Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Visualisere mobilnettet Gibberellin nivåer ved hjelp av NlsGPS1 han selvmord resonans energi overføring (bånd) Biosensor

Published: January 12, 2019 doi: 10.3791/58739
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Sainsbury Laboratory, University of Cambridge

Summary

Gibberellin persepsjon Sensor 1 (GPS1) er det første han selvmord resonans energi overføring-basert biosensor for måling av mobilnettet nivåene av gibberellin phyto-hormoner med et spatiotemporal med høy oppløsning. Denne protokollen rapporter om metoden å visualisere og kvantifisere mobilnettet gibberellin nivåer ved hjelp av genetisk kodet nlsGPS1 biosensor i Arabidopsis hypocotyls og rot tips.

Abstract

Phytohormone gibberellin (GA) er en liten, mobil signalnettverk molekyl som spiller en nøkkelrolle i frø spiring, mobil forlengelse og utviklingsmessige overganger i planter. Gibberellin persepsjon sensoren 1 (GPS1) er den første han selvmord resonans energi overføringen (bånd)-basert biosensor som gjør at overvåking av mobilnettet GA nivåer i vivo. Ved å måle fluorescens utslipp forholdet kjernefysiske lokalisert-GPS1 (nlsGPS1), er spatiotemporal kartlegging av endogenously og exogenously følger GA graderinger i ulike vev typer mulig i mobilnettet skala. Denne protokollen vil beskrive hvordan nlsGPS1 utslipp prosenter i tre eksempel eksperimenter: stabil, før og etter eksogene gibberellin A4 (GA4) behandlinger, og en behandling tid-løpet. Vi tilbyr også metoder for å analysere nlsGPS1 utslipp forholdstall med både Fiji og en kommersiell tredimensjonale (3D) mikroskop-bilde visualisering og analyse programvare og forklare begrensninger og sannsynlig fallgrubene bruke nlsGPS1 for å kvantifisere gibberellin nivåer.

Introduction

Plantehormoner spiller en grunnleggende rolle i anlegget vekst og utvikling. Disse liten, mobil signalnettverk molekylene er vanligvis regulert på flere nivåer, for eksempel biosyntesen og katabolisme kort - og lang fra transport1,2,3,4. Forståelsen av hormon signalveier og nedstrøms transcriptional svar har skjerpet gjennom årene. Imidlertid vil koble ulike mobilnettet svarene på hormon signalveier med regulatoriske innganger regi hormon distribusjoner, krever vi en spatiotemporal kvantifisering av hormonnivået i mobilnettet skala. BÅND-baserte biosensors som kan oppdage phyto-hormoner kan gå forskernes evne å kvantifisere hormonnivået i mobilnettet skala. BÅND-baserte biosensors består av bånd (giver og acceptor fluorescerende proteiner) koblet til en sensorisk domenet binder en bestemt ligand eller svarer på en biologisk stimulans. For små molekyl biosensors utløser ligand binding en conformational endring av sensoriske domenet som resulterer i en endring av avstand og/eller retning mellom to fluorescerende proteiner av bånd par. En ratiometric analyse av et bånd biosensor oppnås ved spennende donor og måle fluorescens utslipp forholdet mellom acceptor over donor5,6. Ligand binding er som en endring i denne utslipp forholdet7.

Vi har nylig utviklet en bånd-baserte biosensor for plantehormonet GA. gass er en klasse av hormoner som kan fremme frø spiring, mobil forlengelse og utviklingsmessige overgangen fra vegetative til blomstrende faser. NlsGPS1 biosensor er kjernefysiske lokalisert og gir spatiotemporal innsikt i GA dynamikk i ulike plante vev. I Arabidopsis celler, GA binder til løselig reseptorer, gibberellin-ufølsom dverg (GID), og komplekset induserer nedbrytning av DELLA proteiner som negative regulatorer av GA signalisere2. GA sensoriske domenet nlsGPS1 består av Arabidopsis GA reseptoren (AtGID1C) koblet til en 74-amino acid trunkering av et DELLA protein (AtGAI) og et bånd par bestående av forbedret dimerization varianter av Cerulean som donor fluorescerende protein og Afrodite (en codon diversifisert Venus) som acceptor fluorescerende protein8. NlsGPS1 biosensor er en høy affinitet sensor for bioaktive GA4 (Kd = 24 nM for GA4) og det kan brukes i ulike vev-typer til kart og kvantifisere GA graderinger. For å unngå feiltolkning av Arabidopsis GA i vivo, har vi også utviklet en selv variant av nlsGPS1 (nlsGPS1-NR) bruke som en negativ kontroll. NlsGPS1-NR protein bærer mutasjoner i GA-binding lomme som forstyrrer binding av GA og mutasjoner i DELLA protein som forstyrrer samspillet med GID reseptor proteiner7,9. Utslipp forholdet mønstre eller endringer observert i både nlsGPS1 og nlsGPS1-NR kan betraktes gjenstander ikke direkte relatert til GA-bindende hendelser. Det er også viktig å merke seg at nlsGPS1 binding til GA4 er ikke raskt reversibel, og derfor mobilnettet nlsGPS1 utslipp prosenter tolkes som representerer den høyeste siste konsentrasjonen av GA i en gitt kjerne snarere enn i sanntid stabil nivåer. Som en konsekvens, er en analyse av fallende GA nivåer ikke mulig med nlsGPS1.

Her gir vi en detaljert protokoll for å benytte en nlsGPS1 biosensor i cellene av modellen anlegget Arabidopsis, med AC confocal imaging-baserte tilnærminger på med høy oppløsning. Protokollen inneholder informasjon om tenkelig planterøttene og hypocotyls både på steady state og over tid-kurs. NlsGPS1 sensoren kan potensielt utnyttes i ulike vev-typer og over plantearter, kart og kvantifisere GA distribusjoner.

Protocol

1. forberedelser

  1. Forberede ½ Murashige og Skoog agar pH 5.7 med ingen sukker (1 L).
    1. Oppløse 2.2 g av Murashige og Skoog (MS) basale medium 950 mL ultrapure vann. Justere pH til 5.7 med 5 M KOH.
    2. Utgjør løsningen til et endelig antall 1 L med ultrapure vann. Dele det i to 500 mL flasker, hver med 1% plante agar. Autoclave ved 121 ° C i 20 min.
  2. Forberede ¼ MS flytende ved pH 5.7 med ingen sukker (1 L).
    1. Oppløse 1.1 g av MS i 950 mL ultrapure vann. Justere pH til 5.7 med 5 M KOH. Utgjør løsningen til et endelig antall 1 L med ultrapure vann. Dele det i to 500 mL flasker. Autoclave ved 121 ° C i 20 min.
  3. Forberede GA4.
    1. Oppløse GA4 i etanol 70% for å gjøre en siste konsentrasjon av 100 mM GA4 lager.
    2. For å forberede fungerende løsning, fortynne GA4 sluttvederlag til 0,1 til 1 µM i ¼ MS flytende pH 5.7.

2. plantevekst

  1. Sterilisere Arabidopsis frø.
    1. Arbeide med kjemiske hette. Aliquot frø (ca 200 frø) i 2 mL microcentrifuge rør. Bruk en markør med klor-motstandsdyktig blekk og plassere rør med åpne lokk inne sterilisering fartøyet (en stor boks som kan forsegles).
    2. Plass en 250 mL kanne inneholder 50 mL ultrapure vann og 50 mL av natriumhypokloritt løsning innenfor sterilisering fartøyet.
    3. Legge til 3 mL konsentrert saltsyre (HCl) begeret. Umiddelbart forsegle fartøyet og tillate sterilisering av klorgass 6-16 h.
    4. Etter unsealing fartøyet, Lukk lokkene på alle microcentrifuge rør i frø stativet. Sterilisert frø kan lagres tørt inntil plating.
  2. Så ca 20 sterilisert Arabidopsis frø på ½ MS agar firkantede tallerkener. Seal platene med porøse kirurgisk tape og pakk dem med aluminiumsfolie. Inkuber dem på 4 ° C i 1-3 dager for lagdeling.
  3. For rot bildebehandling, overføre platene til vekst kammeret i vertikal posisjon for 3 dager med følgende vekst: lang dag forhold (LD, 16 h lys/8 h mørk); 120 µmol⋅m-2s-1 lysintensiteten; temperaturen på 22 ° C (under lyset syklus) eller 18 ° C (under mørke syklus), 65% relativ fuktighet (RH).
  4. For mørk dyrket hypocotyl: overføre platene til vekst kammer for et lys pulsen av 1 – 4 h å synkronisere spiring. Pakk platene med aluminiumsfolie og plassere dem i vekst kammer i vertikal posisjon i 3 dager.

3. eksempel forberedelse

  1. Stabil målinger (figur 1A)
    1. På en ren microscope skyve, Legg 50 µL av ¼ MS (nå kalt som uekte løsning). Forsiktig overføre seedlings uttrykke nlsGPS1 fra platen på lysbildet.
    2. Ta en ren dekkglassvæske og oppdage en dråpe vakuum fett på hvert hjørne av dekkglassvæske. Forsiktig plassere dekkglassvæske over seedlings og nøye legge ekstra narr løsning for å fjerne eventuelle luftbobler.
  2. GA4 behandling: kjemiske exchange eksperimentet (figur 1B).
    1. Før GA4 behandling, kan du bruke en 20 mL sprøyte fylt med vakuum fett (festet til en Pipetter tips) for å tegne et rektangel (lengde: 3,5 cm, høyde: 2,5 cm) med et jevnt lag av vakuum fett på et rent glass lysbilde (figur 1B). For å gi en fin linje av vakuum fett, bør Pipetter spissen kuttes har en åpning av 1 mm i diameter.
    2. Legge til 50 µL av uekte løsning av objektglass. Med ren tang, plukke den nlsGPS1 seedlings og forsiktig plassere dem på falske løsningen. For å hindre skade, overføre seedlings ved å støtte undersiden av cotyledons uten fatte frøplante med tang.
    3. Ta en ren dekkglassvæske og oppdage en dråpe vakuum fett på hvert hjørne av dekkglassvæske. Bruke pinsett, sted i dekkglassvæske i sentrum av vakuum fett rektanglet. Nå er dekkglassvæske forseglet på de to sidene tilsvarer langsider av vakuum fett rektangelet.
    4. Forsiktig legge ekstra narr løsning å fylle opp reservoaret og fjern eventuelle luftbobler i reservoaret uten å forstyrre seedling(s) inni.
    5. Hente bilder før GA4 behandling med AC confocal mikroskop. Følg instruksjonene som beskrevet i del 4 i denne protokollen.
    6. For GA4 behandling, fjerne microscope skyve fra AC confocal scenen. Still et tidsur for 20 min.
    7. Etter igangsetting timeren, utveksle buffer løsning med ¼ MS væske som inneholder 1 µM GA4. Legge til GA4 løsningen (ca 50 µL) fra venstre side av dekkglassvæske og fjerne den forrige (falske) løsningen fra retten. Holde på utveksle løsningen å erstatte den falske løsningen helt, som tar ca 10 min (figur 1B).
    8. Sett av objektglass tilbake på mikroskopet scenen. Vent en annen 10 min før anskaffe etter-GA bildet.
  3. Oppsett av en gang kurs for vevet rundt
    Merk: Vevet rundt kan for eksempel være hypocotyls eller røtter. Vi utfører rutinemessig tiden kurs for imaging nlsGPS1 biosensor ved å bruke en kommersiell perfusjon (figur 1 c, se Tabellen for materiale) eller en RootChip7,10,11.
    1. Legge til 200 µL av uekte løsning til midten av perfusjon kanalen klissete-lysbildet (se Tabell for materiale). Forsiktig plukke nlsGPS1 frøplanter og plassere dem på falske løsningen i prioritert-lysbildet.
    2. Ved hjelp av pinsett, forsiktig plassere glass dekkglassvæske og bruke baksiden av tang, trykk forsiktig på ytre kant av dekkglassvæske slik at den danner et sterkt bånd med klebrig materialet i utkanten av klissete-lysbildet.
    3. Bruke to albue Luer koble kontakter (med en diameter [ID] på 0,8 mm) og silikon slangen (med ID 0,8 mm), klissete-lysbildet til en 20 mL sprøyte og en stikkontakt beholder samle ut løsningen. Bruke Luer lås kontakten (med ID 0,8 mm) for å koble sprøyten til silikon slangen.
    4. Trykk forsiktig sprøyten som inneholder uekte løsningen manuelt for å gi nok løsning passerer gjennom kammeret slik at det er ingen luftbobler i kammeret. Plasser og hold sprøyten på programmerbare sprøytepumpen.
    5. Angi parameterne pumpe bestemt til sprøyten brukes (i.e., diameter og volum) sammen med infusjonshastigheten etter manuell levert med pumpen.
      Merk: I denne protokollen, en strømningshastighet på 1 – 3 mL/t ble brukt, og dette kan endres i henhold til eksperimentelle krav. Start time course ved oppstart av pumpe.
    6. Hvis GA4 behandling under en gang kurs (figur 1 c), innom perfusjonen i å stanse pumpen og endre sprøyten med en ny en med ¼ MS væske med GA4. Fortsett med AC confocal imaging som vist i neste avsnitt.

4. mikroskopi

Merk: Vi utfører AC confocal laser mikroskopi.

  1. Hente bilder bruke AC confocal mikroskop utstyrt med lasere for å utføre BÅNDS tenkelig.
    Merk: For nlsGPS1, er varianter av cyan fluorescerende protein (CFP) og gule fluorescerende protein (YFP) fotografert. I denne protokollen brukes kommersielt mikroskop (se Tabell av materialer, oppført som mikroskop 1 og 2) med 10 x eller 20 x tørr 0,70 harmonisk sammensatt PLAN APO mål.
  2. Mikroskopet 1, bruk 448 nm og 514 nm wavelength lasere å opphisse CFP og YFP, henholdsvis. Erverve sekvensielle avsøkinger. Angi detektorer (f.eks HyD SMD) for å oppdage 460-500 nm for CFP (donor utslipp) og 525-560 nm for YFP (bånd utslipp) etter magnetisering av CFP. Bruker en andre sekvens, satt en detektor for å oppdage 525-560 nm YFP (YFP utslipp) etter magnetisering av YFP.
    Merk: Denne YFP fluorescens brukes som et uttrykk og segmentere kjerner, generere flater med en kommersiell 3D mikroskop-bilde visualisering og analyseprogramvare.
  3. Mikroskopet 2, bruk 440 nm og 514 nm wavelength laser linjer å opphisse CFP og YFP, henholdsvis. Få to spor. For spor 1, angi detektorer (f.eks., ChS) å oppdage 464-500 nm for CFP (donor utslipp) og 526-562 nm for YFP (bånd utslipp) etter magnetisering av CFP. For spor 2, satt en detektor for å oppdage 526-562 nm YFP (YFP utslipp) etter magnetisering av YFP.
    Merk: Denne YFP fluorescens brukes som et uttrykk og segmentere kjerner, generere overflater i 3-D visualisering og analyse programvare.
  4. Hente bilder ved hjelp av 512 x 512 bildepunkter og en oppløsning på 12 biter.
  5. Gevinsten må justeres til en empirisk bestemt verdi som gir et godt signal mens ikke mette piksler. Gevinsten bør ikke endres mellom CFP og bånd utslipp over eksperimentet. Angi hullet 1 luftige enhet (AU). Plasser IBIDI klissete-lysbildet på scenen av AC confocal mikroskopet, og fortsette med bildebehandling som tidligere vist.
  6. I mikroskopet 1-programmet i en aktiv live skanning, benytte glød over/under øverst til venstre av skjermbildet bildet for å bestemme undereksponering og metning i regionen rundt. Bruke Område indikator på undersiden av skjermbildet bildet for å bestemme undereksponering og metning i regionen rundt i mikroskopet 2-programvaren. For alle kvantitativt bildeanalyser, bør det være ingen piksel metning.
  7. Angi z-stabler trinn størrelse på 1 μm. Trinn størrelsen kan reduseres for en økt z-oppløsning eller økt for en økt hastighet av oppkjøpet, eller for å øke antall stillinger/eksempler som kan avbildes. For automatisert time course, angi tiden sammen med z-stabler (xyzt modus fra kategorien oppkjøpet modus) til å utvikle bilder ved angitte tidsintervaller.

5. bildeanalyser med Fiji

Merk: Bruke ImageJ (Fiji) er det mulig å behandle bildebehandling data og produsere todimensjonal (2D) bilder av nlsGPS1 utslipp forholdet i Arabidopsis frøplanter. Eksempler på bilder, kan du se figur 2A, 2 C, 2E, 2 Gog 3A. I ImageJ er det mulig å finne hver kommando av denne protokollen ved hjelp av søkefunksjonen. Trykk på mellomromstasten og L på tastaturet. Et nytt vindu åpnes. Skriv inn kommandoen nødvendig i søkefeltet.

  1. Dra filen (enten .lif eller .lsm-filer) til Fiji (bilde J) og åpne som hyper-stack.
  2. Fra hovedmenyen, velg bilde > stabel > Z prosjektet og velge Sum skiver for å fange alle bildepunkter i stedet for bare de smarteste pikslene som Max projeksjon.
  3. Fra hovedmenyen, velg prosess > trekk fra bakgrunn og sett rullende ballen radius til 50 piksler. Uegennyttig andre alternativer og behandle alle tre bilder. Dette trinnet fjerner bakgrunnen ved hjelp av "rullende ball" algoritmen.
    Merk: 50 piksler identifiserte empirisk ta kjerner som forgrunnen.
  4. Fra hovedmenyen, velg bilde > farge > del opp kanaler. Tre nye vinduer åpnes: C1-SUM (CFP kanal); C2-SUM (Bånd kanal), og C3-SUM (YFP kanal).
  5. Velg vinduet C3-SUM , og fra hovedmenyen, velg prosessen > filtre > Gaussian Blur og bruke Gaussisk sløring 1 for å redusere bildestøy.
  6. Fra hovedmenyen, velg bilde > Juster > Lysstyrke/kontrast og velg automatisk.
  7. Fra hovedmenyen, velg prosess > Forbedre kontrastog angi mettet = 0,35.
  8. Fra hovedmenyen, velg bilde > Type > 8-biters og konvertere stabler i en 8-biters avbildning.
  9. Fra hovedmenyen, velg bilde > Juster > Auto-lokale terskel. Auto-lokale terskel, Velg følgende parametere: Phansalkar-metoden, radius = 15, parameter 1 = 0, parameter 2 = 0og hvite stack. I dette trinnet brukes YFP stabler til å lage en binær maske.
  10. Velg vinduet C2-SUM , og fra hovedmenyen, velg prosessen > filtre > Gaussian Blur og bruke Gaussisk sløring av 1.
  11. Velg vinduet C1-SUM , og fra hovedmenyen, velg prosessen > filtre > Gaussian Blur og bruke Gaussisk sløring av 1.
  12. For å opprette utslipp forholdet stakken fra de to kanalene, fra hovedmenyen, velg prosess > Image kalkulator. I det nye vinduet som vises, velg C2-SUM som bilde 1, velg dele som operatør, og velg C1 summen som bilde 2.
  13. Pass på å velge Opprett et nytt vindu og 32-biters format. Et nytt vindu vises navngitt Resultatet av C2-SUM.
  14. Fra hovedmenyen, velg bilde > oppslagstabellen > LUT 16_colors.
  15. Fra hovedmenyen, velg prosess > Image kalkulator. I det nye vinduet som vises, velg Resultatet av C2-SUM som bilde 1, velg multiplisere som operatør, og velg C3-SUM som bilde 2. I dette trinnet multipliseres YFP binære masken med YFP/CFP stack vise bare bildepunkter i YFP kontrollkanalen.
  16. Fra hovedmenyen, velg prosess > matematikk > dele og sett verdien til 255. I det nye vinduet som åpnes, velg Ja å analysere alle bilder i stakken. Et nytt bilde vises navngitt Resultatet av resultatet av C2-SUM.
  17. Fra hovedmenyen, velg bilde > Juster > Lysstyrke/kontrast og velg Auto.
  18. Fra hovedmenyen, velg prosess > Forbedre kontrasten, og velg Type mettet = 0,35.
  19. Fra hovedmenyen, velg bilde > Juster > Lysstyrke/kontrastog angi minimum og maksimum verdier å fange GA fordelingen. Valgfritt trinn: fra hovedmenyen velger du analysere > verktøy > Kalibreringslinjen og Vis LUT - kalibreringslinjen, og lagre Resultatet av resultatet av C2-SUM som en TIFF-fil.
  20. For å få verdier utslipp prosenter, fra hovedmenyen, velg analyser > sette mål og velg mener grå verdi og Standardavvik.
  21. Velg rektangel-figuren fra verktøylinjen og tegner et område av interesse (ROI). Fra hovedmenyen velger du analysere > mål. Et nytt vindu vil rapportere middelverdien fra valgte Avkastningen.
  22. Avskrift og pasta innhentet verdiene i regnearket programvare (f.eks Excel eller OriginPro) og gjøre et histogram for før og etter GA4 behandling eksperimentere eller et linjediagram for en tid kurs eksperimentere.

6. bildeanalyser med 3-D visualisering og analyseprogramvare

Merk: Fordelen med å bruke utvalgt programvare (se Tabell for materiale) er å segmentere objekter (f.eks kjerner) og opprette 3D-bilder fra en AC confocal z-stabel. Eksempler på bilder, kan du se figur 2B, 2D, 2F, 2tog 3B.

  1. Åpne programvaren og importere filen (enten .lif eller .lsm-filer).
  2. Segmentet kjerner basert på kontrollen YFP utslipp kanalen benytter overflater veiviseren. Segmentert objektene kalles "overflater". Dette segmentering trinnet tillater analyse av alle voxels i en kjerne som ett objekt mens de eliminerer bakgrunn fra voxels utenfor kjernen.
  3. I overflater veiviserenangi bakgrunn subtraksjon (lokale kontrast) 3 µm og terskelverdi til standard. Maske CFP utslipp (donor eksitasjon donor utslipp [DxDm]) og bånd utslipp (donor eksitasjon acceptor utslipp [DxAm]) kanaler basert på overflater laget med YFP utslipp (acceptor eksitasjon acceptor utslipp [AxAm]) kanalen.
  4. Filtypen XT mener intensitet forholdet til å beregne forholdet mellom donor eksitasjon acceptor utslipp delt donor eksitasjon donor utslipp (DxAm/DxDm) mellom mener intensitetsverdiene for individuelle overflater i to kanaler.
    Merk: Denne forlengelsen er tilgjengelig online for nedlasting.
  5. For å fargelegge individuelle overflater med nlsGPS1 utslipp forholdet, velg fargekoding med statistikk, som er representert som et ikon for farge-hjulet. Velg mener intensitet forholdet som statistikk.
  6. Eksportere prosenter av enkelte verdiene fra tabellen, som du finner under ikonet statistikk .
  7. Kopiere og lime inn verdiene i et regneark og gjør et histogram for før og etter GA4 behandling eksperimenter eller en lineær graf for tiden kurs eksperimenter.

7. statistisk analyse

Merk: Se finne 3D for en beeswarm og boksen plott av nlsGPS1 utslipp prosenter.

  1. Åpne programvaren og lim utslipp forholdet mellom kjerner overflater som Y kolonner.
  2. Velg kolonnene rundt og statistikk > Statistikk beskrivelse > normalitet teste vite om prøvene er normalt distribuert. Kjøre normalitet test og et nytt vindu åpnes og rapportere resultatene.
  3. Hvis utvalgene er normalt distribuert, bruke t-test som statistisk test. Velg statistikk > hypotesetesting > t-test med to utvalg på rader og kjøre t-test.
  4. Hvis eksemplene ikke er normalt distribuert, velg ut statistikk > statistikk hypotesetesting > to utvalg tester for varians vite om avviket mellom prøvene ikke er vesentlig annerledes.
  5. Hvis avviket ikke er vesentlig annerledes, kan du bruke Mann-Whitney U test som statistisk test. Velg statistikk > Parametriske tester > Mann-Whitney teste og kjøre testen.
  6. Hvis avviket er signifikant forskjellig, kan du bruke Kruskal Wallis ANOVA test som statistisk test. Velg statistikk > Parametriske tester > Kruskal Wallis ANOVA test og kjøre testen.

Representative Results

Bruker nlsGPS1, er det mulig å måle mobilnettet GA4 nivåer i vev mottakelig for fluorescens bildebehandling, inkludert roten tips og mørk dyrket hypocotyls (figur 2). I Arabidopsis rot er nlsGPS1 utslipp forholdet graderingen et tegn på lav GA nivåer i sonene meristematisk og divisjon og høy GA i slutten forlengelse sonen (figur 2A og 2B). Et utslipp forholdet forløpningen ble derimot ikke observert i nlsGPS1-NR røtter, antyder at endogene GA graderingen ikke er en gjenstand (figur 2C og 2D). NlsGPS1 utslipp forholdet gradering ble også dannet i mørket dyrket hypocotyls, med lave nivåer av cotyledons og apikale krok og høye nivåer i raskt elongating basale regionen hypocotyl (figur 2E og 2F). Et utslipp forholdet gradering ble derimot ikke observert i nlsGPS1-NR hypocotyls (figur 2 g og 2 H). I både Arabidopsis røtter og mørk dyrket hypocotyl celler, endogene GA akkumulering korrelert med cellular forlengelse rate.

Videre akkumuleres exogenously medfølgende GA4 fortrinnsvis i sonen forlengelse sammenlignet sonen divisjon av Arabidopsis rot (Figur 3), som angir at nlsGPS1 kan brukes til å studere endogene og eksogene GA mønstre.

Under tiden kurs eksperimenter, nlsGPS1 seedlings ble plassert i prioritert lysbilde kamre og parfyme med ¼ MS flytende, etterfulgt av en behandling med 0,1 µM GA4 for 30 min. Videoen viser en raskere akkumulering av eksogene GA4 i forlengelse rotsonen sammenlignet sonen divisjon (Video 1).

Figure 1
Figur 1: eksempel forberedelse til AC confocal bildebehandling. Disse skjermbildene viser en skjematisk fremstilling av prøven forberedelse for (A) en stabil eksperiment, (B) før og etter eksogene GA4 behandlinger, og (C) en behandling tid kurs eksperiment bruk av Sticky-lysbilder (C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: GA forløpningen i Arabidopsis røtter og mørk dyrket hypocotyls. Todimensjonale bilder av (A) nlsGPS1 og (C) nlsGPS1-NR røtter ble analysert ved hjelp av ImageJ programvare og tredimensjonale bilder (B) nlsGPS1 og (D) nlsGPS1-NR ble analysert ved hjelp av en kommersiell tredimensjonal analyseprogramvare. Begge analysene viste en endogen GA4 gradient i Arabidopsis røtter. Todimensjonale bilder (E) nlsGPS1 og (G) nlsGPS1-NR mørk dyrket hypocotyl ble analysert ved hjelp av ImageJ programvare og tredimensjonale bilder (F) nlsGPS1 og (H) nlsGPS1-NR ble analysert ved hjelp av kommersielle tredimensjonalt bilde analyseprogramvare. Begge analysene viste en endogen GA4 gradient i mørket dyrket hypocotyls. Baren LUT viser den falske fargen av nlsGPS1 utslipp prosenter. YFP bilder rapporteres som uttrykk kontroller. Hypocotyl bildene ble anskaffet bruker to scenen posisjoner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: eksogene GA forløpningen i røtter. De første to paneler show (A) todimensjonal og (B) tredimensjonale bilder av en nlsGPS1 rot før og 20 min etter behandling av eksogene GA4 (1 µM). YFP bilder rapporteres som uttrykk kontroller. De to siste paneler Vis (C) gjennomsnittet og standardavviket og (D) beeswarm og boksen plott av nlsGPS1 utslipp forholdstall for kjerner i sonen forlengelse (området som er definert med en hvit ramme). I sonen elongation, nlsGPS1 utslipp forholdet var betydelig høyere etter GA4 behandling (Mann-Whitney U test, *** P-verdien < 0,0001). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Video 1
Video 1: perfusjon eksperimentet nlsGPS1 rot med klebrig lysbilde. Denne videoen viser tredimensjonale bilder av nlsGPS1 parfyme med ¼ MS væske og behandlet med 0,1 µM GA4 i 30 min. I time course, bildebehandling overtatt hvert 10 min 3 h med følgende intervaller: 30 min narr løsning (ramme t = 1, t = 2, t = 3), 30 min GA4 behandling (ramme t = 4, t = 5, t = 6), 2 h av uekte slik lution (ramme t = 7 t = 18) løsning. Før oppkjøpet, var prøven parfyme med uekte løsning for 2 h. Klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Discussion

BÅND-baserte GA biosensor nlsGPS1 inneholder en kvantitativ metode for å rapportere og måle GA hormon graderinger i flercellet planter. BÅND-basert biosensors kan kvantifisere dynamics med en forbedret spatiotemporal oppløsning over direkte deteksjon av massespektrometri og indirekte måling av transcriptional journalister eller signalering-protein-degradering-baserte metoder12, 13. Høyoppløselig mobil bildebehandling i ulike vev-typer kan gi meningsfull innblikk inn i GA biologi og gnisten nye hypoteser om regulering og funksjon av GA accumulations i en flercellet kontekst. For eksempel kan overvåke endringer i nlsGPS1 biosensor i bestemte GA biosyntetiske, katabolske og transport mutanter og spatiotemporally indusert forstyrrelser, være veldig informativ teste spesielt hvordan GA forløpninger opprettes i roten og adresse rot celle svar GA gradienter. Sensoren kan brukes i andre modellen og beskjære arter for å teste bevaring av mekanismer som styrer GA-mediert kontroll av frø spiring, mobil forlengelse og blomstrende.

Kritisk trinnene i bånd-baserte avbilding av nlsGPS1 biosensor er at 1) bildepunktene ikke bør være mettet under kvantitative bånd analysen, 2) tenkelig parametere som "detektor gevinst" bør holdes konstant donor utslipp (DxDm) og Acceptor utslipp (DxAm) oppkjøp, 3) kontroll nlsGPS1-NR linjer skal brukes til å utelukke gjenstander og 4) prøver bør være forberedt på å minimere drift og fokus-endring problemer. I tillegg er miljøforholdene der prøver er vokst viktig å kontrollere siden GA er følsomme for miljøforhold som lys varighet og lysintensiteten14,15,16 ,17. En nøkkel begrensning av denne typen analyse er at en høy signal-til-støy-forhold er nødvendig for bildebehandling på grunn av økningen i støy i ratiometric bildebehandling. Dermed nlsGPS1 imaging vil ikke være nyttig for vev og organer som ikke er mottakelig for ratiometric fluorescens mikroskopi bruke cyan og gule fluorescerende proteiner-for eksempel dypere vev hvor fluorescerende proteiner er dårlig oppdaget. På den annen side, er ratiometric readouts foretrukket over intensiometric readouts, fordi en intern kontroll er nyttig å utelukke gjenstander stammer fra endringer i biosensor uttrykk, stabilitet, lysstyrke eller detectability i en gitt celle, vev , eller tilstand. For eksempel bånd biosensor imaging og bilde analyser har også blitt brukt til å studere en rekke ligander i ulike vev5,6,18,19,20,. Tenkelig eksperimenter og bilde analyser rapporterte her kan endres etter nye tenkelig metoder, for eksempel lys ark mikroskopi, som kan gi ny innsikt i, for eksempel dypere rot vev-typer.

Første generasjon nlsGPS1 biosensor er en høy affinitet sensor som gir et høyoppløselig kart over GA forløpninger som kan også rapportere på intracellulær øker i GA følgende eksogene GA behandlinger. En av de nåværende begrensningene av nlsGPS1 er at sensoren er ikke raskt reversibel og dermed rapporterer ikke på stabil GA nivåer, men trolig på maksimal nylig GA konsentrasjon i løsningen av interesse. Den presise omløpshastighet for sensoren er også ikke kjent, og dette, kombinert med lav Reversibilitet, utelukker påvisning av endogene GA depletions som kan skje innen en minutter til noen timer i noen vev-typer. Det er også viktig å merke seg at nlsGPS1 har høy affinitet for GA4 (Kd = 24 nM) sammenlignet med andre GA former (GA3 Kd= 240 nM, GA1Kd = 110 nM) når imaging annen bioactive gass 7. fremtidige generasjoner av GA biosensors kan bli konstruert å øke Reversibilitet samtidig opprettholde høy affinitet eller vise ulike særegenheter for ulike forløper, bioaktive, eller catabolite gass. 

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet har mottatt finansiering fra europeiske Research Council (ERC) under EUs horisonten 2020 forskning og innovasjon programmet (grant avtalen n ° 759282).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
nlsGPS1 Col0 Arabidopsis seeds NASC N2107734
nlsGPS-NR Col0 Arabidopsis seeds NASC N2107735
Gibberellin A4 (GA4) Sigma G7276 dissolve in EtH 70% , and keep at -20 °C
sodium hypochlorite solution (Bleach) Fisher S/5040 HSRA 064
Hydrogen cloride HCl Sigma 31434
Micropore tape 3M 1530-1
ibidi sticky-slide Ibidi 81128 Luer 0.1 for root imaging
ibidi sticky-slide Ibidi 80168 Luer 0.2 for hypocotyl imaging
glass coverslip for sticky slides Ibidi 10812
Elbow Luer Connectors Ibidi 10802
silicone tubing Ibidi 108401
Luer Lock Connector Ibidi 10826
programmable syringe pump World Precision Instruments AL-1000
Vacuum grease Sigma 18405
Murashige and Skoog Basal Salts Duchefa M0221
Agar plant, 1 kg Melford P1001
Microscope slide ground edges, 76 mm x 26 mm, 1.0 mm to 1.2 mm thick Fisher Scientific 12383118
Cover slip No.1 1/2 glass 22 mm x 22 mm Fisher Scientific 12363138
Luer-slip Syringe 20 mL Fisher Scientific 10785126
3M Micropor Surgical Paper Tape Fisher Scientific 12787597
Potassium Hydroxide, 500 g Sigma Aldrich 221473-500G-D
Absolute Ethanol Fisher Scientific 10428671
Forceps Watchmaker 5 StSteel Scientific Laboratory Supplies INS4340
Scissors, 125 mm, stainless steel Fisher Scientific 12338099
Fitting reducer 0.5 to 1.6 Ibidi 10829
Leica SP8 Confocal laser microscope 1
Zeiss LSM 780 Confocal laser microscope 2
Imaris Bitplane 3D visualization and Analysis software
Fiji image analysis software
OriginPro Origin Lab Statistical Analysis Software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Binenbaum, J., Weinstain, R., Shani, E. Gibberellin Localization and Transport in Plants. Trends in Plant Science. 23 (5), 410-421 (2018).
  2. Sun, T. Gibberellin Metabolism, Perception and Signaling Pathways in Arabidopsis. The Arabidopsis Book. 6, 0103 (2008).
  3. Rieu, I., et al. Genetic Analysis Reveals That C19-GA 2-Oxidation Is a Major Gibberellin Inactivation Pathway in Arabidopsis. The Plant Cell Online. 20 (9), 2420-2436 (2008).
  4. Regnault, T., et al. The gibberellin precursor GA12 acts as a long-distance growth signal in Arabidopsis. Nature Plants. 1, 15073 (2015).
  5. Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. Quantitative Imaging with Fluorescent Biosensors. Annual Review of Plant Biology. 63 (1), 663-706 (2012).
  6. Walia, A., Waadt, R., Jones, A. M. Genetically Encoded Biosensors in Plants: Pathways to Discovery. Annual Review of Plant Biology. 69 (1), 497-524 (2018).
  7. Rizza, A., Walia, A., Lanquar, V., Frommer, W. B., Jones, A. M. In vivo gibberellin gradients visualized in rapidly elongating tissues. Nature Plants. 3 (10), 803-813 (2017).
  8. Rizzo, M. A., Springer, G., Segawa, K., Zipfel, W. R., Piston, D. W. Optimization of pairings and detection conditions for measurement of FRET between cyan and yellow fluorescent proteins. Microscopy and Microanalysis. 12 (3), 238-254 (2006).
  9. Ueguchi-Tanaka, M., et al. GIBBERELLIN INSENSITIVE DWARF1 encodes a soluble receptor for gibberellin. Nature. 437, 693-698 (2005).
  10. Grossmann, G., et al. Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip. Journal of Visualized Experiments. (65), 34290 (2012).
  11. Grossmann, G., et al. The RootChip: an integrated microfluidic chip for plant science. Plant Cell. 23 (12), 4234-4240 (2011).
  12. Brunoud, G., et al. A novel sensor to map auxin response and distribution at high spatio-temporal resolution. Nature. 482, 103-106 (2012).
  13. Wang, N. N., Shin, M. C., Li, N. The GUS reporter-aided analysis of the promoter activities of Arabidopsis ACC synthase genes AtACS4, AtACS5, and AtACS7 induced by hormones and stresses. Journal of Experimental Botany. 56 (413), 909-920 (2005).
  14. Alabadi, D. Gibberellins Repress Photomorphogenesis in Darkness. Plant Physiology. 134 (3), 1050-1057 (2004).
  15. De Lucas, M., et al. A molecular framework for light and gibberellin control of cell elongation. Nature. 451 (7177), 480-484 (2008).
  16. Strasser, B., Sanchez-Lamas, M., Yanovsky, M. J., Casal, J. J., Cerdan, P. D. Arabidopsis thaliana life without phytochromes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (10), 4776-4781 (2010).
  17. Feng, S., et al. Coordinated regulation of Arabidopsis thaliana development by light and gibberellins. Nature. 451, 475-479 (2008).
  18. Choi, W. G., Swanson, S. J., Gilroy, S. High-resolution imaging of Ca2+, redox status, ROS and pH using GFP biosensors. Plant Journal. 70 (1), 118-128 (2012).
  19. Lanquar, V., et al. Dynamic imaging of cytosolic zinc in Arabidopsis roots combining FRET sensors and RootChip technology. New Phytologist. 202 (1), 198-208 (2014).
  20. Krebs, M., Schumacher, K. Live cell imaging of cytoplasmic and nuclear Ca2+ dynamics in Arabidopsis roots. Cold Spring Harbor. 2013 (8), 776-780 (2013).

Tags

Utviklingspsykologi biologi problemet 143 planter biokjemi biovitenskap biovitenskap (generelt) gibberellin Phytohormone Spatiotemporal plante utvikling celle vekst Biosensor bånd
Visualisere mobilnettet Gibberellin nivåer ved hjelp av NlsGPS1 han selvmord resonans energi overføring (bånd) Biosensor
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rizza, A., Walia, A., Tang, B.,… More

Rizza, A., Walia, A., Tang, B., Jones, A. M. Visualizing Cellular Gibberellin Levels Using the nlsGPS1 Förster Resonance Energy Transfer (FRET) Biosensor. J. Vis. Exp. (143), e58739, doi:10.3791/58739 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter