Summary
यह प्रोटोकॉल एम्बेडेड polylactic एसिड (पीएलए) microspheres के साथ polycaprolactone (PCL) रेशा के उत्पादन का वर्णन करता है जिसमें संरचनात्मक ऊतक इंजीनियरिंग के निर्माणों के 3d मुद्रण के लिए विसेलुलर मैट्रिक्स (डीएम) होते हैं ।
Abstract
3 डी प्रिंटिंग कस्टम पाड़ है कि जैविक रूप से सक्रिय है और वांछित आकार और ज्यामिति को समायोजित बनाने के उद्देश्य । एक थर्माप्लास्टिक रीढ़ यांत्रिक स्थिरता मूल ऊतकों के समान प्रदान करते हैं, जबकि जीवविज्ञान एजेंटों जनक कोशिकाओं को रचनात्मक cues की पेशकश कर सकते हैं, उनके प्रवास, प्रसार के लिए अग्रणी है, और विभेदक को मूल ऊतकों का पुनर्गठन/ अंगों1,2. दुर्भाग्य से, कई 3d मुद्रण संगत, bioresorbable पॉलिमर (जैसे polylactic एसिड, पीएलए) के तापमान पर मुद्रित कर रहे हैं २१० ° c या उच्च-तापमान कि के लिए हानिकारक हैं । दूसरी ओर, polycaprolactone (PCL), पॉलिएस्टर के एक अलग प्रकार, एक bioresorbable, 3 डी मुद्रण योग्य सामग्री है कि ६५ डिग्री सेल्सियस का एक gentler मुद्रण तापमान है । इसलिए, यह कि एक थर्मल सुरक्षात्मक पीएलए बैरियर के भीतर निहित extracellular मैट्रिक्स (डीएम) की कल्पना की थी PCL रेशा के भीतर मुद्रित किया जा सकता है और अपनी कार्यात्मक अनुरूप में रहते हैं । इस कार्य में osteochondral मरम्मत का आवेदन था जिसके लिए परिकल्पना का परीक्षण किया गया । इस तरह के रूप में, सुअर का उपास्थि और polylactic एसिड में समझाया गया था (पीएलए) microspheres जो तो polycaprolactone (PCL) रेशा में जुड़े जमाव के माध्यम से 3 डी निर्माण उत्पादन के साथ बाहर निकाला गया मॉडलिंग । microspheres (पीएलए-DM/pcl और pcl (-), क्रमशः) के साथ या बिना constructs सतह सुविधाओं में अंतर के लिए मूल्यांकित किए गए थे ।
Introduction
इस तरह के अस्थि, उपास्थि, पट्टा, और बंधन पुनर्निर्माण के रूप में नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए वर्तमान ऊतक इंजीनियरिंग तकनीक ऑटो और क्षतिग्रस्त ऊतकों की मरंमत के लिए allografts का उपयोग करें । इन तकनीकों में से प्रत्येक नियमित रूप से एक "सोने के मानक के रूप में किया जाता है" नैदानिक अभ्यास में पहले दाता ऊतक संचयन से रोगी या एक cadaveric मैच, और फिर दोष साइट2में दाता ऊतक दे । हालांकि, इन रणनीतियों दाता साइट रुग्णता द्वारा सीमित हैं, बड़े दोषों के लिए दाता साइट कमी, संक्रमण का खतरा है, और मुश्किल लग रहा है कि वांछित ज्यामिति मैच भ्रष्टाचार । इसके अलावा, अध्ययनों से पता चला है कि allografts पुनर्निर्माण के लिए इस्तेमाल यांत्रिक और जीवविज्ञान गुण कम है जब देशी ऊतक3के साथ तुलना में । मन में इन विचारों के साथ, ऊतक इंजीनियरों को हाल ही में तीन आयामी (3 डी) के लिए कस्टम, जटिल geometries है कि जैविक रूप से सक्रिय है और दोष आकार और आकार को समायोजित करने के लिए डिज़ाइन करते समय पर्याप्त उत्पादन प्रिंटिंग कर दिया है यांत्रिक गुण जब तक जीवविज्ञान remodeling पूरा हो गया है ।
आदर्श रूप में, एक 3d-मुद्रित पाड़ एक बहुलक रीढ़ है कि देशी ऊतक की आवश्यक यांत्रिक स्थिरता बनाए रखने कर सकते है से मिलकर होता है, जबकि शामिल जैव तर्क आसपास के कोशिकाओं को रासायनिक cues प्रदान करते हैं, उनके प्रवास, प्रसार के लिए अग्रणी, भेदभाव, और ऊतक उत्पादन2,5। दुर्भाग्य से, सबसे निर्माण है कि जीवविज्ञान घटक शामिल जैल या पॉलिमर कि भी vivo ऑटो/allograft पुनर्निर्माण के लिए लक्षित ऊतकों द्वारा अनुभवी बलों में सामना करने के लिए कमजोर कर रहे है के साथ बना रहे हैं । polylactic एसिड (पीएलए) जैसे अंय पॉलिमर bioresorbable, 3 डी मुद्रण योग्य और संरचनात्मक रूप से ध्वनि कर रहे हैं, लेकिन २१० डिग्री सेल्सियस से ऊपर या तापमान पर मुद्रित कर रहे हैं-यह असंभव करने के लिए निर्माण के दौरान सह मुद्रित किया जा करने के लिए । Polycaprolactone (PCL) एक और एफडीए मंजूरी दे दी है, bioresorbable बहुलक है कि एक कम तापमान (६५ डिग्री सेल्सियस) है, जो तेजी से रोगी निर्माण जटिल morphologies5,6 के साथ विशेष प्रत्यारोपण में लोकप्रिय हो गया है पर मुद्रित कर सकते है 3 डी ,7,8,9. हालांकि, वायवीय प्रौद्योगिकी का उपयोग कर सबसे अधिक जैव मुद्रण यह असंभव कम तापमान पर PCL मुद्रित करने के लिए जहां जैविक गतिविधियों को नुकसान नहीं रह सकते हैं । तारीख करने के लिए, ऑटो के साथ इन पॉलिमर के एकीकरण/allografts एक उपंयास मुद्रण योग्य में अभी तक पूरा हो गया है । इस तरह के एक सामग्री के अभाव में, ऊतक पुनर्निर्माण के लिए एक सच्चे ऊतक इंजीनियर दृष्टिकोण की संभावना नहीं है । इसलिए, हम पीएलए, PCL गठबंधन करने की मांग की है, और सेलुलर allograft मैट्रिक्स (डीएम) के लिए प्रत्येक सामग्री के लाभों का उपयोग करने के लिए एक व्यवहार्य जटिल ऊतकों के पुनर्निर्माण में सक्षम निर्माण विनिर्माण । यह प्रक्रिया प्रारंभिक यांत्रिक को vivo बलों में विरोध और थर्मल स्थिरता के लिए एक निर्माण है कि वांछित ऊतक के गठन लाती में additive विनिर्माण को समायोजित करने के लिए आवश्यक शक्ति प्रदान करेगा ।
aforementioned बाधाओं को संबोधित करने के लिए एक हाल ही में प्रयास में, हमें पता चला है कि यह PCL तंतु के भीतर बाहर निकाला जा सकता है कि एक थर्मल सुरक्षात्मक पीएलए बाधा के भीतर विसेलुलर उपास्थि extracellular मैट्रिक्स encapsulate करने के लिए संभव है, की क्षमता बनाए रखने डीएम ने आसपास के मेजबान कोशिकाओं को प्रभावित करने के लिए2. यह हमें ऊतक पुनर्निर्माण के लिए नैदानिक प्रभावी दृष्टिकोण की तलाश करने के लिए प्रेरित किया है । वर्तमान अध्ययन में, हम सभी में एक मचान है कि पीएलए, डीएम, और pcl (पीएलए-डीएम/) शामिल बनाने के लिए मंच प्रौद्योगिकी का उपयोग ।
हमारा लक्ष्य के लिए और अधिक सही देशी ऊतक दोहराऊंगा करने के लिए प्रस्तावित उपंयास के लिए allografts का उपयोग कर की प्रभावकारिता और उपयोगिता में सुधार है, अंततः उंहें विभिंन अनुप्रयोगों में उपयोग करें ।
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Protocol
1. प्राप्त करने और प्रक्रिया Microspheres
- उत्पादन वांछित मैट्रिक्स के साथ microspheres (पीएलए-डीएम)2।
नोट: यह आवश्यक है कि microspheres समान आकार के हों । इस कारण से, sieving उपयोग करने के लिए पहले microspheres आवश्यक है । हालांकि मैट्रिक्स decellularization और encapsulation पिछले प्रकाशनों में विस्तृत किया गया है2, प्रक्रिया का एक संक्षिप्त सारांश इस प्रकार है ।- सबसे पहले, सुअर का हिंद अंगों से फसल उपास्थि प्लग. Decellularize ०.०५% trypsin/0.5 mm tetrasodium ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA), Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम (DMEM), और १.५% peracetic एसिड और २.०% ट्राइटन एक्स-१०० के साथ धोने की एक श्रृंखला में उपास्थि आसुत पानी बहाकर साथ प्रत्येक 4 एच के लिए इससे पहले और प्रत्येक चरण2के बाद ।
- सेलुलर मैट्रिक्स नाली, यह फ्रीज, lyophilize, पीसने, और पेप्सिन समाधान में भंग । विघटन के बाद, dichloromethane में घुल गया है, जो पीएलए के साथ पेप्सिन समाधान मिश्रण ।
- पानी के घोल में 3% polyvinyl शराब में मिश्रण dropwise जोड़ें । जिसके परिणामस्वरूप microspheres, कुल्ला, नाली, और lyophilize फिर से केंद्रापसारक ।
नोट: प्रक्रिया पर पूर्ण विवरण के लिए पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल2देखें ।
- चलनी microspheres ।
- सुनिश्चित करें कि सभी चलनी प्लेट अच्छी तरह से साफ किया गया है और उपयोग करने से पहले शुष्क कर रहे हैं । यदि आवश्यक हो, साफ छलनी अल्ट्रासोनिक क्लीनर का उपयोग सुनिश्चित करने के लिए कि सभी क्षेत्रों छलनी से हटा रहे हैं ।
- शीर्ष पर १०६ µm चलनी ट्रे के साथ छलनी शेखर इकट्ठा, ५३ µm ट्रे उस के बाद, और छलनी तल पर पैन ।
- सूखी microspheres को सबसे ऊपर चलनी ट्रे में रखें और ढक्कन को शीर्ष ट्रे पर रखें । 8 से 10 मिनट के लिए ठीक पर 8 करने के लिए 10 min. दोहराएँ के लिए मोटे sieving पर बारी.
नोट: चलनी बार बैच के आधार पर वृद्धि हुई है या कम करने की आवश्यकता हो सकती है । - ध्यान से छलनी प्लेटें एक एक करके निकालें और उंहें एक बड़े पैमाने पर वजन कागज पर उल्टा जगह है । पक्षों को धीरे से यह सुनिश्चित करना है कि क्षेत्रों की सबसे छलनी से बाहर गिर गया है और कागज पर ठोकर ।
- oversized क्षेत्रों (> 106 µm) और oversized क्षेत्रों (< 53 µm) को त्यागें । ५३ करने के लिए १०६ µm आकार रेंज में है कि क्षेत्र के प्रकार और बैच संख्या के साथ एक लेबल केंद्रापसारक ट्यूब तो जगह एक-20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में आगे उपयोग तक जोड़ें ।
2. Microsphere गुणवत्ता नियंत्रण आकलन
नोट: चित्र 1देखें ।
- macroscopic/दृश्य आकलन है कि microspheres एक समान और गोलाकार, कोई समुच्चय के साथ मौजूद है की जांच करने के लिए करते हैं ।
- एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन micrograph (SEM) का उपयोग कर microspheres का आकलन करें ।
- इस के लिए, प्लेस microspheres एक SEM चक और धूम कोट के साथ सोने-पैलेडियम आर्गन वातावरण में 4 एनएम की एक मोटाई के लिए एक धूम कोट का उपयोग कर ।
- सतह सुविधाओं, आकृति विज्ञान, और microspheres के व्यास का निरीक्षण एक 10 केवी तेजी वोल्टेज और एक 10 मिमी काम दूरी सुनिश्चित करने के लिए कि उत्पादन और microspheres के sieving सफल रहा था का उपयोग कर ।
3.3डी प्रिंटिंग के लिए रेशा सृजन
- उपाय और चरण 2 और 3 से प्राप्त microspheres के द्रव्यमान रिकॉर्ड; इसमें कम से 25 माम की जरूरत है ।
- pcl करने के लिए microspheres के एक 1:4 वजन अनुपात के लिए microspheres के लिए polycaprolactone (pcl) पाउडर जोड़ें ।
- मिश्रण 5 मिनट के लिए 20 rpm पर एक लघु रोलिंग मिक्सर पर पाउडर मिश्रण तो कंटेनर फ्लिप और एक अतिरिक्त 5 मिनट के लिए 20 rpm पर मिश्रण ( चित्रा 2देखें) ।
- कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध बाहर निकालना ( सामग्री की तालिकादेखें) जैकेट अछूता है क्योंकि उनके उद्देश्य काम कर रहे तापमान पारंपरिक जुड़े जमाव मॉडलिंग (FDM) रेशा के लिए कर रहे हैं । बाहर निकालना (यदि आवश्यक हो) को हटाने सामग्री को संशोधित करने और डेस्कटॉप प्रशंसकों के साथ संयोजन में इसका इस्तेमाल (जो बाहर निकालना और बाहर निकला हुआ रेशा पर परिवेशी हवा उड़ा) कम तापमान पर बाहर निकालना का उपयोग करने के लिए ।
नोट: डेस्कटॉप प्रशंसक जो परिवेश हवा को उड़ाने के लिए बाहर निकालना और रेशा शांत इस प्रक्रिया के लिए उपयोगी होते हैं । - सेटअप उपकरण बाहर निकालना के लिए सेटअप । चित्र 3देखें ।
- ताकि इसके आउटलेट स्पूलर प्रवेश करने के लिए बाहर निकालना आउटलेट से एक सीधा रास्ता के साथ, के लिए प्रवेश से है ~ ६० cm सेटअप बाहर निकालना दुकान ।
नोट: स्पूलर बेंच से वैकल्पिक रूप से 3-4 इंच उठाया जा सकता है यदि यह पाया जाता है कि रेशा benchtop को छूने की बात करने के लिए drooping है । - हीटिंग जैकेट से एक डेस्कटॉप प्रशंसक ~ 15 सेमी प्लेस और हीटिंग जैकेट की ओर प्रत्यक्ष यह रेशा उत्पादन भर में परिवेशी वायु के साथ ठंडा करने की पेशकश । लगभग आधे रास्ते बाहर निकालना और स्पूलर के बीच एक दूसरे ठंडा प्रशंसक प्लेस और यह extrudate की ओर निर्देशित करने के लिए परिवेशी वायु के साथ रेशा ठंडा करने में सहायता करते हैं ।
- प्रक्रिया के दौरान आवश्यकतानुसार स्थिति समायोजित करें ।
- ताकि इसके आउटलेट स्पूलर प्रवेश करने के लिए बाहर निकालना आउटलेट से एक सीधा रास्ता के साथ, के लिए प्रवेश से है ~ ६० cm सेटअप बाहर निकालना दुकान ।
- ५२ ° c के लिए संशोधित बाहर निकालना मशीनी हीटिंग तत्व सेट, डेस्कटॉप ठंडा प्रशंसकों पर बारी है, और साधन के लिए 20 से 30 मिनट के लिए संतुलन में आने की अनुमति । सुनिश्चित करें कि उचित नोजल बाहर निकालना से जुड़ा हुआ है ।
- बस शुरू करने से पहले, microsphere/PCL मिश्रण से ३.३ कदम से बाहर निकालना कूदनेवाला भरें । स्पूलर और बाहर निकालना से रेशा के बाहर निकलने शुरू करने के लिए ।
- प्रारंभिक रेशा बाहर निकाले जाने पर, मैन्युअल रूप से extrudate बाहर निकालना आउटलेट से संदंश के साथ खींच और यह रेशा स्पूलर के लिए फ़ीड.
- वांछित रेशा स्पूलर से बाहर आने के लिए कुछ समय लगेगा । अलग स्पूल या टेप का उपयोग करना, स्पष्ट रूप से चिह्नित जब रेशा संरचना नेत्रहीन वर्दी दिखाई देता है ।
- प्रक्रिया बारीकी से निगरानी और आवश्यक के रूप में मापदंडों को संशोधित । कैलिपर्स द्वारा मापा के रूप में १.७५ मिमी व्यास रेशा प्राप्त करने के लिए बाहर निकालना के तापमान, बाहर निकालना बरमा गति, और स्पूलर गति को समायोजित करें । गैर परिपत्र रेशा पार वर्गों से बचने के लिए ठीक से रेशा ठंडा करने के लिए जरूरत के रूप में प्रशंसकों को समायोजित करें । मिश्रण और आवश्यक के रूप में कूदनेवाला फिर से भरना ।
नोट: बंद ध्यान इस प्रक्रिया के दौरान आवश्यक है बाद में 3 डी मुद्रण के लिए पर्याप्त रेशा प्राप्त करने के लिए । इसके बाद के संस्करण मापदंडों परिवेश की स्थिति, भरने के स्तर और कूदनेवाला में मिश्रण की एकरूपता के आधार पर बदल जाएगा, और ऊष्मा और PCL और microspheres के विशिष्ट बैचों के प्रवाह गतिशीलता । - जब तक सभी पाउडर का इस्तेमाल किया गया है और कूदनेवाला लगभग खाली है बाहर निकालना जारी रखें । microsphere मिश्रण है कि बाहर निकालना में वर्तमान में है बाहर फ्लश करने के लिए कूदनेवाला के लिए PCL पाउडर (microspheres के बिना) जोड़ें । extrudate में कोई अधिक microspheres दिखाई दे रहे हैं जब तक कि कूदनेवाला के लिए PCL पाउडर जोड़ना जारी रखें ।
- लेबल और रेशा जो वांछित एकाग्रता में microspheres शामिल अलग करने के लिए सुनिश्चित करें, के बाद के रूप में रेशा ठंडा है यह गैर वर्दी रेशा से वर्दी रेशा भेद करने के लिए कठिन है ।
- बाहर निकलने जारी रखें जब तक वहां ंयूनतम पाउडर कूदनेवाला में छोड़ दिया है, तो बंद स्पूलर, बाहर निकालना बरमा, बाहर निकालना मशीन है हीटिंग तत्व, और प्रशंसकों ।
4. रेशा के साथ मुद्रण
- डिजाइन एक कंप्यूटर सहायता प्राप्त डिजाइन सॉफ्टवेयर का उपयोग कर वांछित आकार और फार्म की एक ज्यामिति । फिर मॉडल टुकड़ा और टुकड़ा करने की क्रिया सॉफ्टवेयर है कि 3 डी प्रिंटिंग मशीन के साथ संगत है प्रयोग toolpath हुक्म ।
- किसी भी मानक FDM प्रिंटर पर चरण 3 से रेशा लोड, वांछित व्यास के मानक नलिका के साथ सज्जित (आमतौर पर ०.४ मिमी). प्रिंट शुरू (आम तौर पर 65-70 डिग्री सेल्सियस और ३०० mm/न्यूनतम रैखिक गति) के रूप में कस्टम रेशा मशीन द्वारा परत-दर-परत जमा है ।
- पहली परत पर विशेष ध्यान देने और एक अच्छी गुणवत्ता प्रिंट प्राप्त करने के लिए आवश्यक के रूप में सेटिंग्स समायोजित करने के लिए सुनिश्चित करें ।
नोट: समायोजन मुद्रण गति, मुद्रण तापमान, प्लेटफ़ॉर्म तापमान, बाहर निकालना गुणक, और अन्य पैरामीटर्स के लिए किया जा सकता है । आगे की सहायता के लिए प्रिंटर और टुकड़ा करने की क्रिया निर्माता की समस्या निवारण मार्गदर्शिका देखें ।
5. गुणवत्ता नियंत्रण मूल्यांकन
- SEM चक और धूम कोट पर सोने-पैलेडियम आर्गन वातावरण में 4 एनएम की एक मोटाई के लिए एक धूम कोट का उपयोग के साथ मुद्रित निर्माण प्लेस ।
- एक 10 केवी तेजी वोल्टेज और 10 मिमी काम दूरी की सतह सुविधाओं की जांच करने के लिए और उपस्थिति या microspheres की अनुपस्थिति के लिए अगर लागू का उपयोग माइक्रोस्कोप के तहत निरीक्षण ।
6. मुद्रित construction का कार्यात्मक परीक्षण
नोट: क्षारीय फॉस्फेट (ALP) के लिए एक किराए के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है अगर encapsulated प्रोटीन रेशा उत्पादन की प्रक्रिया के बाद सक्रिय हैं, यह निर्धारित करने के लिए । ALP प्रयोग किया जाता है क्योंकि यह एक सब्सट्रेट, पी-nitrophenyl फॉस्फेट से एक प्रतिक्रिया catalyzes पीले शोधकार्य, पी nitrophenol और अकार्बनिक फॉस्फेट के लिए बेरंग से बदलने के लिए, लेकिन केवल अगर ALP कार्यात्मक अनुरूपता में है ।
- एक ज्यामिति प्रिंट (n = 3) है कि ALP microsphere रेशा (पीएलए-ALP/pcl) पीएलए के रूप में समान प्रिंट मापदंडों का उपयोग कर के साथ एक अंत मास-डीएम/ भी pcl-केवल (pcl (-)) एक ही ज्यामिति के मचान के रूप में पीएलए-ALP/ उंहें 1 मिलीलीटर Tris में जलमग्न-एचसीएल बफर और ३७ डिग्री सेल्सियस और ११० rpm रोटेशन पर 24 घंटे के लिए मशीन एंजाइम प्रसार की अनुमति के लिए ।
- 1 मिलीग्राम/एमएल पी-nitrophenyl फॉस्फेट, disodium hexahydrate Tris-HCl में जोड़ें । ३७ ° c, ११० rpm पर एक अतिरिक्त 10 घंटे के लिए मशीन ४१५ एनएम पर supernatant अवशोषक पढ़ें ।
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Representative Results
sieving के बाद, microspheres वर्दी दिखाई और समुच्चय से मुक्त होना चाहिए । SEM के तहत, छलनी microspheres छोटी उनकी सतह पर pores हो सकता है, लेकिन अंयथा गोलाकार और चिकनी, के रूप में चित्र 1में दिखाया जाएगा । सभी बाहर निकाला रेशा वर्दी व्यास और परिपत्र पार अनुभाग की जानी चाहिए । एक रेशा जिसमें microspheres (पीएलए-डीएम/pcl) एक थोड़ा अधिक मैट खत्म होगा, जबकि एक pcl-केवल (pcl (-)) रेशा अधिक चमकदार दिखेगा । पीएलए-डीएम/pcl रेशा भी मोटे के लिए (-) रेशा से छूने के लिए महसूस होता है । मचान वांछित ज्यामिति जो कदम ४.१ में सॉफ्टवेयर द्वारा तय किया गया था में मुद्रित किया जाना चाहिए । पाड़ गुणवत्ता और आकार दोहराया जा सकता है और एक प्रिंट से दूसरे को वर्दी चाहिए । मुद्रण के बाद, पाड़ों के साथ और बिना microspheres macroscopically अंतर करने के लिए मुश्किल हो जाएगा, लेकिन SEM के तहत, microspheres सतह पर और निर्माणों भर में दिखाई जानी चाहिए । SEM के अंतर्गत, PCL (-) रेशा चिकनी दिखाई देगा, बाहर निकालना प्रक्रिया (चित्रा 4बी) के एक विरूपण साक्ष्य के रूप में कुछ striations के साथ । Microspheres दोनों के माध्यम से और पीएलए की सतह के तहत फैला हुआ दिखाई देना चाहिए-DM/PCL पाड़ ( चित्रा 4सीदेखें) । जब डीएम के लिए एक किराए के रूप में ALP का उपयोग कर, पाड़ के भीतर एंजाइम की कार्यक्षमता काफी उच्च अवशोषण के साथ बनाए रखा जाना चाहिए (टीपरीक्षण, पी < ०.०५) ४१५ समुद्री मील की तुलना में खाली PCL (-) पाड़ों, ०.२९७ ± ०.०२३ और ०.१६६ ± ०.०१२ के उन से क्रमशः चित्रा ५।
चित्रा 1 . प्रतिनिधि macroscopic (बाएं) और SEM (दाएं) microspheres की छवियां तैयार करने के बाद और sieving 2. ध्यान दें कि microspheres गोलाकार और उपयुक्त आकार रेंज (53-106 µm व्यास) में हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2 . कस्टम रोलिंग मिक्सर बनाया है । कस्टम-निर्मित रोलिंग मिक्सर PCL पाउडर के साथ microspheres के संयोजन के लिए प्रयोग किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3 . रेशा उत्पादन सेटअप । बाहर निकालना के आउटलेट स्पूलर के प्रवेश से लगभग ६० सेमी सेट है । डेस्कटॉप प्रशंसक हीटिंग तत्व और बाहर निकालना और स्पूलर के बीच लगभग आधे रास्ते के पास स्थित हैं । स्पूलर वैकल्पिक रूप से benchtop के ऊपर 3-4 इंच ऊंचा किया जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 4 . गुणवत्ता आकलन । (क) pcl (-) (बाएँ) और पीएलए-डीएम/pcl (दाएँ) पाड़ों में macroscopically भेद करना कठिन होता है. (ख) SEM के तहत, PCL (-) पाड़ ज्यादातर चिकनी मुद्रण प्रक्रिया की कलाकृतियों के रूप में कुछ striations के साथ, प्रकट होता है । (ग) SEM के अंतर्गत, microspheres पीएलए में दिखाई दे रहे हैं-डीएम/ microspheres में से कुछ तीरों का उपयोग कर संकेत कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 5 . एक ALP वर्णमिति परख के प्रतिनिधि परिणाम । ALP-युक्त पाड़ों (पीएलए-ALP/pcl) के अवशोषक से काफी अधिक है कि pcl-केवल (pcl (-)) पाड़ों, यह दर्शाता है कि ALP एंजाइम बेरंग पी-nitrophenyl फॉस्फेट से प्रतिक्रिया catalyzed पी-nitrophenol और अकार्बनिक फॉस्फेट. यह दर्शाता है कि इस पांडुलिपि में वर्णित प्रक्रिया के साथ कार्यात्मक प्रोटीन मुद्रित करने की क्षमता । * काफी अलग (पी < ०.०५) अंय सभी समूहों से । त्रुटि पट्टियां मानक विचलन इंगित करती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
दोनों विसेलुलर मैट्रिक्स और 3 डी मुद्रित PCL पाड़ों स्वतंत्र रूप से आसंजन और कोशिकाओं के प्रसार की अनुमति, osteochondral मरंमत के लिए उनके उपयोग के सत्यापन10,11,12दिखाया गया है । ऊतक की मरंमत के लिए इंजीनियरिंग दृष्टिकोण में विसेलुलर मैट्रिक्स का उपयोग हाल ही में पिछले2,3,14,15में बहुत रुचि और सफलता का विषय रहा है । हम पहले से बढ़ प्रवास, आसंजन, प्रसार, और परिणामस्वरूप ऊतकों के समग्र रखरखाव जब पारंपरिक तकनीकों की तुलना में उल्लेख किया है2,15,16,17 ,18. कई गतिशील पारस्परिकता की प्रक्रिया के माध्यम से जो मेजबान कोशिकाओं को विसेलुलर मैट्रिक्स से cues प्राप्त करने के लिए इन वांछनीय परिणामों को जिंमेदार ठहराया है, गतिशील जवाब है, और अधिक extracellular मैट्रिक्स बिछाने से नई कोशिकाओं के लिए cues दोहराने कि आमतौर पर क्या पहले से ही19,20,21,22मौजूद है जैसा दिखता है । हालांकि यह कई अनुप्रयोगों के लिए अध्ययन किया गया है, प्रक्रियाओं के कई आसान नहीं दोहराने के लिए कर रहे हैं और विभिन्न का उपयोग करता है के लिए अनुकूलित नहीं किया जा सकता, सफलतापूर्वक अत्यधिक रोगी विशिष्ट निर्माण बनाने में असमर्थ, जटिल morphologies बनाने में असमर्थ, और करने में असमर्थ vivo बलों में झेलने2,3,4,13,14,15,16।
अभिनव दृष्टिकोण के साथ साथ प्रस्तावित एक नया वाहक वाहन के साथ पारंपरिक यांत्रिक बाहर निकालना-आधारित FDM प्रिंटर का उपयोग करते समय आम तौर पर 3 डी मुद्रण द्वारा आवश्यक हैं कि उच्च तापमान के लिए दोनों क्षणिक और लंबे समय तक निवेश से बचा जाता है । इसके अलावा, वाहक वाहन (पीएलए microspheres) समय यह गर्मी से अवगत कराया है की अपेक्षाकृत कम अवधि के लिए encapsulated जीवविज्ञान की रक्षा में मदद करता है और क्लिनिक2में तेजी से कारोबार के लिए एक सभी में एक उपचार विकल्प प्रदान करता है । इस के साथ साथ प्रस्तावित तरीके 3d मुद्रण के माध्यम से 3 डी मुद्रण और मचान के लिए कैसे जैविक रूप से सक्रिय रेशा बनाने के लिए प्रदर्शन जहां एक महत्वपूर्ण कदम रेशा के बाहर निकालना और कम तापमान पर उन तंतुओं के मुद्रण (६५ डिग्री सेल्सियस) है । encapsulated प्रोटीन की क्षमता कार्यात्मक रहने के लिए प्रक्रिया में डीएम के लिए एक किराए के रूप में ALP का उपयोग करके प्रदर्शन किया गया । ALP के रूप में इस्तेमाल किया गया था एंजाइम एक बहुत ही विशिष्ट कार्यात्मक अनुरूपता में होना चाहिए ताकि वर्णमिति इस प्रोटोकॉल में मूल्यांकन की प्रतिक्रिया उत्प्रेरित के लिए23. यदि रेशा व्यास, तापमान, और गति के लिए सावधान ध्यान के साथ बाहर निकाला नहीं है, जीवविज्ञान गतिविधि और 3 डी मुद्रण के लिए उपयोगिता बलिदान दिया जाएगा ।
इस प्रोटोकॉल में, microspheres युक्त decelluarized मैट्रिक्स (पीएलए-डीएम) osteochondral मरंमत (पीएलए-डीएम/pcl) के लिए 3 डी मुद्रण योग्य रेशा और 3 डी मुद्रित पाड़ बनाने के लिए PCL के साथ सह-बाहर थे । के रूप में प्रोटोकॉल कदम में वर्णित है, रेशा उत्पादन प्रक्रिया की सतत निगरानी रेशा की उच्च गुणवत्ता के लिए आवश्यक है । वांछित रेशा व्यास (आमतौर पर १.७५ मिमी) को बनाए रखने के क्रम में समायोजन बाहर निकालना गति, स्पूलर गति, और बाहर निकालना तापमान के लिए किया जाना चाहिए । पाड़ों में microspheres की उपस्थिति SEM इमेजिंग द्वारा पुष्टि की है और एंजाइम कार्यशीलता के रखरखाव के एक alkaline फॉस्फेट परख द्वारा प्रदर्शन किया है । ध्यान दें कि इस प्रोटोकॉल उत्पादन के लिए आवश्यक microspheres की बड़ी राशि और अंय 3 डी मुद्रण के लिए मॉडलिंग से जुड़े बयान के अपेक्षाकृत कम संकल्प द्वारा सीमित है । फिर भी, बढ़ी हुई जीवविज्ञान गतिविधि एक प्रमुख उन्नति है । हालांकि इस प्रोटोकॉल का ध्यान केंद्रित नहीं, बाद में अध्ययन यांत्रिक शक्ति, सेल प्रवास और भेदभाव पर microspheres के प्रभाव पर ध्यान केंद्रित है, और पाड़ों के आगे characterizations होगा । कुल मिलाकर, इस के साथ साथ वर्णित तकनीक और अंय प्रोटीन की अनुमति देता है कम तापमान पर मुद्रित करने के लिए पहले से अनुमति दी और थर्मल सुरक्षात्मक बाधाओं में क्रम में समारोह और यांत्रिक शक्ति2बनाए रखने के लिए, 3.
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस परियोजना को आंशिक रूप से उत्तर अमेरिका के बाल चिकित्सा ऑर्थोपेडिक सोसायटी (POSNA) और स्वास्थ्य अनुदान NIBIB R21EB025378-01 (खोजपूर्ण इंजीनियरिंग रिसर्च ग्रांट) के राष्ट्रीय संस्थानों से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sieve machine | Haver & Boecker Tyler | Ro-Tap RX 29-E Pure | |
| Sieve 90 um | Fisherbrand | 170328156 | No. 170 |
| Sieve 53 um | Fisherbrand | 162513588 | No. 270 |
| Sieve 106 um | Fisherbrand | 162018121 | No. 140 |
| Sputter coater | Leica | n/a | |
| Scanning Electron Microscope | Hitachi, USA | n/a | |
| Filabot EX2 | Filabot.com | FB00061 | |
| Filabot Spooler | Filabot.com | FB00073 | |
| CAPA 6506 | Perstorp | 24980-41-4 | |
| Phosphate buffered saline, PBS | Gibco | 10010023 | |
| 6" Fan | Comfort Zone, Amazon | n/a | |
| Ultrasonic Water Bath | Cole Parmer | SK-08895-13 | |
| Dreamer | FlashForge | n/a | |
| Drum Mixer | Custom made | n/a | Similar piece of equipment: https://www.coleparmer.com/i/argos-technologies-flexiroll-digital-tube-roller-shaker-120-vac/0439744?PubID=UX&persist=true&ip= no&gclid=CjwKCAjw- dXaBRAEEiwAbwCi5khGDMz0 dTjsraEsBGfhMEH7ytx LQWGUPNgUJYQ1p3vj_yxkYoI_ ixoC9GwQAvD_BwE |
| Micro Balance | Mettler Toledo, Fisher Scientific | 01-913-851 | |
| Simplify3D | Simplify3D | n/a | |
| SolidWorks | SolidWorks | n/a | |
| Microspheres | Produced in-house, see concurrently submitted JoVE submission | ||
| p-nitrophenyl phosphate, disodium salt, hexahydrate | Millipore | 4876-5GM | |
| Phosphatase, alkaline | Roche Diagnostics GmbH | 10 713 023 001 | |
| Absorbance Reader | Tecan | Sunrise | |
| Tris-HCl Buffer | Sigma-Aldrich | T6455-100ML | |
| Heated shaker | New Brunswick Scientific | Excella E24 |
References
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