden gehandhaafd met aanzienlijk hogere extinctie (t-testen, p < 0.05) bij 415 nm dan die van lege PCL(-) steigers, 0,297 ± 0.023 en 0.166 ± 0,012, respectievelijk, Figuur 5.
Figuur 1 . Representatieve macroscopische (links) en SEM (rechts) beelden van microsferen na opmaak en zeven 2. Merk op dat de microsferen bolvormig en in de juiste grootte (53-106 µm diameter zijn). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Op maat gemaakte rollende mixer. De op maat gemaakte rollende mixer wordt gebruikt voor het combineren van de microsferen met PCL-poeder. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . Gloeidraad productie setup. De uitlaat van de extruder ligt ongeveer 60 cm van de inlaat van de spooler. Bureauventilatoren bevinden zich in de buurt van het verwarmingselement en ongeveer halverwege tussen de extruder en de spooler. De spooler kunnen eventueel verhoogde 3-4 duim boven de benchtop. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 . Kwaliteit evaluaties. (A) PCL(-) (links) en PLA-DM/PCL (rechts) steigers zijn moeilijk te onderscheiden macroscopisch. (B) onder SEM, de PCL(-) steiger verschijnt meestal glad, met een paar strepen als artefacten van het drukproces. (C) onder SEM, microbolletjes zijn zichtbaar in de PLA-DM/PCL-monsters. Sommige van de microsferen worden aangeduid met behulp van pijlen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 . Representatieve resultaten van een ALP colorimetrische bepaling. De extinctie van de ALP-bevattende steigers (PLA-ALP/PCL) is aanzienlijk hoger dan die van de PCL-only (PCL(-)) steigers, die aangeeft dat het enzym ALP gekatalyseerd de reactie van kleurloze p-nitrofenyl fosfaat p-nitrofenol en anorganische fosfaat. Dit toont aan dat de mogelijkheid om afdrukken van functionele eiwitten met het proces in dit manuscript beschreven. * aanzienlijk verschillende (p < 0,05) van alle andere groepen. Foutbalken geven standaarddeviatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beide matrices decellularized en 3D gedrukte PCL-steigers, onafhankelijk is gebleken dat hechting en proliferatie van cellen, het valideren van hun gebruik voor osteochondrale herstellen10,11,12. Het gebruik van decellularized matrix in engineering benaderingen voor weefselherstel een onderwerp geweest van veel belang en het succes in het recente verleden2,3,14,15. Wij hebben eerder opgemerkt, de toegenomen migratie, hechting, proliferatie en algehele onderhoud van resulterende weefsels in vergelijking met traditionele technieken2,15,16,17 ,18. Velen zijn deze wenselijk resultaten toegeschreven aan het proces van dynamische wederkerigheid, waardoor de cellen van de gastheer signalen uit de decellularized matrix ontvangt, dynamisch reageren en de signalen voor nieuwe cellen te repliceren door meer extracellulaire matrix te leggen die meestal lijkt op wat er al aanwezig19,20,-21,22. Terwijl dit is onderzocht voor vele toepassingen, veel van de processen zijn niet gemakkelijk te repliceren en kunnen niet worden aangepast voor verschillende doeleinden, niet in staat om met succes sterk patiënt-specifieke constructies, niet in staat om complexe morphologies, en niet in staat te weerstaan in vivo troepen2,3,4,13,14,15,16.
De hierin voorgestelde innovatieve aanpak vermijdt zowel tijdelijke en langdurige blootstelling aan hoge temperaturen die doorgaans 3D printen vereist zijn bij het gebruik van traditionele mechanische extrusie gebaseerde FDM printers met een nieuw voertuig van de vervoerder. Bovendien, het voertuig van de vervoerder (PLA microbolletjes) beveiligt de ingekapselde biologische voor de relatief korte periode van tijd dat hij is blootgesteld aan de hitte en biedt een alles-in-één behandelingsoptie voor snel omzet in de kliniek2. De hierin voorgestelde methoden laten zien hoe het maken van biologisch actieve filamenten voor afdrukken in 3D en steigers via 3D printen waar een cruciale stap de extrusie van de gloeidraad is en het afdrukken van deze gloeidraden bij lage temperaturen (65 ° C). Het vermogen van de ingekapselde eiwitten blijven functionele werd aangetoond met behulp van ALP als een surrogaat voor DM gedurende het gehele proces. ALP werd gebruikt als het enzym in een zeer specifieke functionele conformatie moet om te kunnen katalyseren van de colorimetrische reactie beoordeeld in dit protocol23. Als de gloeidraad niet warm met zorgvuldige aandacht voor diameter, temperatuur en snelheid geperst is, zou het hulpprogramma voor afdrukken in 3D en biologische activiteit worden opgeofferd.
In dit protocol microbolletjes met decelluarized matrices (PLA-DM) waren samen geëxtrudeerde met PCL om 3D afdrukbare filamenten en 3D gedrukte steigers voor osteochondrale herstellen (PLA-DM/PCL). Zoals vermeld in het protocol stappen, is continue monitoring van het productieproces van de gloeidraad essentieel voor de hoge kwaliteit van de gloeidraad. Aanpassingen moeten worden aangebracht in de extrusie snelheid, de snelheid van de spooler en extrusie temperatuur teneinde de gewenste gloeidraad diameter (meestal 1,75 mm). De aanwezigheid van de microsferen in de steigers is bevestigd door SEM beeldvorming en het onderhoud van enzym functionaliteit wordt aangetoond door een alkalische fosfatase assay. Merk op dat dit protocol wordt beperkt door de grote hoeveelheid microsferen nodig zijn voor de productie en de relatief lagere resolutie van fused deposition modelleren naar andere 3D-printen modaliteiten. De verhoogde biologische activiteit is echter een grote vooruitgang. Hoewel nog niet de focus van dit protocol, zal latere studies concentreren op de gevolgen van de microsferen op mechanische sterkte, cel migratie en differentiatie, en verder de karakteristieken van de steigers. Over het geheel genomen de hier beschreven techniek maakt het mogelijk decellularized matrix en andere eiwitten om te worden afgedrukt bij lagere temperaturen dan eerder toegestaan en in thermisch beschermende barrières teneinde functie en mechanische sterkte2, 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit project werd gedeeltelijk gefinancierd door een subsidie van de pediatrische orthopedische maatschappij van Noord-Amerika (POSNA) en de National Institutes of Health verlenen NIBIB R21EB025378-01 (verkennend Bioengineering onderzoeksbeurs).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sieve machine | Haver & Boecker Tyler | Ro-Tap RX 29-E Pure | |
| Sieve 90 um | Fisherbrand | 170328156 | No. 170 |
| Sieve 53 um | Fisherbrand | 162513588 | No. 270 |
| Sieve 106 um | Fisherbrand | 162018121 | No. 140 |
| Sputter coater | Leica | n/a | |
| Scanning Electron Microscope | Hitachi, USA | n/a | |
| Filabot EX2 | Filabot.com | FB00061 | |
| Filabot Spooler | Filabot.com | FB00073 | |
| CAPA 6506 | Perstorp | 24980-41-4 | |
| Phosphate buffered saline, PBS | Gibco | 10010023 | |
| 6" Fan | Comfort Zone, Amazon | n/a | |
| Ultrasonic Water Bath | Cole Parmer | SK-08895-13 | |
| Dreamer | FlashForge | n/a | |
| Drum Mixer | Custom made | n/a | Similar piece of equipment: https://www.coleparmer.com/i/argos-technologies-flexiroll-digital-tube-roller-shaker-120-vac/0439744?PubID=UX&persist=true&ip= no&gclid=CjwKCAjw- dXaBRAEEiwAbwCi5khGDMz0 dTjsraEsBGfhMEH7ytx LQWGUPNgUJYQ1p3vj_yxkYoI_ ixoC9GwQAvD_BwE |
| Micro Balance | Mettler Toledo, Fisher Scientific | 01-913-851 | |
| Simplify3D | Simplify3D | n/a | |
| SolidWorks | SolidWorks | n/a | |
| Microspheres | Produced in-house, see concurrently submitted JoVE submission | ||
| p-nitrophenyl phosphate, disodium salt, hexahydrate | Millipore | 4876-5GM | |
| Phosphatase, alkaline | Roche Diagnostics GmbH | 10 713 023 001 | |
| Absorbance Reader | Tecan | Sunrise | |
| Tris-HCl Buffer | Sigma-Aldrich | T6455-100ML | |
| Heated shaker | New Brunswick Scientific | Excella E24 |
References
- Hutchmaker, D., Teoh, S., Zein, I., Ng, K. W., Schantz, J. -T., Leahy, J. C. Design and Fabrication of a 3D Scaffold for Tissue Engineering Bone. Synthetic Bioabsorbable Polymers and Implants. 15 (2), 845-847 (1988).
- Ghosh, P., Gruber, S. M. S., Lin, C. -Y., Whitlock, P. Microspheres containing decellularized cartilage induce chondrogenesis and remain functional after incorporation within a poly(caprolactone) filament useful for fabricating a 3D scaffold. Biofabrication. , (2018).
- Partington, L., et al. Biochemical changes caused by decellularization may compromise mechanical integrity of tracheal scaffolds. Acta Biomaterialia. 9 (2), 5251-5261 (2013).
- Hutmacher, D. W. Scaffolds in tissue engineering bone and cartilage. Biomaterials. 21 (24), 2529-2543 (2000).
- Kang, H., Hollister, S. J., La Marca, F., Park, P., Lin, C. -Y. Porous biodegradable lumbar interbody fusion cage design and fabrication using integrated global-local topology optimization with laser sintering. Journal of biomechanical engineering. 135 (10), 101013-101018 (2013).
- Kang, H., Lin, C. Y., Hollister, S. J. Topology optimization of three dimensional tissue engineering scaffold architectures for prescribed bulk modulus and diffusivity. Structural and Multidisciplinary Optimization. 42 (4), 633-644 (2010).
- Lin, C. -Y., et al. Functional bone engineering using ex vivo. gene therapy and topology-optimized, biodegradable polymer composite scaffolds. Tissue Engineering. 11 (9-10), 1589-1598 (2005).
- Lin, C. -Y., Hsiao, C. -C., Chen, P. -Q., Hollister, S. J. Interbody Fusion Cage Design Using Integrated Global Layout and Local Microstructure Topology Optimization. Spine. 29 (16), 1747-1754 (2004).
- Zopf, D., Hollister, S., Nelson, M., Ohye, R., Green, G. Bioresorbable Airway Splint Created with a Three-Dimensional Printer. New England Journal of Medicine. 368 (21), 2043-2045 (2013).
- Pati, F., Song, T. H., Rijal, G., Jang, J., Kim, S. W., Cho, D. W. Ornamenting 3D printed scaffolds with cell-laid extracellular matrix for bone tissue regeneration. Biomaterials. 37, 230-241 (2015).
- Zhang, W., et al. The effect of interface microstructure on interfacial shear strength for osteochondral scaffolds based on biomimetic design and 3D printing. Materials Science and Engineering C. 46, 10-15 (2015).
- Williams, J. M., et al. tissue engineering using polycaprolactone scaffolds fabricated via. selective laser sintering. Biomaterials. 26 (23), 4817-4827 (2005).
- Monibi, F. A., Cook, J. L. Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioscaffolds: Emerging Applications in Cartilage and Meniscus Repair. Tissue Engineering Part B: Reviews. , (2017).
- Wiles, K., Fishman, J., Coppi, P., Birchall, M. The Host Immune Response to Tissue-Engineered Organs: Current Problems and Future Directions. Tissue Engineering Part B: Reviews. 22 (3), (2016).
- Sutherland, A. J., Detamore, M. S. Bioactive Microsphere-Based Scaffolds Containing Decellularized Cartilage. Macromolecular Bioscience. , (2015).
- Whitlock, P. W., Smith, T. L., Poehling, G. G., Shilt, J. S., Van Dyke, M. A naturally derived, cytocompatible, and architecturally optimized scaffold for tendon and ligament regeneration. Biomaterials. , (2007).
- Whitlock, P. W., et al. Effect of cyclic strain on tensile properties of a naturally derived, decellularized tendon scaffold seeded with allogeneic tenocytes and associated messenger RNA expression. Journal of surgical orthopaedic advances. 22 (3), 224-232 (2013).
- Whitlock, P. W., et al. A novel process for optimizing musculoskeletal allograft tissue to improve safety, ultrastructural properties, and cell infiltration. Journal of Bone and Joint Surgery - Series A. 94 (16), 1458-1467 (2012).
- Schultz, G. S., Davidson, J. M., Kirsner, R. S., Herman, I. M. Dynamic Reciprocity in the Wound Microenvironment. Wound Repair Regeneration. 19 (2), 134-148 (2012).
- Benders, K. E. M., van Weeren, P. R., Badylak, S. F., Saris, D. B. F., Dhert, W. J. A., Malda, J. Extracellular matrix scaffolds for cartilage and bone regeneration. Trends in Biotechnology. 31 (3), 169-176 (2013).
- Crapo, P., Gilbert, T., Badylak, S. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Guan, Y., et al. Porcine kidneys as a source of ECM scaffold for kidney regeneration. Materials Science and Engineering C. 56, 451-456 (2015).
- Dean, R. L. Kinetic studies with alkaline phosphatase in the presence and absence of inhibitors and divalent cations. Biochemistry and Molecular Biology Education. 30 (6), 401-407 (2002).
