Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

NlsGPS1 Förster अनुनाद ऊर्जा स्थानांतरण (झल्लाहट) का उपयोग कर सेलुलर Gibberellin स्तरों visualizing

Published: January 12, 2019 doi: 10.3791/58739
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Sainsbury Laboratory, University of Cambridge

Summary

Gibberellin धारणा संवेदक 1 (GPS1) एक उच्च phytohormones संकल्प के साथ Gibberellin spatiotemporal के सेलुलर स्तर को मापने के लिए पहली Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण आधारित है । इस प्रोटोकॉल की विधि पर रिपोर्ट करने के लिए कल्पना और nlsGPS1 Arabidopsis hypocotyls और रूट युक्तियों में आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग gibberellin का उपयोग करके सेलुलर स्तर बढ़ाता है ।

Abstract

phytohormone gibberellin (GA) एक छोटे, मोबाइल संकेतन अणु है कि बीज अंकुरण, सेलुलर बढ़ाव, और पौधों में विकास के संक्रमण में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । Gibberellin धारणा सेंसर 1 (GPS1) पहले Förster अनुनाद ऊर्जा अंतरण (झल्लाहट) आधारित है कि vivo में सेलुलर GA के स्तर की निगरानी की अनुमति देता है । नाभिकीय स्थानीयकृत-GPS1 (nlsGPS1) के प्रतिदीप्ति उत्सर्जन अनुपात को मापने के द्वारा, विभिन्न ऊतक प्रकारों में endogenously और exogenously की आपूर्ति किए गए GA ग्रेडिएंट का spatiotemporal मानचित्रण एक सेलुलर पैमाने पर व्यवहार्य है । इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे तीन उदाहरण के प्रयोगों में nlsGPS1 उत्सर्जन अनुपात छवि को: स्थिर राज्य, से पहले और exogenous gibberellin एक4 (GA4) उपचार के बाद, और एक इलाज के समय पर पाठ्यक्रम । हम भी दोनों फिजी और एक वाणिज्यिक तीन आयामी (3-डी) micrograph दृश्य और विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर nlsGPS1 उत्सर्जन अनुपात का विश्लेषण करने के तरीके प्रदान करते है और सीमाएं और gibberellin स्तर यों तो nlsGPS1 का उपयोग करने की संभावना नुकसान की व्याख्या ।

Introduction

संयंत्र हार्मोन संयंत्र विकास और विकास में एक मौलिक भूमिका निभाते हैं । इन छोटे, मोबाइल संकेत अणुओं आमतौर पर कई स्तरों पर विनियमित रहे हैं, जैसे कि, catabolism, और लघु और लंबी दूरी के परिवहन1,2,3,4। हार्मोन संकेत मार्ग और बहाव transcriptional प्रतिक्रियाओं की समझ वर्षों में पैनापन है । हालांकि, हार्मोन वितरण का निर्देशन नियामक आदानों के साथ मार्ग संकेतन हार्मोन के विविध सेलुलर प्रतिक्रियाओं को जोड़ने के लिए, हम एक सेलुलर पैमाने पर हार्मोन के स्तर के एक spatiotemporal ठहराव की आवश्यकता होती है. झल्लाहट आधारित है कि phytohormones का पता लगाने के लिए एक सेलुलर पैमाने पर हार्मोन का स्तर बढ़ाता है ' वैज्ञानिकों की क्षमता अग्रिम कर सकते है संवेदी । झल्लाहट आधारित जैव सेंसर एक झल्लाहट जोड़ी (दाता और स्वीकार्य फ्लोरोसेंट प्रोटीन) एक संवेदी डोमेन है कि एक विशिष्ट ligand बांध या एक जैविक उत्तेजना के लिए प्रतिक्रिया से जुड़े से मिलकर बनता है । छोटे अणु के लिए, ligand बाध्यकारी संवेदी डोमेन का एक गठन परिवर्तन है कि परिणाम दूरी और/या झल्लाहट जोड़ी के दो फ्लोरोसेंट प्रोटीन के बीच अभिविन्यास के परिवर्तन में ट्रिगर । एक झल्लाहट के एक ratiometric विश्लेषण-संवेदी दाता द्वारा पूरा किया है और दाता5,6पर स्वीकारकर्ता के प्रतिदीप्ति उत्सर्जन अनुपात को मापने । Ligand बाइंडिंग इस उत्सर्जन अनुपात7में परिवर्तन के रूप में detectable है ।

हम हाल ही में संयंत्र हार्मोन GA. GAs के लिए एक झल्लाहट आधारित-संवेदी विकसित एक वर्ग के हार्मोन है कि बीज अंकुरण, सेलुलर बढ़ाव को बढ़ावा देने, और वनस्पति से फूल चरणों के लिए विकासात्मक संक्रमण कर सकते हैं । nlsGPS1 का स्थानीयकरण संवेदी होता है और विविध पादप ऊतकों में GA गतिशीलता में spatiotemporal अंतर्दृष्टि प्रदान करता है । Arabidopsis कोशिकाओं में, घुलनशील रिसेप्टर्स करने के लिए GA बांध, gibberellin-असंवेदनशील बौना (GID), और जटिल ga संकेत2के नकारात्मक नियामकों के रूप में कार्य है कि डेला प्रोटीन की गिरावट लाती है. nlsGPS1 के ga संवेदी डोमेन Arabidopsis GA रिसेप्टर (AtGID1C) एक डेला प्रोटीन के एक ७४ एमिनो एसिड जनचेतना से जुड़े होते है (AtGAI) और एक झल्लाहट दाता फ्लोरोसेंट प्रोटीन के रूप में dimerization के बढ़ाया आसमानी वेरिएंट से मिलकर जोड़ी और Aphrodite (एक codon-विविध वीनस) के रूप में स्वीकारकर्ता फ्लोरोसेंट प्रोटीन8. nlsGPS1 के लिए एक उच्च समानता संवेदक है (Kd = 24 एनएम ga 4के लिए) और यह विविध ऊतक में उपयोग किया जा सकता है-प्रकार के नक्शे और ga ढाल को बढ़ाता है । vivo में Arabidopsis GA के स्तर की अशुद्ध व्याख्या से बचने के लिए, हम भी एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग करने के लिए nlsGPS1 (nlsGPS1-NR) के एक गैर उत्तरदायी संस्करण विकसित किया है. nlsGPS1-NR प्रोटीन ga-बाध्यकारी जेब में उत्परिवर्तनों कि डेला प्रोटीन है कि GID रिसेप्टर प्रोटीन7,9के साथ बातचीत को बाधित में ga और उत्परिवर्तनों के बंधन को बाधित किया जाता है । उत्सर्जन अनुपात पैटर्न या परिवर्तन दोनों nlsGPS1 और nlsGPS1-NR लाइनों में मनाया GA-बाध्यकारी घटनाओं के लिए सीधे संबंधित नहीं कलाकृतियों माना जा सकता है । यह भी ध्यान दें कि nlsGPS1 ga4 के लिए बाध्यकारी नहीं है तेजी से प्रतिवर्ती महत्वपूर्ण है, और इसलिए, सेलुलर nlsGPS1 उत्सर्जन अनुपात के रूप में एक दिया नाभिक में ga के सर्वोच्च हाल ही में एकाग्रता का प्रतिनिधित्व करने के बजाय वास्तविक समय व्याख्या की जानी चाहिए संभल-राज्य स्तर । एक परिणाम के रूप में, nlsGPS1 के साथ GA स्तर गिरने का एक विश्लेषण संभव नहीं है ।

यहां हम मॉडल संयंत्र Arabidopsisकी कोशिकाओं में एक nlsGPS1 के उपयोग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, फोकल इमेजिंग का उपयोग कर एक उच्च संकल्प पर आधारित दृष्टिकोण । प्रोटोकॉल इमेजिंग संयंत्र जड़ें और hypocotyls दोनों स्थिर राज्य में और समय पर-पाठ्यक्रमों के बारे में जानकारी प्रदान करता है । nlsGPS1 संवेदक संभावित विविध ऊतक में उपयोग किया जा सकता है प्रकार, के रूप में अच्छी तरह के रूप में संयंत्र प्रजातियों के पार, नक्शे और GA वितरण मात्रा बढ़ाता है ।

Protocol

1. तैयारी

  1. कोई सुक्रोज (1 L) के साथ ½ Murashige और Skoog आगर पीएच ५.७ तैयार करें ।
    1. ultrapure पानी की ९५० मिलीलीटर में Murashige और Skoog (एमएस) बेसल मध्यम के २.२ जी भंग । 5 एम KOH के साथ ५.७ के लिए पीएच समायोजित करें ।
    2. ultrapure पानी के साथ 1 एल के एक अंतिम मात्रा करने के लिए समाधान बनाओ । यह २ ५०० मिलीलीटर की बोतलों में विभाजित, प्रत्येक 1% संयंत्र आगर युक्त । 20 मिनट के लिए १२१ ° c पर आटोक्लेव ।
  2. कोई सुक्रोज (1 एल) के साथ पीएच ५.७ में ¼ एमएस तरल तैयार करें ।
    1. ultrapure पानी की ९५० मिलीलीटर में एमएस के १.१ जी भंग । 5 एम KOH के साथ ५.७ के लिए पीएच समायोजित करें । ultrapure पानी के साथ 1 एल के एक अंतिम मात्रा करने के लिए समाधान बनाओ । इसे २ ५०० मिलीलीटर की बोतलों में बांट लें । 20 मिनट के लिए १२१ ° c पर आटोक्लेव ।
  3. GA4तैयार करें ।
    1. इथेनॉल ७०% में ga4 भंग १०० mM ga4 शेयर के अंतिम एकाग्रता बनाने के लिए ।
    2. काम समाधान तैयार करने के लिए, GA4 शेयर को 0.1-1 ¼ एमएस लिक्विड पीएच ५.७ में µ मीटर पतला ।

2. पौधे की वृद्धि

  1. Arabidopsis के बीजों का बंध्याकरण कराएं ।
    1. एक रासायनिक डाकू का उपयोग कर काम करते हैं । Aliquot बीज (लगभग २०० बीज) में 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों । क्लोरीन प्रतिरोधी स्याही के साथ एक मार्कर का प्रयोग करें और नसबंदी पोत के अंदर खुला ढक्कन के साथ ट्यूबों जगह (एक बड़ा बॉक्स है कि सील किया जा सकता है) ।
    2. नसबंदी पोत के अंदर ५० मिलीलीटर ultrapure पानी और सोडियम हाइपोक्लोराइट सॉल्यूशन की ५० मिलीलीटर की जगह एक २५० एमएल वाला यूरिन लगाएं ।
    3. 3 मिलीलीटर केंद्रित हाइड्रोक्लोरिक एसिड (HCl) को चोंच में डालें । पोत को तुरंत सील करें और 6-16 एच के लिए क्लोरीन गैस द्वारा नसबंदी की अनुमति दें ।
    4. पोत सील करने के बाद, बीज रैक में सभी microcentrifuge ट्यूबों के ढक्कन बंद । निष्फल बीज चढ़ाना के समय तक सूखा संग्रहित किया जा सकता है ।
  2. ½ एमएस आगार वर्ग प्लेटों पर लगभग 20 निष्फल Arabidopsis बीज बोना । छिद्रित शल्य टेप के साथ प्लेटें सील और उंहें एल्यूमीनियम पंनी के साथ लपेटो । स्तरीकरण के लिए उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर 1-3 दिनों के लिए मशीन ।
  3. रूट इमेजिंग के लिए, निंनलिखित वृद्धि की स्थिति के साथ 3 दिनों के लिए एक ऊर्ध्वाधर स्थिति में वृद्धि चैंबर के लिए प्लेटों हस्तांतरण: लंबे समय दिन की स्थिति (LD, 16 प्रकाश के ज/ १२० µmol ⋅ एम-2एस-1 प्रकाश तीव्रता; तापमान 22 डिग्री सेल्सियस (प्रकाश चक्र के दौरान) या 18 ° c (अंधेरे चक्र के दौरान), ६५% सापेक्षिक आर्द्रता (आरएच) ।
  4. के लिए डार्क-बढ़ी hypocotyl: अंकुरण सिंक्रनाइज़ करने के लिए 1 – 4 एच की एक हल्की नाड़ी के लिए वृद्धि चैंबर के लिए प्लेट स्थानांतरण । एल्यूमीनियम पंनी के साथ प्लेट लपेटें और उंहें 3 दिनों के लिए एक ऊर्ध्वाधर स्थिति में वृद्धि चैंबर में जगह है ।

3. नमूना तैयारी

  1. संभल-राज्य मापन (आंकड़ा 1a)
    1. एक साफ माइक्रोस्कोप स्लाइड पर, ¼ एमएस लिक्विड के ५० µ एल जोड़ें (अब से नकली समाधान के रूप में पद पर) । धीरे ट्रान्सफर बनवली nlsGPS1 थाली से स्लाइड कर के.
    2. एक साफ coverslip ले लो और coverslip के प्रत्येक कोने पर वैक्यूम चर्बी की एक बूंद हाजिर । धीरे अंकुर पर coverslip जगह है और ध्यान से अतिरिक्त नकली समाधान किसी भी हवा के बुलबुले को हटाने के लिए जोड़ें ।
  2. GA4 उपचार: रासायनिक विनिमय प्रयोग (आंकड़ा 1b) ।
    1. GA4 उपचार से पहले, एक साफ गिलास स्लाइड (चित्र 1b) पर वैक्यूम चर्बी की एक समान परत के साथ एक आयत (लंबाई: ३.५ सेमी, ऊंचाई: २.५ सेमी) आकर्षित करने के लिए वैक्यूम तेल (एक प्लास्टिक टिप से अनुलग्न) से भरा एक 20 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करें । वैक्यूम तेल की एक अच्छी लाइन के लिए अनुमति देने के लिए, प्लास्टिक टिप व्यास में 1 मिमी के एक खोलने के लिए कटौती की जानी चाहिए ।
    2. ग्लास स्लाइड में मॉक सॉल्यूशन के ५० µ l को जोड़ें । स्वच्छ संदंश के साथ, nlsGPS1 अंकुर उठाओ और धीरे से नकली समाधान पर उन्हें जगह है । किसी भी क्षति को रोकने के लिए, संदंश के साथ अंकुर लोभी बिना cotyledons के नीचे की ओर का समर्थन करके अंकुर हस्तांतरण ।
    3. एक साफ coverslip ले लो और coverslip के प्रत्येक कोने पर वैक्यूम चर्बी की एक बूंद हाजिर । संदंश का प्रयोग, वैक्यूम तेल आयत के केंद्र में coverslip जगह है । अब coverslip दो वैक्यूम तेल आयत के लंबे किनारों को इसी पक्ष पर बंद है ।
    4. ध्यान से अतिरिक्त नकली समाधान जोड़ने के लिए जलाशय को भरने और जलाशय के भीतर किसी भी हवा बुलबुले को हटाने के अंदर परेशान अंकुर (ओं) के बिना ।
    5. GA4 उपचार से पहले एक फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर छवियों को प्राप्त । इस प्रोटोकॉल के खंड 4 में वर्णित निर्देशों का पालन करें ।
    6. GA4 उपचार के लिए, फोकल मंच से माइक्रोस्कोप स्लाइड निकालें । 20 मिनट के लिए एक टाइमर सेट करें ।
    7. टाइमर शुरू करने के बाद, ¼ एमएस तरल युक्त 1 µ एम GA4के साथ बफर समाधान विनिमय । coverslip के बाईं ओर से GA4 समाधान (लगभग ५० µ l) जोड़ें और दाईं ओर से पिछला (मॉक) समाधान निकालें । समाधान का आदान प्रदान करने के लिए पूरी तरह से नकली समाधान की जगह है, जो लगभग लेता है 10 मिनट (आंकड़ा 1b) ।
    8. कांच की स्लाइड को माइक्रोस्कोप स्टेज पर वापस रखें । के बाद GA छवि प्राप्त करने से पहले एक और 10 मिनट रुको ।
  3. ब्याज की ऊतक के लिए एक समय पाठ्यक्रम की स्थापना
    नोट: ब्याज की ऊतक, उदाहरण के लिए हो सकता है, hypocotyls या जड़ों । हम नियमित रूप से इमेजिंग nlsGPS1 के लिए समय पाठ्यक्रम प्रदर्शन एक वाणिज्यिक छिड़काव प्रणाली (चित्रा 1C, सामग्री की तालिकादेखें) या एक RootChip7,10,11का उपयोग कर सेंसर ।
    1. चिपचिपा स्लाइड के छिड़काव चैनल के केंद्र के लिए नकली समाधान के २०० µ एल जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें) । धीरे nlsGPS1 अंकुर उठाओ और चिपचिपा स्लाइड में नकली समाधान पर उन्हें जगह है ।
    2. संदंश का प्रयोग, धीरे गिलास coverslip जगह है और, संदंश की पीठ का उपयोग कर, coverslip के बाहरी किनारों पर धीरे से इतना है कि यह चिपचिपा-स्लाइड की परिधि पर चिपचिपा सामग्री के साथ एक मजबूत बंधन रूपों ।
    3. दो कोहनी Luer connectors का उपयोग (०.८ मिमी के एक भीतरी व्यास [id] के साथ) और सिलिकॉन टयूबिंग (०.८ मिमी की एक आईडी के साथ), चिपचिपा-स्लाइड एक 20 मिलीलीटर सिरिंज के लिए और एक दुकान से बहिर्वाह समाधान इकट्ठा करने के लिए कनेक्ट । सिलिकॉन टयूबिंग के लिए सिरिंज कनेक्ट करने के लिए (०.८ मिमी की एक आईडी के साथ) Luer ताला संबंधक का प्रयोग करें.
    4. धीरे कक्ष के माध्यम से इतना है कि वहाँ कोई हवा बुलबुले चैंबर में छोड़ दिया है पर्याप्त समाधान जाने के लिए मैन्युअल रूप से नकली समाधान युक्त सिरिंज दबाएँ. जगह और प्रोग्राम सिरिंज पंप पर सिरिंज पकड़ो ।
    5. पंप के साथ उपलब्ध कराई मैनुअल के अनुसार प्रवाह की दरके साथ प्रयोग किया सिरिंज (यानी, व्यास और मात्रा) के लिए विशिष्ट मापदंडों निर्धारित करें ।
      नोट: इस प्रोटोकॉल में, 1 – 3 एमएल/एच का प्रवाह दर का उपयोग किया गया था, और यह प्रायोगिक मांगों के अनुसार बदला जा सकता है । पंप शुरू करके समय पाठ्यक्रम शुरू करो ।
    6. एक समय पाठ्यक्रम (चित्रा 1C) के दौरान GA4 उपचार के लिए, पंप रुके और एक नया ¼ एमएस तरल युक्त ga4के साथ पूरक के साथ सिरिंज बदलने के छिड़काव बंद करो । अगले अनुभाग में दिखाए गए के रूप में फोकल इमेजिंग के साथ आगे बढ़ें ।

4. माइक्रोस्कोपी

नोट: हम फोकल लेजर माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन करते हैं ।

  1. एक फोकल खुर्दबीन लेजर से सुसज्जित का उपयोग कर छवियों को झल्लाहट इमेजिंग प्रदर्शन का अधिग्रहण ।
    नोट: nlsGPS1 के लिए, सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन के वेरिएंट () और पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP) imaged हैं । इस प्रोटोकॉल में, वाणिज्यिक सूक्ष्मदर्शी ( सामग्री की तालिकादेखें, माइक्रोस्कोप के रूप में सूचीबद्ध 1 और 2) 10x या 20x शुष्क ०.७० सुरीले यौगिक योजना एपीओ उद्देश्यों के साथ प्रयोग किया जाता है ।
  2. 1 माइक्रोस्कोप के लिए, क्रमश: ४४८ एनएम और ५१४ समुद्री तरंग पराबैंगनीकिरण का उपयोग करें और YFP को उत्तेजित करने के लिए । अनुक्रमिक स्कैन प्राप्त । सेट डिटेक्टरों (जैसे, HyD SMD) के लिए 460-500 एनएम का पता लगाने के लिए (दाता उत्सर्जन) और 525 – YFP के लिए 560 एनएम (झल्लाहट उत्सर्जन) के बाद उत्तेजना । एक दूसरे अनुक्रम का उपयोग कर, YFP के लिए 525-560 एनएम का पता लगाने के लिए एक डिटेक्टर सेट (YFP उत्सर्जन) YFP के उत्तेजना के बाद.
    नोट: इस YFP प्रतिदीप्ति का उपयोग अभिव्यक्ति नियंत्रण के रूप में, साथ ही साथ सेगमेंटिंग नाभिक में, एक वाणिज्यिक 3-डी micrograph विज़ुअलाइज़ेशन और विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके सतहों को जेनरेट करने के लिए किया जाता है.
  3. 2 माइक्रोस्कोप के लिए, ४४० एनएम और ५१४ एनएम तरंग दैर्ध्य लेजर लाइनों का उपयोग करने के लिए क्रमशः और YFP को उत्तेजित । दो पटरियों का अधिग्रहण । 1 ट्रैक के लिए, सेट डिटेक्टरों (जैसे, ChS) के लिए 464 का पता लगाने के लिए-500 एनएम (दाता उत्सर्जन) और 526 के लिए-562 एनएम YFP (झल्लाहट उत्सर्जन) के लिए उत्तेजना के बाद । ट्रैक 2 के लिए, YFP के उत्तेजना के बाद YFP (YFP उत्सर्जन) के लिए 526-562 एनएम का पता लगाने के लिए एक डिटेक्टर सेट करें ।
    नोट: इस YFP प्रतिदीप्ति का उपयोग अभिव्यक्ति नियंत्रण के रूप में, साथ ही साथ सेगमेंटिंग नाभिक में, 3-डी विज़ुअलाइज़ेशन और विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में सतहों को जेनरेट करने के लिए किया जाता है.
  4. ५१२ x ५१२ पिक्सेल और 12 बिट्स के एक प्रस्ताव का एक प्रारूप का उपयोग कर छवियों को प्राप्त करें ।
  5. लाभ की जरूरत है एक empirically निर्धारित मूल्य है कि एक अच्छा संकेत के लिए अनुमति देता है जबकि पिक्सल संतृप्त नहीं करने के लिए समायोजित किया जाना है । लाभ के प्रयोग पर और झल्लाहट उत्सर्जन के बीच नहीं बदला जाना चाहिए । pinhole को 1 हवादार यूनिट (AU) पर सेट करें । फोकल माइक्रोस्कोप के मंच पर IBIDI चिपचिपा स्लाइड प्लेस, और इमेजिंग के साथ आगे बढ़ना के रूप में पहले दिखाया गया है ।
  6. माइक्रोस्कोप 1 सॉफ्टवेयर में, जबकि एक सक्रिय लाइव स्कैन में, पर चमक का उपयोग /के तहत छवि स्क्रीन के शीर्ष बाईं ओर पर स्थित है और ब्याज के क्षेत्र के जोखिम संतृप्ति निर्धारित करते हैं । माइक्रोस्कोप 2 सॉफ्टवेयर में, रेंज संकेतक का उपयोग करने के लिए छवि स्क्रीन के नीचे की ओर स्थित है और ब्याज के क्षेत्र के जोखिम संतृप्ति निर्धारित करते हैं । किसी भी मात्रात्मक छवि विश्लेषण के लिए, कोई पिक्सेल संतृप्ति होना चाहिए ।
  7. z-स्टैक्स को 1 माइक्रोन के चरण आकार के साथ सेट करें । चरण आकार एक बढ़ी हुई z-रिज़ॉल्यूशन के लिए कम किया जा सकता है या अधिग्रहण की बढ़ी हुई गति के लिए या छवि वाले हो सकते हैं स्थितियों/नमूने की संख्या बढ़ाने के लिए बढ़ाई जा सकती है । स्वचालित समय पाठ्यक्रम के लिए, सेट समय अंतराल पर छवियों को प्राप्त करने के लिए z-स्टैक्स (प्राप्ति मोड टैब से xyzt मोड) के साथ समय सेट करें.

5. छवि विश्लेषण फिजी का उपयोग

नोट: ImageJ (फिजी) का उपयोग करना यह संभव है इमेजिंग डेटा की प्रक्रिया और Arabidopsis अंकुरों में nlsGPS1 उत्सर्जन अनुपात के दो आयामी (2-डी) छवियों का उत्पादन । चित्रों के उदाहरणों के लिए, चित्र 2a, 2c2, 2E, 2gऔर 3ए देखें । ImageJ में, यह खोज समारोह का उपयोग कर इस प्रोटोकॉल के प्रत्येक आदेश को खोजने के लिए संभव है । कंप्यूटर कीबोर्ड पर स्पेस बार और L दबाएँ. एक नई विंडो खुलेगी; खोज फ़ील्ड में आवश्यक आदेश लिखें ।

  1. फ़ाइल (या तो. लिफ या. lsm फ़ाइलें) फिजी (छवि जंमू) में खींचें और हाइपर-स्टैक के रूप में छवियों को खोलने ।
  2. मुख्य मेनू से, छवि का चयन करें > > जेड परियोजना ढेर और सभी पिक्सल के बजाय अधिकतम प्रक्षेपणके रूप में केवल प्रतिभाशाली पिक्सल पर कब्जा करने के लिए Sum स्लाइस का चयन करें ।
  3. मुख्य मेनू से, चयन प्रक्रिया > पृष्ठभूमि घटाना और ५० पिक्सल के लिए रोलिंग गेंद त्रिज्या निर्धारित किया है । किसी भी अन्य विकल्प अचयनित करें और सभी तीन छवियों प्रक्रिया. यह कदम "रोलिंग बॉल" एल्गोरिथ्म का उपयोग कर पृष्ठभूमि को हटा ।
    नोट: ५० पिक्सल अग्रभूमि के रूप में नाभिक शामिल करने के लिए निर्धारित empirically था ।
  4. मुख्य मेनू से, छवि > रंग > विभाजन चैनलोंका चयन करें । तीन नई खिड़कियां खुलेगी: C1-SUM (विस्थिती चैनल); C2-SUM (झल्लाहट चैनल), और C3-SUM (YFP चैनल).
  5. C3-योग विंडो का चयन करें और, मुख्य मेनू से, प्रक्रिया > फ़िल्टर का चयन करें > गाऊसी कलंक और छवि शोर को कम करने के लिए 1 की एक गाऊसी कलंक लागू.
  6. मुख्य मेनू से, छवि का चयन करें > > चमक को समायोजित /कंट्रास्ट और ऑटो का चयन करें ।
  7. मुख्य मेनू से, चुनें प्रक्रिया > इसके विपरीत बढ़ानेके लिए, और सेट संतृप्त = ०.३५ ।
  8. मुख्य मेनू से, छवि > प्रकार > 8-bit का चयन करें और एक 8-bit छवि में ढेर कंवर्ट ।
  9. मुख्य मेनू से, छवि का चयन करें > > स्वत: स्थानीय दहलीज समायोजित । ऑटो-स्थानीय थ्रेशोल्डमें, निम्न पैरामीटर्स का चयन करें: Phansalkar विधि, त्रिज्या = 15, पैरामीटर 1 = 0, पैरामीटर 2 = 0, और सफेद स्टैक। इस चरण में, YFP स्टैक्स एक बाइनरी मास्क बनाने के लिए उपयोग किया जाता है ।
  10. C2-SUM विंडो का चयन करें, और मुख्य मेनू से, प्रक्रिया > फ़िल्टर्स का चयन करें > गाऊसी धुंधला और 1 का एक गाऊसी कलंक लागू होते हैं ।
  11. C1-योग विंडो का चयन करें और, मुख्य मेनू से, प्रक्रिया > फ़िल्टर का चयन करें > गाऊसी धुंधला और 1 का एक गाऊसी कलंक लागू होते हैं ।
  12. दो चैनलों से उत्सर्जन अनुपात स्टैक बनाने के लिए, मुख्य मेनू से, प्रक्रिया > छवि कैलकुलेटरका चयन करें । दिखाई देगा जो नई विंडो में, छवि 1 के रूप में C2-योग का चयन करें, ऑपरेटर के रूप में विभाजित करेंका चयन करें, और छवि 2 के रूप में c1 योग का चयन करें ।
  13. एक नई विंडो और ३२-बिट स्वरूप बनाएं का चयन करने के लिए सुनिश्चित करें । एक नई विंडो C2-SUM का नाम परिणामदिखाई देगा ।
  14. मुख्य मेनू से, छवि > लुकअप तालिका > LUT 16_colorsचयन करें ।
  15. मुख्य मेनू से, प्रक्रिया > छवि कैलकुलेटरका चयन करें । दिखाई देगा जो नई विंडो में, छवि 1 के रूप में C2-sum के परिणाम का चयन करें, ऑपरेटर के रूप में गुणा करें चुनें, और छवि 2 के रूप में C3-sum का चयन करें । इस चरण में, YFP बाइनरी मास्क YFP नियंत्रण चैनल में मौजूद केवल पिक्सेल्स दिखाने के लिए YFP//
  16. मुख्य मेनू से, चयन प्रक्रिया > गणित > विभाजन और २५५ करने के लिए मान सेट करें । खुलने वाली नई विंडो में, स्टैक में सभी छवियों का विश्लेषण करने के लिए हाँ का चयन करें. एक नई छवि C2-SUM के परिणाम के नाम सेप्रकट होगी ।
  17. मुख्य मेनू से, छवि का चयन करें > > चमक को समायोजित /कंट्रास्ट और ऑटोका चयन करें ।
  18. मुख्य मेनू से, कंट्रास्ट बढ़ानेके > प्रक्रिया का चयन करें, और प्रकार संतृप्त = ०.३५का चयन करें ।
  19. मुख्य मेनू से, छवि का चयन करें > > चमक को समायोजित /कंट्रास्ट, और GA बंटन कैप्चर करने के लिए ंयूनतम और अधिकतम मान सेट है । वैकल्पिक चरण: मुख्य मेनू से, अंशांकन पट्टी > > उपकरण का विश्लेषण और LUT-अंशांकन पट्टी दिखाएँका चयन करें, और एक. tiff फ़ाइल के रूप में c2-योग के परिणाम का परिणाम सहेजें ।
  20. उत्सर्जन अनुपात के मूल्यों को प्राप्त करने के लिए, मुख्य मेनू से, विश्लेषण > सेट माप का चयन करें और मतलब ग्रे मूल्य और मानक विचलनका चयन करें ।
  21. टूलबार से आयत आकृति का चयन करें और ब्याज (ROI) का क्षेत्र बनाएं । मुख्य मेनू से, > मापका विश्लेषण करें चुनें. एक नई विंडो चयनित ROI से माध्य मान की रिपोर्ट करेगी.
  22. स्प्रैडशीट सॉफ़्टवेयर (उदा., Excel या OriginPro) में प्राप्त मानों को कॉपी करके पेस्ट करें और या तो पहले से और बाद में GA4 उपचार प्रयोग के लिए हिस्टोग्राम बनाएं या किसी समय पाठ्यक्रम प्रयोग के लिए एक लाइन ग्राफ़ बनाएँ.

6.3-डी दृश्य और विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर छवि विश्लेषण

नोट: चयनित सॉफ्टवेयर का उपयोग करने का लाभ ( सामग्री की तालिकादेखें) के लिए वस्तुओं खंड (जैसे, नाभिक) है और एक फोकल जेड ढेर से 3 डी छवियों को बनाने के लिए है । छवियों के उदाहरणों के लिए, चित्र 2 बी, 2d, 2F, 2H, और बी. के.

  1. सॉफ़्टवेयर खोलें और फ़ाइल (या तो. लिफ या. lsm फ़ाइलें) आयात करें ।
  2. खंड नाभिक पर आधारित नियंत्रण YFP उत्सर्जन चैनल का उपयोग कर सतहों जादूगर। विभाजित वस्तुओं "सतहों" शब्द हैं । यह विभाजन चरण नाभिक के बाहर voxels से पृष्ठभूमि को नष्ट करते हुए एक नाभिक में सभी voxels के विश्लेषण को अनुमति देता है ।
  3. सतहों विज़ार्डमें, पृष्ठभूमि घटाव सेट (स्थानीय कंट्रास्ट) करने के लिए 3 µm और थ्रेशोल्ड करने के लिए डिफ़ॉल्ट । मुखौटा (दाता उत्तेजना दाता उत्सर्जन [DxDm]) और झल्लाहट उत्सर्जन (दाता उत्तेजना स्वीकार करनेवाला उत्सर्जन [DxAm]) चैनल YFP उत्सर्जन (स्वीकारकर्ता उत्तेजना स्वीकार उत्सर्जन [AxAm]) चैनल का उपयोग कर बनाई गई सतहों पर आधारित है ।
  4. दो चैनलों में व्यक्तिगत सतहों के अर्थ तीव्रता मूल्यों के बीच दाता उत्तेजना दाता उत्सर्जन (DxAm/DxDm) द्वारा विभाजित दाता उत्तेजना स्वीकारकर्ता उत्सर्जन के अनुपात की गणना करने के लिए एक्सटेंशन एक्सटी माध्य तीव्रता अनुपात का उपयोग करें ।
    नोट: यह एक्सटेंशन डाउनलोड के लिए ऑनलाइन उपलब्ध है ।
  5. nlsGPS1 उत्सर्जन अनुपात के साथ व्यक्तिगत सतहों रंग, सांख्यिकी, जो एक रंग पहिया आइकन के रूप में प्रतिनिधित्व किया है के साथ रंग कोडिंगका चयन करें । आंकड़े प्रकार के रूप में मतलब तीव्रता अनुपात का चयन करें ।
  6. तालिका से व्यक्तिगत मानों के अनुपात को निर्यात करें, जो आँकड़े चिह्न के अंतर्गत पाया जाता है.
  7. कॉपी और एक स्प्रेडशीट में मूल्यों पेस्ट करें और या तो के लिए एक हिस्टोग्राम बनाने से पहले और बाद GA4 उपचार प्रयोगों या समय पाठ्यक्रम प्रयोगों के लिए एक रैखिक ग्राफ.

7. सांख्यिकीय विश्लेषण

नोट: nlsGPS1 उत्सर्जन अनुपात के एक beeswarm और बॉक्स प्लॉट के लिए चित्रा 3d देखें ।

  1. सॉफ़्टवेयर खोलें और नाभिक सतहों के उत्सर्जन अनुपात को Y स्तंभों के रूप में चिपकाएं ।
  2. रुचि के स्तंभों का चयन करें और आंकड़े > आँकड़े विवरण > सामान्यता परीक्षण के लिए पता है कि क्या नमूने सामान्य रूप से वितरित कर रहे हैं का चयन करें. सामान्यता परीक्षण चलाएँ और एक नई विंडो खुल जाएगा और परिणामों की रिपोर्ट.
  3. नमूने सामान्य रूप से वितरित किए जाते हैं, तो सांख्यिकीय परीक्षण के रूप में t-परीक्षण का उपयोग करें । आँकड़ों > परिकल्पना परीक्षण > दो-नमूना टी-टेस्ट पंक्तियों पर चुनें और टी-टेस्ट चलाएँ.
  4. यदि नमूने सामान्य रूप से वितरित नहीं किए जाते हैं, तो आँकड़ों > आँकड़े परिकल्पना परीक्षण > दो-नमूना परीक्षण प्रसरण के लिए नमूनों के बीच प्रसरण महत्वपूर्ण रूप से भिन्न नहीं है कि पता करने के लिए का चयन करें ।
  5. यदि प्रसरण काफी अलग नहीं है, तो सांख्यिकीय परीक्षण के रूप में मान-Whitney U परीक्षण का उपयोग करें । चुनें सांख्यिकी > Nonparametric टेस्ट > मान-Whitney परीक्षण और भागो परीक्षण ।
  6. प्रसरण काफी भिन्न है, तो सांख्यिकीय परीक्षण के रूप में Kruskal वालिस ANOVA परीक्षण का उपयोग करें । > Nonparametric परीक्षण > Kruskal वालिस ANOVA परीक्षण और भागो परीक्षण सांख्यिकी का चयन करें ।

Representative Results

nlsGPS1 का प्रयोग, यह प्रतिदीप्ति इमेजिंग करने के लिए उत्तरदायी ऊतकों में सेलुलर GA4 स्तरों को मापने के लिए संभव है, रूट युक्तियाँ और डार्क hypocotyls (चित्रा 2) सहित. Arabidopsis रूट में, nlsGPS1 उत्सर्जन अनुपात ढाल meristematic और विभाजन क्षेत्रों और देर से बढ़ाव क्षेत्र में उच्च ga के स्तर में कम ga के स्तर का संकेत है (चित्रा 2a और बी b) । इसके विपरीत, एक उत्सर्जन अनुपात ढाल nlsGPS1-NR जड़ों में नहीं देखा गया था, सुझाव है कि अंतर्जात GA ढाल एक मूर्ति (चित्रा 2c और 2d) नहीं है । एक nlsGPS1 उत्सर्जन अनुपात ढाल भी अंधेरे में गठन किया गया hypocotyls, cotyledons में निंन स्तर और शिखर हुक और hypocotyl (चित्रा 2E और 2F) के तेजी से बढ़ाव बेसल क्षेत्र में उच्च स्तर के साथ । इसके विपरीत, nlsGPS1-NR hypocotyls (चित्रा 2g और 2H) में उत्सर्जन अनुपात ग्रैडिएंट नहीं देखा गया था । दोनों Arabidopsis जड़ों और काले-बड़े hypocotyl कोशिकाओं में, अंतर्जात GA संचय सेलुलर बढ़ाव दर के साथ संबंधित ।

इसके अलावा, exogenously की आपूर्ति ga4 Arabidopsis रूट (चित्रा 3) के विभाजन क्षेत्र की तुलना में बढ़ाव क्षेत्र में तरजीही जमा है, यह दर्शाता है कि nlsGPS1 अंतर्जात और exogenous GA अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता Patterning.

समय पाठ्यक्रम प्रयोगों के दौरान, nlsGPS1 अंकुर चिपचिपा स्लाइड कक्षों में रखा गया था और ¼ एमएस तरल के साथ perfused, 30 मिनट के लिए ०.१ µ एम गा4 के साथ एक उपचार के बाद । वीडियो रूट बढ़ाव क्षेत्र में विभाजन क्षेत्र (वीडियो 1) की तुलना में exogenous GA4 के एक तेजी से संचय से पता चलता है ।

Figure 1
चित्रा 1: फोकल इमेजिंग के लिए नमूना तैयारी । इन पैनलों (क) एक स्थिर राज्य प्रयोग के लिए नमूना तैयार करने का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व दिखाने के लिए, (ख) से पहले और exogenous GA4 उपचार के बाद, और (ग) एक उपचार के समय पाठ्यक्रम का प्रयोग प्रयोग चिपचिपा-स्लाइड (सी) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: Arabidopsis जड़ों और अंधेरे में GA ढाल hypocotyls हो गया । दो आयामी (एक) nlsGPS1 और (सी) nlsGPS1-nr जड़ें ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण किया गया, और तीन के आयामी छवियों (ख) nlsGPS1 और (घ) nlsGPS1-NR एक वाणिज्यिक तीन आयामी का उपयोग कर विश्लेषण किया गया छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर । दोनों विश्लेषणों Arabidopsis जड़ों में एक अंतर्जात GA4 ढाल दिखाया । के दो आयामी छवियों (ई) nlsGPS1 और (जी) nlsGPS1-nr डार्क hypocotyl ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण किया गया, और (च) nlsGPS1 और (एच) nlsGPS1-nr के तीन आयामी छवियों का उपयोग कर विश्लेषण किया गया वाणिज्यिक तीन आयामी छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर । दोनों विश्लेषणों अंधेरे में एक अंतर्जात GA4 ढाल-बड़े hypocotyls दिखाया । LUT बार nlsGPS1 उत्सर्जन अनुपात की झूठी रंगाई प्रदर्शित करता है । YFP छवियां अभिव्यक्ति नियंत्रण के रूप में रिपोर्ट की गई हैं । Hypocotyl छवियों दो स्तर की स्थिति का उपयोग कर अधिग्रहीत किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: जड़ों में exogenous GA ढाल । पहले दो पैनलों (एक) दो आयामी और (बी) तीन एक nlsGPS1 जड़ के आयामी छवियों से पहले और 20 मिनट exogenous GA4 (1 µ m) के उपचार के बाद दिखाओ । YFP छवियां अभिव्यक्ति नियंत्रण के रूप में रिपोर्ट की गई हैं । पिछले दो पैनलों (ग) का मतलब है और मानक विचलन और (घ) बढ़ाव क्षेत्र के नाभिक के लिए nlsGPS1 उत्सर्जन अनुपात के beeswarm और बॉक्स प्लाट (क्षेत्र जो एक सफेद फ्रेम के साथ परिभाषित किया गया है) दिखाओ । बढ़ाव क्षेत्र में, GA4 उपचार (मान-Whitney यू परीक्षण, * * * P-value < ०.०००१) के बाद nlsGPS1 उत्सर्जन अनुपात काफी अधिक था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Video 1
वीडियो 1: nlsGPS1 रूट के छिड़काव प्रयोग चिपचिपा स्लाइड का उपयोग कर । यह वीडियो तीन nlsGPS1 perfused के आयामी ¼ एमएस तरल के साथ छवियों से पता चलता है और ०.१ µ एम GA4 के साथ 30 मिनट के लिए इलाज किया । समय पाठ्यक्रम में, इमेजिंग हर 10 मिनट के लिए 3 घंटे के साथ निंनलिखित अंतराल के साथ अधिग्रहीत किया गया था: नकली समाधान के 30 मिनट (फ़्रेम t = 1, t = 2, t = 3), GA4 उपचार के 30 मिनट (फ़्रेम t = 4, t = 5, t = 6), नकली के 2 h तो lution (फ़्रेम t = 7 से t = 18) समाधान । अधिग्रहण से पहले, नमूना 2 एच के लिए मॉक सॉल्यूशन के साथ perfused किया गया था । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Discussion

झल्लाहट आधारित ga nlsGPS1 सेंसर कोशिकीय पौधों में ga हार्मोन की ढाल की रिपोर्ट और माप करने के लिए एक मात्रात्मक विधि प्रदान करता है । झल्लाहट आधारित बायोमास स्पेक्ट्रोमेट्री और अप्रत्यक्ष माप द्वारा transcriptional रिपोर्टर द्वारा प्रत्यक्ष पता लगाने पर एक बेहतर spatiotemporal संकल्प के साथ गतिशीलता को बढ़ाता है या संकेत कर सकते हैं-प्रोटीन-क्षरण-आधारित तरीकों12, 13. विविध ऊतक में उच्च संकल्प सेलुलर इमेजिंग-प्रकार ga जीवविज्ञान में सार्थक अंतर्दृष्टि उपज और विनियमन और एक कोशिकीय संदर्भ में ga संचय के समारोह के बारे में नई परिकल्पना चिंगारी कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, विशिष्ट ga, catabolic, और परिवहन म्यूटेंट में nlsGPS1 में परिवर्तन की निगरानी, साथ ही साथ spatiotemporally प्रेरित perturbations के दौरान, बहुत विशेष रूप से परीक्षण करने के लिए कैसे GA ढाल में स्थापित कर रहे है जानकारीपूर्ण जा सकता है GA ग्रैडिएंट के लिए रूट और पता रूट कक्ष प्रतिसाद । संवेदक बीज अंकुरण, सेलुलर बढ़ाव, और फूल के GA-मध्यस्थता नियंत्रण नियंत्रण तंत्र के संरक्षण का परीक्षण करने के लिए अन्य मॉडल और फसल प्रजातियों में इस्तेमाल किया जा सकता है.

झल्लाहट में महत्वपूर्ण कदम-आधारित इमेजिंग nlsGPS1 के संवेदक है कि, 1) पिक्सल मात्रात्मक झल्लाहट विश्लेषण के दौरान संतृप्त नहीं किया जाना चाहिए, 2) ऐसे "डिटेक्टर लाभ" के रूप में इमेजिंग मानकों दाता उत्सर्जन के लिए लगातार रखा जाना चाहिए (DxDm) और स्वीकार उत्सर्जन (DxAm) अधिग्रहण, 3) नियंत्रण nlsGPS1-NR लाइनों के बाहर कलाकृतियों शासन करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए, और 4) नमूने बहाव और फोकल परिवर्तन के मुद्दों को कम करने के लिए तैयार किया जाना चाहिए. इसके अतिरिक्त, पर्यावरण की स्थिति में जो नमूने बड़े हो रहे है नियंत्रित करने के लिए महत्वपूर्ण है के बाद से GA स्तर जैसे प्रकाश अवधि और प्रकाश की तीव्रता14,15,16 के रूप में पर्यावरण की स्थिति के प्रति संवेदनशील हैं ,17. विश्लेषण के इस प्रकार की एक प्रमुख सीमा है कि एक उच्च संकेत करने वाली शोर अनुपात ratiometric इमेजिंग में निहित शोर में वृद्धि के कारण इमेजिंग के लिए आवश्यक है । इस प्रकार, nlsGPS1 इमेजिंग ratiometric प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी सियान और पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग करने के लिए उत्तरदायी नहीं हैं कि ऊतकों और अंगों के लिए उपयोगी नहीं होगा-उदाहरण के लिए, गहरे ऊतकों जहां फ्लोरोसेंट प्रोटीन खराब पाया जाता है. दूसरी ओर, ratiometric readouts अक्सर intensiometric readouts पर पसंद कर रहे हैं, क्योंकि एक आंतरिक नियंत्रण बाहर एक दिया सेल, ऊतक में एक सेंसर अभिव्यक्ति, स्थिरता, चमक, या जासूसी में परिवर्तन से उपजी कलाकृतियों शासन करने के लिए उपयोगी है , या शर्त । उदाहरण के लिए, झल्लाहट सेंसर इमेजिंग और छवि विश्लेषण भी ऊतकों की एक किस्म में लाइगैंडों की एक किस्म का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है5,6,18,19,20,. इमेजिंग प्रयोगों और छवि विश्लेषण यहां रिपोर्ट इस तरह के प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी के रूप में नई इमेजिंग तरीकों, के अनुरूप संशोधित किया जा सकता है, कि में उपंयास अंतर्दृष्टि उपज सकता है, उदाहरण के लिए, गहरी जड़ ऊतक प्रकार ।

पहली पीढ़ी के nlsGPS1 एक उच्च-संबंध संवेदक है कि ga ढाल के एक उच्च संकल्प नक्शा है कि भी ga में intracellular वृद्धि पर रिपोर्ट कर सकते है प्रदान करता है exogenous ga उपचार निंनलिखित । nlsGPS1 की वर्तमान सीमाओं में से एक यह है कि संवेदक तेजी से प्रतिवर्ती नहीं है और, इस प्रकार, स्थिर पर नहीं रिपोर्ट-राज्य ga स्तर पर, की संभावना है, ब्याज के समाधान में अधिकतम हाल ही में ga एकाग्रता पर । संवेदक के लिए सटीक कारोबार दर भी ज्ञात नहीं है और यह, कम reversibility के साथ संयुक्त, अंतर्जात GA की कमी है कि कुछ ऊतक-प्रकार में कुछ घंटे के लिए एक मिनट के भीतर हो रहा हो सकता है की precludes का पता लगाने । यह भी ध्यान रखें कि nlsGPS1 ga4 (kd = 24 एनएम के लिए एक उच्च समानता है) अंय ga रूपों की तुलना में महत्वपूर्ण है (ga3 kd= २४० एनएम, ga1kd = ११० एनएम) जब इमेजिंग अंय सक्रिय गैस 7. GA के reversibility के भविष्य की पीढ़ियों के लिए उच्च संबंध बनाए रखने या विभिंन अग्रदूत, सक्रिय, या catabolite गैस के लिए विभिंन विशिष्टताओं को प्रदर्शित करने के लिए समय बढ़ाने के इंजीनियर जा सकता है । 

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को यूरोपीयन यूनियन के क्षितिज २०२० रिसर्च ऐंड इनोवेशन प्रोग्राम (ग्रांट एग्रीमेंट एन ° ७५९२८२) के तहत यूरोपियन रिसर्च काउंसिल (ईआरसी) से फंडिंग मिली है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
nlsGPS1 Col0 Arabidopsis seeds NASC N2107734
nlsGPS-NR Col0 Arabidopsis seeds NASC N2107735
Gibberellin A4 (GA4) Sigma G7276 dissolve in EtH 70% , and keep at -20 °C
sodium hypochlorite solution (Bleach) Fisher S/5040 HSRA 064
Hydrogen cloride HCl Sigma 31434
Micropore tape 3M 1530-1
ibidi sticky-slide Ibidi 81128 Luer 0.1 for root imaging
ibidi sticky-slide Ibidi 80168 Luer 0.2 for hypocotyl imaging
glass coverslip for sticky slides Ibidi 10812
Elbow Luer Connectors Ibidi 10802
silicone tubing Ibidi 108401
Luer Lock Connector Ibidi 10826
programmable syringe pump World Precision Instruments AL-1000
Vacuum grease Sigma 18405
Murashige and Skoog Basal Salts Duchefa M0221
Agar plant, 1 kg Melford P1001
Microscope slide ground edges, 76 mm x 26 mm, 1.0 mm to 1.2 mm thick Fisher Scientific 12383118
Cover slip No.1 1/2 glass 22 mm x 22 mm Fisher Scientific 12363138
Luer-slip Syringe 20 mL Fisher Scientific 10785126
3M Micropor Surgical Paper Tape Fisher Scientific 12787597
Potassium Hydroxide, 500 g Sigma Aldrich 221473-500G-D
Absolute Ethanol Fisher Scientific 10428671
Forceps Watchmaker 5 StSteel Scientific Laboratory Supplies INS4340
Scissors, 125 mm, stainless steel Fisher Scientific 12338099
Fitting reducer 0.5 to 1.6 Ibidi 10829
Leica SP8 Confocal laser microscope 1
Zeiss LSM 780 Confocal laser microscope 2
Imaris Bitplane 3D visualization and Analysis software
Fiji image analysis software
OriginPro Origin Lab Statistical Analysis Software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Binenbaum, J., Weinstain, R., Shani, E. Gibberellin Localization and Transport in Plants. Trends in Plant Science. 23 (5), 410-421 (2018).
  2. Sun, T. Gibberellin Metabolism, Perception and Signaling Pathways in Arabidopsis. The Arabidopsis Book. 6, 0103 (2008).
  3. Rieu, I., et al. Genetic Analysis Reveals That C19-GA 2-Oxidation Is a Major Gibberellin Inactivation Pathway in Arabidopsis. The Plant Cell Online. 20 (9), 2420-2436 (2008).
  4. Regnault, T., et al. The gibberellin precursor GA12 acts as a long-distance growth signal in Arabidopsis. Nature Plants. 1, 15073 (2015).
  5. Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. Quantitative Imaging with Fluorescent Biosensors. Annual Review of Plant Biology. 63 (1), 663-706 (2012).
  6. Walia, A., Waadt, R., Jones, A. M. Genetically Encoded Biosensors in Plants: Pathways to Discovery. Annual Review of Plant Biology. 69 (1), 497-524 (2018).
  7. Rizza, A., Walia, A., Lanquar, V., Frommer, W. B., Jones, A. M. In vivo gibberellin gradients visualized in rapidly elongating tissues. Nature Plants. 3 (10), 803-813 (2017).
  8. Rizzo, M. A., Springer, G., Segawa, K., Zipfel, W. R., Piston, D. W. Optimization of pairings and detection conditions for measurement of FRET between cyan and yellow fluorescent proteins. Microscopy and Microanalysis. 12 (3), 238-254 (2006).
  9. Ueguchi-Tanaka, M., et al. GIBBERELLIN INSENSITIVE DWARF1 encodes a soluble receptor for gibberellin. Nature. 437, 693-698 (2005).
  10. Grossmann, G., et al. Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip. Journal of Visualized Experiments. (65), 34290 (2012).
  11. Grossmann, G., et al. The RootChip: an integrated microfluidic chip for plant science. Plant Cell. 23 (12), 4234-4240 (2011).
  12. Brunoud, G., et al. A novel sensor to map auxin response and distribution at high spatio-temporal resolution. Nature. 482, 103-106 (2012).
  13. Wang, N. N., Shin, M. C., Li, N. The GUS reporter-aided analysis of the promoter activities of Arabidopsis ACC synthase genes AtACS4, AtACS5, and AtACS7 induced by hormones and stresses. Journal of Experimental Botany. 56 (413), 909-920 (2005).
  14. Alabadi, D. Gibberellins Repress Photomorphogenesis in Darkness. Plant Physiology. 134 (3), 1050-1057 (2004).
  15. De Lucas, M., et al. A molecular framework for light and gibberellin control of cell elongation. Nature. 451 (7177), 480-484 (2008).
  16. Strasser, B., Sanchez-Lamas, M., Yanovsky, M. J., Casal, J. J., Cerdan, P. D. Arabidopsis thaliana life without phytochromes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (10), 4776-4781 (2010).
  17. Feng, S., et al. Coordinated regulation of Arabidopsis thaliana development by light and gibberellins. Nature. 451, 475-479 (2008).
  18. Choi, W. G., Swanson, S. J., Gilroy, S. High-resolution imaging of Ca2+, redox status, ROS and pH using GFP biosensors. Plant Journal. 70 (1), 118-128 (2012).
  19. Lanquar, V., et al. Dynamic imaging of cytosolic zinc in Arabidopsis roots combining FRET sensors and RootChip technology. New Phytologist. 202 (1), 198-208 (2014).
  20. Krebs, M., Schumacher, K. Live cell imaging of cytoplasmic and nuclear Ca2+ dynamics in Arabidopsis roots. Cold Spring Harbor. 2013 (8), 776-780 (2013).

Tags

विकास जीवविज्ञान अंक १४३ पादप जैव रसायन जीवन विज्ञान जीवन विज्ञान (जनरल) gibberellin Phytohormone Spatiotemporal संयंत्र विकास सेल विकास जैव सेंसर झल्लाहट
NlsGPS1 Förster अनुनाद ऊर्जा स्थानांतरण (झल्लाहट) का उपयोग कर सेलुलर Gibberellin स्तरों visualizing
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rizza, A., Walia, A., Tang, B.,… More

Rizza, A., Walia, A., Tang, B., Jones, A. M. Visualizing Cellular Gibberellin Levels Using the nlsGPS1 Förster Resonance Energy Transfer (FRET) Biosensor. J. Vis. Exp. (143), e58739, doi:10.3791/58739 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter