Summary
Vi presenterar ett protokoll för att hämta proteomiska signaturer av mänskliga makrofager och tillämpa detta att fastställandet av verkningarna av en låg syrehalt miljö på makrofag polarisering.
Abstract
Makrofager är innate immuna celler involverade i ett antal fysiologiska funktioner alltifrån Svaren till smittsamma patogener till vävnad homeostas. De olika funktionerna i dessa celler är relaterade till deras aktivering stater, som också kallas polarisering. Den exakta molekylära beskrivningen av dessa olika polarizations är en prioritering i fältet av makrofag biologi. Det erkänns för närvarande att en flerdimensionell strategi är nödvändigt att beskriva hur polarisering styrs av Miljösignaler. I den här rapporten beskriver vi ett protokoll som syftar till att erhålla proteomiska undertecknandet av olika polarizations i mänskliga makrofager. Detta protokoll baseras på en etikett-fri kvantifiering av makrofag proteinuttryck framställs i-gel fractionated och Lys C/trypsin-rötas Lys innehåll. Vi ger också ett protokoll baserat på i-lösning matsmältningen och isoelektrisk fokusering fraktionering att använda som ett alternativ. Eftersom syrehalten är en relevanta miljömässiga parameter i vävnader, vi använder detta protokoll för att utforska hur atmosfärens sammansättning eller en låg syrehalt miljö påverkar klassificeringen av makrofag polarisering.
Introduction
Makrofager är innate immuna celler involverade i ett antal fysiologiska funktioner alltifrån Svaren till smittsamma patogener till vävnad homeostas, inklusive borttagning av apoptotiska celler och ombyggnationer av extracellulär matrix1. Dessa celler kännetecknas av en stark fenotypisk plasticitet2 som översätter till en många möjliga aktiveringen stater, som också kallas polarisationer. Den exakta molekylära beskrivningen av dessa olika polarizations är en prioritering i fältet av makrofag biologi3. Det har föreslagits att klassificera dessa polarizations som använder så kallade M1/M2 dikotomin, där M1 representerar proinflammatoriska och M2 representerar antiinflammatoriska makrofager. Denna modell passar bra i olika patologiska situationer som akuta infektioner, allergi och fetma4. Dock i kroniskt inflammerade vävnader och cancer, har det visats att denna klassificering är oförmögna att förstå den bred fenotypiska repertoar som makrofager presenterar i vissa cellulära miljöer5,6, 7. den nuvarande uppfattningen är att makrofag polarisering bättre beskrivs med en flerdimensionell modell för att integrera specifika microenvironmental signaler8. Denna slutsats har bekräftats genom transcriptomic analys av mänskliga makrofager visar att modellen M1/M2 är ineffektiva i att beskriva den erhållna polarizations9.
Studien presenteras syftar till att ge ett protokoll för att hämta proteomiska signaturer av olika polarizations i mänskliga makrofager. Vi beskriver hur att skilja mänskliga makrofager i miljöer av olika syrenivåer och erhålla peptider från det hela makrofag proteomet att utföra en etikett-fri kvantifiering. Denna kvantifiering tillåter jämförelse av uttrycksnivåerna för olika proteiner. Som forskning på stamceller har visat betydelsen av syre som en miljö viktig parameter10, försöker vi förstå hur denna vävnad parameter kan påverka makrofag polarisering i människor. Partialtrycket för syre har hittats till utbud från 3 till 20% (av totalt atmosfärstryck) i den mänskliga kroppen, där 20% motsvarar ungefär vad används ofta i en cell kultur inkubator (det exakta värdet är cirka 18,6% samtidigt som förekomsten av vatten i beräkningen).
Tidigare arbete har visat att alveolära skiljer sig från interstitiell makrofager från funktionella och morfologisk synpunkt visningar11 och att dessa skillnader är förmodligen delvis på grund av olika syrehalten som de är exponerade12. Benmärg-derived makrofager visar dessutom en ökad förmåga att fagocytera bakterier när de utsätts för en låg syrehalt miljö12. Motsatt effekt har hittats för THP1-differentierade mänskliga makrofager13, men dessa resultat stöder idén att syre är en regulator av makrofag biologi och att det är nödvändigt att klargöra denna roll på molekylär nivå i mänskliga makrofager. I en tidigare studie, har vi tillämpat en proteomik strategi för att hantera dessa frågor. Genom att mäta uttrycksnivåerna för tusentals proteiner samtidigt, vi belyst effekten av syre på polarisering och en lista över nya molekylära markörer. Vi var också kunna relatera dessa fynd till vissa makrofager funktioner. Vi hittade noterbart att graden av fagocytos av apoptotiska celler höjdes i IL4/IL13-polariserade makrofager, som var kopplad till uppreglering av ALOX15 som framkommit vid proteomiska analys14. I föreliggande studie beskriver vi hur du utför en sådan analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Humant blodprover (LRSC) från friska, avidentifierad givare erhölls från EFS (franska National Blood Service) som en del av en auktoriserad protokoll (CODECOH DC-2018 – 3114). Givare gav undertecknat samtycke för användning av blod.
1. Media och buffert förberedelse
- Förbereda makrofag medium [RPMI glutamax + 10 mM HEPES + 1 x icke-essentiella aminosyror (NEAA)] och Värm till 37 ° C.
- Förbereda den makrofag medium + 10% humant serum från AB plasma (SAB), filtrera det (0,22 µm filter) och Värm till 37 ° C (kallad makrofag medium + 10% SAB nedan).
- Förbereda sortering bufferten [1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) + 0,5% bovint serumalbumin (BSA) + 2 mM etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA)], filtrera det (0,22 µm filter) och behålla den vid 4 ° C.
2. isolering av perifera mononukleära blodceller (PBMC) från Leukoreduction System kammare (LRSC)
- Satte 15 mL täthet lutning cell separation lösning (se Tabell för material) i en 50 mL tub centrifugering så det kan värmas till rumstemperatur (RT) innan du får LRSC.
Obs: Densitet beror på temperaturen. Eftersom denna produkt lagras vid 4 ° C, måste detta steg göras i förväg så det kan temperera vid RT. - Töm LRSC i en 50 mL centrifugering tub, lägga till upp till 50 mL 1 x PBS och blanda. Mycket långsamt, tillsätt 25 mL av den mix som förbereddes under steg 2.2 ovanpå 15 mL täthet lutning lösning värmts upp under steg 2.1.
Obs: Var noga med att inte blanda faserna under detta steg. Blodet måste läggas på täthet lutning lösningen utan störningar i denna fas. - Centrifugera båda centrifugering rör för 25 min på 700 x g utan pauser.
Anmärkning: I slutet av den täthet lutning centrifugeringen, lagren från botten till toppen är: de erytrocyter och granulocyter bildar den pellet, täthet lutning lösning fas, lager av PBMC och plasma. - Med en Pipettera, passera fasen plasma utan aspirera det och samla PBMC lagret i en ny 50 mL centrifugering tub. Lägga till upp till 50 mL 1 x PBS i PBMC som tvätt steg och Centrifugera i 10 min vid 300 x g.
- Aspirera supernatanten och återsuspendera pelleten i 40 mL makrofag medium.
3. magnetisk märkning och isolering av CD14+ celler (monocyter)
- Räkna PBMC i en Malassez kammare. Dra upp mängden PBMC nödvändiga för att genomföra experimentet (vanligtvis 100 till 300 x 106 celler), placera dem i en centrifugering rör och Centrifugera i 10 min vid 300 x g.
- Aspirera supernatanten och återsuspendera pelleten i 80 µL av sortering bufferten förbereddes under steg 1,3 per 107 PBMC. Lägg 20 µL av CD14 mikrokulor per 107 PBMC. Mix väl och inkubera i 15 minuter vid 4 ° C under ständig agitation.
- Tillsätt 1 mL sortering buffert per 107 PBMC som en tvätt steg och Centrifugera i 10 min vid 300 x g. Aspirera supernatanten och återsuspendera pelleten i 500 µL av sortering buffert per 108 PBMC.
- Placera en kolumn i det magnetiska fältet i separatorn. Förbereda kolumnen genom att skölja det med 3 mL sortering buffert.
- Tillämpa cellsuspension på kolumnen. Kolumnen beror på antalet celler isoleras (här, LS kolumner för upp till 109 PBMC används). Samla genomflöde innehållande omärkt celler.
Obs: Starta vid detta steg, förvaras alla rören (negativa och positiva val) för senare kontroll av de olika stegen av flödescytometri. - Tvätta kolonnen med 3 x 3 mL sortering buffert. Samla omärkt celler passerar genom samma rör från steg 3.12. Utför tvätt steg genom att lägga till sortering buffert, vara noga med att inte torka din kolumn. Placera en samling röret under kolumnen och flytta den från separatorn.
- Pipettera 5 mL sortering buffert i kolumnen. Spola omedelbart ut magnetiskt märkt cellerna av fast kolven in i kolonnen. Att öka renheten av CD14+ celler, den eluerade fraktionen är berikad över en andra kolumn.
- Upprepa steg 3,4 till 3,7 med en ny kolumn.
4. plätering av monocyter
- Räkna av monocyter i en Malassez kammare. Kontrollera CD14 renhet+ celler av flödescytometri. Dra tillbaka beloppet av monocyter nödvändigt för experimentet och placera dem i en centrifugering tub.
- Centrifugera i 10 min vid 300 x g. Aspirera supernatanten och återsuspendera pelleten monocyt i makrofag medium. Platta celler och låta dem bosätta sig för 50 min till 1 h. aspirera på medellång och ersätta det med makrofag medium + 10% SAB + 25 ng/mL makrofag koloni stimulerande faktor (M-CSF) för att inducera differentiering.
5. polarisering av makrofager på dag 6
- Aspirera medium. Ersätta det med makrofag medium + 10% SAB med olika stimuli. Exempelvis lägga till 10 ng/mL interferon gamma (INFγ) + 1 ng/mL lipopolysackarid (LPS) att få M1 polarisering, eller 20 ng/mL interleukin 4 (IL4) + 20 ng/mL interleukin 13 (IL13) för M2 polarisering.
Obs: Stimulering kan utföras mellan 24 och 48 timmar innan du fortsätter till andra tester. - Skörda celler med hjälp av en detaching lösning eller en cell skrapa.
6. cellkultur låg syrehalt villkor
- Start från steg 4, upprätthålla monocyter och sedan makrofager i en syre-kontrollerad miljö att utföra hypoxisk skick analys. Använd en hypoxi arbetsplats för att upprätthålla celler under önskad syre partialtrycket under experimentet.
Obs: När du arbetar under låg syrehalt tryck, det är viktigt att förbereda alla media och tvätt buffertar under postera och vänta tillräckligt att få det rätta partialtrycket i vätskan. 10 mL PBS i en 60 mm petriskål kräver till exempel ungefär 2 h att nå 25 mmHg för O2 partiella tryck start från atmosfäriskt tryck (som vi har mätt det använder en fiberoptisk syresensor). I många hypoxisk stationer eller inkubatorer anges syre trycket som en procentandel av det atmosfäriska trycket. Om exakta mätningar är nödvändiga, är det bättre att använda en station bemyndigande att direkt ställa in syre trycket i mmHg.
7. Lys och i-Gel matsmältningen (protokoll 1)
Obs: I detta och följande avsnitt beskrivs två protokoll som används för att erhålla peptider och utföra LC-MS/MS-analys. Protokoll 1 beskriver cell lysis och i-gel fraktionering och matsmältning samt protokoll 2 i-lösning cellys följt av i-lösning matsmältningen och fraktionering med hjälp av isoelektrisk fokusering metod.
- Utföra cellys i Laemmli buffert [234 mM Tris-HCL (pH 6,8), 7,5% SDS, 37% glycerol, 33,3% (v/v) β-merkaptoetanol, bromofenolblått 0,2% w/v]. Ladda protein motsvarar 300.000 celler för varje prov på 4-12% bis-Tris akrylamid geler.
- Styra varaktighet elektroforesiska migrationen att tillåta varje protein prov fördelas på 6 gel band som exemplifieras i figur 3.
- Tillsätt färglösningen (R-250 Coomassie blå för 45 min), sedan fixa gelen med en fastställande lösning (30% etanol + 7,5% ättiksyra för 20 min). Lägg till den destaining lösningen (30% etanol + 7,5% ättiksyra tills band visas) innan excising banden protein med en ren skalpell.
- Tärna varje exciderad band före införandet i 500 µL rör. En ren glasytan är befogad för att undvika kontaminering med keratins (5% SDS lösning i avjoniserat vatten kan användas för att rengöra ytor).
- Tvätta gel skivor 3 gånger i 200 µL hjorthornssalt 25 mM under 20 minuter vid 37 ° C, följt av en tvätt i 25 mM hjorthornssalt och acetonitril (50% v/v). Torka gel bitar med 200 µL 100% acetonitril i 10 min.
- Inkubera varje gel bit med 10 mM DTT (Ditiotreitol) i 25 mM hjorthornssalt för 45 min vid 56 ° C (200 µL), följt av 55 mM iodoacetamide i 25 mM ammoniumbikarbonat (200 µL) för 35 min i mörker vid RT.
- Att stoppa alkylering, inkubera varje gel bit med 200 µL 10 mm DTT i 25 mM hjorthornssalt i 10 min på RT. Wash gel bitar i 200 µL av 25 mM hjorthornssalt och sedan torka med 200 µL 100% acetonitril i 10 min.
- Smälta proteiner över natten vid 37 ° C med Trypsin/Lys-C blandning enligt tillverkarens anvisningar.
- Extrahera de resulterande peptiderna från gel bitar genom att lägga till 50 μL 50% acetonitril i 15 min, sedan 50 μL av 5% myrsyra för 15 min, och slutligen 50 μL 100% acetonitril för 15 min. Pool och torr respektive fraktion i låg-adsorptionsrör att begränsa adsorption av peptider och prov förlust. Lagra proverna vid-80 ° C tills vidare analys.
8. protein utvinning och i-lösning matsmältning (protokoll 2)
- Utföra cellys (2 x 106 celler) med 150 µL av den följande lyseringsbuffert:
- 7 M urea, 2 M tiourea, 40 mM Tris och 4% käkar, kompletterad med proteashämmare (komplett mini, EDTA-fria proteashämmare cocktail).
- Homogenisera lösningar för 30 min vid RT med en thermoshaker. Centrifugera vid 13.800 x g i 20 min RT och hålla supernatanten.
- Avlägsna föroreningar med en 2D sanering-kit:
- Satsen innehåller fällningsmedel lösning, Co precipitant lösning, tvättbuffert och tvätta additiv.
- Tillsätt 300 µL fällningsmedel lösning och blanda väl. Inkubera i ice för 15 min. Tillsätt 300 µL samtidig precipitant lösning. Centrifugera rören (minst) 12 000 x g i 5 min. En liten pellet ska synas. Vidare snabbt till nästa steg för att undvika resuspension eller dispersion av pelleten. Ta bort supernatanten utan att störa pelleten.
- Centrifugera rören igen med cap-gångjärn och pellet utåt för att få eventuella kvarvarande vätska till botten av röret. En kort puls räcker. Det bör ingen synlig vätska kvar i rören.
- Utan att störa pelleten, tillsätt 40 µL av samtidig precipitant lösning. Låt röret sitta på is för 5 min. Centrifugera under 5 minuter, ta sedan bort och ignorera tvätten. Tillsätt 25 µL avjoniserat vatten. Vortex varje tube för 5-10 s. Pelleten bör skingra men inte löser sig i vattnet.
- Tillsätt 1 mL av tvättbuffert (pre kyld för minst 1 h vid-20 ° C) och 5 µL av tvätt tillsats. Vortex tills pelleten är fullt utspridd. Inkubera rören vid-20 ° C i minst 30 min. Vortex för 20-30 s varje 10 min
Obs: Rören kan förvaras vid-20 ° C i upp till 1 vecka med minimal proteinnedbrytning eller modifiering. - Centrifugera rören (minst) 12 000 × g för 5 min. Ta försiktigt bort och Kassera supernatanten. En vit pellet ska synas. Låt pelleten till airdry för mer än 5 min (om det är alltför torr, blir det svårt att resuspendera pelleten).
- Återsuspendera pelleten protein i 300 µL av 8 M urea och 0,1 M hjorthornssalt. Vortex starkt för 1 min. bestämma proteinkoncentration med en kolorimetrisk test.
9. i-lösning matsmältningen (protokoll 2)
- Minska disulfidbryggor genom att lägga till 5,1 µL av en 700 mM DTT vattenlösning (slutlig koncentration 12,5 mM) till de återsuspenderade proteinerna från steg 8,4 och inkubera vid 37 ° C i 30 min med en thermoshaker. Alkylatbensin cystein rester genom att lägga till 20,3 µL av en 700 mM iodoacetamide vattenlösning (slutlig koncentration 40 mM) och inkubation vid 25° C i 30 min i mörker med en thermoshaker.
- Tillsätt 990 µL 0,1 M hjorthornssalt i provet. Tillsätt en motsvarande volym av Trypsin/Lys-C mix (enzym: substrat baserat på 1: 100 w/w). Inkubera vid 37° C över natten med en thermoshaker.
10. sanering patron (protokoll 2)
- Blöt en patron med 1 kolumn-volym (1 mL) av metanol. Rengöra patronen med 1 kolumn-volym (1 mL) av 80% acetonitril/HPLC-kvalitet vatten och kassera genomflöde. Temperera patronen med 4 kolumn-volymer (4 mL) 0,1% myrsyra/HPLC-kvalitet vatten och kassera genomflöde.
- Gör filtratet surt prover med 90 µL 10% myrsyra eller vatten till pH 2-3 (kontrollera pH-värdet med en pH-indikator). Ladda de försurade proverna och samla genomflöde. Ladda den genomströmmande (innehållande de inte-behöll peptiderna). Tvätta patronen med 6 kolumn-volym (6 mL) 0,1% myrsyra/HPLC-kvalitet vatten.
- Eluera peptider från patronen med 1 kolumn-volymer (1 mL) 0,1% myrsyra acid/50% acetonitril/HPLC-kvalitet vatten. Överföra till ett 1,5 mL mikrocentrifug rör. Koncentrera sig provet med en vakuum koncentrator (150 x g, vakuum vid 160 mBar).
11. fraktionering genom isoelektrisk fokusering (protokoll 2)
Obs: Peptider är skilda enligt deras isoelektriska punkter med en off-gel naftafraktioneringskolonn på en 13 cm bandtäckningar en pH varierar från 3 till 10. Vi använde följande protokoll tillhandahålls av leverantören (sammanfattas nedan):
- Förbered följande lösningar: lösning en (600 µL av glycerol lösning, 60 µL av OFFGEL buffert, 4.34 mL ultrarent vatten) och lösning B (1.776 mL av lösning A) och 444 µL av ultrarent vatten.
- Montera den IPG remsor, ramar och elektroder enligt tillverkarens anvisningar.
- Återsuspendera provet med 1,8 mL lösning B. lägga 40 µL av lösning B i varje brunn. Läsa in 150 µL prov i varje brunn.
- Välj standardmetod för peptider: OG12PE00 (OFFGEL standardmetoden för peptider för användning med ett 3100 OFFGEL Low Res Kit, pH 3-10, 12-väl ramar. Vänta tills denna metod har varit ifyllda (~ 20 h). Samla fraktionerna i korrekt märkta rör.
12. ren-upp Harvard apparater kolumn omvänd C18 Post-IEF (protokoll 2)
- Gradvis tillsätt några μL i en tid av 1% transfettsyror i avjoniserat vatten till varje fraktion till syrsätt provet. Kontrollera med hjälp av pH-papper som pH är om 3 eller lägre.
- Förbered följande lösningar: lösning 1 (5 mL acetonitril, 10 µL av myrsyra, 4,99 mL ultrarent vatten) och lösning 2 (0,5 mL acetonitril, 10 µL av myrsyra, 9.49 mL ultrarent vatten).
- Pre våt kolumnen spin med 150 µL av lösning 1. Centrifugera i 90 s vid 750 x g och kassera genomflöde. Tvätta den spin kolumnen med 150 μL av lösning 2. Centrifugera i 90 s vid 750 x g och kassera genomflöde.
- Passera fraktionen genom kolonnen. Centrifugera i 90 s vid 750 x g och kassera genomflöde. Tvätta med 150 μL av lösning 2. Centrifugera i 90 s vid 750 x g och kassera genomflöde.
- Eluera andelen med 50 μl lösning 1. Centrifugera i 90 s vid 750 x g. Upprepa stegen en gång till.
- Torr-fraktionen med en vakuum koncentrator (150 x g, vakuum 160 mBar) och förvaras vid-80 ° C
13. analys av proteomiska Data och bioinformatik18
- Analysera data som erhållits genom en nano-LC-MS/MS mass spectrometer använda kvantifiering programvara såsom MaxQuant (version 1.5.2.8) och Andromeda sökmotorn.
- Ange false discovery (FDR) till 1% för både proteiner och peptider och en minsta längd på 7 aminosyror. Ange enzym specificitet som C-terminal till Arg och Lys. Tillåta 2 missade Klyvningar proline obligationer. Välj carbamidomethylation av cystein som en fast modifiering och N-terminala protein acetylering och metionin oxidation som variabel modifieringar.
- Ytterligare analysera data med statistisk analysprogramvara. Utföra en funktionell anrikning analys använder FunRich programvara (www.funrich.org/). Utföra en gen ontologi anrikning analys med DAVID programvara (https://david.ncifcrf.gov/).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Start från perifera mononukleära blodceller (PBMC) erhålls genom differential centrifugering, protokollet medger erhållande av en befolkning på CD14+ monocyter med en bedömd renhetsgrad av mer än 98% av flödescytometri (figur 1). Dessa monocyter särskiljs sekundärt mot olika polarizations (figur 2). När en fraktionering på gel är valt, migreringen på SDS-page geler är anpassad att erhålla antalet önskat band och band är censurerade (figur 3). Matsmältningen är sekundärt utförs i banden exciderad gel, sedan peptiderna utvinns. Peptiderna analyseras med en nano-LC (vätskekromatografi)-MS/MS mass spectrometer. MS/MS spectra ge identiteten hos olika proteiner enligt annotering av spectra erhålls för kända peptider (figur 4A). Kvantifiering av överflödet av ett protein beräknas sedan i samband med mängden identifierade peptider från proteinet använda publicerade programvara och databaser15,16. Detta protokoll med i-gel matsmältningen ger cirka 4000 identifierade proteiner, och det dynamiska omfånget har befunnits täcka 5 logaritmisk skala enheter (figur 4B). Analys av differentiell uttrycket av dessa identifierade proteiner kan användas för att bestämma den klustring av olika polarizations under olika syre miljöer.
Med den här metoden kan vi också identifiera kluster av proteiner som är uppreglerat när de utsätts för en låg syrekoncentration 3 procent (figur 5, tabell 1). För att bedöma effektiviteten i matsmältningen, vilket är inte möjligt när en i-gel-protokoll används, föreslog vi en i-lösning matsmältningen metod som anpassats till mänskliga makrofager (figur 6A). Med den här metoden kan vi enkelt få (efter in-lösning matsmältningen) identifiering av 3600 proteiner utan fraktionering, vilket innebär att fraktionering med IEF kommer förnuftigt öka antalet (figur 6B).
Figur 1: Flow flödescytometri analys av CD14 uttryck av PBMC före sortering (till vänster) och efter sortering (höger panel) visar erhållna renhet efter magnetiska pärlor urval. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: faskontrast bilder av differentierade mänskliga makrofager visar heterogeniteten i de erhållna morfologier för två olika polarisationer. Skalstapeln representerar 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3: avbildning av Coomassie blå färgade gel visar de olika banden som kommer att vara censurerade [här, 6 band i M(Ø) makrofager] för 5 polarizations av makrofager som utsätts för en miljö med låg syrehalt. IC = immunkomplex, DXM = dexametason. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: MS/MS spektrum och kvantifiering. (A) ett exempel på en MS/MS-spektrum. Här visas CID (kollision-inducerad dissociation) spectrumen av en peptid som finns på m/z 597.29 på MS spektrumet med en elektrisk laddning av + 2. Den motsvarande sekvensen bestämdes från detta spektrum som Val-Ala-Glu-Leu-Glu-Asn-Ser-Glu-Phe-Arg från proteinet CD58. (B) rank beställde etikett-fri kvantifiering för var och en av de identifiera proteiner (log10 LFQ). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Heat map som representerar den hierarkisk klustring av alla polarisering stater använder Differentiellt uttryckta proteiner. Analysen avslöjar ett kluster av proteiner i ökad utsträckning hos alla polarisationer i 3% O2 skick (röda rektangeln). Färgskalan motsvarar z-score (log2 intensitet). Varje rad är ett protein och varje kolumn är ett exempel. Denna siffra som härstammar från en tidigare publikation14. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: SDS-PAGE och kromatogram. (A) silver-färgade SDS-PAGE geler med protein från cell lysis och efter in-lösning matsmältningen visar avsaknad av nedbrytning under Lys och effektiviteten i matsmältningen. (B) kromatogram erhålls från efter in-lösning matsmältningen utan fraktionering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Kluster | proteinID | Protein namn | Gen namn | Peptider | Razor + unika peptider | Unika peptider | Protein-ID | ||
| Röd | P0DMV9 | Värme chock 70 kDa protein 1B | HSPA1A | 40 | 37 | 4 | P0DMV9; P0DMV8; A8K5I0; Q59EJ3; B4DNT8; B4DWK5; B4DFN9; B4DI39; B4E1S9; B4DVU9; V9GZ37; B3KTT5; B4DNX1; B4E1T6; B4DNV4; Q9UQC1 | ||
| Röd | P54709 | Natrium/kalium-transport ATPas subenhet beta-3 | ATP1B3 | 8 | 8 | 8 | P54709; D3DNF9; C9JXZ1; C9JA36; H7C547; F8WBY4; Q58I18 | ||
| Röd | O00462 | Beta-mannosidase | MANBA | 14 | 13 | 13 | O00462; A7LFP5; A8K6D3; E9PFW2; B4DT18; Q59EG5 | ||
| Röd | Q8NAS7 | NADH dehydrogenas [ubikinon] järn-svavel protein 7, mitokondriell | NDUFS7 | 4 | 4 | 4 | Q8NAS7; Q6ZQU6; F5H5N1; B7Z1U1; A8K0V6; Q7LD69; F5GXJ1; O75251; B7Z4P1; Q9H3K5; A0A087WXF6; A0A087WTI3; Q6ZS38 | ||
| Röd | Q8WWQ0 | PH-interagera protein | PHIP | 5 | 5 | 4 | Q8WWQ0; Q9NWP3 | ||
| Röd | E5RHK8 | Dynamin-3 | DNM3 | 11 | 2 | 2 | E5RHK8; Q9UQ16; B3KPF2; E5RIK2 | ||
| Röd | A0A024QZ64 | Fruktos-bisphosphate aldolase C | ALDOC | 18 | 14 | 7 | A0A024QZ64; P09972; B7Z1Y2; B7Z3K9; B7Z1N6; B7Z3K7; A8MVZ9; J3KSV6; J3QKP5; B7Z1L5; C9J8F3; K7EKH5; J3QKK1; B7Z1H6 | ||
| Röd | O75489 | NADH dehydrogenas [ubikinon] järn-svavel protein 3, mitokondriell | NDUFS3 | 12 | 12 | 12 | O75489; Q9UF24; Q53FM7; E9PS48; E9PKL8; G3V194 | ||
| Röd | P21912 | Succinat dehydrogenas [ubikinon] järn-svavel subenhet, mitokondriell | SDHB | 11 | 11 | 11 | P21912; A0A087WXX8; A0A087WWT1 | ||
| Röd | A0A024R1Y7 | GH3 domän-innehållande protein | LGP1; GHDC | 7 | 7 | 7 | A0A024R1Y7; Q8N2G8; B3KVB0; K7ESN3; K7EJT7; K7EQ41; K7EL54 | ||
| Röd | E5KRK5 | NADH-ubikinon mitokondriskt 75 kDa subenhet, mitokondriell | NDUFS1 | 29 | 29 | 29 | E5KRK5; P28331; B4DJ81; Q9P1A0; C9JPQ5; F8WDL5 | ||
| Röd | A0A024QZ30 | Succinat dehydrogenas [ubikinon] flavoprotein subenhet, mitokondriell | SDHA | 17 | 17 | 17 | A0A024QZ30; P31040; D6RFM5; B3KT34; A0A087X1I3; Q0QF12; B4DYN5; B3KYA5; B4DNB2; H0Y8X1; B7Z6J5 | ||
| Röd | A0A024R2F9 | Transmembrane protein 43 | TMEM43 | 16 | 16 | 16 | A0A024R2F9; Q9BTV4; Q8TEP9; V9GY05 | ||
| Röd | A0A024R5K3 | NADH dehydrogenas [ubikinon] järn-svavel protein 8, mitokondriell | NDUFS8 | 5 | 5 | 5 | A0A024R5K3; E9PPW7; O00217; E9PN51; F8W9K7; E9PKH6; B4DYI3; Q53G17 | ||
| Röd | O76003 | Glutaredoxin-3 | GLRX3 | 13 | 13 | 13 | O76003 | ||
| Röd | Q1HBJ4 | Mitogen-aktiverat proteinkinas; Mitogen-aktiverat proteinkinas 1 | MAPK1 | 26 | 26 | 21 | Q1HBJ4; P28482; B4DHN0; Q499G7; K7ELV1; K7EN18; B4E104; P31152; Q16659 | ||
| Röd | Q13151 | Heterogena nukleära ribonukleoprotein A0 | HNRNPA0 | 8 | 8 | 8 | Q13151 | ||
| Röd | V9HWN7 | Fruktos-bisphosphate aldolase A | ALDOA | 36 | 36 | 14 | V9HWN7; P04075; J3KPS3; H3BQN4; H3BUH7; H3BR04; H3BMQ8; H3BU78; H3BR68; A4UCS9; A4UCT0 | ||
| Röd | B4DVJ0 | Glukos-6-fosfat isomerase | GPI | 32 | 32 | 23 | B4DVJ0; P06744; B4DE36; A0A0A0MTS2; K7EQ48; K7EP41; K7EPY4; K7ELR7; K7ERC6; K7ENA0; K7ESF4; K7EIL4; K7ERK8; Q59F85 | ||
| Röd | V9HWB9 | L-laktatdehydrogenas; L-laktatdehydrogenas en kedja | LDHA | 36 | 36 | 34 | V9HWB9; P00338; B4DJI1; F5GXY2; F5GYU2; F5GXH2; F5H5J4; F5H6W8; F5GZQ4; F5H8H6; F5GXC7; F5GWW2; F5GXU1; A0A087WUM2; Q96L19; Q6ZMR3 | ||
| Röd | P13674 | Prolyl 4-hydroxylas subenhet alfa-1 | P4HA1 | 26 | 26 | 26 | P13674; Q5VSQ6 | ||
| Röd | Q6FHV6 | Gamma-enolase; Enolase | ENO2 | 18 | 15 | 14 | Q6FHV6; P09104; A8K3B0; F5H0C8; F5H1C3; U3KQP4; U3KQQ1; Q9NPL4 | ||
| Röd | Q99798 | Aconitate hydratase, mitokondriell | ACO2 | 40 | 40 | 40 | Q99798; B4DZ08; B2RBW5; A2A274; B4DJW1; B4DLY4; Q71UF1; B4DEC3; B4DW08; O75944 | ||
| Röd | P17858 | ATP-beroende 6-phosphofructokinase, lever typ | PFKL | 32 | 29 | 28 | P17858; Q7L2M7; Q9BSP4; B3KNQ7; B4E108; Q59GI2; F8WEU2; Q7Z3R9; Q6MZK4 | ||
| Röd | A0A024R872 | Niban-liknande protein 1 | FAM129B | 32 | 32 | 32 | A0A024R872; Q96TA1; Q9H8K1; Q2YD88; Q9H6L6 | ||
| Röd | A0A024RC61 | Aminopeptidase N | ANPEP | 58 | 58 | 25 | A0A024RC61; P15144; Q59E93; B4DV63; B4DP01; B4DP96; H0YKT6; H0YLZ8; Q71E46; H0YMC1; Q8IVL7 | ||
| Röd | V9HWF4 | Phosphoglycerate kinase; Phosphoglycerate kinase 1 | PGK1 | 41 | 41 | 35 | V9HWF4; P00558; B4E1H9; B4DHM5; B4DHB3; B4DWQ3; Q16444 | ||
| Röd | Q12882 | Dihydropyrimidindehydrogenas [NADP(+)] | DPYD | 44 | 44 | 44 | Q12882; B4DML1 | ||
| Röd | B4DEQ0 | Electron överföring flavoprotein-ubikinon mitokondriskt, mitokondriell | ETFDH | 9 | 9 | 9 | B4DEQ0; Q547S8; A7UNU5; Q16134; D6RAD5 | ||
| Röd | D9UAX9 | MHC klass I antigen | HLA-B | 13 | 3 | 2 | D9UAX9 | ||
| Röd | V9HWK1 | Triosephosphate isomerase | TPI1 | 29 | 29 | 17 | V9HWK1; P60174; Q53HE2; B4DUI5; U3KPZ0; U3KQF3; U3KPS5 | ||
| Röd | Q96HE7 | ERO1-liknande protein alpha | ERO1L | 28 | 28 | 28 | Q96HE7; G3V3E6; G3V5B3; G3V2H0; G3V503; Q5TAE8; B2RD00; Q86YB8 | ||
| Röd | P14868 | Aspartat--tRNA ligase, cytoplasmiska | DARS | 29 | 29 | 2 | P14868; Q53T60; Q53R85; H7BZ35; H7C278 | ||
| Röd | P36871 | Phosphoglucomutase-1 | PGM1 | 24 | 24 | 5 | P36871; B4DFP1; Q9H1D2 | ||
Tabell 1: Lista över uttryckta proteiner för mänskliga makrofager gemensamma för varje polarisering under låg syre spänning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eftersom proteomik är ett kraftfullt verktyg att studera uttrycket av olika proteiner från en hel cell eller subcellulär fack, har optimering av protokollet cell lysis och nedbrytning av proteiner tagits upp av ett antal studier. Det finns tre klasser av metoder, bland annat i-gel matsmältningen (matsmältningen av proteiner i polyakrylamid gelmatrisen)17, matsmältningen i lösning18 och filter-aided prov förberedelse19. Denna sista metod, först beskrivs som universal, har rapporterats att uppvisa låg reproducerbarhet och eventuell förlust av proteiner på filtret20. I-gel matsmältning är en robust metod som kan vara tidskrävande och missgynna däri att bedöma effektiviteten i matsmältningen inte är lätt, om möjligt. I-lösning matsmältningen erbjuder denna möjlighet men kräver rengöring av prover efter matsmältningen och IEF. När dessa två metoder jämförs mellan samma prov, ger i-lösning matsmältningen med IEF fraktionering protokollet ett högre antal identifierade proteiner (med samma antal fraktioner) än i-gel matsmältningen21.
Trots denna fördel är det nödvändigt att överväga möjliga protein nedbrytningen under in-lösning Lys på grund av intracellulära proteaser (särskilt i myeloida celler). Det är också viktigt att komma ihåg att dessa tekniker baseras på protein matsmältningen och endast kunna analysera proteiner presentera trypsin specifika klyvning platser. Det är möjligt att använda en uppifrån proteomiska tillvägagångssätt som lindrar detta matsmältningen tvång men tillägger data analys steg och bioinformatik ressources22. Lösbarhet av proteiner från olika cellulära fack kan också vara svårt att få, speciellt från plasma membran, vilket leder till en okontrollerad provtagning av cellulära proteomet. För att gå vidare med en nano-LC-MS/MS masspektrometer analys av proverna, är det viktigt att få en tillräcklig mängd peptider, vilket kan bero på den masspektrometer som används (vanligtvis börjar totalt protein bör vara minst 1 µg för ett tillstånd, och det antyds för att öka denna kvantitet enligt antalet bråk som används med IEF). Denna begränsning kan vara en nackdel om cell befolkningen som studeras är knappa, vilket skiljer proteomiska från genomiska tekniker där amplifiering av råvara är möjligt.
Även efter nyskapande verk rikare och kollegor23 och Packer och Fuehr24, har vikten av syre i cellodlingar erkänts otillräckligt. Vi vet nu att odla cellerna under låga syrehalter gynnar vidhäftning, livslängd och division. Det är erkänt att detta är av yttersta vikt i stamceller forskning25. Den viktigaste tekniska frågan för cellodlingar under kontrollerade Syreförhållandena är relaterad till underhåll av önskad syrekoncentrationen under hela experimentet. Detta kräver före inkubering av alla medier för att förhindra utsläpp av upplöst syre och användning av hypoxisk arbetsplatser tillåter manipulering av celler under låg syrehalt (bearbetning kammare med handskfacket) och förhindra övergående exposition till hög syreförhållanden .
Protokollet beskrivs användes för att få de molekylära signaturerna av olika polarizations av mänskliga monocyt-derived makrofager och studera effekterna av syre modulering på dessa signaturer. Denna studie har gett insikt om beskrivningen av dessa polarizations och har avslöjat vissa funktionella konsekvenser. Vi hittade till exempel att många proteiner involverade i efferocytosis var moduleras av en miljö med låg syrehalt. Detta proteomiska tillvägagångssätt, baserat på protokollet beskrivs, presenterar möjlighet att utforska hur miljöparametrar ändra makrofag funktioner och hur dessa signaler kan användas för att designa nya behandlingsmetoder14.
Det proteomiska tillvägagångssätt som beskrivs i detta arbete är ett komplement till genomisk tillvägagångssätt som har använts under senare år i området mänskliga makrofag polarisering studier. Proteomik erbjuder fördelen av protein kvantifiering, som kan presentera ett annat uttryck än sin motsvarande mRNA på grund av post-translationella modifieringar och leda till upptäckten av nya biomarkörer. Trots denna fördel är proteomiska data ofta svåra att tolka, delvis på grund av hög känslighet för masspektrometri, vilket leder till mycket komplexa MS spectra och falskt positiva upptäcka peptider. Nyligen, analysprogram vunnit effektivitet för att förhindra detta. Även om det är en föränderlig situation, proteomik också vetter mot lägre reproducerbarhet än genomik26 och associeras med validering steg använder andra tekniker (flödescytometri, immunoblotting) för att bekräfta kvantitativa ändringar av protein uttrycksnivåerna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
AM finansieras av programmet ung grupp ledare (ATIP/Avenir Inserm-CNRS), av la Ligue Nationale contre le Cancer och la Fondation ARC pour la recherche sur le Cancer. Vi tackar Mariette Matondo från den Mass Spectrometry för biologi plattform (UTECHS MSBIO, Pasteurinstitutet, Paris). Vi tackar Lauren Anderson för hennes läsning av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hypoxia Working Station | Oxford Optronix | Hypoxylab | |
| C6 Flow cytometer | BD | Accuri C6 | |
| Urea | Agilent Technologies | 5188-6435 | |
| Formic acid (FA) | ARISTAR | 450122M | |
| R-250 Coomassie blue | Biorad | 1,610,436 | |
| Lipopolysaccharide, E.Coli (LPS) | Calbiochem | 437627 | |
| 2D clean-up kit | GE Healthcare | 80-6484-51 | |
| RPMI 1640 medium, glutamax supplement | Gibco | 61870044 | |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-080 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) Solution 100X | Gibco | 11140-035 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) 1X | Gibco | 14190-094 | |
| Harvard Apparatus column Reverse C18 micro spin column | Harvard Apparatus | 74-4601 | |
| EDTA 0.5 M, pH 8.0 | Invitrogen | AM9260G | |
| NuPAGE Bis-Tris 4-12% | Life Technologies SAS | NP0321 BOX | |
| CD14 Microbeads human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
| MACS separation column LS | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) | Miltenyi Biotec | 130-096-485 | |
| Interleukin 4 (IL4) | Miltenyi Biotec | 130-093-917 | |
| Interleukin 13 (IL13) | Miltenyi Biotec | 130-112-410 | |
| Interferon gamma (INFγ) | Miltenyi Biotec | 130-096-482 | |
| CD14-FITC (clone TÜK4) | Miltenyi Biotec | 130-080-701 | |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| Trifluoroacetic Acid (TFA) | Pierce | 28904 | |
| Trypsin/Lys-C Mix | PROMEGA | V5073 | |
| Complete Mini, EDTA-free Protease Inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| Density Gradient Solution (Histopaque 1077) | Sigma Aldrich | 10771-100ML | |
| Accumax | Sigma Aldrich | A7089-100ML | |
| Human Serum from human male AB plasma (SAB) | Sigma Aldrich | H4522-100ML | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) solution 30% | Sigma Aldrich | A9576-50ML | |
| Trisma-base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | 49767 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Bromophenol blue | Sigma Aldrich | 114405 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) 20% | Sigma Aldrich | 5030 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 9830 | |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34888 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 43819 | |
| Iodoacetamide | Sigma Aldrich | 57670 | |
| Thiourea | Sigma Aldrich | T8656 | |
| CHAPS | Sigma Aldrich | C9426 | |
| Micro BCA Assay Kit | ThermoFisher | 23235 | |
| 5 mL sterile plastic pipette | VWR | 612-1685 | |
| Thermomixer C Eppendorf | VWR | 460-0223 | |
| Sep-Pak tC18 reverse phase cartridges, 100 mg | Waters | WAT036820 |
References
- Okabe, Y., Medzhitov, R. Tissue biology perspective on macrophages. Nature Immunology. 17 (1), 9-17 (2016).
- Sica, A., Mantovani, A. Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas. The Journal of Clinical Investigation. 122 (3), 787-795 (2012).
- Murray, P. J.
- Chinetti-Gbaguidi, G., Staels, B. Macrophage polarization in metabolic disorders: functions and regulation. Current Opinion in Lipidology. 22 (5), 365-372 (2011).
- Chow, A., Brown, B. D., Merad, M. Studying the mononuclear phagocyte system in the molecular age. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 788-798 (2011).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).
- Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).
- Xue, J., et al. Transcriptome-based network analysis reveals a spectrum model of human macrophage activation. Immunity. 40 (2), 274-288 (2014).
- Csete, M.
- Johansson, A., et al. Functional, morphological, and phenotypical differences between rat alveolar and interstitial macrophages. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 16 (5), 582-588 (1997).
- Pfau, J. C., Schneider, J. C., Archer, A. J., Sentissi, J., Leyva, F. J., Cramton, J. Environmental oxygen tension affects phenotype in cultured bone marrow-derived macrophages. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 286 (2), L354-L362 (2004).
- Grodzki, A. C. G., Giulivi, C., Lein, P. J. Oxygen tension modulates differentiation and primary macrophage functions in the human monocytic THP-1 cell line. PLoS One. 8 (1), e54926 (2013).
- Court, M., Petre, G., Atifi, M. E., Millet, A. Proteomic Signature Reveals Modulation of Human Macrophage Polarization and Functions Under Differing Environmental Oxygen Conditions. Molecular & Cellular Proteomics. 16 (12), 2153-2168 (2017).
- Cox, J., et al. Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).
- Cox, J., Neuhauser, N., Michalski, A., Scheltema, R. A., Olsen, J. V., Mann, M. Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).
- Court, M., et al. Toward a standardized urine proteome analysis methodology. Proteomics. 11 (6), 1160-1171 (2011).
- Wiśniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).
- Liebler, D. C., Ham, A. -J. L. Spin filter-based sample preparation for shotgun proteomics. Nature Methods. 6 (11), 785-786 (2009).
- Hubner, N. C., Ren, S., Mann, M. Peptide separation with immobilized pI strips is an attractive alternative to in-gel protein digestion for proteome analysis. Proteomics. 8 (23-24), 4862-4872 (2008).
- Park, J., et al. Informed-Proteomics: open-source software package for top-down proteomics. Nature Methods. 14 (9), 909-914 (2017).
- Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. Influence of oxygen and culture media on plating efficiency of some mammalian tissue cells. Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).
- Packer, L., Fuehr, K. Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells. Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).
- Lengner, C. J., et al. Derivation of pre-X inactivation human embryonic stem cells under physiological oxygen concentrations. Cell. 141 (5), 872-883 (2010).
- Sidoli, S., Kulej, K., Garcia, B. A. Why proteomics is not the new genomics and the future of mass spectrometry in cell biology. Journal of Cell Biology. 216 (1), 21-24 (2017).
