Summary
Biz insan makrofajlar proteomik imzaları elde edilir ve bu düşük oksijen çevre makrofaj polarizasyon üzerindeki etkisinin belirlenmesi için geçerli bir iletişim kuralı mevcut.
Abstract
Makrofajlar doğuştan gelen bağışıklık hücreleri doku homeostazı için yanıt Bulaşıcı patojenler için arasında değişen fizyolojik fonksiyonları bir dizi yer vardır. Bu hücrelerin çeşitli işlevlerini etkinleştirme durumlarına hangi da polarizasyon denir ilişkilidir. Bu çeşitli kutuplaşmalar hassas moleküler açıklaması makrofaj biyoloji alanında bir önceliktir. Şu anda çok boyutlu bir yaklaşım nasıl polarizasyon çevre sinyalleri tarafından kontrol edilir açıklamak gerekli olduğunu kabul edilmektedir. Bu raporda, biz insan makrofajlar içinde çeşitli kutuplaşmalar proteomik imza elde etmek için tasarlanmış bir protokol tanımlamak. Bu iletişim kuralı etiket içermeyen bir miktar jel-şeker ve Lys C/tripsin-sindirmek hücresel lizis içerik elde makrofaj protein ifade temel alır. Biz de bağlı olarak çözüm sindirim ve isoelectric alternatif olarak kullanmak için ayırma odaklanan bir protokol sağlar. Oksijen konsantrasyonu dokularda ilgili bir çevre parametresi olduğundan, biz nasıl atmosferik kompozisyon keşfetmek için bu iletişim kuralını kullanmanız veya düşük oksijen ortamı makrofaj polarizasyon sınıflandırılması etkiler.
Introduction
Makrofajlar doğuştan gelen bağışıklık hücreleri apoptotik hücreler kaldırılması da dahil olmak üzere ve hücre dışı matriks1/ remodeling doku homeostazı için yanıt Bulaşıcı patojenler için arasında değişen fizyolojik fonksiyonları bir dizi yer vardır. Bu hücreler kutuplaşmalar olarak da adlandırılan bir birçok olası etkinleştirme devlet çevirir güçlü fenotipik plastisite2 ile karakterizedir. Bu çeşitli kutuplaşmalar hassas moleküler açıklaması makrofaj biyoloji3alanında bir önceliktir. Sözde M1/M2 ikilemi M1 pro-inflamatuar temsil eder ve anti-inflamatuar makrofajlar M2 temsil eder kullanarak bu kutuplaşmalar sınıflandırmak için önerilmiştir. Bu model de akut enfeksiyonlar, alerji ve obezite4gibi çeşitli patolojik durumlar sığar. Ancak, kronik iltihaplı doku ve kanser, o bu sınıflandırma makrofajlar belirli hücresel ortamlar5,6', mevcut geniş fenotipik repertuar kavramak değiştiremiyor gösterilmiştir 7. makrofaj kutuplaşma daha iyi belirli microenvironmental sinyalleri8entegre etmek için bir çok boyutlu modeli kullanarak açıklanan geçerli fikir birliği olduğunu. Bu sonuç insan makrofajlar M1/M2 model elde edilen kutuplaşmalar9tanımlamada yetersiz olduğunu gösteren transcriptomic analizi ile doğrulanmıştır.
Çalışma insan makrofajlar içinde çeşitli kutuplaşmalar proteomik imzalarını edinmek için bir protokol sağlar amaçlamaktadır sundu. Biz çeşitli oksijen düzeyleri ortamlarda insan makrofajlar ayırt etmek ve peptidler etiket içermeyen bir miktar gerçekleştirmek için tüm makrofaj Proteom elde etmek nasıl açıklar. Bu miktar çeşitli proteinlerin ifade düzeylerinin karşılaştırılması sağlar. Kök hücre araştırma bir çevre anahtar parametreyi10olarak oksijen önemini ortaya koyduğu gibi bu doku parametre insanlarda makrofaj polarizasyon etkisi nasıl anlamak arıyoruz. Oksijen kısmi basınç aralığı %3 20 (Toplam atmosferik basınç) % 20 kabaca ne genellikle (tam değer %18,6 su varlığı çekerken civarındadır bir hücre kültür kuluçka kullanılır için kaynakçalara insan vücudunda bulundu hesap).
Önceki çalışma alveoler fonksiyonel üzerinden interstisyel makrofajlar farklıdır ve morfolojik nokta sayısı11 ve bu farklılıkların muhtemelen kısmen maruz kalan12oldukları farklı oksijen seviyesi nedeniyle vardır göstermiştir. Ayrıca, kemik iliği türevi makrofajlar bir düşük oksijen çevre12' ye maruz kaldığında bakteri işbirliği için artan bir yetenek göstermek. Tam tersi bir etki için insan makrofajlar THP1 Ayrıştırılan13buldum, ama bu sonuçlar oksijen regülatörü makrofaj biyoloji olduğunu ve insan makrofajlar moleküler düzeyde bu rolü açıklamak için gerekli fikir destek. Bir önceki çalışmada, bu sorunlara yönelik olarak proteomik yaklaşım başvurdum. Aynı anda binlerce proteinler için ifade düzeylerini ölçme tarafından oksijen polarizasyon etkisi vurgulanır ve yeni moleküler işaretleyicilerin görünümünü bir liste sunuyoruz. Ayrıca bu bulgular bazı makrofajlar işlevlerine ilişkilendirmek başardık. Özellikle, fagositoz apoptotik hücre oranı ALOX15 upregulation için proteomik analizi14tarafından ortaya bağlı IL4/IL13-polarize makrofajlar içinde artış olmuştur bulduk. Bu da çalışmanın, biz böyle bir analiz gerçekleştirmek açıklar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
İnsan kanı örnekleri (LRSC) sağlıklı, de-tanımlanan bağışçılardan EFS (Fransız Ulusal kan servisi) protokolünün bir parçası olarak bir yetkili (CODECOH DC-2018-3114) elde edilmiştir. Bağış kan kullanım için imzalanmış izin verdi.
1. kitle iletişim araçları ve arabellek hazırlık
- Makrofaj orta [RPMI glutamax + 10 mM HEPES + 1 x esansiyel olmayan amino asitler (NEAA)] hazırlamak ve 37 ° c sıcak
- Hazırlamak makrofaj orta + AB plazma (SAB) üzerinden % 10 insan serumu (0,22 µm filtre) filtre sonra 37 ° C sıcak (sevk makrofaj orta + % 10 SAB bundan sonra).
- Sıralama arabellek [1 fosfat tamponlu tuz (PBS) + %0.5 Sığır serum albumin (BSA) + 2 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) x] hazırlamak, (0,22 µm filtre) filtre ve 4 ° C'de korumak
2. izolasyon periferik kan mononükleer hücre (PBMCs) Leukoreduction sistem odası (LRSC)
- Yoğunluk gradient hücre ayrılık çözümü 15 mL koymak ( Tablo malzemelerigörmek) 50 mL aralıklarla tüp LRSC almadan önce oda sıcaklığına (RT) sıcak olabilir bu yüzden.
Not: Yoğunluk sıcaklığına bağlıdır. Bu ürün 4 ° C'de saklandığı şekliyle, RT için equilibrate bu yüzden bu adımı önceden yapılmalıdır - LRSC 50 mL aralıklarla tüp içine boş ilâ 50 mL 1 x PBS ekleyip karıştırın. Çok yavaş, 25 mL. yoğunluk gradient çözüm adımı sırasında 2.1 ısıtılan 15 mL üstüne adımı 2.2 hazırlanan karışımı ekleyin.
Not: Bu adımı aşamalarında karıştırmak değil dikkatli olun. Kan yoğunluk gradient çözüm bu aşamada herhangi bir rahatsızlık olmadan eklenmesi gerekir. - Her iki Santrifüjü tüpler için 700 x g olmadan sonları itibariyle 25 dk santrifüj kapasitesi.
Not: yoğunluk gradient Santrifüjü sonunda alt katmanlardan dön vardır: eritrositler ve granülosit şekillendirme Pelet, yoğunluk gradient çözüm aşaması, PBMCs ve plazma tabakası. - Bir damlalıklı ile aspirating olmadan plazma faz üzerinden geçmek ve PBMC katman yeni bir 50 mL aralıklarla tüp içine toplamak. İlâ 50 mL 1 x PBS PBMCs çamaşır adım ve 300 x g, 10 dk santrifüj olarak ekleyin.
- Süpernatant Aspire edin ve Pelet 40 mL makrofaj orta resuspend.
3. manyetik etiketleme ve CD14 yalıtım+ hücreleri (monosit)
- Malassez odasında PBMCs saymak. PBMCs (genellikle 100 ile 300 x 106 hücreler) deney için gerekli miktarda çekmek, bir Santrifüjü tüp ve 300 x g, 10 dk santrifüj yerleştirebilirsiniz.
- Süpernatant Aspire edin ve içinde adım 10 1.3 sırasında hazırlanan sıralama arabelleği 80 µL Pelet resuspend7 PBMCs. Ekle 20 µL CD14 lastikteki başına 10,7 PBMCs. Mix iyi ve sürekli ajitasyon altında 4 ° C'de 15 dakika kuluçkaya.
- Bir çamaşır adım ve 300 x g., 10 dk santrifüj süpernatant Aspire edin ve 108 PBMCs başına arabellek sıralama 500 µL Pelet resuspend gibi 107 PBMCs başına arabellek sıralama, 1 mL ekleyin.
- Bir sütun ayırıcı manyetik alana yerleştirin. Sütun arabellek sıralama 3 mL ile durulama tarafından hazırlayın.
- Hücre süspansiyon sütuna uygulanır. Sütun hücreleri izole olmak sayısına bağlıdır (burada, LS sütunlar için en çok 109 PBMCs kullanılır). Akışı aracılığıyla içeren etiketlenmemiş hücreleri toplamak.
Not: Bu adımda itibaren tüm tüpler (negatif ve pozitif seçimleri) daha sonra farklı adımları kontrol etmek için akış sitometresi tarafından tutulur. - Sütun 3 x 3 mL arabellek sıralama ile yıkayın. Etiketlenmemiş hücreleri aynı tüpten 3.12 adımından geçen toplamak. Çamaşır adımları ekleme sıralama arabellek, köşeni kuru değil dikkatli olun. Bir koleksiyon tüp sütununun altında yerleştirin ve ayırıcıyı kaldırmak.
- Arabellek sütuna sıralama 5 mL pipet. Hemen manyetik olarak etiketli hücreleri sıkıca sütuna pistonu iterek sifonu çek. CD14 saflığı artırmak için+ hücreleri, eluted kesir ikinci bir sütun üzerinde zenginleştirilmiş.
- Yeni bir sütun ile 3.4-3.7 adımları yineleyin.
4. monosit kaplama
- Monosit Malassez odasında say. CD14 saflığı kontrol+ hücreleri akış sitometresi tarafından. Monosit deney için gerekli miktarda çekmek ve Santrifüjü tüpte koyun.
- 300 x g. aspiratı süpernatant, 10 dk santrifüj kapasitesi ve monosit Pelet makrofaj ortamda resuspend. Hücreleri plaka ve SAB + 25 ng/mL makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) farklılaşma ikna etmek için 50 dk 1 h. için orta Aspire edin ve eski yerine koymak o ile makrofaj orta + % 10 yerleşmek izin.
5. makrofajlar gün 6 polarizasyon
- Orta Aspire edin. Eski yerine koymak o makrofaj orta + % 10 ile SAB çeşitli uyaranlara ile. Örneğin, 10 ng/mL interferon Gama (INFγ) + 1 ng/mL lipopolysaccharide (LPS M1 polarizasyon, elde etmek için) ya da 20 ng/mL interlökin 4 (IL4) + 20 ng/mL interlökin 13 (IL13) M2 polarizasyon için ekleyin.
Not: 24 ve 48 s diğer testlere devam etmeden önce arasındaki uyarımı gerçekleştirilebilir. - Ayırmayı bir çözüm ya da bir hücre kazıyıcı kullanarak hücre hasat.
6. hücre kültürü düşük oksijen koşullar altında
- Adım 4 den başlayarak, monosit ve makrofajlar hipoksik durum analizi yapmak için bir oksijen kontrollü ortamda korumak. Bir hipoksi çalışma istasyonu deneme sırasında istenen oksijen kısmi basınç altında hücreleri korumak için kullanın.
Not: düşük oksijen basınç altında çalışırken, bu tüm medya ve çamaşır arabellekleri istasyonunun altındaki hazırlamak ve yeterince sıvı doğru kısmi basınç elde etmek için beklemek önemlidir. Örneğin, PBS 10 mL 60 mm Petri kabına O2 kısmi basıncı atmosferik baskılardan (Biz bir fiber optik oksijen sensör kullanarak ölçülen var gibi) başlangıç için 25 mmHg ulaşmak için yaklaşık 2 saat gerektirir. Birçok hipoksik istasyonları veya İnkübatörler, oksijen basıncı atmosferik basınç yüzdesi olarak ayarlanır. Kesin ölçüler gerekliyse, doğrudan oksijen basıncı mmHg ayarlamak için yetki veren bir istasyonu kullanmak daha iyidir.
7. lizis ve jel sindirim (protokolü 1)
Not: Bu ve aşağıdaki bölümlerde, peptidler elde etmek ve LC-MS/MS çözümlemesi için kullanılan iki protokol anlatılmıştır. Protokol 1 hücre lizis ve jel ayırma ve sindirim ve çözüm hücre lizis ardından çözüm sindirim ve isoelectric bir odaklama yöntemini kullanarak Ayırma Protokolü 2 açıklar.
- Hücre lizis Laemmli arabellek [234 mM Tris-HCL (pH 6.8), %7.5 SDS, % 37 gliserol, %33,3 (v/v) β-mercaptoethanol, bromophenol mavi % 0,2 w/v] gerçekleştirin. 4-%12 BIS-Tris akrilamid jeller her örnek için 300.000 hücrelerin protein eşdeğer yükleyin.
- Şekil 3' te olarak 6 jel bantları bölünecek Her protein örnek izin vermek için elektroforetik geçiş süresini kontrol eder.
- Jel tespit bir çözüm (% 30 etanol + 20 dk için % 7,5 asetik asit) ile düzeltmek, sonra boyama çözüm (R-250 Coomassie 45 dk için mavi) ekleyin. Destaining çözüm (% 30 etanol + % 7.5 bant görününceye kadar asetik) ekleyin temiz bir neşter ile protein bantları bilincin önce.
- Giriş önce çıkarılan her grup 500 µL tüplerde zar. Temiz cam yüzey (%5 SDS Çözüm deiyonize su yüzeyleri temizlemek için kullanılabilir) keratins ile kirlenmesini önlemek için garanti kapsamındadır.
- Jel dilimler 3 kez 25 mM Amonyum Bikarbonat 25 mM Amonyum Bikarbonat ve Asetonitril (% 50 v/v) bir yıkama ardından 37 ° C'de 20 dk için 200 µL yıkayın. % 100 Asetonitril 10 min için jel adet 200 µL ile kurutmak.
- 10 mM 35 dk. RT., karanlıkta için 25 mM Amonyum Bikarbonat (200 µL) 55 mM iodoacetamide ardından DTT (dithiothreitol) 25 mM Amonyum Bikarbonat 56 ° c (200 µL), 45 dk içinde her jel parçasıyla kuluçkaya
- Alkillenme durdurmak için 10 mM DTT 25 mM Amonyum Bikarbonat 10 dakika dik yıkama her jel parçası 200 µL ile 200 µL jel parçaları 25 mM Amonyum Bikarbonat kuluçkaya sonra 200 µL % 100 Asetonitril 10 dk ile kurutmak.
- Gecede 37 ° C'de üretici yönergelerine göre tripsin/Lys-C karışımı ile protein sindirimi.
- Jel parçalardan % 50 Asetonitril 15 dk sonra 50 μL %5 formik asit 15 dakika için 50 μL ve son olarak, 50 μL % 100 Asetonitril 15 dk. havuzu ekleyerek elde edilen peptidler ayıklamak ve her kesir peptidler adsorpsiyon sınırlamak için düşük-emme tüpler kuru ve örnek kaybı. -80 ° C'de örnekleri daha fazla analiz kadar saklayın.
8. protein çıkarma ve çözüm sindirim (2 iletişim kuralı)
- Hücre lizis (2 x 106 hücreler) aşağıdaki lizis arabellek 150 µL ile gerçekleştirin:
- 7 M üre, 2 M Tioüre, 40 mM Tris ve % 4 çocuklar, proteaz inhibitörleri (tam mini, proteaz inhibitörü kokteyl EDTA içermeyen) ile desteklenmiştir.
- RT 30 min bir thermoshaker ile için çözümler lunaparkçı. 13,800 x g 20 dk RT için de santrifüj kapasitesi ve süpernatant tutun.
- 2D bir temizlik kiti ile kirleticiler kaldırın:
- Kit precipitant çözüm, eş precipitant çözüm, yıkama arabellek ve yıkama katkı sağlar.
- Precipitant çözümün 300 µL ekleyin ve iyice karıştırın. 15 dk. eklemek 300 µL Co precipitant çözüm için buz üzerinde kuluçkaya. Borular 12,000 x g 5 min için de (en az) santrifüj kapasitesi. Küçük bir Pelet görünür olmalıdır. Hızla resuspension veya pelet dağılım önlemek için sonraki adıma geçin. Süpernatant Pelet bozmadan kaldırın.
- Tüplerini tekrar cap-menteşe ve Pelet dışa tüpün dibinde kalan herhangi bir sıvı getirmek için karşı karşıya santrifüj kapasitesi. Kısa darbe yeterli olur. Görünür hiçbir sıvı tüplerde kalan olmalıdır.
- Pelet bozmadan, 40 µL Co precipitant çözüm ekleyin. Tüp buz 5 dakika santrifüj 5 dakika süreyle oturup sonra kaldırmak ve yıkama atmak izin. 25 µL de-iyonize su ekleyin. Girdap her 5-10 s için tüp. Pelet dağıtmak ama suda çözülür değil.
- 1 mL (en az 1 h-20 ° c için önceden soğutulmuş) yıkama arabelleği ve yıkama katkı 5 µL ekleyin. Pelet tümüyle dağıldı kadar girdap. Tüpler-20 ° c en az 30 dk. girdap 20-30 s her 10 min için kuluçkaya
Not: Tüpler-20 ° C ilâ 1 hafta en az protein yıkımı veya değişiklik ile saklanır. - 5 dk. dikkatle kaldırmak ve süpernatant için tüpler (en az) de 12.000 × g santrifüj kapasitesi. Beyaz bir Pelet görünür olmalıdır. (Pelet çok kuru, resuspend zor olacak ise) Pelet en fazla 5 min için airdry için izin verir.
- Protein Pelet 8 M üre ve 0.1 M Amonyum Bikarbonat 300 µL içinde resuspend. 1 dk. için güçlü girdap kolorimetrik bir tahlil kullanarak protein konsantrasyonu belirlemek.
9.-çözüm sindirim (2 iletişim kuralı)
- 700 mM DTT sulu çözüm 5.1 µL ekleyerek disülfür köprü azaltmak (son konsantrasyonu 12.5 mM) 8.4 resuspended proteinler adım ve bir thermoshaker ile 30 dk 37 ° C'de kuluçkaya. Sistein kalıntıları 700 mM iodoacetamide sulu çözüm 20,3 µL ekleyerek alkylate (son konsantrasyonu 40 mM) ve 25 ° c 30 dk içinde belgili tanımlık karanlık ile bir thermoshaker için kuluçka.
- 0.1 M Amonyum Bikarbonat 990 µL örnek için ekleyin. Tripsin/Lys-C Mix (enzim: substrat oranı 1: 100 w/w) karşılık gelen bir birim eklemek. Gecede bir thermoshaker ile 37 ° C'de kuluçkaya.
10. temizlik kartuş (2 iletişim kuralı)
- Bir kartuşu 1 sütun-hacmi (1 mL) metanol ile ıslak. Kartuş ile 1 sütun-hacmi (1 mL) % 80 Asetonitril/HPLC-grade su temiz ve akışı aracılığıyla atın. Kartuş 4 sütun-cilt (4 mL) %0.1 formik asit/HPLC-grade su ile equilibrate ve akışı aracılığıyla atın.
- Örnekleri 90 µL % 10 formik asit veya pH 2-3 (pH pH göstergesi ile kontrol edin) su ile acidify. Acidified örnekleri yüklemek ve akışı aracılığıyla toplamak. (Değil muhafaza peptidler içeren) aracılığıyla akış-yeniden yükleyin. Kartuş 6 sütun-hacmi (6 mL) %0.1 formik asit/HPLC-grade su ile yıkayın.
- 1 sütun-birimleri (1 mL) kartuşla üzerinden peptidler %0,1 formik acid/50% Asetonitril/HPLC-grade su elute. 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarın. Vakum yoğunlaştırıcı (150 x g, vakum 160 mBar) kullanarak örnek konsantre.
11. ayırma (protokol 2) Isoelectric odaklanarak
Not: Peptidler 10 3 pH aralığı kapsayan bir 13 cm şerit üzerinde bir jel fractionator kullanarak kendi isoelectric noktalarına göre ayrılır. Biz (aşağıda özetlenmiştir) Tedarikçi tarafından sağlanan aşağıdaki iletişim kuralı kullanılır:
- Aşağıdaki çözümleri hazırlamak: çözüm (600 µL) gliserol çözüm, 60 µL OFFGEL arabelleği, 4.34 mL Ultrasaf Su ve çözüm B (çözüm a 1.776 mL) ve 444 µL Ultrasaf Su.
- IPG şeritler, çerçeve ve elektrotlar üreticinin talimatlarına göre bir araya getirin.
- Örnek çözüm d. 40 eklemek µL çözüm B her kuyuya 1,8 mL ile resuspend. Örneğin 150 µL her kuyunun içine yükleyin.
- Peptidler için varsayılan yöntemi seçin: OG12PE00 (peptidler 3100 OFFGEL düşük Res Kit, pH 3-10, 12-şey çerçeveler ile kullanılmak için varsayılan yöntemi OFFGEL. Bu yöntem tamamlanan (~ 20 h) olmuştur kadar bekleyin. Düzgün etiketli tüpler kesirleri toplamak.
12. temizlik Harvard aparatı sütun ters C18 Post-IEF (2 iletişim kuralı)
- Kademeli %1 bir seferde birkaç μL ekleyin TFA her kesir için de-iyonize su örnek acidify. PH yaklaşık 3 veya daha düşük pH kağıt kullanarak onay.
- Aşağıdaki çözümleri hazırlamak: çözüm 1 (5 mL Asetonitril de, 10 µL formik asit, 4,99 mL Ultrasaf Su) ve çözüm 2 (Asetonitril 0.5 mL, formik asit, 9,49 mL Ultrasaf Su 10 µL).
- Çözüm 1 150 µL spin sütunla önceden ıslak. Santrifüj için 90 s 750 x g ve atma akışı aracılığıyla. Çözüm 2 150 μL spin sütunla yıkayın. Santrifüj için 90 s 750 x g ve atma akışı aracılığıyla.
- Kesir sütunu boyunca geçmek. Santrifüj için 90 s 750 x g ve atma akışı aracılığıyla. Çözüm 2 150 μL ile yıkayın. Santrifüj için 90 s 750 x g ve atma akışı aracılığıyla.
- Kesir çözüm 1 50 μL ile elute. Santrifüj için 90 s 750 x g., bir kez daha bu adımları yineleyin.
- Kuru-kesir vakum yoğunlaştırıcı (150 x g, vakum 160 mBar) kullanarak ve-80 ° C'de
13. analiz proteomik veri ve Biyoinformatik18
- Bir nano-LC MS tarafından elde edilen verileri analiz/MS kütle spektrometre miktar yazılım MaxQuant (sürüm 1.5.2.8) gibi ve Andromeda arama motoru kullanarak.
- Yanlış bulma oranı (FDR) %1 proteinler ve peptidler ve 7 amino asitler en az uzunluğunu ayarlayın. C-terminal ayarla enzim özgüllük Arg ve Lys için. 2 cevapsız nefrette prolin tahvil izin. Sistein carbamidomethylation bir sabit değişiklik ve N-terminal protein asetilasyon ve metionin oksidasyon olarak değişken değişiklikler seçin.
- Daha fazla veri istatistiksel analiz yazılımı ile analiz. FunRich yazılımı (www.funrich.org/) kullanarak bir işlevsel zenginleştirme çözümlemesi gerçekleştirin. DAVID yazılım (https://david.ncifcrf.gov/) kullanarak bir gen Ontoloji zenginleştirme çözümlemesi gerçekleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs) tarafından fark Santrifüjü elde başlayarak, protokol CD14 nüfusu izni alması+ monosit akış sitometresi (Şekil 1) fazla % 98 oranında biçilen bir saflığı ile. Bu monosit ikincil olarak çeşitli kutuplaşmalar doğru (Şekil 2) farklı. Ne zaman bir ayırma jel üzerinde seçilir, SDS-sayfa jeller üzerinde geçiş istenen bant sayısı elde etmek için adapte ve bantları çıkardım (Şekil 3). Sindirim ikincil olarak jel eksize bantlarında gerçekleştirilir sonra peptidler ayıklanır. Peptidler bir nano-LC (sıvı kromatografi) kullanılarak analiz-MS/MS kütle spektrometre. MS/MS spectra bilinen peptidler (Şekil 4A) elde edilen spectra ürününün ek açıklama göre çeşitli proteinlerin kimlik vermek. Bereket bir protein miktar sonra tanımlanan peptidler kullanarak yayımlanmış yazılım ve veritabanları15,16protein geliyor miktarı ile bağlantılı olarak hesaplanır. Bu iletişim kuralıyla jel sindirim yaklaşık 4000 saptanan proteinler verir ve dinamik alan 5 Logaritmik ölçek birimlerini (Şekil 4B) kapak tespit edilmiştir. Saptanan bu proteinler fark ifade analizi altında farklı oksijen çevre çeşitli kutuplaşmalar kümeleme belirlemek için kullanılabilir.
Bu yöntemle Ayrıca kümeleri up-%3 (Şekil 5, Tablo 1) için bir düşük oksijen konsantrasyonu maruz kaldığında düzenlenmektedir proteinlerin tanıyabilir. Olan sindirim, verimliliğini değerlendirmek mümkün değil bir jel protokol kullanıldığında, insan makrofajlar (Şekil 6A) adapte edilmiş bir çözüm sindirim yöntemi önerdi. Bu yöntemle, biz kolayca (sonra çözüm sindirim) elde edebilirsiniz kimlik ayırma, o ayırma IEF will ile makul anlamı olmadan 3600 proteinlerin artış bu sayı (Şekil 6B).
Şekil 1: Akış Sitometresi Analizi CD14 ifade PBMC (sol panelde) sıralama önce ve sonra (doğru kapı aynası) sıralama elde edilen saflık manyetik boncuklar seçimden sonra gösterilen. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: iki farklı kutuplaşmalar için elde edilen türleri morfoloji heterojen gösterilen farklılaştırılmış insan makrofajlar faz kontrast görüntüler. Ölçek çubuğu temsil eden 50 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: eksize çeşitli gruplar gösterilen lekeli görüntüleme Coomassie mavi jel [burada, 6 M(Ø) makrofajlar bantlarında] için bir düşük oksijen ortamına maruz makrofajlar 5 kutuplaşmalar. IC bağışıklık kompleksleri, DXM = deksametazon =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: MS/MS spektrum ve miktar. (A) bir MS/MS spektrum bir örnek. Burada m/z 597.29 + 2 bir elektrik yükü ile MS spektrum üzerinde bulunan bir peptid CID (çarpışma kaynaklı ayrılma) spektrum gösterilir. Karşılık gelen sıra bu yelpazenin protein CD58 gelen Val-Ala-Glu-Leu-Glu-Asn-Ser-Glu-Phe-Arg olarak tespit edilmiştir. (B) sırası etiket içermeyen miktar (10 LFQ oturum) saptanan proteinler herbiri için emretti. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: ısı haritası tüm kutuplaşma hiyerarşik kümeleme temsil eden Devletler differentially kullanarak ifade proteinler. Analiz bir küme proteinlerin % 3 O2 koşulu (kırmızı dikdörtgen) bütün kutuplaşmalar overexpressed ortaya koymaktadır. Renk ölçeği z-score (log2 yoğunluğu) temsil eder. Her satır bir proteindir ve her sütun bir örnektir. Bu rakam bir önceki yayın14kökenli. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: SDS-sayfa ve kromatografik. (A) gümüş lekeli SDS-sayfa jelleri protein hücre lizis ve yıkımı sırasında lizis yokluğu ve hazım verimliliğini gösteren çözüm sindirim sonra. (B) kromatografik ayırma olmadan çözüm sindirim sonra elde edilen. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Küme | proteinID | Protein adları | Gene adları | Peptidler | Ustura + benzersiz peptidler | Benzersiz peptidler | Protein kimlikleri | ||
| Kırmızı | P0DMV9 | Isı şok 70 kDa protein 1B | HSPA1A | 40 | 37 | 4 | P0DMV9; P0DMV8; A8K5I0; Q59EJ3; B4DNT8; B4DWK5; B4DFN9; B4DI39; B4E1S9; B4DVU9; V9GZ37; B3KTT5; B4DNX1; B4E1T6; B4DNV4; Q9UQC1 | ||
| Kırmızı | P54709 | Sodyum/Potasyum-taşıma ATPaz alt birim beta-3 | ATP1B3 | 8 | 8 | 8 | P54709; D3DNF9; C9JXZ1; C9JA36; H7C547; F8WBY4; Q58I18 | ||
| Kırmızı | O00462 | Beta-mannosidase | MANBA | 14 | 13 | 13 | O00462; A7LFP5; A8K6D3; E9PFW2; B4DT18; Q59EG5 | ||
| Kırmızı | Q8NAS7 | NADH dehidrogenaz [ubiquinone] demir-kükürt protein 7, mitokondrial | NDUFS7 | 4 | 4 | 4 | Q8NAS7; Q6ZQU6; F5H5N1; B7Z1U1; A8K0V6; Q7LD69; F5GXJ1; O75251; B7Z4P1; Q9H3K5; A0A087WXF6; A0A087WTI3; Q6ZS38 | ||
| Kırmızı | Q8WWQ0 | PH etkileşim protein | PHIP | 5 | 5 | 4 | Q8WWQ0; Q9NWP3 | ||
| Kırmızı | E5RHK8 | Dynamin-3 | DNM3 | 11 | 2 | 2 | E5RHK8; Q9UQ16; B3KPF2; E5RIK2 | ||
| Kırmızı | A0A024QZ64 | Fruktoz-bisphosphate aldolaz C | ALDOC | 18 | 14 | 7 | A0A024QZ64; P09972; B7Z1Y2; B7Z3K9; B7Z1N6; B7Z3K7; A8MVZ9; J3KSV6; J3QKP5; B7Z1L5; C9J8F3; K7EKH5; J3QKK1; B7Z1H6 | ||
| Kırmızı | O75489 | NADH dehidrogenaz [ubiquinone] demir-kükürt protein 3, mitokondrial | NDUFS3 | 12 | 12 | 12 | O75489; Q9UF24; Q53FM7; E9PS48; E9PKL8; G3V194 | ||
| Kırmızı | P21912 | Süksinat dehidrogenaz [ubiquinone] demir-kükürt alt birimi, mitokondrial | SDHB | 11 | 11 | 11 | P21912; A0A087WXX8; A0A087WWT1 | ||
| Kırmızı | A0A024R1Y7 | GH3 etki alanını içeren protein | LGP1; GHDC | 7 | 7 | 7 | A0A024R1Y7; Q8N2G8; B3KVB0; K7ESN3; K7EJT7; K7EQ41; K7EL54 | ||
| Kırmızı | E5KRK5 | NADH-ubiquinone oxidoreductase 75 kDa alt birimi, mitokondrial | NDUFS1 | 29 | 29 | 29 | E5KRK5; P28331; B4DJ81; Q9P1A0; C9JPQ5; F8WDL5 | ||
| Kırmızı | A0A024QZ30 | Süksinat dehidrogenaz [ubiquinone] flavoprotein alt birimi, mitokondrial | SDHA | 17 | 17 | 17 | A0A024QZ30; P31040; D6RFM5; B3KT34; A0A087X1I3; Q0QF12; B4DYN5; B3KYA5; B4DNB2; H0Y8X1; B7Z6J5 | ||
| Kırmızı | A0A024R2F9 | Transmembran protein 43 | TMEM43 | 16 | 16 | 16 | A0A024R2F9; Q9BTV4; Q8TEP9; V9GY05 | ||
| Kırmızı | A0A024R5K3 | NADH dehidrogenaz [ubiquinone] demir-kükürt protein 8, mitokondrial | NDUFS8 | 5 | 5 | 5 | A0A024R5K3; E9PPW7; O00217; E9PN51; F8W9K7; E9PKH6; B4DYI3; Q53G17 | ||
| Kırmızı | O76003 | Glutaredoxin-3 | GLRX3 | 13 | 13 | 13 | O76003 | ||
| Kırmızı | Q1HBJ4 | Mitojenle-aktive protein kinaz; Mitojenle-aktive protein kinaz 1 | MAPK1 | 26 | 26 | 21 | Q1HBJ4; P28482; B4DHN0; Q499G7; K7ELV1; K7EN18; B4E104; P31152; Q16659 | ||
| Kırmızı | Q13151 | Türdeş olmayan nükleer Ribonükleoprotein A0 | HNRNPA0 | 8 | 8 | 8 | Q13151 | ||
| Kırmızı | V9HWN7 | Fruktoz-bisphosphate aldolaz A | ALDOA | 36 | 36 | 14 | V9HWN7; P04075; J3KPS3; H3BQN4; H3BUH7; H3BR04; H3BMQ8; H3BU78; H3BR68; A4UCS9; A4UCT0 | ||
| Kırmızı | B4DVJ0 | Glukoz-6-fosfat izomeraz | GPI | 32 | 32 | 23 | B4DVJ0; P06744; B4DE36; A0A0A0MTS2; K7EQ48; K7EP41; K7EPY4; K7ELR7; K7ERC6; K7ENA0; K7ESF4; K7EIL4; K7ERK8; Q59F85 | ||
| Kırmızı | V9HWB9 | L-laktat dehidrogenaz; L-laktat dehidrogenaz bir zincir | LDHA | 36 | 36 | 34 | V9HWB9; P00338; B4DJI1; F5GXY2; F5GYU2; F5GXH2; F5H5J4; F5H6W8; F5GZQ4; F5H8H6; F5GXC7; F5GWW2; F5GXU1; A0A087WUM2; Q96L19; Q6ZMR3 | ||
| Kırmızı | P13674 | Prolyl hidroksilaz 4 alt birim Alfa-1 | P4HA1 | 26 | 26 | 26 | P13674; Q5VSQ6 | ||
| Kırmızı | Q6FHV6 | Gama-metallerin; Metallerin | O2 | 18 | 15 | 14 | Q6FHV6; P09104; A8K3B0; F5H0C8; F5H1C3; U3KQP4; U3KQQ1; Q9NPL4 | ||
| Kırmızı | Q99798 | Aconitate hidrataz, mitokondrial | ACO2 | 40 | 40 | 40 | Q99798; B4DZ08; B2RBW5; A2A274; B4DJW1; B4DLY4; Q71UF1; B4DEC3; B4DW08; O75944 | ||
| Kırmızı | P17858 | ATP-bağımlı 6-phosphofructokinase, karaciğer türü | PFKL | 32 | 29 | 28 | P17858; Q7L2M7; Q9BSP4; B3KNQ7; B4E108; Q59GI2; F8WEU2; Q7Z3R9; Q6MZK4 | ||
| Kırmızı | A0A024R872 | Niban benzeri proteini 1 | FAM129B | 32 | 32 | 32 | A0A024R872; Q96TA1; Q9H8K1; Q2YD88; Q9H6L6 | ||
| Kırmızı | A0A024RC61 | Aminopeptidaz N | ANPEP | 58 | 58 | 25 | A0A024RC61; P15144; Q59E93; B4DV63; B4DP01; B4DP96; H0YKT6; H0YLZ8; Q71E46; H0YMC1; Q8IVL7 | ||
| Kırmızı | V9HWF4 | Phosphoglycerate kinaz; Phosphoglycerate kinaz 1 | PGK1 | 41 | 41 | 35 | V9HWF4; P00558; B4E1H9; B4DHM5; B4DHB3; B4DWQ3; Q16444 | ||
| Kırmızı | Q12882 | Dihydropyrimidine dehidrogenaz [NADP(+)] | DPYD | 44 | 44 | 44 | Q12882; B4DML1 | ||
| Kırmızı | B4DEQ0 | Elektron transferi flavoprotein-ubiquinone oxidoreductase, mitokondrial | ETFDH | 9 | 9 | 9 | B4DEQ0; Q547S8; A7UNU5; Q16134; D6RAD5 | ||
| Kırmızı | D9UAX9 | MHC sınıf ı antijen | HLA-B | 13 | 3 | 2 | D9UAX9 | ||
| Kırmızı | V9HWK1 | Triosephosphate izomeraz | TPI1 | 29 | 29 | 17 | V9HWK1; P60174; Q53HE2; B4DUI5; U3KPZ0; U3KQF3; U3KPS5 | ||
| Kırmızı | Q96HE7 | ERO1 benzeri protein Alfa | ERO1L | 28 | 28 | 28 | Q96HE7; G3V3E6; G3V5B3; G3V2H0; G3V503; Q5TAE8; B2RD00; Q86YB8 | ||
| Kırmızı | P14868 | Aspartat--tRNA ligaz, sitoplazmik | DARS | 29 | 29 | 2 | P14868; Q53T60; Q53R85; H7BZ35; H7C278 | ||
| Kırmızı | P36871 | Phosphoglucomutase-1 | PGM1 | 24 | 24 | 5 | P36871; B4DFP1; Q9H1D2 | ||
Tablo 1: İnsan makrofajlar düşük oksijen gerilim altında her polarizasyon için ortak için aşırı ifade proteinler listesi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Proteomik ifade bütün bir hücre veya hücre altı bölmeleri farklı proteinlerin eğitim için güçlü bir araç olduğundan, hücre lizis Protokolü duruma getirilmesi ve proteinlerin sindirim çalışmalar bir dizi tarafından ele alınmıştır. Jel sindirim (polyacrylamide jel matris proteinlerin sindirim)17, çözüm18 ve filtre destekli örnek hazırlama19sindirim dahil yöntemleri üç ana sınıf vardır. Bu son yöntem, evrensel olarak, açıklanan ilk başta düşük tekrarlanabilirlik ve filtre20proteinlerin mümkün kaybı sergilemek bildirilmiştir. Jel sindirim sindirim verimliliğini değerlendirmek kolay değil o zaman alıcı ve dezavantajlı olabilir bir sağlam mümkünse yöntemidir. Çözüm sindirim bu imkanı sunuyor ama örnekleri sindirim ve IEF sonra temizleme gerektirir. Bu iki yöntem arasında aynı örnek karşılaştırıldığında, çözüm sindirim IEF Ayırma Protokolü (kesirler aynı numarayla) tanımlanan proteinlerin jel sindirim21daha yüksek bir sayı verir.
Bu avantaj rağmen mümkün protein yıkımı sırasında çözüm lysis hücre içi proteaz (özellikle de myeloid hücrelerin) nedeniyle dikkate almak gereklidir. Önemli bu teknikler protein sindirimi üzerinde temel alan akıldan çıkarmamak ve biricik güçlü-tripsin belirli bölünme siteleri sunan proteinleri analiz etmek de. Bu sindirim sınırlama rahatlatır, ancak veri çözümleme adımları ve Biyoinformatik kaynakları22ekler bir tepeden proteomik yaklaşım kullanmak mümkündür. Proteinlerin çeşitli hücresel kompartmanlarda üzerinden solubilization da, özellikle plazma membran, hücresel Proteom kontrolsüz bir örnekleme için önde gelen elde etmek zor olabilir. Nano-LC-MS/MS kütle spektrometre analiz örnekleri ile devam etmek için kullanılan kütle spektrometre üzerinde bağlı olabilir peptidler yeterli miktarda elde etmek önemlidir (genellikle, toplam protein başlayan bir koşul için en az 1 µg olmalıdır ve Bu kesir IEF ile kullanılan sayısına göre bu miktar artırmak için açık). Bu sınırlama hangi proteomik hammadde amplifikasyon olanaklı olduğu genomik teknikleri farklılaştıran okudu hücre nüfus kıt, ise bir dezavantaj olabilir.
Richer ve meslektaşları23 ve Packer ve Fuehr24seminal işleri bile sonra yeterince oksijen hücre kültürlerinde önemini kabul edilmiştir. Düşük oksijen konsantrasyonları altında hücre kültürü çalışmalarının yapışma, ömrü ve bölünme yana olduğunu artık biliyoruz. Bu kök hücre araştırma25son derece önemlidir bu tanınır. Ana teknik sorun için hücre kültürleri kontrollü oksijen koşullar altında bakım tüm deney sırasında istenen oksijen konsantrasyonunun ilgilidir. Bu serbest bırakmak-in çözünmüş oksijen önlemek ve hipoksik çalışma istasyonları düşük oksijen (odası torpido ile işleme) altında hücre işleme izin vermek için kullanın ve yüksek oksijen koşulları için geçici sergi önlemek için tüm medya ön kuluçka gerektirir .
İnsan makrofajlar monosit kaynaklı çeşitli kutuplaşmalar moleküler imzalarını edinmek ve oksijen modülasyon bu imzaları üzerinde etkileri çalışma için kullanılan açıklanan protokol. Bu çalışmada Insight o kutuplaşmalar açıklamasını verdi ve bazı fonksiyonel sonuçlar ortaya koymuştur. Örneğin, birçok protein efferocytosis içinde yer alan bir düşük oksijen ortamı tarafından modülasyonlu bulduk. Açıklanan protokolüne dayanan bu proteomik yaklaşım, çevre parametreleri makrofaj işlevlerini değiştirin ve bu sinyaller yeni tedavi yaklaşımları14tasarlamak için kullanılabilir nasıl keşfetme fırsatı sunuyor.
Bu çalışmada açıklanan proteomik son yıllarda insan makrofaj polarizasyon çalışmaları alanında kullanılan genomik yaklaşımlar için tamamlayıcı bir yaklaşımdır. Proteomik translasyonel modifikasyonlar nedeniyle onların karşılık gelen mRNA'ların daha farklı bir ifade mevcut ve yeni biyolojik keşif kurşun protein miktar avantaj sunuyor. Bu avantaj rağmen proteomik veri genellikle kütle spektrometresi, çok karmaşık MS spectra ve peptidler, yanlış pozitif algılama için önde gelen yüksek duyarlılık nedeniyle, kısmen yorumlamak zordur. Son zamanlarda, analiz yazılımı bunu engellemek için verimliliği kazanmıştır. Değişen bir durum olsa bile, proteomik Ayrıca genomik26 daha düşük tekrarlanabilirlik yüzleri ve (akış sitometresi, immunoblotting) protein nicel değişiklikleri onaylamak için diğer teknikleri kullanarak doğrulama adımları ile ilişkilidir ifade düzeyleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir çıkar çatışmaları bildirin.
Acknowledgments
AM genç grup lideri programıyla (CD'ye atıp/Avenir INSERM-CNRS), la Ligue Nationale contre le kanser ve la Fondation ARC pour la recherche sur le kanser tarafından finanse edilmektedir. Kütle spektrometresi biyoloji platformu (UTECHS MSBIO, Pasteur Enstitüsü, Paris) için gelen Mariette Matondo teşekkür ediyoruz. Lauren Anderson el yazması onun okuma için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hypoxia Working Station | Oxford Optronix | Hypoxylab | |
| C6 Flow cytometer | BD | Accuri C6 | |
| Urea | Agilent Technologies | 5188-6435 | |
| Formic acid (FA) | ARISTAR | 450122M | |
| R-250 Coomassie blue | Biorad | 1,610,436 | |
| Lipopolysaccharide, E.Coli (LPS) | Calbiochem | 437627 | |
| 2D clean-up kit | GE Healthcare | 80-6484-51 | |
| RPMI 1640 medium, glutamax supplement | Gibco | 61870044 | |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-080 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) Solution 100X | Gibco | 11140-035 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) 1X | Gibco | 14190-094 | |
| Harvard Apparatus column Reverse C18 micro spin column | Harvard Apparatus | 74-4601 | |
| EDTA 0.5 M, pH 8.0 | Invitrogen | AM9260G | |
| NuPAGE Bis-Tris 4-12% | Life Technologies SAS | NP0321 BOX | |
| CD14 Microbeads human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
| MACS separation column LS | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) | Miltenyi Biotec | 130-096-485 | |
| Interleukin 4 (IL4) | Miltenyi Biotec | 130-093-917 | |
| Interleukin 13 (IL13) | Miltenyi Biotec | 130-112-410 | |
| Interferon gamma (INFγ) | Miltenyi Biotec | 130-096-482 | |
| CD14-FITC (clone TÜK4) | Miltenyi Biotec | 130-080-701 | |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| Trifluoroacetic Acid (TFA) | Pierce | 28904 | |
| Trypsin/Lys-C Mix | PROMEGA | V5073 | |
| Complete Mini, EDTA-free Protease Inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| Density Gradient Solution (Histopaque 1077) | Sigma Aldrich | 10771-100ML | |
| Accumax | Sigma Aldrich | A7089-100ML | |
| Human Serum from human male AB plasma (SAB) | Sigma Aldrich | H4522-100ML | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) solution 30% | Sigma Aldrich | A9576-50ML | |
| Trisma-base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | 49767 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Bromophenol blue | Sigma Aldrich | 114405 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) 20% | Sigma Aldrich | 5030 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 9830 | |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34888 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 43819 | |
| Iodoacetamide | Sigma Aldrich | 57670 | |
| Thiourea | Sigma Aldrich | T8656 | |
| CHAPS | Sigma Aldrich | C9426 | |
| Micro BCA Assay Kit | ThermoFisher | 23235 | |
| 5 mL sterile plastic pipette | VWR | 612-1685 | |
| Thermomixer C Eppendorf | VWR | 460-0223 | |
| Sep-Pak tC18 reverse phase cartridges, 100 mg | Waters | WAT036820 |
References
- Okabe, Y., Medzhitov, R. Tissue biology perspective on macrophages. Nature Immunology. 17 (1), 9-17 (2016).
- Sica, A., Mantovani, A. Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas. The Journal of Clinical Investigation. 122 (3), 787-795 (2012).
- Murray, P. J. Macrophage Polarization. Annual Review of Physiology. 79, 541-566 (2017).
- Chinetti-Gbaguidi, G., Staels, B. Macrophage polarization in metabolic disorders: functions and regulation. Current Opinion in Lipidology. 22 (5), 365-372 (2011).
- Chow, A., Brown, B. D., Merad, M. Studying the mononuclear phagocyte system in the molecular age. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 788-798 (2011).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).
- Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).
- Xue, J., et al. Transcriptome-based network analysis reveals a spectrum model of human macrophage activation. Immunity. 40 (2), 274-288 (2014).
- Csete, M. Oxygen in the cultivation of stem cells. Annals of the New York Academy of Sciences. 1049, 1-8 (2005).
- Johansson, A., et al. Functional, morphological, and phenotypical differences between rat alveolar and interstitial macrophages. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 16 (5), 582-588 (1997).
- Pfau, J. C., Schneider, J. C., Archer, A. J., Sentissi, J., Leyva, F. J., Cramton, J. Environmental oxygen tension affects phenotype in cultured bone marrow-derived macrophages. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 286 (2), L354-L362 (2004).
- Grodzki, A. C. G., Giulivi, C., Lein, P. J. Oxygen tension modulates differentiation and primary macrophage functions in the human monocytic THP-1 cell line. PLoS One. 8 (1), e54926 (2013).
- Court, M., Petre, G., Atifi, M. E., Millet, A. Proteomic Signature Reveals Modulation of Human Macrophage Polarization and Functions Under Differing Environmental Oxygen Conditions. Molecular & Cellular Proteomics. 16 (12), 2153-2168 (2017).
- Cox, J., et al. Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).
- Cox, J., Neuhauser, N., Michalski, A., Scheltema, R. A., Olsen, J. V., Mann, M. Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).
- Court, M., et al. Toward a standardized urine proteome analysis methodology. Proteomics. 11 (6), 1160-1171 (2011).
- Wiśniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).
- Liebler, D. C., Ham, A. -J. L. Spin filter-based sample preparation for shotgun proteomics. Nature Methods. 6 (11), 785-786 (2009).
- Hubner, N. C., Ren, S., Mann, M. Peptide separation with immobilized pI strips is an attractive alternative to in-gel protein digestion for proteome analysis. Proteomics. 8 (23-24), 4862-4872 (2008).
- Park, J., et al. Informed-Proteomics: open-source software package for top-down proteomics. Nature Methods. 14 (9), 909-914 (2017).
- Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. Influence of oxygen and culture media on plating efficiency of some mammalian tissue cells. Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).
- Packer, L., Fuehr, K. Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells. Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).
- Lengner, C. J., et al. Derivation of pre-X inactivation human embryonic stem cells under physiological oxygen concentrations. Cell. 141 (5), 872-883 (2010).
- Sidoli, S., Kulej, K., Garcia, B. A. Why proteomics is not the new genomics and the future of mass spectrometry in cell biology. Journal of Cell Biology. 216 (1), 21-24 (2017).
