I denne protokollen beskriver vi fullstendig arbeidsflyten for rask isolering av ekstracellulære blemmer fra menneskelig fullblod og karakterisering av spesifikke indikatorer fluorescens-baserte hydrogenion sporing analysen. Presentert resultatene viser høy reproduserbarhet og kan justeres til celle kultur supernatants.
Ekstracellulære blemmer (EVs), inkludert exosomes, er spesialisert membranous nano-størrelse blemmer i kroppsvæsker som utgis constitutively fra mange celletyper og spille en avgjørende rolle i å regulere celle-celle kommunikasjon og en rekke biologiske prosesser. Mange ulike metoder for karakterisering av EVs nattestid. Men har de fleste av disse metodene ulempen at utarbeidelse og karakterisering av prøvene er svært tidkrevende, eller det er ekstremt vanskelig å analysere bestemte indikatorer rundt sin lille størrelse og mangel på diskret bestander. Mens metoder for analyse av EVs har vært betydelig forbedret det siste tiåret, finnes det fortsatt ingen standardisert metode for kategorisering av enkelt EVs. Her viser vi en semi-automatisert metode for kategorisering av enkelt EVs fluorescens-baserte hydrogenion sporing analysen. Protokollen som presenteres løser vanlige problemet med mange forskere i dette feltet og gir fullstendig arbeidsflyten for rask isolering av EVs og karakterisering med PKH67, et generelt cellemembranen linker, samt bestemte overflate markører slik som CD63, CD9, vimentin og lysosomale-assosiert membran protein 1 (lampe-1). Presentert resultatene viser høy reproduserbarhet, som bekreftes av andre metoder, som vestlige blotting. I de utført eksperimentene, vi brukt utelukkende EVs isolert fra koagulasjon, men denne metoden er også egnet for plasma- eller andre kroppsvæsker, og kan justeres for karakteristikk av EVs fra celle kultur supernatants. Uavhengig av fremtidige utviklingen av forskning på EV biologi gir protokollen som presenteres her en rask og pålitelig metode for rask karakterisering av enkelt EVs med spesifikke indikatorer.
Ekstracellulære blemmer (EVs), inkludert exosomes, er spesialisert membranous nano-størrelse blemmer (20-150 nm) som inneholder bestemte kombinasjoner av lipider, vedheft og intercellulære signalnettverk molekyler, samt andre cytosolic funksjonskomponenter som microRNA (miRNA) og mRNA og spille en avgjørende rolle i å regulere celle-celle kommunikasjon1,2. EVs utgis i miljøet fra mange forskjellige celletyper, f.eks endotelceller, immun celler og kreftceller, og kan påvises i kroppsvæsker som serum sæd, urin, morsmelk, spytt eller Cerebrospinalvæske3, 4. økende antall studier høydepunkt mangfoldig bidrag av EVs som potensielle biomarkers for tidlig diagnostisering av flere sykdommer og/eller prediksjon sykdom progresjon5,6. Exosomes er ofte beskrevet av tilstedeværelsen av molekyler som de er spesielt forbundet med, uavhengig av hvilken celle som de utlede fra7. For eksempel exosomes inneholder ulike tetraspanins (CD9, CD63, CD81), store histocompatibility kompleks klassen jeg (MHC jeg) molekyler, ulike transmembrane proteiner, typisk cytosolic proteiner (tubulin og utgangen), molekyler involvert i multivesicular kroppen ( MVB) biogenesis (TSG101 og alix), varme sjokk proteiner (HSP 70 og HSP 90) og proteiner som deltar i signal signaltransduksjon (protein kinaser)8.
Mange ulike metoder har blitt beskrevet for karakterisering av EVs9. Vanligste og utbredt metodene som brukes for EV analyse er flyt cytometri10, skanning elektronmikroskop (SEM) og overføring elektronmikroskop (TEM)11. Den best etablerte og brukte metoden for biokjemiske karakterisering av EV innhold er Western blotting12,13. SEM og TEM tillater påvisning av EVs over hele størrelsen spekteret, er svært begrenset identifikasjon av spesifikke overflaten proteiner en særlig ulempe av disse metodene. I kontrast, flowcytometri er et kraftig verktøy for identifikasjon av bestemte EV overflate markører, men terskelen til denne metoden begrenser analyse for å EVs størrelse mer enn 500 nm. Dermed er analyse av isolerte EVs med påvisning av bestemte overflate markører ikke tilgjengelig via en av disse tre veletablerte metodene. Vi beskrev tidligere en annen høylig følsom metode for visualisering og analyse av EVs, hydrogenion sporing analyse (NTA)14. Kort, denne metoden kombinerer to forskjellige fysiske prinsipper. Først punktdiagram partikler lys når de er bestrålt med en laserstråle, og det andre prinsippet, kjent som Brownsk bevegelse, innebærer at spredningen av ulike partikler i en flytende suspensjon er omvendt proporsjonal med størrelsen. Halvautomatisk desktop hydrogenion analyse instrumentet for flytende prøver består av partikkel sporing analyzer med en software-basert analyse, der digitale bilder av spredte lys fra enkelt partikler registreres. Partikler og bevegelse av partikler oppdages av laser spredning mikroskop med et videokamera. Laserstrålen er orientert vertikalt, mens den optiske aksen er vannrett og fokusert i cellen kanalen fylt med prøven. Dataene fra tomter spredte lyse flekker og deres fart bevegelse aktiverer fastsettelse av totale partikkel antall og størrelse distribusjon. Etter bestråling av laser, partikler spre lyset, som er registrert av en digital video kameraet via mikroskop14. Fremme våre tidligere metoden er innsetting av en 500 nm lang bølge-pass (LWP) cut-off filter mellom laser (bølgelengden til 488 nm) og celle kanalen, som muliggjør direkte analyse av fluorescens-merket partikler (figur 1). Våre protokollen løser vanlige etterspørselen av mange forskere i dette feltet for rask karakteristikk av enkelt EVs, f.eks etter deres foreldre opprinnelse. I denne protokollen beskriver vi fullstendig arbeidsflyten for rask isolering av EVs fra menneskelig fullblod og rask karakterisering av spesifikke indikatorer fluorescens-baserte nanopartikler sporing analysen. EVs kan oppdages av flekker med PKH67, et generelt cellemembranen linker, og bestemte exosomal markører, f.eks CD63, CD9 og vimentin. Våre protokollen er også egnet for EDTA og citrerte plasma, samt andre kroppsvæsker og celle kultur supernatants.
Vi viser en detaljert protokoll for isolering av EVs fra fullblod og rask karakterisering av bestemte overflate markører med fluorescens-baserte nanopartikler sporing analyse. I de utført eksperimentene, vi brukt utelukkende EVs isolert fra serumprøver, men denne metoden er også egnet for ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) og citrerte plasma og kan også utvides til andre kroppsvæsker som urin, morsmelk, spytt, Cerebrospinalvæske og sæd. Dessuten, denne protokollen kan justeres for karakteristikk av EVs fra celle kultur supernatants. I denne protokollen, EV suspensjon ble generert fra 100 μL serum ved bruk av en exosome nedbør reagens, som inneholder en proprietær polymer som forsiktig precipitates exosomes og EVs i henhold til en corpuscular størrelse fra 30 nm til 200 nm, der 10-20 μL på Evens ble utnevnt for karakteristikk av hver overflate indikator. Dessverre er isolasjon trinnet uunngåelig, fordi den høye mengden protein i serumprøver (f.eks albumin og globulin) griper antistoffer flekker prosedyre og resulterer i høy bakgrunn og sofistikert funn. Videre må basert på biologiske tilgjengeligheten av exosomes i prøvene, mengden av næringsdrivende EV suspensjon samt fortynning før behandling justeres for andre kildemateriale. Sammenligne flere eksempler, en standardisert metode for fortynning av prøver, samt konsekvent oppkjøpet parametere (følsomhet, nedleggelse, etc.) er nødvendig. Et annet viktig poeng er at målingene ikke er startet før drift er lav (i våre hender, < 5 μm/s). Hvis drift var for høyt, gjentatte målinger av prøven gitt høy standardavvik seg imellom, men med en lav drift, resultatdataene var svært konsekvent og bekreftet høy reproduserbarhet. Det er viktig at valgte antistoffer har en riktig fluorochrome. Antistoffer må være likt med Alexa Fluor 488, fordi FITC har en høy grad av foto-bleking. Muligens vil mer stabil fluophores helt sikkert føre til økt analysen stabilitet i fremtiden. Vanligvis bruke mange forskere PBS som en fortynner for EVs. For denne protokollen er det avgjørende å bruke destillert vann som en fortynner for EV suspensjoner. Når EVs er merket med fluorescing fargestoffer, høye osmolality og konsentrasjon av andre løsningsmidler, som PBS, kan forstyrre målingen og føre til forandret resultatet.
Mens metoder for analyse av EVs har vært betydelig forbedret det siste tiåret, er det fortsatt ingen standardisert metode for isolering og karakterisering av EVs. Den store ulempen av flowcytometri, der EVs er ofte bundet til perler å gi en større overflate, er at mange EVs dock på overflaten for å gi en sterk og detectable signal10. SEM og TEM har ulempen at utarbeidelse av prøvene er tidkrevende og EVs kan bare være preget av sin størrelse og morfologi11. Opp til dags dato den best etablerte og brukte metoden for kvalitativ (dvs. biokjemiske) er EV karakteristikk Western blotting, der proteiner kan analyseres med spesifikke antistoffer12,13. Men ligger ulempene av alle disse metodene i manglende evne til å analysere enkelt EVs for bestemte overflate markører. Videre innebære den lange behandlingstider og lang vask/isolering prosedyrer brukes av mange av dagens protokoller arbeidskrevende trinn, noe som gjør dem uegnet for høy utvalg ytelse og karakterisering av enkelt EVs. Våre protokollen gir en komplett arbeidsflyt for rask isolering og karakterisering av enkelt EVs bestemt overflate markører som CD63, CD9, vimentin og CD107a, og kan utvides for et bredt spekter av andre overflate markører å fastslå opprinnelsen til utgitt EVs. På grunn av et permanent tekniske fremskritt NTA enheten bekreftet vi våre funn i samarbeid med produsenten med den nyeste analyzer. Uavhengig av fremtidige utviklingen av forskning på EV biologi, spesielt om exosomes, vil protokollen som presenteres her gi en rask og pålitelig metode for kategorisering av enkelt EVs med spesifikke indikatorer. Samling av EVs under isolasjon og flekker prosedyren er så langt uunngåelig, bør fremtidig forskning fokusere på å utvikle metoder for å hindre EV aggregering og aktiverer en nøyaktig størrelse bestemmelse av fluorescerende-merket EVs.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker partikkel Metrix GmbH for delvis dekker publikasjonen kostnadene for dette arbeidet.
Serum-separation tube | BD | 366882 | BD Vacutainer |
Ampuwa water | Fresenius Kabi | 10060 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline | Sigma | 56064C | |
Falcon tube, 15 mL | Greiner Bio One | 188271 | |
Falcon tube, 50 mL | Greiner Bio One | 227270 | |
Microcentrifuge tube, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | Speciality tubes for ultra centrifugation |
Tube with Snap-On Cap 1.5 mL | Beckman Coulter | 357448 | |
Polybeads Microspheres 0.2 µm | Polysciences, Inc. | 7304 | Alignment Solution |
Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres beads 0.2 µm | Polysciences, Inc. | 09834-10 | Alignment Solution |
Syringe, 2 mL | Braun | 4606027V | |
Syringe, 10 mL | Braun | 4606728V | |
Exoquick | SBI | EXOQ20A-1 | EV precipitation solution |
Laemmli Sample Buffer (2x) | BioRad | 1610737 | |
DC Protein Assay Kit II | BioRad | 5000112 | Lowry prtein assay |
PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Kit | Sigma | PKH67GL-1KT | For general membrane labelling |
Alexa Fluor 488 anti-human CD107a Antibody | BioLegend | 328609 | Lysosomal-associated membrane protein-1 (LAMP-1) |
Human CD9-Alexa Fluor 488 | R&D Systems | FAB1880G | |
Anti-CD9 Antibody | SBI | EXOAB-CD9A-1 | |
CD63-Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | MA5-18149 | |
FITC anti-human CD63 Antibody | BioLegend | 353005 | |
CD63. Antibody, polyclonal | SantaCruz | Sc-15363 | |
Alexa Fluor 488 anti-vimentin Antibody | BioLegend | 677809 | |
Anti-Vimentin Antibody | SBI | EXOAB-VMTN-1 | |
Goat anti mouse IgG + IgM | Jackson Immuno | 315-035-048 | |
Goat anti rabbit IgG | Dianova | 111-035-003 | |
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | ThermoFisher | 34094 | |
ZetaView | Particle Metrix | PMX 100, Type | |
Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | |
Chemiluminescence Imager | GE Healthcare | Amersham Imager 600 |