I denne protokol beskriver vi fuldstændig arbejdsgangen for hurtige isolering af ekstracellulære vesikler fra humant fuldblod og karakterisering af specifikke markører af fluorescens-baserede nanopartikel-tracking analyse. De præsenterede resultater viser en høj grad af reproducerbarhed og kan justeres til celle kultur analysere.
Ekstracellulære vesikler (EVs), herunder exosomes, er specialiserede hindeagtige nano-størrelse vesikler fundet i kropsvæsker, der frigives constitutively fra mange celletyper og spille en central rolle i reguleringen af celle-celle kommunikation og en bred vifte af biologiske processer. Mange forskellige metoder til karakterisering af evt er blevet beskrevet. Men de fleste af disse metoder har den ulempe, at forberedelse og karakterisering af prøverne er meget tidskrævende, eller det er yderst vanskeligt at analysere specifikke markører af interesse på grund af deres lille størrelse og på grund af manglende diskrete populationer. Mens metoder til analyse af evt er blevet betydeligt forbedret i det seneste årti, er der stadig ingen standardiseret metode til karakterisering af enkelt EVs. Her viser vi en halvautomatisk metode til karakterisering af enkelt evt af fluorescens-baserede nanopartikel-tracking analyse. Den protokol, der er præsenteret omhandler den fælles problem for mange forskere på dette område og giver den komplette workflow for hurtig isolation af evt- og karakterisering med PKH67, en generel cellemembranen linker, samt specifikke celleoverflademarkører sådanne som CD63, CD9, vimentin og lysosomale-associerede membranen protein 1 (lampe-1). Præsenteres resultaterne viser en høj grad af reproducerbarhed, som bekræftet af andre metoder, såsom Western blotting. I de gennemførte eksperimenter, vi anvendes udelukkende evt isoleret fra menneskelige serumprøver, men denne metode er også velegnet til plasma eller andre kropsvæsker og kan justeres til karakterisering af evt fra celle kultur analysere. Uanset den fremtidige udvikling af forskning på EV biologi giver den protokol, der er præsenteret her en hurtig og pålidelig metode til hurtig karakterisering af enkelt evt med specifikke markører.
Ekstracellulære vesikler (EVs), herunder exosomes, er specialiserede hindeagtige nano-størrelse vesikler (20-150 nm) indeholdende visse kombinationer af lipider, vedhæftning og intercellulære signaling molekyler samt andre funktionelle cytosole komponenter som mikroRNA (miRNA) og mRNA og spille en central rolle i reguleringen af celle-celle kommunikation1,2. Evt er udgivet i deres miljø fra mange forskellige celletyper, f.eks endotelceller, immun celler og tumorceller, og kan påvises i kropsvæsker som serum sæd, urin, brystmælk, spyt eller cerebrospinalvæske3, 4. stigende antal undersøgelser fremhæve evt forskelligartede bidrag som potentielle biomarkører for tidlig diagnosticering af flere sygdomme og/eller forudsigelse af sygdom progression5,6. Exosomes er ofte beskrevet af tilstedeværelsen af molekyler, som de er specielt forbundet med, uanset hvilken celletype de hidrører fra7. For eksempel, exosomes indeholder forskellige tetraspanins (CD9, CD63, CD81), major histocompatibility komplekse klasse jeg (MHC jeg) molekyler, forskellige transmembrane proteiner, typisk cytosole proteiner (tubulin og aktin), molekyler involveret i () multivesicular krop MVB) Biogenese (TSG101 og alix), heat shock proteiner (HSP 70 og HSP 90), og proteiner, der deltager i signal transduktion (protein kinaser)8.
Mange forskellige metoder er blevet beskrevet for karakterisering af evt-9. De mest almindelige og udbredte metoder anvendes til EV analyse er flow flowcytometri10, scanning elektronmikroskopi (SEM) og transmissions Elektron Mikroskopi (TEM)11. Den best-established og almindeligt anvendte metode til biokemiske karakterisering af EV indhold er Western blotting12,13. Mens SEM og TEM giver mulighed for påvisning af evt på tværs af hele størrelse spektrum, er meget begrænset identificering af specifikke overflade proteiner en særlig ulempe ved disse metoder. Derimod flowcytometri er et kraftfuldt værktøj til identifikation af specifikke EV overflade markører, men tærsklen til denne metode begrænser analysen til evt med en størrelse større end 500 nm. Derfor, analyse af isolerede evt med påvisning af specifik overflade markører er i øjeblikket ikke tilgængelig via enhver af disse tre veletablerede metoder. Vi har tidligere beskrevet en anden yderst følsom metode for visualisering og analyse af evt, nanopartikel-tracking analyse (NTA)14. Kort, denne metode kombinerer to forskellige fysiske principper. Først, partikler scatter lys, når de er bestråles med en laserstråle, og det andet princip, kaldet Brownske bevægelser, indebærer, at udbredelsen af forskellige partikler i en flydende suspension er omvendt proportional med deres størrelse. Semi-automatiske desktop nanopartikel analyse instrument for flydende prøver består af partiklen tracking analyzer med et software-baseret analyse, hvor digitale billeder af spredt lys fra én partikler registreres. Partiklerne og bevægelse af partikler er opdaget af en laser spredning mikroskop med et videokamera. Laserstrålen er orienteret vertikalt, mens den optiske akse er vandret og fokuseret ind i cellen kanal fyldt med prøven. Oplysningerne fra parceller af spredt lys steder og deres hastighed af motion aktiverer bestemmelse af total partikel antal og størrelse distribution. Efter bestråling af laser, partiklerne scatter lys, som er registreret af en digital video kamera via mikroskop14. Avancement til vores tidligere metode er indsættelsen af en 500 nm lang bølge-pass (LWP) cut-off filter mellem laser (bølgelængde på 488 nm) og celle-kanal, som gør det muligt for den direkte analyse af fluorescens-mærket partikler (figur 1). Vores protokol adresser mange forskere i feltet fælles efterspørger en hurtig karakterisering af enkelt evt, fx efter deres forældres oprindelse. I denne protokol beskriver vi fuldstændig arbejdsgangen for hurtige isolering af evt fra humant fuldblod og hurtig karakterisering af specifikke markører af fluorescens-baserede nanopartikler-tracking analyse. Evt kan påvises ved farvning med PKH67, en generel cellemembranen linker, samt særlige exosomal markører, fx CD63, CD9, og vimentin. Vores protokol er også velegnet til EDTA og værdier plasma, samt andre kropsvæsker og celle kultur analysere.
Vi demonstrere en detaljeret protokol til isolation af evt fra fuldblod og hurtig karakterisering af specifikke overflade markører med fluorescens-baserede nanopartikler tracking analyse. I de gennemførte eksperimenter, vi anvendes udelukkende evt isoleret fra serumprøver, men denne metode er også velegnet til ethylendiamintetra syre (EDTA) og værdier plasma og kan også udvides til andre kropsvæsker såsom urin, modermælk, spyt, cerebrospinalvæsken, og sæd. Denne protokol kan desuden justeres til karakterisering af evt fra celle kultur analysere. I denne protokol, EV suspension blev genereret fra 100 μL serum ved hjælp af en exosome udfældning reagens, som indeholder en navnebeskyttet polymer, der forsigtigt udfældes exosomes og evt en corpuscular størrelse spænder fra 30 nm til 200 nm, hvorved 10-20 μL evt blev udnævnt til karakterisering af hver overflade markør. Desværre, trinnet isolation er uundgåelig, fordi den store mængde af protein i serumprøver (fx albumin og globulin) forstyrrer antistof farvning procedure og resultater i høj grad af baggrund og sofistikeret resultater. Desuden skal baseret på den biologiske tilgængelighed af exosomes i prøverne, den erhvervsdrivende EV suspension samt fortynding før behandling være justeret for andre udgangsmaterialer. At sammenligne flere prøver, en standardiseret tilgang til fortynding af prøver samt konsekvent erhvervelse parametre (sensitivitet, lukkeren, etc.) er nødvendige. Et andet vigtigt punkt er, at målingerne ikke er startet endnu indtil drivgarn er lav (i vores hænder, < 5 μm/s). Hvis drivgarn var for høj, gentagne målinger af prøven viste høj standardafvigelse indbyrdes, men med en lav drift, de resulterende data var meget konsekvent og bekræftet en høj grad af reproducerbarhed. Det er vigtigt, at de valgte antistoffer har en passende fluorokrom. Antistoffer skal konjugeret med Alexa Fluor 488, fordi FITC har en høj foto-blegning. Eventuelt vil mere stabil fluophores helt sikkert føre til øget assay stabilitet i fremtiden. Normalt, bruger mange forskere PBS som en fortyndingsmiddel for EVs. For denne protokol er det afgørende at bruge destilleret vand som et fortyndingsmiddel for EV suspensioner. Hvornår evt er mærket med fluorescerende farvestoffer, høj osmolalitet og ion koncentration af andre fortyndingsmidler, såsom PBS, kan forstyrre målingen og føre til ændret resultater.
Mens metoder til analyse af evt er blevet betydeligt forbedret i det seneste årti, er der stadig ingen standardiseret metode til isolering og karakterisering af EVs. Den store ulempe ved flowcytometri, hvor evt er ofte bundet til perler til at give en større overflade, er, at mange evt dock overfladen, til at give en stærk og påviselige signal10. SEM og TEM har den ulempe, at forberedelsen af prøver er tidskrævende og evt kan kun adskilles på deres størrelse og morfologi11. Op til dato, den best-established og almindeligt anvendte metode til kvalitativ (dvs. biokemiske) er EV karakterisering Western blotting, hvor proteiner kan analyseres med specifikke antistoffer12,13. Men ulemperne ved alle disse metoder ligge i manglende evne til at analysere enkelt evt for specifikke overflade markører. Desuden omfatte lange sagsbehandlingstider og lange vask/isolation procedurer anvendes af mange af de nuværende protokoller arbejdskrævende trin, hvilket gør dem ikke velegnet til høje prøve overførselshastighed og karakterisering af enkelt EVs. Vores protokol giver en komplet workflow for hurtig isolering og karakterisering af enkelt evt specifikke overflade markører som CD63, CD9, vimentin og CD107a, og kan udvides til et bredt spektrum af andre overflade markører til at fastslå oprindelsen af frigivne EVs. På grund af et permanent tekniske fremskridt af NTA enhed bekræftet vi vores resultater i samarbejde med fabrikanten med den nyeste analyzer. Uanset den fremtidige fremskridt af forskning på EV biologi, særlig hvad angår exosomes, vil den protokol, der er præsenteret her give en hurtig og pålidelig metode til karakterisering af enkelt evt specifikke markører. Fordi sammenlægning af evt under isolation og farvning procedure er hidtil uundgåelig, bør fremtidig forskning fokusere på at udvikle metoder til at forhindre EV sammenlægning og muliggøre en nøjagtig størrelsesbestemmelse af fluorescerende-mærket EVs.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takke partikel Metrix GmbH for delvist omkostningsdækning offentliggørelsen af dette arbejde.
Serum-separation tube | BD | 366882 | BD Vacutainer |
Ampuwa water | Fresenius Kabi | 10060 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline | Sigma | 56064C | |
Falcon tube, 15 mL | Greiner Bio One | 188271 | |
Falcon tube, 50 mL | Greiner Bio One | 227270 | |
Microcentrifuge tube, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | Speciality tubes for ultra centrifugation |
Tube with Snap-On Cap 1.5 mL | Beckman Coulter | 357448 | |
Polybeads Microspheres 0.2 µm | Polysciences, Inc. | 7304 | Alignment Solution |
Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres beads 0.2 µm | Polysciences, Inc. | 09834-10 | Alignment Solution |
Syringe, 2 mL | Braun | 4606027V | |
Syringe, 10 mL | Braun | 4606728V | |
Exoquick | SBI | EXOQ20A-1 | EV precipitation solution |
Laemmli Sample Buffer (2x) | BioRad | 1610737 | |
DC Protein Assay Kit II | BioRad | 5000112 | Lowry prtein assay |
PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Kit | Sigma | PKH67GL-1KT | For general membrane labelling |
Alexa Fluor 488 anti-human CD107a Antibody | BioLegend | 328609 | Lysosomal-associated membrane protein-1 (LAMP-1) |
Human CD9-Alexa Fluor 488 | R&D Systems | FAB1880G | |
Anti-CD9 Antibody | SBI | EXOAB-CD9A-1 | |
CD63-Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | MA5-18149 | |
FITC anti-human CD63 Antibody | BioLegend | 353005 | |
CD63. Antibody, polyclonal | SantaCruz | Sc-15363 | |
Alexa Fluor 488 anti-vimentin Antibody | BioLegend | 677809 | |
Anti-Vimentin Antibody | SBI | EXOAB-VMTN-1 | |
Goat anti mouse IgG + IgM | Jackson Immuno | 315-035-048 | |
Goat anti rabbit IgG | Dianova | 111-035-003 | |
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | ThermoFisher | 34094 | |
ZetaView | Particle Metrix | PMX 100, Type | |
Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | |
Chemiluminescence Imager | GE Healthcare | Amersham Imager 600 |