Summary
В этом протоколе мы описываем полный рабочий процесс для быстрой изоляции внеклеточного везикулы от человека цельной крови и характеризация конкретных маркеров путем анализа на основе Флуоресценция наночастиц отслеживания. Представленные результаты показывают высокий уровень воспроизводимости и может быть скорректирована в supernatants культуры клеток.
Abstract
Внеклеточные везикулы (EVs), включая exosomes, являются специализированными мембранное нано размера везикулы в жидкостях, которые конститутивно освобождаются от многих типов клеток и играть ключевую роль в регулировании ячеек коммуникации и широкий спектр биологические процессы. Были описаны многие различные методы для определения характеристик EVs. Однако большинство из этих методов имеют тот недостаток, что подготовка и квалификация образцов очень много времени, или чрезвычайно трудно проанализировать конкретные маркеры интерес из-за их малого размера и из-за отсутствия дискретных населения. Хотя за последнее десятилетие были значительно усовершенствованы методы для анализа EVs, есть еще не стандартизированный метод для характеристики одного EVs. Здесь мы демонстрируем полуавтоматический метод для характеризации одно электромобилей путем анализа на основе Флуоресценция наночастиц отслеживания. Протокол, который представлен адреса общей проблемой многих исследователей в этой области и предоставляет полный рабочий процесс для быстрой изоляции EVs и характеристика PKH67, компоновщик общей клеточной мембраны, а также с конкретными поверхностных маркеров как CD63, CD9, виментин и лизосомальных связанные мембранный белок 1 (лампа-1). Представленные результаты показывают высокий уровень воспроизводимости, что подтверждается другими методами, например Западный blotting. В проведенных экспериментах мы использовали исключительно EVs, изолированных от образцов сыворотки крови человека, но этот метод также подходит для плазмы или другими жидкостями организма и может быть скорректирована для характеризации EVs от supernatants культуры клеток. Независимо от будущего хода исследования по биологии EV протокол, который представлен здесь обеспечивает быстрый и надежный метод для быстрого характеристика одно электромобилей с конкретными маркерами.
Introduction
Внеклеточные везикулы (EVs), включая exosomes, являются специализированными мембранное нано размера везикулы (20-150 Нм) содержащие определенные комбинации липиды, адгезии и межклеточных сигнальных молекул, а также другие функциональные цитозольной компоненты как микроРНК (miRNA) и мРНК и играть ключевую роль в регулировании ячеек коммуникации1,2. EVs выпускаются в их среде из многих различных типов клеток, например, эндотелиальные клетки, клетки иммунной системы и опухолевых клеток и может быть обнаружен в жидкостях организма как сыворотки спермы, мочи, грудное молоко, слюна или спинномозговой жидкости3, 4. увеличение числа исследований подчеркивают разнообразные вклад EVs в качестве потенциальных биомаркеров для ранней диагностики нескольких заболеваний и/или прогноз болезнь прогрессии5,6. Exosomes часто характеризуются присутствие молекул, которые они конкретно связаны с, независимо от типа ячейки, которую они получают от7. К примеру, exosomes содержат различные tetraspanins (CD9, CD63, CD81), основной комплекс гистосовместимости класса я (MHC я) молекулы, различные трансмембранные белки, типичный цитозольной белки (тубулин и миозина), молекул, участвующих в multivesicular тело ( Блок измеряемых величин) биогенеза (TSG101 и Аликс), тепло белки шока (HSP 70 и HSP 90), и белки, которые участвуют в сигнала трансдукции (протеинкиназы)8.
Были описаны различные методы для характеризации EVs9. Наиболее распространенный и широко распространены методы, используемые для анализа EV являются потока цитометрии10, сканирование электронная микроскопия (SEM) и передачи электронной микроскопии (ТЕА)11. Насчитывающий и часто используемый метод для биохимических характеристик EV содержание является западной blotting12,13. В то время как SEM и ТЕА позволяют для обнаружения EVs через весь размерный ряд, весьма ограниченное определение специфических поверхностных белков является особое недостатком этих методов. В противоположность этому, проточной цитометрии является мощным инструментом для выявления конкретных EV поверхностных маркеров, но порог этого метода ограничивает анализ для EVs с размером больше чем 500 Нм. Следовательно анализ изолированных EVs с обнаружением конкретных поверхностных маркеров в настоящее время не доступен через любой из этих трех устоявшихся методов. Мы ранее описанных еще чувствительный метод для визуализации и анализа EVs, наночастиц отслеживания анализа (НТА)14. Вкратце этот метод сочетает в себе два различных физических принципах. Во-первых частицы рассеивают свет, когда они являются облученных лазерный луч, и второй принцип, известный как броуновского движения, подразумевает, что распространение различных частиц в жидкой суспензии обратно пропорциональна их размер. Инструмент анализа полуавтоматические Обои наночастиц для исследования жидких образцов состоит из частиц, отслеживания анализатор с анализа, на основе программного обеспечения, где записываются цифровые изображения рассеянного света от одной частицы. Лазерный микроскоп рассеяния с видео камерой обнаружить движение частиц и частиц. Лазерный луч ориентирован вертикально, в то время как оптической оси горизонтального и сосредоточены в канал ячейки заполнены с образцом. Данные, предоставленные земельные участки рассеянного света пятен и их скорость движения возможность определения общего количества и размера частиц. После облучения лазером, частицы рассеивают свет, который записан цифровой видеокамеры через Микроскоп14. По улучшению нашего бывшего метод является включение 500 нм длиной волны перевал (LWP) отключения фильтра между лазер (длина волны 488 нм) и мобильный канал, который позволяет прямой анализ флуоресцировани обозначенного частиц (рис. 1). Наш протокол рассматриваются общие потребность многих исследователей в этой области быстро характеристика одного EVs, например, согласно их родителей происхождения. В этом протоколе мы описываем полный рабочий процесс для быстрой изоляции EVs от человека цельной крови и быстрая характеристика конкретных маркеров путем анализа на основе Флуоресценция наночастиц отслеживания. EVs могут быть обнаружены путем пятнать с PKH67, компоновщик общей клеточной мембраны, а также с конкретными exosomal маркеров, например, CD63, CD9 и виментин. Наш протокол подходит также для ЭДТА и citrated плазмы, а также других жидкостей организма и supernatants культуры клеток.
Protocol
Институциональные этические Совет Университета Дюссельдорфа одобрил эксперименты, представленные в этой работе (номер: 3381).
1. EV изоляции от человека цельной крови
- Изолируйте EVs раствором exosome осадков.
- Сбор 2 мл крови человека целом в сыворотке разделение трубы (SST) через венепункции и инкубировать трубки для 15 мин при комнатной температуре (RT), до завершения коагуляции.
- Центрифуга SST на 1700 x g 10 мин на RT отдельные клетки от сыворотки и передать трубку реакции 1,5 мл 1 мл сыворотки. Центрифуга тромбоцитов богатые плазмы (PRP) на 3000 x g 15 мин при 4 ° C для удаления тромбоцитов и передачи 100 мкл плазмы тромбоцитов плохой (ППС) к новой пробке реакции 1,5 мл.
- Добавьте 25 мкл раствора exosome осадков (4 части PPP, 1 часть exosome осадков решение) и вихревой тщательно. Инкубируйте образца на 30 минут на льду. Держите трубу вертикально и не повернуть или смешивать трубку во время инкубационного периода.
- Центрифуга для образца на 1500 x г за 30 мин при 4 ° C до Пелле EVs. После центрифугирования EVs появляются как бежевый или белые гранулы в нижней части судна. Аспирационная супернатант и Центрифугуйте образцы на 1500 x g 5 мин при 4 ° C.
- Удалите все следы жидкости и вновь приостановить гранулы в 100 мкл фосфат амортизированное saline (PBS), часто закупорить вверх и вниз. Храните подвеска EV-80 ° c, когда анализ выполняется не сразу.
Примечание: При изоляции EVs из плазмы, фибриногена и фибрин может препятствовать эффективной восстановления и ресуспендирования тяжелых и занимает больше времени.
- Изолируйте EVs с ultracentrifugation.
- Возьмите предварительно охлажденным ротора (TLA-55 фиксированной угловой) с холодильником и охладить вниз ультрацентрифуга перед использованием.
- Передача 1,25 мл PPP (подготовленный на этапе 1.1) ultracentrifugation трубка подходящего 1,5 мл с крышкой и центрифуги образца на 110 000 g x 90 мин при 4 ° C. Убедитесь, что перед началом является сбалансированной нагрузкой ротора.
- Декант супернатант и место трубы вверх вниз на бумажное полотенце для 2 мин вновь приостановить гранулы в 500 мкл PBS и Центрифугуйте образцы на 110 000 x g 90 мин при 4 ° C.
- Аспирационная супернатант и вновь приостановить гранулы в 50 мкл PBS.
Примечание: Используйте только роторов и аксессуары предназначены для ультрацентрифуги, который используется. Предварительное тестирование труб в ротор с помощью воды, потому что сила трубок может варьироваться между партиями.
2. Окрашивание образцов
- Пятно образцы с PKH67.
- Окрашивание раствора путем добавления 1 мкл раствора обколоть красителя PKH67 50 мкл разбавителя C (входит в комплект) в 1,5 мл реакции и перемешать тщательно подготовьте.
- Передача 10 мкл окрашивание раствора до 20 мкл EV подвески (подготовленный на этапе 1.1) к пробке реакции, тщательно перемешать и проинкубируйте 5 мин на RT в темноте.
- Развести 50 мкл окрашенных EV подвеска с 2,5 мл дистиллированной воды в трубке реакции 15 мл, тщательно перемешать и использовать этот окончательный подвеска для измерения частиц.
Примечание: Важно использовать воду в качестве растворителя для подвески EV, потому что другие разбавители (например, PBS) могут ухудшить измерения. При использовании хранимых EV-подвеска, оттепель образцы на льду и тщательно перемешать до окрашивания.
- Пятно образцы с специфическими антителами.
- Развести в 10-20 мкл суспензии EV (подготовленный на этапе 1.1) с 50 мкл дистиллированной воды в 1,5 мл реакции и перемешать тщательно.
- Добавьте 2.5-5 мкл специфическое антитело (Таблица 1) к пробке реакции, тщательно перемешать и Инкубируйте 30 мин на RT в темноте.
- Передача 50 мкл окрашенных подвески EV до 2,5-10 мл дистиллированной воды (Таблица 1) в пробирке реакция 15 мл, тщательно перемешать и использовать этот окончательный подвеска для измерения частиц.
Примечание: При некоторых обстоятельствах, концентрация антител используемых должна быть скорректирована (Таблица 1).
3. обработка образцов
Примечание: Основы этого метода подробно были описаны ранее и ниже протокол фокусируется на конкретные шаги, необходимые для анализа флуоресцировани обозначенного EVs14.
- Выполните процедуру запуска.
- Вставьте фильтр флуоресценции оптического пути микроскоп и камеры. Запустите программу и следуйте инструкциям на экране для автоматического выполнения.
- Выберите правильные ячейки номер (Z158_C1149_Fluor) в закладке «Проверить клеток» (определение ячейки) для измерения флуоресценции. Выберите исходное положение для оптики, чтобы убедиться, что лазерный микроскоп общий фокус (лазерные и Микроскоп двигаться к этой позиции автоматически).
- Промойте канал клетки с помощью шприца, заполнены с 10 мл дистиллированной воды. Убедитесь, что измерения ячейка свободна от пузырьков воздуха и не вводите пузырьков воздуха в систему.
- Подготовьте калибровки подвеска, содержащих единообразные 200 Нм размера помечены флуоресцентным полистирола частицы, которые имеют карбоксилат групп на их поверхности. Разбавленной 10 мкл частиц с 990 мкл дистиллированной воды. Затем разбавьте 10 мкл 10 мл дистиллированной воды для получения требуемой концентрации раствора этой частицы в 15 мл.
- Придать 2,5 мл раствора разреженных частиц в канале ячейки и нажмите кнопку «Оптимизировать фокус» для настройки камеры.
- Измерьте образца.
- Флеш мобильный канал несколько раз с помощью шприца, заполнены с 10 мл дистиллированной воды до каждого образца измерений. Inject окрашенных подвеска EV (подготовленных на шаге 2) в клетки канала.
- Настройте следующие параметры основной камеры в закладке «Проверить ячейки» в программное обеспечение как необходимое (Таблица 2). Используйте ссылку позиции или позиции 0.41193 для регулировки параметров.
- Для чувствительности, найти диапазон оптимальной чувствительности, нажав на кнопку «Количество частиц против чувствительность» для отображения кривой измерения частиц на экране чувствительность различных уровней.
Примечание: - Для жалюзи Отрегулируйте период времени, которое Камера позволяет свету проходить определяется интервал.
- Для приобретения параметры, выбрать минимальную яркость 20, минимальный размер 20 Нм и максимальный размер 500 Нм для измерения.
- Для чувствительности, найти диапазон оптимальной чувствительности, нажав на кнопку «Количество частиц против чувствительность» для отображения кривой измерения частиц на экране чувствительность различных уровней.
- Обратите внимание на количество обнаруженных частиц в поле зрения от дисплея. В баре рассеяния должны быть в зеленый оранжевый круг (50-300 частицы). Если панель рассеяния красный, разброс будет предохранитель индивидуальных частиц, и они считаются одной одной частицы, что приводит к ложным результатам. В таком случае дальнейшего разбавления образца, чтобы избежать дублирования частиц или понизить чувствительность.
- Нажмите «Проверить частиц дрейф в 0 V» на вкладке «Проверка ячейки» перед началом измерения. Если дрейфа выше 5 мкм/s, подождите, пока образец останавливается течет продолжать измерение.
Примечание: Если дрейф слишком высока в начале измерения, повторные измерения может отличаться и лишать результаты. Из-за основополагающих принципов НТА соответствующие дрейф может повлиять в размер определяется частиц, как вычисляемые программным обеспечением. - Нажмите на «Запустить видео приобретения» в закладке «Измерение» выберите количество экспериментов (3-5) и время задержки между ними (0 мин).
- Определить количество (индивидуальный subvolume-) позиций (11) и количество циклов (измерение) (10) на каждой позиции измерения, где частицы должны быть проанализированы
- Выберите папку, создайте новое имя файла и нажмите кнопку «ОК», чтобы начать измерение.
4. Толкование результатов
- Просмотрите результаты и параметры на вкладке «Анализ» после измерения. Проверьте следующие параметры после анализа перед очисткой ячейки канала: среднее количество частиц в положение, общее количество отслеживаемых частиц и концентрации частиц, ширина распределения частиц (x10, x50 и x90 значения), значение среднее и стандартное отклонение. Если требуется, повторите измерение образца.
Примечание: Также результаты сохраняются в формате .pdf или .txt. - Нажмите на вкладку «Анализ» для просмотра на графике, рассчитываются после измерения, который показывает распределение обнаруженных частиц по размеру. Нажмите на «Отображение» в закладке «Анализ» и используйте значки для настройки и измените настройки графиков для конкретных требований.
5. Проверка через EV обнаружение западный Blotting
- Распустить EV Пелле (подготовленных на шаге 1) в лизис и извлечения буфер RIPA, Пипетка тщательно и инкубировать на льду на 30 мин центрифуги образца на 8000 x g 10 мин при температуре 4 ° C для уточнения lysate и передать новой трубки супернатант.
- Измерьте общий белок набор assay протеина Lowry. Разбавьте 1 мкл изолированных EV подвеска с 49 мкл Буфер RIPA и использовать 5 мкл в triplicates для анализа. Разбавить EV подвеска с 2 x Laemmli загрузки буфера до конечной концентрации 2 мкг/мкл и тепла в течение 10 минут при 95 ° C.
- Загрузите 20 мкг белка на хорошо. Отдельные и переноса белков путем электрофореза геля полиакриламида и танк промокательной согласно стандартных протоколов.
- Блокировать мембраны (Фторид винилидена 0.2 мкм) с бычьего сухое молоко (5%) за 1 ч в RT и Проинкубируйте мембрану с первичного антитела (CD9, CD63 и виментин) на ночь при 4 ° C.
Примечание: Первичного антитела используются в разведении 1:1,000. - Промойте мембрану с TBST 3 x 5 мин и Проинкубируйте мембрану с пероксидазой хрена (ПХ)-конъюгированных вторичное антитело (1:20, 000 в TBST) 60 мин на RT.
- Промойте мембрану с TBST 3 x 5 мин и обнаруживать белки, хемилюминесценция с высокой чувствительностью раствора субстрата на съемочной системы.
Примечание: Потому что CD63 антигена широко и переменно гликозилированного, молекулярная масса может варьироваться, и полосы могут появляться между 40-65 кДа.
Representative Results
EVs были изолированы от цельной крови и характеризуется наночастиц, отслеживание анализ флюоресцирующей реагентами. Оптимальной чувствительности для измерения неокрашенных частиц была выявлена в диапазоне на 70% во время наших экспериментов. Флуоресцентный бусы, используется для перестройки и калибровка приборов для измерения показали оптимальной настройки на чувствительность 85% (рис. 2A). Чувствительность 70%-90% количество обнаруженных частиц увеличился, в то время как дальнейшего повышения чувствительности может привести к ухудшению распределения размера частиц, где количество частиц вновь снижается. Параметры камеры отображается резкое изображение (рис. 2B) и неоднократные замеры показали низкий стандартное отклонение (рис. 2 c). Той протокол для обработки образцов EVs была скорректирована таким образом, чтобы все измерения могут проводиться с теми же параметрами (Таблица 2). Ширина распределения определяется три значения по оси x, x10, x50 и x90. X50, или размер средний частиц — диаметр, при котором половина населения находится ниже этого значения. Аналогично x10 и x90 указывают на которой 10% и 90% обнаруженных частиц находятся под сообщил размер диаметра. Окрашивание с PKH67 клеток компоновщика комплект, включая люминесцентные клеток компоновщик, который включает зеленый Люминесцентную краску с длинных алифатических хвосты в регионы липидов клеточных мембран, продемонстрировал сильная корреляция между чувствительностью и количество частицы измерено (рис. 3A). PKH67 часто используется для распространения контроля, но также оказался полезным для мониторинга exosome или липосом поглощения как в естественных условиях торговли клеток. Из-за маркировки неспецифические PKH67, широкий спектр EVs можно помечены и обнаружены. Распределение частиц был в диапазоне от 266 Нм (x10) и 1946 Нм (x90) с пик максимум в 857 Нм (x50) и с низкой стандартное отклонение между измерениями (28,1 Нм). ЛАМПА-1, также известный как связанные лизосомальных мембран гликопротеина 1 и CD107a проживают главным образом через лизосомальных мембран. После окрашивания с Alexa Fluor 488 помечены специфическое антитело против лампа-1, распределение частиц колеблется от 220 Нм (x10) до 1145 Нм (x90) с пик максимум в 541 Нм (x50) и стандартное отклонение 11,7 Нм (рис. 3B). Для характеризации EVs мы использовали Alexa Fluor 488 помечены антител против общих exosomal маркеры и подтверждают наши выводы Западный blotting. После окрашивания с Alexa Fluor 488-меченых CD9-антитела, распределение частиц колеблется от 251 Нм (x10) до 1139 Нм (x90) с пик максимум в 548 Нм и второй незначительные пика примерно 25 Нм (рис. 4A). Окрашивание с Alexa Fluor 488 помечены CD63 (рис. 4B) и виментин (рис. 4 c) дали аналогичные результаты. Западной blotting анализа обоснованы наш положительный результат для антитела использованы здесь. Повторные измерения показали воспроизводимые результаты для всех антитела, используемые в настоящем докладе. Как элементы управления мы окрашенных везикул, свободной воды с соответствующими антителами (Рисунок 5A), где PKH67 и LAMP1 антител практически обнаружено не EV до чувствительность близка к 100%. Используя пример виментин, высокая чувствительность увеличилось количество новых предметов, даже когда образец по существу свободен частиц. Если измерение начинается, когда дрейф еще слишком высока (> 5 мкм/s), отдельные повторений отчетливо отличаться между собой (рис. 5B). Как представлено с трех различных антител, важно, что дрейф минимально возможной перед началом измерения. Согласно нашему опыту, использование флуоресцеин Изотиоцианаты (FITC) в качестве флюрохром результаты измерений, которые не являются точные и воспроизводимые потому что FITC подвержен быстрому фото отбеливание (рис. 5 c). Поэтому мы рекомендуем использовать исключительно Alexa Fluor 488 помечены антитела для характеризации EV. В этом протоколе EVs были изолированы на полимерной основе exosome осадков раствор, содержащий полиэтиленгликоля. Чтобы гарантировать, что наши результаты не будут сфальсифицированы методом прикладной изоляции, мы характеризуется EVs после изоляции с ultracentrifugation. Как с PKH67 и два различных антител (CD63 и лампа-1), результаты нашего прикладная изоляции раствором exosome осадков (рис. 6A) сопоставимы с EVs изолированных через ultracentrifugation (Рисунок 6B ). К сожалению, из-за плохого урожая EVs после ultracentrifugation, первоначальный набор сыворотки для изоляции должна быть намного выше по сравнению с изоляции раствором exosome осадков.
Рисунок 1: схема установки наночастиц, отслеживания анализа. Оси и лазерный луч Микроскоп/видео ориентированы ортогонально друг к другу, пересекая в ячейке канал поперечного сечения. Флуоресценции фильтр помещается между клеток канала и Микроскоп. Света, рассеянного частицы отображается в окне «Просмотр» программного обеспечения. После приобретения результаты отображаются в виде системы координат кривой распределения размера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: калибровка с флуоресценцией помечены бусины. (A) количество частиц против кривой чувствительности отображает частицы в одном положении в одной точке во времени при проверке Автоматическая чувствительность. (B) визуализация частиц на экране в режиме реального времени. (C) фракция распределение после повторных измерений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: представитель результаты после окрашивания с PKH67 и лампа-1. Количество частиц против чувствительность кривой (1), Визуализация частиц на просмотре экрана (2) и размер распределение частиц (3) после окрашивания с PKH67 (A) и лампа-1 (B). Подобное распределение размера частиц наблюдается, хотя изменения в чувствительности, установление аналогичных, но еще не полностью идентичные изменения обнаруженных частиц свинца. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: представитель результатов после окрашивания с Alexa Fluor 488 помечены CD9, CD63 и виментин. Количество частиц против чувствительность кривой (1), Визуализация частиц на экране просмотра (2), распределение размеров частиц (3) и представитель западных помарках двух различных суспензий EV (4) для CD9 (24-27 кДа, A), CD63 (26 кДа, B) и виментин (54 кДа, C). Позднего появления частицы сигналы вдоль повышение чувствительности (ось x) коррелирует с меньшей интенсивностью сигнала в западной помарки анализа, подтверждающего меньшее количество соответствующих частиц поверхности маркера (например, виментин против CD63). Обратите внимание на почти идентичных кривых представитель измерений для всех проанализированных задающие высокую воспроизводимость (3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: представитель результаты для используемых элементов управления и источников возможных ошибок. (A) везикул свободной воды витражи с PKH67 (1), лампа-1 (2) и виментин (3) как элементы управления. (B) представитель частиц размер дистрибутивов после окрашивания с лампа-1 (1), CD63 (2) и CD9 (3), и измерения выполнены при подвеска дрейф еще слишком высока. (C) количество частиц против кривой чувствительности (1) и распределение частиц по размерам (2) после окрашивания с антителом меченого FITC CD63. Четкие отбеливающий эффект наблюдается после каждого измерения, что приводит к постепенно меньшее количество частиц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: сравнение различных методов для EVs. Распределение по размерам частиц EVs, изолированные с exosome осадков решение (A) и ultracentrifugation (B) после окрашивания с PKH67 (1), лампа-1 (2) и CD63 (3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| ЛАМПА-1 | CD9 | CD63 | Виментин | |
| Антитела (мкл) | 5 | 2,5-5 | 2,5-5 | 5 |
| EV подвеска (мкл) | 10 | 20 | 10 | 10 |
| H2O (мкл) для окрашивания | 50 | 50 | 50 | 50 |
| Окончательный объем (мл) | 5-10 | 2,5-5 | 5 | 10 |
Таблица 1: Список используемых антител и разбавления спектр образцов.
| Приобретение параметры | |
| Чувствительность (%) | 85 |
| Затвора | 70 |
| Min. яркость | 20 |
| Макс. Размер (Нм) | 500 |
| Мин размер (Нм) | 20 |
| Полярность | Негативные |
| Напряжения | Выкл |
| Дрейф частиц в 0 V (микрон/сек) | < 5 |
| Позиции | 11 |
| Циклы | 10 |
| Несколько приобретений | 3-5 |
| Время задержки (мин) | 0 |
Таблица 2: Приобретение параметры для отслеживания анализа наночастиц.
Discussion
Мы демонстрируем подробный протокол для изоляции EVs от цельной крови и быстрая характеристика конкретных поверхностных маркеров с на основе Флуоресценция наночастиц, отслеживания анализа. В проведенных экспериментах мы использовали исключительно EVs, изолированных от образцов сыворотки, но этот метод также подходит для Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) и citrated плазмы и также может быть расширена до других телесных жидкостей, таких как моча, грудное молоко, слюна, спинномозговой жидкости и спермы. Кроме того этот протокол может настраиваться для характеризации EVs от supernatants культуры клеток. В этом протоколе EV подвеска был создан из 100 мкл сыворотки с помощью exosome осадков реагента, который содержит несвободные полимер, который мягко осаждает exosomes и EVs согласно корпускулярная размер в диапазоне от 30 Нм до 200 Нм, whereby 10-20 мкл из EVs были назначены для характеристики каждой поверхности маркера. К сожалению изоляции шаг неизбежен, потому что большое количество белка в образцах сыворотки (например, альбумин и глобулина) вмешивается антитело пятная процедуру и приводит к высоким уровнем фона и сложные выводы. Кроме того на основе биологической доступности exosomes в образцах, количество занятых EV подвески, а также разведение перед обработкой должна корректироваться для других исходных материалов. Чтобы сравнить несколько образцов, необходим стандартизированный подход для разведения образцов, а также параметры последовательного приобретения (чувствительность, затвор и т.д.). Другим важным моментом является не начала измерений до тех пор, пока дрейф является низким (в наших руках, < 5 мкм/s). Если дрейф была слишком высокой, повторные измерения образца принесли высокое стандартное отклонение между собой, но с низкий дрейф, полученные данные были весьма последовательной и подтвердил высокий уровень воспроизводимости. Важно, что выбранный антитела имеют соответствующие флюрохром. Антитела должны проспряганное с Alexa Fluor 488, потому что FITC имеет высокую скорость фото-отбеливания. Возможно более стабильные fluophores безусловно приведет к увеличению пробирного стабильности в будущем. Как правило многие исследователи используют PBS в качестве разбавителя для EVs. Для этого протокола важно использовать дистиллированную воду в качестве разбавителя для суспензий EV. Когда EVs помечены флуоресцентных красителей, высокий осмотического давления и концентрации ионов другими растворителями, например PBS, может мешать измерения и привести к изменить результаты.
Хотя за последнее десятилетие были значительно усовершенствованы методы для анализа EVs, есть еще не стандартизированный метод для изоляции и характеристика EVs. Основным недостатком проточной цитометрии, где EVs часто привязаны к бусины предоставлять большую поверхность, что многие EVs док на поверхность для обеспечения сильной и обнаружить сигнал10. SEM и ТЕА имеют тот недостаток, что подготовка образцов является длительным и EVs можно отличить только по их размер и морфология11. На сегодняшний день, насчитывающий и часто используемый метод для качественного (т.е. биохимические) Характеристика EV это западной blotting, где белки могут быть проанализированы с специфическими антителами12,13. Однако недостатки этих методов лежат в неспособности анализировать одно электромобилей для конкретных поверхностных маркеров. Кроме того долгое время обработки и длинные Стиральная/изоляции процедур используются многие из нынешних протоколов включают трудоемкие шаги, делая их не подходит для высокого образца пропускной способности и характеристика одного EVs. Наш протокол обеспечивает полный рабочий процесс для быстрой изоляции и характеристика одно электромобилей с конкретными поверхностных маркеров, например CD63, CD9, виментин и CD107a и может быть расширена для широкого спектра других поверхностных маркеров, чтобы определить происхождение выпущенные EVs. Из-за постоянного технического прогресса НТА устройства мы подтвердили наши выводы в сотрудничестве с производителем с помощью новейших анализатора. Независимо от будущего хода исследования по биологии EV, особенно относительно exosomes протокол, который представлен здесь обеспечит быстрый и надежный метод для характеризации одно электромобилей с конкретными маркерами. Потому что агрегирование EVs в изоляции и окрашивание процедуры пока является неизбежным, будущие исследования должны сосредоточиться на разработке методов для предотвращения агрегации EV и позволить для определения точного размера люминесцентные меченых EVs.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы благодарят частиц Metrix GmbH для частично покрытия расходов на публикацию этой работы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Serum-separation tube | BD | 366882 | BD Vacutainer |
| Ampuwa water | Fresenius Kabi | 10060 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Sigma | 56064C | |
| Falcon tube, 15 mL | Greiner Bio One | 188271 | |
| Falcon tube, 50 mL | Greiner Bio One | 227270 | |
| Microcentrifuge tube, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | Speciality tubes for ultra centrifugation |
| Tube with Snap-On Cap 1.5 mL | Beckman Coulter | 357448 | |
| Polybeads Microspheres 0.2 µm | Polysciences, Inc. | 7304 | Alignment Solution |
| Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres beads 0.2 µm | Polysciences, Inc. | 09834-10 | Alignment Solution |
| Syringe, 2 mL | Braun | 4606027V | |
| Syringe, 10 mL | Braun | 4606728V | |
| Exoquick | SBI | EXOQ20A-1 | EV precipitation solution |
| Laemmli Sample Buffer (2x) | BioRad | 1610737 | |
| DC Protein Assay Kit II | BioRad | 5000112 | Lowry prtein assay |
| PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Kit | Sigma | PKH67GL-1KT | For general membrane labelling |
| Alexa Fluor 488 anti-human CD107a Antibody | BioLegend | 328609 | Lysosomal-associated membrane protein-1 (LAMP-1) |
| Human CD9-Alexa Fluor 488 | R&D Systems | FAB1880G | |
| Anti-CD9 Antibody | SBI | EXOAB-CD9A-1 | |
| CD63-Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | MA5-18149 | |
| FITC anti-human CD63 Antibody | BioLegend | 353005 | |
| CD63. Antibody, polyclonal | SantaCruz | Sc-15363 | |
| Alexa Fluor 488 anti-vimentin Antibody | BioLegend | 677809 | |
| Anti-Vimentin Antibody | SBI | EXOAB-VMTN-1 | |
| Goat anti mouse IgG + IgM | Jackson Immuno | 315-035-048 | |
| Goat anti rabbit IgG | Dianova | 111-035-003 | |
| SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | ThermoFisher | 34094 | |
| ZetaView | Particle Metrix | PMX 100, Type | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | |
| Chemiluminescence Imager | GE Healthcare | Amersham Imager 600 |
References
- Ibrahim, A., Marban, E. Exosomes: Fundamental Biology and Roles in Cardiovascular Physiology. Annual Review of Physiology. 78, 67-83 (2016).
- Su, S. A., et al. Emerging role of exosome-mediated intercellular communication in vascular remodeling. Oncotarget. 8 (15), 25700-25712 (2017).
- Lasser, C., et al. Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages. Journal of Translational Medicine. 9, 9 (2011).
- Li, M., et al. Analysis of the RNA content of the exosomes derived from blood serum and urine and its potential as biomarkers. Philosophical Transactions of The Royal Society B Biological Sciences. 369 (1652), (2014).
- Lin, J., et al. Exosomes: novel biomarkers for clinical diagnosis. The Scientific World Journal. 2015, 657086 (2015).
- Properzi, F., Logozzi, M., Fais, S. Exosomes: the future of biomarkers in medicine. Biomarkers in Medicine. 7 (5), 769-778 (2013).
- Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).
- De Toro, J., Herschlik, L., Waldner, C., Mongini, C. Emerging roles of exosomes in normal and pathological conditions: new insights for diagnosis and therapeutic applications. Frontiers in Immunology. 6, 203 (2015).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 3 Unit 3 22 (2006).
- Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
- Wu, Y., Deng, W., Klinke, D. J. 2nd Exosomes: improved methods to characterize their morphology, RNA content, and surface protein biomarkers. Analyst. 140 (19), 6631-6642 (2015).
- Bianco, N. R., Kim, S. H., Morelli, A. E., Robbins, P. D. Modulation of the immune response using dendritic cell-derived exosomes. Methods in Molecular Biology. 380, 443-455 (2007).
- Conde-Vancells, J., et al. Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes. Journal of Proteome Research. 7 (12), 5157-5166 (2008).
- Mehdiani, A., et al. An innovative method for exosome quantification and size measurement. Journal of Visualized Experiments. (95), 50974 (2015).
