Summary
ב פרוטוקול זה, אנו מתארים את זרימת העבודה מלאה עבור בידוד מהיר של שלפוחית חוץ-תאי של דם אנושי ואפיון של סמני ספציפיים על-ידי ניתוח מעקב nanoparticle מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית. התוצאות שהוצגו להציג רמה גבוהה של הפארמצבטית, ניתן לכוונן תא תרבות supernatants.
Abstract
שלפוחית חוץ-תאית (EVs), כולל exosomes, הם מיוחדים עלי הלוואי קרומיים בגודל ננו שלפוחית נמצאו נוזלי גוף צורונים משתחררים מכל סוגי תאים רבים, לשחק תפקיד מרכזי בוויסות תקשורת, מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים. שיטות שונות רבות אפיון EVs תוארו. עם זאת, רוב השיטות האלה יש החיסרון כי הכנה ואפיון של הדגימות הן זמן רב, או קשה מאוד לנתח סמנים ספציפי של ריבית בשל גודלם הקטן, בשל היעדר דיסקרטית אוכלוסיות. בעוד שיטות לניתוח של EVs שופרו במידה ניכרת בעשור האחרון, יש עדיין אין שיטה סטנדרטית פלואורסנציה EV יחידס כאן, נדגים שיטה אוטומטי למחצה של אפיון של EVs יחיד על-ידי ניתוח מעקב nanoparticle מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית. פרוטוקול המוצג מטפל בבעיה נפוצה של חוקרים רבים בתחום זה ומספק את זרימת עבודה עבור בידוד מהיר של EVs ואפיון עם PKH67, מקשר קרום התא הכללית, כמו גם עם מסוים סמנים משטח כזה כמו CD63, CD9, vimentin, חלבון ממברנלי lysosomal-הקשורים 1 (המנורה-1). התוצאות שהוצגו להציג רמה גבוהה של הפארמצבטית, כפי שאושר על-ידי שיטות אחרות, כגון סופג המערבי. בניסויים מתנהל, השתמשנו באופן בלעדי EVs מבודד מן הדוגמאות סרום אנושי, אך שיטה זו מתאימה גם עבור פלזמה או נוזלי גוף אחרים, ניתן לכוונן את האפיון של EVs מן התא תרבות supernatants. ללא קשר ההתקדמות העתידית של מחקר על ביולוגיה EV, פרוטוקול זה מוצג כאן מספק שיטה מהירה ואמינה אפיון מהירה של EVs יחיד עם סמנים ספציפיים.
Introduction
שלפוחית חוץ-תאית (EVs), כולל exosomes, הם מיוחדים עלי הלוואי קרומיים בגודל ננו שלפוחית (20-150 ננומטר) המכיל בשילובים מסוימים של ליפידים, אדהזיה מולקולות איתות המערכת, כמו גם רכיבים פונקציונליים אחרים cytosolic כמו microRNA (miRNA) ה-mRNA, ואתה משחק תפקיד מרכזי בוויסות תא-תא-תקשורת-1,-2. EVs משתחררים לסביבה שלהם רבים לסוגי תאים שונים, למשל, תאי אנדותל, תאים חיסוניים, תאים סרטניים, ניתן להבחין בנוזלי גוף כגון סרום זרע, שתן, חלב אם, רוק או נוזל מוחי שדרתי3, 4. Increasing מספרים של מחקרים לסמן את תרומתו מגוונות של EVs סמנים ביולוגיים פוטנציאלי לאבחון מוקדם של מחלות מספר ו/או חיזוי של המחלה התקדמות5,6. Exosomes מתוארים לעתים קרובות על ידי הנוכחות של מולקולות שהן משוייכות באופן ספציפי, ללא תלות בסוג התא שהם שואבים7. לדוגמה, exosomes מכילים tetraspanins שונים (CD9, CD63, CD81), רס ן histocompatibility מורכב מחלקה אני (MHC אני) מולקולות, חלבונים transmembrane שונים, חלבונים cytosolic טיפוסי (טובולין, אקטין), מולקולות מעורב (גוף multivesicular להן MVB) (TSG101 ונתנאל כהן), מחממים חלבונים הלם (HSP 70 ו- HSP 90), חלבונים להשתתף האות התמרה חושית (חלבונים kinases)8.
בשיטות רבות ומגוונות תוארו על האפיון של EVs9. השיטות הנפוצות ביותר בשימוש לניתוח EV הם לזרום cytometry10, סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM) והילוכים מיקרוסקופ אלקטרונים (TEM)11. שיטת best-established ונמצאים בשימוש נפוץ איפיון ביוכימי של תוכן EV הוא מערבי סופג12,13. בעוד SEM, TEM לאפשר הגילוי של EVs הקשת גודל כולו, הזיהוי מוגבלת מאוד של חלבונים פני שטח מסוים הוא חיסרון מסוים בשיטות אלה. לעומת זאת, cytometry זרימה הוא כלי רב עוצמה עבור זיהוי ספציפי EV סמני פני השטח, אבל הסף של שיטה זו מגבילה את ניתוח EVs עם גודל גדול מ 500 ננומטר. ומכאן, ניתוח של EVs מבודד עם זיהוי של סמני פני שטח מסוים הוא כרגע לא נגיש באמצעות כל אחת מהשיטות ומבוססת שלושה אלה. תיארנו קודם לכן עוד שיטה רגישה מאוד עבור הדמיה וניתוח של EVs, ננו-חלקיק-מעקב ניתוח (נ)14. בקצרה, שיטה זו משלבת שני עקרונות פיזיים שונים. ראשית, חלקיקים פיזור אור כאשר הם נמצאים מוקרן עם קרן לייזר, העיקרון השני, המכונה תנועה בראונית, מרמז כי דיפוזיה של חלקיקים שונים בהשעיה נוזלי הוא ביחס הפוך לגודל שלהם. כלי ניתוח אוטומטי למחצה nanoparticle בשולחן העבודה עבור דגימות נוזלים מורכב החלקיק מעקב מנתח עם ניתוח המבוסס על תוכנה, שבו יירשמו תמונות דיגיטליות של אור מפוזר של חלקיקים בודדים. החלקיקים, את תנועת החלקיקים מזוהים על ידי מיקרוסקופ פיזור לייזר עם מצלמת וידאו. קרן הלייזר מכוון אנכית לציר האופטי הוא אופקי וממוקד לתוך התעלה התא מלא המדגם. הנתונים שסופקו על-ידי חלקות מפוזרות נקודות האור ומהירות שלהם התנועה מאפשרים הקביעה של התפלגות ספירת וגודל החלקיקים הכולל. לאחר הקרנה על ידי הלייזר, החלקיקים פיזור האור, אשר נרשם על ידי מצלמת וידאו דיגיטלית באמצעות מיקרוסקופ14. קידום לשיטה לשעבר שלנו היא החדרת 500 ננומטר ארוך גל (LWP) ניתוק מסנן לעבור בין הלייזר (אורך גל של 488 ננומטר) וערוץ התא, המאפשר ניתוח ישירה של חלקיקים התווית על-ידי קרינה פלואורסצנטית (איור 1). פרוטוקול שלנו כתובות משותף הביקוש של חוקרים רבים בתחום זה אפיון מהיר של EVs יחיד, למשל, על-פי מוצאם הורים. ב פרוטוקול זה, אנו מתארים את זרימת העבודה מלאה עבור בידוד מהיר של EVs של דם אנושי ואפיון מהיר של סמני ספציפיים על-ידי ניתוח מעקב אחר חלקיקים המבוססת על ידי קרינה פלואורסצנטית. ניתן להבחין EVs מכתים עם PKH67, מקשר קרום התא הכללית, כמו גם עם סמנים exosomal ספציפי, למשל, CD63, CD9 ו- vimentin. פרוטוקול שלנו מתאים גם EDTA, פלזמה citrated, כמו גם אחרים נוזלי הגוף, תא תרבות supernatants.
Protocol
המנהלים אתית מוסדית של האוניברסיטה של דיסלדורף אישר את הניסויים שהוצגו בעבודה זו (מספר אסמכתא: 3381).
1. EV בידוד של דם אנושי
- לבודד EVs exosome משקעים פתרון.
- לאסוף 2 מ"ל של דם אנושי שלם בסרום-הפרדת צינורות (SST) באמצעות venipuncture, דגירה הצינור למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT) עד לסיום קרישת הדם.
- Centrifuge את SST ב x 1,700 g 10 דקות ב RT בתאים נפרדים מסרום ולהעביר 1 מ"ל של הנסיוב ל צינור התגובה 1.5 mL. Centrifuge טסיות דם עשיר פלזמה (PRP) ב x 3000 g למשך 15 דקות ב 4 ° C להסיר טסיות ולהעביר μL 100 של פלזמה טסיות-עני (PPP) ל צינור 1.5 mL התגובה.
- להוסיף 25 µL של פתרון משקעים exosome (PPP לארבעה חלקים, חלק 1 exosome משקעים פתרון), מערבולת ביסודיות. דגירה המדגם במשך 30 דקות על קרח. לשמור את הצינור זקוף ולא לסובב או לערבב את הצינור במהלך תקופת הדגירה.
- Centrifuge הדגימה ב x 1,500 g למשך 30 דקות ב- 4 ° C עד גלולה של EVs. לאחר צנטריפוגה, EVs מופיעים גלולה בז או לבן בתחתית הכלי. וארוקן את תגובת שיקוע, centrifuge את הדגימה ב x 1,500 g למשך 5 דקות ב 4 º C.
- להסיר כל עקבות של נוזל, מחדש להשעות את צניפה ב 100 µL של באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) מאת לעתים קרובות pipetting למעלה ולמטה. לאחסן את המתלים EV ב-80 מעלות צלזיוס כאשר ניתוח לא מבוצע באופן מיידי.
הערה: כאשר בידוד EVs מ פלזמה, פיברינוגן, פיברין לטרפד שחזור יעיל, resuspension כבד ולוקח יותר זמן.
- לבודד EVs עם ultracentrifugation.
- קח הרוטור טרום מקורר (TLA-55 קבוע-זוויתי) מקרר, תרגע ultracentrifuge לפני השימוש.
- 1.25 מ של PPP (להכין בשלב 1.1) להעביר צינור ultracentrifugation מתאימים 1.5 מ עם מכסה, centrifuge את הדגימה ב x 110,000 g למשך 90 דקות ב 4 º C. ודא כי המטען רוטור מאוזן לפני שמתחילים.
- Decant את תגובת שיקוע ואת המקום צינור הפוך על מגבת נייר עבור 2 דק מחדש להשעות את צניפה ב μL 500 ל- PBS centrifuge הדגימה ב 110,000 x g למשך 90 דקות ב 4 º C.
- וארוקן את תגובת שיקוע, מחדש להשעות את צניפה ב- 50 μL ל- PBS.
הערה: השתמש רק הרוטורים ואביזרים המיועדים ultracentrifuge הנמצאת בשימוש. Pretest הצינורות בתוך הרוטור באמצעות מים, כי כוחו של הצינורות עשויים להשתנות בין מגרשים.
2. צביעת של הדגימות
- כתם דגימות עם PKH67.
- להכין את הפתרון צביעת על-ידי הוספת 1 μL של הפתרון צבע ethanolic PKH67 μL 50 של diluent C (כלול בערכה) 1.5 mL התגובה שפופרת, לערבב ביסודיות.
- להעביר 10 μL של הפתרון מוכתמים μL 20 של ההשעיה EV (להכין בשלב 1.1) אל הצינור התגובה, לערבב ביסודיות, תקופת דגירה של 5 דקות ב RT בחושך.
- לדלל 50 μL של ההשעיה EV ויטראז'ים עם 2.5 מ ל מזוקקים מים בצינור תגובה 15 מ"ל, לערבב היטב ולהשתמש ההשעייה הסופי למדידה של חלקיקים.
הערה: זה חיוני כדי להשתמש במים כמו diluent עבור EV ההשעיה, בגלל מדלל אחרים (למשל, PBS) עלול לפגום את המדידה. בעת שימוש המאוחסנים EV-השעיה, להפשיר את הדגימות בקרח ומערבבים ביסודיות לפני צביעת.
- כתם דגימות עם נוגדנים ספציפיים.
- לדלל 10-20 μL של ההשעיה EV (להכין בשלב 1.1) עם 50 μL של מים מזוקקים 1.5 mL התגובה שפופרת, לערבב היטב.
- להוסיף 2.5-5 μL של נוגדן ספציפי (טבלה 1) הצינור התגובה, לערבב היטב, וכן תקופת דגירה של 30 דקות ב- RT בחושך.
- להעביר 50 μL של ההשעיה EV מוכתם 2.5-10 מ ל מים מזוקקים (טבלה 1) צינור תגובה 15 מ"ל, לערבב היטב ולהשתמש ההשעייה הסופי למדידה של חלקיקים.
הערה: בנסיבות מסוימות, הריכוז של הנוגדן משומש חייב להיות מותאם (טבלה 1).
3. עיבוד של הדגימות
הערה: העקרונות הבסיסיים של שיטה זו בהרחבה שתוארו קודם לכן ומתחת את מתמקדת פרוטוקול על המדרגות ספציפיים לצורך ניתוח של התווית על-ידי קרינה פלואורסצנטית EVs14.
- בצע את ההליך האתחול.
- לדחוף את המסנן קרינה פלואורסצנטית לתוך הנתיב אופטי של מיקרוסקופ, מצלמה. הפעלת התוכנית ובצע את ההוראות על המסך עבור אוטומטית מימוש.
- בחר את המספר הנכון תא (Z158_C1149_Fluor) "תא לבדוק" (הגדרה תא) על הכרטיסיה פלורסצנטיות מדידה. בחר את מיקום התייחסות לצורך אופטיקה לוודא כי לייזר במיקרוסקופ הינם מוקד משותף (לייזר ומיקרוסקופ לעבור עמדה זו באופן אוטומטי).
- לשטוף את הערוץ תא עם מזרק מלא 10 מ ל מים מזוקקים. ודא כי התא מדידה ללא בועות אוויר, לא להזריק בועות אוויר לתוך המערכת.
- להכין השעיה כיול המכיל אחיד 200 ננומטר בגודל מתויג פלורסצנטיות פוליסטירן חלקיקים בעלי קבוצות carboxylate על פני השטח שלהם. ΜL 10 שתדללו של החלקיקים עם 990 μL מים מזוקקים. ואז לדלל 10 μL של פתרון זה חלקיקים בשפופרת 15 מ"ל עם 10 מ"ל מים מזוקקים כדי להשיג את הריכוז הדרוש.
- להזריק 2.5 מ של הפתרון מדולל חלקיקים בערוץ התא ולחץ על "לייעל את המוקד" כדי להתאים את המצלמה.
- למדוד את הדגימה.
- לשטוף את הערוץ תא מספר פעמים עם מזרק מלא 10 מ"ל מים מזוקקים לפני כל מדידה לדוגמה. להזריק את המתלים EV ויטראז'ים (להכין בשלב 2) לתוך התעלה תא.
- להתאים את הפרמטרים הבאים המצלמה הראשית בכרטיסיה "תא לבדוק" בתוכנה כמו הצורך (טבלה 2). השתמש המיקום הפניה או הצב 0.41193 כדי להתאים את הפרמטרים.
- רגישות, למצוא את טווח רגישות אופטימלית על ידי לחיצה על לחצן "מספר של חלקיקים לעומת רגישות" להצגת עקומת של חלקיקים נמדד לפי המסך עבור רמות רגישות שונה.
הערה: - תריס, להתאים את תקופת הזמן שבו המצלמה מאפשר לאור לעבור עבור מרווח נחוש.
- עבור פרמטרים שלאחר הרכישה, לבחור הבהירות מינימלי של 20, בגודל מינימלי של 20 ננומטר, הגודל המרבי של 500 ננומטר למדידה.
- רגישות, למצוא את טווח רגישות אופטימלית על ידי לחיצה על לחצן "מספר של חלקיקים לעומת רגישות" להצגת עקומת של חלקיקים נמדד לפי המסך עבור רמות רגישות שונה.
- רשום את מספר החלקיקים שזוהו במניין את שדה הראייה של מהתצוגה. הבר פיזור חייב להיות ירוק למטווח כתומה (חלקיקי 50-300). אם הבר פיזור אדום, הפיזור נתיך חלקיקים בודדים, הם הנספרות בתור חלקיק בודד אחד, ובכך מוביל כוזב. במקרה כזה, עוד יותר לדלל את הדגימה כדי למנוע חפיפה של חלקיקי או להפחית את הרגישות.
- לחץ על "בדיקת חלקיקים להיסחף ב 0 V" בכרטיסיה "תא לבדוק" לפני שמתחילים את המדידה. אם הסחף הוא גבוה יותר מאשר μm 5/s, המתן עד המדגם יפסיק לזרום כדי להמשיך את המדידה.
הערה: אם הסחף גבוהה מדי בתחילת המדידה, המידות חוזרות ניתן שונים, sophisticate את התוצאות. בשל עקרונות היסוד של נ. ת. סחיפה הרלוונטיים עשויים להיות לו השפעה גודל החלקיקים נחוש, כפי שמחשבת התוכנה. - לחץ על "הפעל וידאו רכישה" היחידים "מדידה" בחר את מספר ניסויים (3-5) ואת משך ההשהיה ביניהם (0 דקות).
- הגדרת המספר (בודדים subvolume) משרות (11) ואת מספר מחזורים (מדידה) (10) במיקום כל מדידה, היכן צריך להיות מנותח חלקיקים
- בחר תיקיה ליצור שם קובץ חדש, לחץ על "אישור" כדי להתחיל את המדידה.
4. פרשנות של תוצאות
- להציג את התוצאות ואת הפרמטרים בכרטיסייה "ניתוח" לאחר המדידה. בדוק את הפרמטרים הבאים לאחר הניתוח לפני ניקוי התעלה תא: המספר הממוצע של חלקיקים לכל מיקום, המספר הכולל של חלקיקים עקיבה וריכוז החלקיקים, רוחב התפלגות החלקיקים (x10 x50, x90 ערכים), הערך של וסטיית. חזור על המדידה של המדגם במידת הצורך.
הערה: התוצאות נשמרות גם בתור קובץ .pdf או. txt. - לחץ על הכרטיסיה "ניתוח" כדי להציג את הגרף מחושב לאחר המדידה, אשר מציג את ההתפלגות של החלקיקים שזוהו על-ידי גודל. לחץ על "תצוגה" בכרטיסיה "ניתוח" ולהשתמש הסמלים כדי להתאים ולשנות את ההגדרות גרף עבור דרישות מסוים.
5. אימות באמצעות EV זיהוי על ידי סופג המערבי
- להמיס את צניפה EV (להכין בשלב 1) במאגר פירוק והפקת ריפה, פיפטה ביסודיות, דגירה על קרח במשך 30 דקות צנטריפוגה המדגם ב x 8000 g 10 דקות ב 4 ° C כדי להבהיר את lysate ולהעביר את תגובת שיקוע צינור חדש.
- למדוד את החלבון הכולל על ידי ערכת וזמינותו של חלבון לאורי. למהול 1 μL של ההשעיה EV מבודד עם 49 μL ריפה המאגר ושימוש 5 μL triplicates לניתוח. לדלל את המתלים EV באמצעות מאגר x Laemmli העמסה 2 כדי ריכוז סופי של 2 µg/μL, חום למשך 10 דקות ב 95 ° C.
- לטעון μg 20 של חלבון ליום טוב. להפריד ולהעביר את החלבונים על ידי אלקטרופורזה בג'ל לזיהוי ומיכל סופג על פי פרוטוקולים סטנדרטיים.
- לחסום את הקרום (0.2 μm polyvinylidene difluoride) עם אבקת חלב פרה (5%) 1 h ב- RT, דגירה הקרום עם נוגדנים ראשי ספציפיים (CD9, CD63 ו vimentin) בן לילה ב 4 º C.
הערה: נוגדנים העיקרי משמשים לדילול 1:1,000. - לשטוף את הקרום עם TBST 3 x 5 דקות דגירה הקרום עם חזרת peroxidase (HRP)-נוגדנים משניים מצומדת (1:20, 000 TBST) עבור 60 דקות ב- RT.
- לשטוף את הקרום עם TBST 3 x 5 דקות, לזהות את החלבונים chemiluminescence עם פתרון המצע רגישות גבוהה במערכת דימות.
הערה: בגלל CD63 אנטיגן זה בהרחבה, variably glycosylated, משקל מולקולרי יכול להשתנות, להקות יכולים להופיע בין 40-65 kDa.
Representative Results
EVs מבודד דם מלא, מאופיין ע י nanoparticle מעקב ניתוח עם ריאגנטים ואזוריט. הרגישות האופטימלי למדידת חלקיקים מוכתם זוהה לטווח ב-70% במהלך הניסויים שלנו. החרוזים פלורסנט המשמש עבור התאמת וכיול של המדד הראה הגדרה של האופטימלית-רגישות של 85% (איור 2 א). בין הרגישות של 70%-90%, מספר החלקיקים שזוהו גדל במהירות, בעוד נוספת. להגדיל את הרגישות יכול להוביל התדרדרות של התפלגות גודל החלקיקים איפה לצנוח מחדש מספר החלקיקים. ההגדרות של המצלמה מוצגת תמונה חדה (איור 2B) וחזר מדידות הראו סטיית תקן נמוכה (איור 2C). ונתחיל, הפרוטוקול עבור עיבוד הדגימות של EVs היה מותאם כך כל המדידות יכולה להתנהל עם אותן הגדרות (טבלה 2). רוחב תפוצה מוגדרת על-ידי שלושה ערכים על ציר ה-x, את x10, x50 x90. את x50, או גודל החלקיקים החציוני הוא הקוטר שבו חצי מהאוכלוסייה נמצאת מתחת ערך זה. באופן דומה, של x10 ו x90 מצביעים על הקוטר שבה 10% ל- 90% של החלקיקים שזוהו נמצאים תחת גודל המדווחת. צביעת עם ערכת PKH67 תא מקשר, כולל מקשר (linker) תא פלורסנט המשלבת צבע ניאון ירוק עם זנב ארוך אליפטיות למחוזות השומנים של קרום התא, הפגינו מתאם חזק בין את הרגישות ואת המספר של חלקיקים הנמדד (איור 3 א). PKH67 משמש לעיתים קרובות עבור ניטור תפוצת אך גם הוכיח שימושי עבור ניטור exosome או ליפוזום ספיגת גם באשר ויוו תא סחר. בגלל שאינם ספציפיים תיוג של PKH67, מגוון רחב של EVs ניתן להיות מתויג, זוהה. התפלגות החלקיקים היה בטווח בין 266 nm (x10) ו 1946 nm (x90) לשיא המרבי-857 nm (x50) עם סטיית תקן נמוכה בין המדידות (28.1 ננומטר). המנורה-1, המכונה גם קרום ליזוזום-הקשורים גליקופרוטאין 1, CD107a שוכנים כולם בעיקר מעבר ממברנות lysosomal. לאחר צביעת עם 488 עבור חיל הים אלקסה שכותרתו נוגדנים ספציפיים נגד מנורה-1, התפלגות החלקיקים נע בין 220 nm (x10) כדי 1145 nm (x90) לשיא המרבי-541 nm (x50) וסטיית תקן של 11.7 nm (איור 3B). על אפיון של EVs, אנו בשימוש אלקסה עבור חיל הים 488 שכותרתו נוגדנים נגד סמנים exosomal נפוצים, אישר את הממצאים שלנו על ידי סופג המערבי. לאחר צביעת עם התווית על-ידי אלקסה עבור חיל הים 488 CD9-נוגדן, התפלגות החלקיקים נע בין nm nm (x10) כדי 1139 251 (x90) לשיא המרבי-548 nm ו השנייה לשיא מינור-כ 25 ננומטר (איור 4A). צביעת עם אלקסה עבור חיל הים 488 הנקרא CD63 (איור 4B) ו vimentin (איור 4C) הניבו תוצאות דומות. המערבי סופג ניתוח תימוכין שלנו תוצאה חיובית עבור נוגדנים המשמש כאן. מדידות חוזרות הראו תוצאות לשחזור לכל הנוגדנים להשתמש בדוח זה. כפקדי, אנחנו מוכתם נטולת בועית המים עם נוגדנים המתאימים (איור 5A), שבו נוגדנים PKH67 ו- LAMP1 זוהה כמעט אין EV עד רגישות ל 100 אחוז. באמצעות הדוגמה של vimentin, רגישות גבוהה גדל המספר של חפצי אמנות המתעוררים, גם כאשר המדגם הוא חופשי למעשה של חלקיקים. אם המדידה התחיל הסחף הוא עדיין גבוה מדי (> 5 מיקרומטר/s), מספר החזרות בודדים במובהק לסטות בינם לבין עצמם (איור 5B). כמו מיוצג עם שלושה נוגדנים שונים, חשוב כי הסחף הוא מתערבות ככל האפשר לפני תחילת המדידה. הניסיון שלנו באמצעות fluorescein isothiocyanate (FITC) כמו fluorochrome תוצאות מדידות שאינם מדויקים ו לשחזור משום FITC הוא נוטה צילום מהיר הלבנה (איור 5C). לכן, אנו ממליצים להשתמש אך ורק אלקסה עבור חיל הים 488 שכותרתו הנוגדנים עבור אפיון EV. ב פרוטוקול זה, EVs היו מבודדים על ידי פתרון משקעים מבוסס פולימר exosome המכיל פוליאתילן גליקול. כדי להבטיח כי התוצאות שלנו הם לא זייף בשיטת בידוד יישומית, אנחנו מאופיין EVs לאחר בידוד עם ultracentrifugation. כמו מיוצג עם PKH67 ועם שני נוגדנים שונים (CD63 ומנורה-1), התוצאות של בידוד יישומית שלנו עם פתרון משקעים exosome (איור 6A) דומות עם EVs מבודדים באמצעות ultracentrifugation (איור 6B ). למרבה הצער, בשל התשואה המסכנה של EVs לאחר ultracentrifugation, הקבוצה הראשונית של סרום לבידוד חייב להיות במובהק גבוהה יותר בהשוואה בידוד עם פתרון משקעים exosome.
איור 1: כיוונון סכמטי של ננו-חלקיק מעקב ניתוח. קרן ציר ולייזר מיקרוסקופ/וידאו הם orientated orthogonally זו לזו, חציה התא ערוץ חתך. מסנן קרינה פלואורסצנטית ממוקמת בין הערוץ התא המיקרוסקופ. אור מתפזרים על ידי החלקיקים מוצג בחלון "live-view" של התוכנה. לאחר הרכישה, התוצאות מוצגים מערכת קוארדינטות עקומת התפלגות גודל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: כיול עם פלורסצנטיות שכותרתו חרוזים. (א) מספר חלקיקים לעומת רגישות עקומת מציג החלקיקים בתנוחה אחת בנקודה מסוימת בזמן במהלך בסריקה אוטומטית רגישות. ויזואליזציה (B) של חלקיקים על המסך תצוגה חיה. (ג) חלקיק גודל הפצה לאחר מדידות חוזרות ונשנות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: נציג תוצאות לאחר צביעת עם PKH67 ומנורה-1- מספר חלקיקים לעומת רגישות עקומה (1), ויזואליזציה של חלקיקים על תצוגת live מסך (2) וחלקיקים בגודל ההתפלגות (3) לאחר צביעת עם PKH67 (א) ומנורה-1 (B). הוא ציין התפלגות גודל דומה של חלקיקים, תוך שינויים הרגישות הגדרת להוביל שינוי דומים אך עדיין אינם זהים לחלוטין של חלקיקים שזוהו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: נציג תוצאות לאחר צביעת עם אלקסה עבור חיל הים 488 הנקרא CD9, CD63, vimentin. מספר חלקיקים לעומת רגישות עקומה (1), ויזואליזציה של חלקיקים על המסך תצוגה חיה (2), פילוג גודל החלקיקים (3), נציג המערבי שהכלים של שני המתלים EV שונים (4) עבור CD9 (kDa 24-27, א), CD63 (26 kDa, B), ו- vimentin (kDa 54, ג). מופע מאוחר של חלקיקים אותות לאורך הרגישות הגוברת (ציר x) בקורלציה עם עוצמת אות נמוכה המערב כתם ניתוח, המאשרת את הסכום התחתון של סמן משטח חלקיקים המתאימים (למשל, vimentin לעומת CD63). הערה את עקומות כמעט זהה של המידות נציג עבור כל הסמנים שנותחה המציין הפארמצבטית גבוהה (3). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: נציג תוצאות עבור פקדים השתמשו, מקורות השגיאה אפשרי. (א) שלפוחית ללא מים צבעונית עם PKH67 (1), המנורה-1 (2) ו- vimentin (3) כפקדים. (B) נציג של חלקיקים בגודל הפצות לאחר צביעת עם המנורה-1 (1), CD63 (2), ו- CD9 (3), וביצע מדידות בעת ההשעיה הסחף הוא עדיין גבוה מדי. (ג) מספר חלקיקים לעומת רגישות עקומה (1) ו פילוג גודל החלקיקים (2) לאחר צביעת עם נוגדנים CD63 שאותה ניתן להתאים FITC. תופעת הלבנת ברור הוא ציין אחרי כל מדידה, וכתוצאה מכך מספרים חלקיקים בהדרגה נמוכים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6: השוואה בין שיטות בידוד שונות עבור EVs. פילוג גודל החלקיקים של EVs מבודדת עם פתרון משקעים exosome (א) ו- ultracentrifugation (B) לאחר צביעת עם PKH67 (1), המנורה-1 (2) ו- CD63 (3). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| המנורה-1 | CD9 | CD63 | Vimentin | |
| נוגדנים (µL) | 5 | 2.5-5 | 2.5-5 | 5 |
| EV ההשעיה (µL) | 10 | 20 | 10 | 10 |
| H2O (µL) עבור צביעת | 50 | 50 | 50 | 50 |
| נפח סופי (mL) | 5-10 | 2.5-5 | 5 | 10 |
טבלה 1: רשימת נוגדנים בשימוש, דילול מגוון של דוגמאות.
| רכישת פרמטרים | |
| רגישות (%) | 85 |
| תריס | 70 |
| בהירות מינימלית | 20 |
| . מקס. גודל (אן אם) | 500 |
| גודל מ (אן אם) | 20 |
| קוטביות | שלילי |
| מתח | . |
| הסחף חלקיקים ב 0 V (מיקרומטר/s) | < 5 |
| עמדות | 11 |
| מחזורים | 10 |
| לרכישות מרובות | 3-5 |
| השהיית הזמן (דקות) | 0 |
בטבלה 2: רכישת פרמטרים עבור ננו-חלקיק מעקב ניתוח.
Discussion
נדגים פרוטוקול מפורט עבור בידוד של EVs של דם מלא ואפיון מהיר של סמני פני שטח מסוים עם חלקיקים המבוססת על ידי קרינה פלואורסצנטית מעקב ניתוח. בניסויים מתנהל, השתמשנו באופן בלעדי EVs מבודד מן הדוגמאות סרום, אך שיטה זו מתאימה ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) ו פלזמה citrated ניתן גם להרחיב את נוזלי גוף אחרים כגון שתן, חלב אם, רוק, נוזל מוחי שדרתי, וזרע. יתר על כן, פרוטוקול זה ניתן לכוונן את האפיון של EVs מן התא תרבות supernatants. ב פרוטוקול זה, ההשעיה EV הופק מ- 100 μL של נסיוב באמצעות ריאגנט משקעים של exosome, אשר מכיל פולימר קניינית זה בעדינות ארגונייט שוקע exosomes ו- EVs בהתאם מידה corpuscular הנע בין 30 ננומטר ל-200 nm, לפיה 10-20 μL של EVs מונו פלואורסנציה כל סמן משטח. למרבה הצער, השלב בידוד הוא בלתי נמנע, כי כמות גבוהה של חלבון הדוגמאות סרום (למשל, אלבומין, גלובולין) משבש את הנוגדן מכתים הליך ותוצאות רמה גבוהה של רקע וממצאים מתוחכמים. יתר על כן, על סמך את הזמינות הביולוגית של exosomes הדגימות, הכמות של המתלה EV מועסקים, כמו גם הדילול לפני עיבוד שתישמר לחומרים אחרים מקור. כדי להשוות בין מספר דוגמאות, הכרחי בגישה סטנדרטית עבור הדילול של דוגמאות, כמו גם רכישת עקבי פרמטרים (רגישות, תריס, וכו '). נקודה חשובה נוספת היא כי המדידות לא הופעלו עד והרשע הוא נמוך (בידיים שלנו, < 5 μm/s). אם והרשע היה גבוה מדי, מדידות חוזרות של המדגם הניב סטיית תקן גבוהה בינם לבין עצמם, אך עם סחיפה נמוך, הנתונים המתקבלים הם מאוד עקביים ואישר רמה גבוהה של הפארמצבטית. חשוב שיש נוגדנים הנבחר של fluorochrome המתאים. חייב להיות מצומדת נוגדנים עם אלקסה עבור חיל הים 488, בגלל FITC יש שיעור גבוה של הלבנת-צילום. ואולי יותר יציב fluophores בהחלט יוביל ליציבות מוגברת assay בעתיד. בדרך כלל, חוקרים רבים להשתמש PBS כמו diluent עבור EVס עבור פרוטוקול זה, זה הכרחי להשתמש מים מזוקקים diluent המתלים EV. מתי EVs מסומנות עם צבעי ואזוריט osmolality גבוהה, ריכוז יון של מדלל אחרים, כגון PBS, יכול להתערב עם המדידה ושינינו להוביל לתוצאות.
בעוד שיטות לניתוח של EVs שופרו במידה ניכרת בעשור האחרון, יש עדיין אין שיטה סטנדרטית עבור בידוד ואפיון של EVס החיסרון העיקרי של cytometry זרימה, איפה EVs לעיתים קרובות מאוגדים חרוזים לספק משטח גדול יותר, הוא EVs רבים המזח על גבי המשטח לספק אות לזיהוי וחזק10. החיסרון כי הכנת דוגמאות גוזלת זמן, EVs רק ניתן להבחין ב שלהם ובגודל מורפולוגיה11SEM ויש TEM. למעלה נכון להיום, שיטת best-established ונמצאים בשימוש נפוץ עבור איכותי (קרי, הביוכימי) אפיון EV הוא מערבי סופג, היכן ניתן לנתח חלבונים עם נוגדנים ספציפיים12,13. עם זאת, החסרונות של כל השיטות האלה נובע חוסר היכולת לנתח EVs יחיד עבור סמני פני שטח מסוים. יתר על כן, זמן עיבוד טיימס ונהלים כביסה ארוך/בידוד המשמש רבים הפרוטוקולים הנוכחי לערב צעדים שדורשת, שהופך אותם למתאימים לא עבור תפוקה גבוהה מדגם ואפיון של EV יחידס פרוטוקול שלנו ומספק זרימת עבודה מלאה מהירה בידוד ואפיון של EVs יחיד עם סמני פני ספציפי כגון CD63, CD9, vimentin, CD107a, ואל ניתן להרחיב על קשת רחבה של סמנים אחרים משטח כדי לקבוע את מקור EV שפורסמוס בגלל קידמה טכנולוגית הקבועה של המכשיר נ, אנחנו אישר את הממצאים שלנו בשיתוף עם היצרן במנתח החדש. ללא קשר ההתקדמות העתידית של מחקר על ביולוגיה EV, במיוחד בנוגע exosomes, פרוטוקול זה מוצג כאן יספק שיטה מהירה ואמינה אפיון של EVs יחיד עם סמנים ספציפיים. מכיוון צבירה של EVs בתקופת הבידוד, מוכתמים הליך כה בלתי נמנע, למחקר עתידי צריך להתמקד בפיתוח שיטות כדי למנוע צבירת EV, לאפשר קביעת גודל מדויק של התווית על-ידי פלורסנט EVס
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מודים GmbH מה החלקיקים על חלקית המכסה את עלויות הפרסום של עבודה זו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Serum-separation tube | BD | 366882 | BD Vacutainer |
| Ampuwa water | Fresenius Kabi | 10060 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Sigma | 56064C | |
| Falcon tube, 15 mL | Greiner Bio One | 188271 | |
| Falcon tube, 50 mL | Greiner Bio One | 227270 | |
| Microcentrifuge tube, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | Speciality tubes for ultra centrifugation |
| Tube with Snap-On Cap 1.5 mL | Beckman Coulter | 357448 | |
| Polybeads Microspheres 0.2 µm | Polysciences, Inc. | 7304 | Alignment Solution |
| Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres beads 0.2 µm | Polysciences, Inc. | 09834-10 | Alignment Solution |
| Syringe, 2 mL | Braun | 4606027V | |
| Syringe, 10 mL | Braun | 4606728V | |
| Exoquick | SBI | EXOQ20A-1 | EV precipitation solution |
| Laemmli Sample Buffer (2x) | BioRad | 1610737 | |
| DC Protein Assay Kit II | BioRad | 5000112 | Lowry prtein assay |
| PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Kit | Sigma | PKH67GL-1KT | For general membrane labelling |
| Alexa Fluor 488 anti-human CD107a Antibody | BioLegend | 328609 | Lysosomal-associated membrane protein-1 (LAMP-1) |
| Human CD9-Alexa Fluor 488 | R&D Systems | FAB1880G | |
| Anti-CD9 Antibody | SBI | EXOAB-CD9A-1 | |
| CD63-Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | MA5-18149 | |
| FITC anti-human CD63 Antibody | BioLegend | 353005 | |
| CD63. Antibody, polyclonal | SantaCruz | Sc-15363 | |
| Alexa Fluor 488 anti-vimentin Antibody | BioLegend | 677809 | |
| Anti-Vimentin Antibody | SBI | EXOAB-VMTN-1 | |
| Goat anti mouse IgG + IgM | Jackson Immuno | 315-035-048 | |
| Goat anti rabbit IgG | Dianova | 111-035-003 | |
| SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | ThermoFisher | 34094 | |
| ZetaView | Particle Metrix | PMX 100, Type | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | |
| Chemiluminescence Imager | GE Healthcare | Amersham Imager 600 |
References
- Ibrahim, A., Marban, E. Exosomes: Fundamental Biology and Roles in Cardiovascular Physiology. Annual Review of Physiology. 78, 67-83 (2016).
- Su, S. A., et al. Emerging role of exosome-mediated intercellular communication in vascular remodeling. Oncotarget. 8 (15), 25700-25712 (2017).
- Lasser, C., et al. Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages. Journal of Translational Medicine. 9, 9 (2011).
- Li, M., et al. Analysis of the RNA content of the exosomes derived from blood serum and urine and its potential as biomarkers. Philosophical Transactions of The Royal Society B Biological Sciences. 369 (1652), (2014).
- Lin, J., et al. Exosomes: novel biomarkers for clinical diagnosis. The Scientific World Journal. 2015, 657086 (2015).
- Properzi, F., Logozzi, M., Fais, S. Exosomes: the future of biomarkers in medicine. Biomarkers in Medicine. 7 (5), 769-778 (2013).
- Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).
- De Toro, J., Herschlik, L., Waldner, C., Mongini, C. Emerging roles of exosomes in normal and pathological conditions: new insights for diagnosis and therapeutic applications. Frontiers in Immunology. 6, 203 (2015).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 3 Unit 3 22 (2006).
- Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
- Wu, Y., Deng, W., Klinke, D. J. 2nd Exosomes: improved methods to characterize their morphology, RNA content, and surface protein biomarkers. Analyst. 140 (19), 6631-6642 (2015).
- Bianco, N. R., Kim, S. H., Morelli, A. E., Robbins, P. D. Modulation of the immune response using dendritic cell-derived exosomes. Methods in Molecular Biology. 380, 443-455 (2007).
- Conde-Vancells, J., et al. Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes. Journal of Proteome Research. 7 (12), 5157-5166 (2008).
- Mehdiani, A., et al. An innovative method for exosome quantification and size measurement. Journal of Visualized Experiments. (95), 50974 (2015).
