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Bioengineering

고분자 나노 입자에 소수 성 및 친수성 화합물의 캡슐화에 대 한 NanoPrecipitation 플래시

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58757
Automatic Translation
, , , ,
1Department of Chemical and Biological Engineering, Princeton University

Summary

플래시 NanoPrecipitation (FNP) 고분자 코어-쉘 나노 입자를 생산 하는 확장 가능한 접근 이다. 소수 성 또는 친수성 치료제의 캡슐화에 대 한 실험실 규모 공식 설명 되어 있습니다.

Abstract

나노 (NPs)로 치료 화합물의 배합 수 고유한 속성을가 르 친다. 저조한 수용 성 약물에 대 한 NP 공식 생체 이용률을 개선 하 고 신체 내에서 마약 유통 수정 수 있습니다. 펩 티 드 또는 단백질 같은 친수성 약물에 대 한 NPs에서 캡슐화는 자연 정리 메커니즘에서 보호를 제공할 수도 있습니다. 확장 가능한 고분자 NPs의 생산에 대 한 몇 가지 기술이 있다. 플래시 NanoPrecipitation (FNP)는 사용 하는 프로세스는 30와 400 nm 사이의 가변 크기와 좁은 크기 분포 NPs를 생산 혼합 형상 설계 된다. 이 프로토콜은 코어-쉘 FNP를 사용 하 여 대상 크기의 고분자 나노 입자의 실험실 규모 생산에 설명 합니다. 단지 약간의 수정으로 친수성 또는 소수 성 화합물을 캡슐화 하는 프로토콜을 구현할 수 있습니다. 기술은 화면 정립에 밀리 그램 규모 실험실에서 쉽게 사용할 수 있습니다. 리드 안타 직접 확장할 수 있습니다 그램 및 킬로그램-스케일. 연속 과정으로 서 확장 새로운 프로세스 선박 번역 보다는 오히려 더 이상 혼합 프로세스 실행 시간을 포함 한다. NPs FNP 제작한 높은 치료와 함께 로드 됩니다, 그리고 조밀한 안정화 폴리머 브러시 있으며 크기 재현성 ± 6%의.

Introduction

1990 년대 후반 이후 나노1,2를 고용 하는 임상 시험의 수에 있는 꾸준한 증가 되었습니다. 상승 관심 소수 성 약물의 생체 이용률을 개선 하 고 몸3내에서 우선 대상으로 사용할 수 있도록 nanomaterials의 약속을 반영 합니다. 고분자 나노 입자 (nanoparticles 또는 라고도 NPs 여기) 재료2의이 클래스의 성장 비율을 나타냅니다. NPs는 크기, 구성, 및 표면 기능화4등 높은 가변 속성을가지고 있기 때문에 관심을 얻고 있다. 가난 하 게 녹는 약물의 관리에 적용 하는 경우 NPs는 자주 코어-쉘 구조 치료 소수 성 중 핵에서 캡슐화와 친수성 폴리머 브러시 쉘에 의하여 이루어져 있다. 이 구조를 생성 하는 간단한 방법을 사용 하 여 입자 코어의 일부를 형성, 분해성 소수 성 블록의 구성 된는 amphiphilic diblock 공중 합체 (BCP)와 친수성 poly(ethylene glycol) (PEG) 차단, 폴리머 브러시를 형성 하 고 입체 안정화4,5부여.

Nanoprecipitation은 간단 하 고 하지 에너지 집중6이기 때문에 고분자 나노 입자에 대 한 일반적인 제조 기술입니다. 그것의 간단한 형식에서는, nanoprecipitation는 촉발 물 초과 볼륨에 아세톤 같은 유기 용 매 구성 요소 NP의 피 펫으로 추가 포함 한다. 희석 용액을 용 매에 불용 성 핵심 구성의 강 수 발생합니다. 이 성장 입자 표면에는 안정제 조립 축소 된 소수 성 블록7,8,,910의 흡착에 의해 감독. 균일 한 크기 분포는 균질 솔루션 빠르게 혼합 용 매와 물 때 얻어진 다. 혼합 하는 nucleation 및 어셈블리의 구성 요소는 더 큰, 더 많은 polydisperse 입자 인구 보다 느립니다. 비록 간단한 테스트를 위한 쉽게 접근할 수, 냈다 일괄 처리 방법은 넓은 가변성 혼합 불일치 때문에 결과 하 고 확장6,11의무가 아니다. 마이크로 NP 생산 지속적으로 실행 될 수 있는 또 다른 애비뉴로 떠오르고 있다. 생산의이 의미는 최근 검토 딩 외. 11 . 일반적인 방법은 서브 미크론 값을 용 길이 규모를 줄이기 위해 집중 하는 층 류를 사용 합니다. antisolvent의 혼합 그래서 작은 흐름 차원은 균일 한 입자11,12를 위해 중요 한 확산에 의해 발생 합니다. 스케일 업에 대 한 여러 미세 챔버의 병렬화는 큰 생산 볼륨에 대 한 문제가 있다.

마이크로에 균일 한 nanoprecipitation 호의 빠른 혼합 조건 또는 한정 된, 난 류 흐름에 생산 수 있습니다. 플래시 NanoPrecipitation (FNP) 이러한 조건 가능한 마이크로 보다 더 높은 체적 flowrates 달성 하기 위해 특별 한 혼합 형상 사용 합니다. 용 매/안티 solvent lamellae 확산11,13의 길이 규모 형성 있도록 입구 스트림 vortices의 생성으로 이어질 난 류 조건 하에서 혼합 챔버를 입력 합니다. 따라서, nucleation 및 치료의 성장 보다 더 짧은 시간 규모에 균일 한 혼합 이루어집니다. 믹서의 밀폐 형상 난 류 에너지 소산 발생 전체 시스템 경험 같은 프로세스 역사13지역의 무시 스트림을 허용 하지 않습니다. Nucleation 혼합 챔버에 균일 하 게 발생 및 입자 성장까지 표면9,14에 BCP의 어셈블리 중지. 안정 된 입자를 포함 하는 혼합된 스트림에 추가 antisolvent 오 스 트 발트를 표시 하지 않으려면 다음 희석 수 있습니다 입자15,,1617의 숙성.

한정 된 제위치 제트 (CIJ) 믹서 FNP에 대 한 간단한 믹서 디자인 이며 확장 가능 하 고 지속적인 패션, 그림 1A13에서 같이 두 개의 스트림을의 혼합을 허용. 멀티 입구와 동 믹서 (MIVM) 아직도18 그림 1B같이 균일 한 입자 형성에 필요한 빠른 micromixing를 달성 하는 동안 최대 4 개의 다른 스트림 입력 수 있도록 개발 되었다. FNP 간단한 공식 심사를 상업 규모 생산 쉽게 변환할 수 있습니다. 과정의 연속 특성상 큰 일괄 처리 크기는 오히려 더 이상 실행된 시간, 동일한 장비 기차에 킬로그램-규모 생산을 사용 하면 간단한 번역 하지만 새로운 혈관을 필요 하지 않습니다.

펩 티 드 및 단백질 ('생물 의약품')와 같은 친수성 화합물 또한 프로세스 불리 역 플래시 NanoPrecipitation (iFNP)에 캡슐화 될 수 있습니다. 기술은 amphiphilic를 BCP 어디 한 블록은 소수 이며 다른 polyacid19필요 합니다. 초기 단계는 디 메 틸 sulfoxide (DMSO) 스트림을 포함 하는 생물 학적 및 dichloromethane 또는 클로 프롬 등 질 성 용 매에 대 한 BCP의 빠른 혼합을 포함 한다. 소수 성 블록 브러시로 안정 입자의 형성 결과. 여기, '거꾸로' NP 사용 하는 이러한 아키텍처 불리 수 것입니다. 핵심은 다음 상태의 polyacid 포함 multivalent 양이온을 사용 하 여 가교 된. 이 기술로 문학19,,2021에 보고 된 미 또는 나무 못 코팅 된 나노 입자의 형태로 수성 환경으로 처리를 위해 입자를 안정화.

이 프로토콜은 소수 성 또는 친수성 화합물을 캡슐화 하는 고분자 코어-쉘 나노 입자의 실험실 규모의 생산에 대 한 사용할 수 있습니다. 프로토콜의 하위 두 믹서 클래스-는 CIJ는 MIVM의 사용에 지침을 제공합니다. 독자는 소설 핵심 구성 요소에 대 한 프로토콜을 reproducibly 스트림 입력에 대 한 적절 한 믹서를 사용 하 여 원하는 크기의 나노 입자를 생성할 수 있어야 합니다. 3 예제 공식 FNP 및 iFNP를 사용 하 여 아래 표시 됩니다. 2 CIJ 믹서를 사용 하며 하나 MIVM15,22. 첫 번째 공식 모델의 캡슐화를 보여줍니다 소수 FNP에 의해 화합물. 두 번째 공식 모델의 캡슐화를 보여줍니다 친수성 CIJ 믹서에 iFNP에 의해 화합물. 최종 배합 iFNP는 MIVM를 사용 하 여 단백질 캡슐화의 예를 제공 합니다. 이 세 번째 공식에 대 한 프로토콜 소규모, 휴대용 MIVM 불리는 'μMIVM'의 사용을 설명 합니다. 믹서 디자인은 단순화 된 공식 심사, 수 있도록 더 작은 하지만 크기 조정 동작을 잘 이해 하 고 믹서 미세 장치22아니다. 프로토콜의 마지막 섹션 리드 공식 심사에서 확인 된의 스케일 업에 몇 가지 메모를 포함 합니다. 이러한 공식 과정 학습에 대 한 액세스 포인트를 제공 하 고 따라서 비 분해성 폴 리 (스 티 렌)를 사용 하기 위한 것입니다-고분자를 기반으로. 대체 안정제 생체 상업 옵션 사용할 수 있는14,,2324의 번호와 문학에서 설명 했습니다.

Protocol

1. 고분자 NPs CIJ 믹서를 사용 하 여 소수 성 화합물의 캡슐화

  1. 준비 하 고 장비를 청소.
    1. 조달 하 고 CIJ 믹서의 유효성을 검사 합니다.
      참고: 추가 정보 섹션 1 건설 지도 보기 CAD 파일 추가 정보 로 사용할 수 있습니다.
    2. 각 사용 하기 전에 확인 CIJ 믹서에 모든 부속품은 아늑한 콘센트 배관 구부러졌거나 슬쩍입니다.
    3. 증기 두건에서 각 입구 어댑터 용 매 2-3 mL를 포함 하는 5 mL luer 잠금 주사기를 연결 합니다. 용 매 (예를 들어, 아세톤) 어떤 화합물 믹서에서 최근에 사용한 청소를 선택 합니다.
      참고: 일반적인 선택은 아세톤 또는 tetrahydrofuran (THF). 만 사용 폴 리 프로필 렌 주사기 침 같은 용 매 호환성 문제를 방지 하려면. 고무 O-ring 물개 plungers를 주사기를 사용 하지 마십시오.
    4. 폐기물 콘테이너에 CIJ 어셈블리를 설정 합니다.
      참고: CIJ 몸 보다 작은 오프닝 가진 플라스 크 작동 잘이 믹서를 지원 하 고 주사기의 쉬운 가동을 허용 합니다.
    5. 꾸준히 몇 초 동안 혼합 챔버를 통해 콘텐츠를 주사기 plungers 우울. 주사기를 제거 합니다.
      참고: 주사기 유지 고 FNP 실행 사이의 청소의 여러 라운드를 위해 다시 사용 될 수 있습니다.
    6. CIJ 믹서 내부 N2 스트림을 사용 하 여 건조. N2 줄의 끝에 남성 luer 어댑터 효과적입니다.
      참고: 청소 용 매 없는 경우 (예를 들어, DMSO), 휘발성 1.1.6 단계로 진행 하기 전에 아세톤 또는 THF 단계 1.1.3-1.1.5 반복. 그것은 실행 실행 가능한 일관성에 대 한 잔여 용 매를 제거 중요 합니다.
  2. 용 매 및 antisolvent 스트림을 대상 작곡에서 준비 합니다.
    1. FNP 실행의 원하는 번호를 완료 하는 데 충분 한 금액에 10 mg/mL에서 unstabilized THF에 소수 성 화합물 (즉, 비타민 E)을 분해. 준비 보다 약간 더 실행 당 필요.
      참고: 다른 용 매는 토론 섹션에서 제약 조건에 따라 다음이 단계에서 사용할 수 있습니다. THF를 고용, 안정제-무료 용 매 자로 낮은 수성 가용성 때문에 권장 합니다. 주의 사용 하 여 (포함 과산화 수소 테스트) 과산화 수소 형성을 방지 하 고 과산화물의 낮은 수준의 특정 NP 응용 프로그램 (예를 들어, 염료의 표백) 방해할 수 있다는 점에 유의.
    2. 해산 때까지 소용돌이 믹서에 비타민 E 솔루션을 믹스.
      참고: 일부 화합물에 대 한 1-2 분 동안 목욕 쥡니다 녹아 솔루션 생성에 도움이 수 있습니다. 모든 NP 구성 요소 분자로 해체는 중요 하다.입니다.
    3. 블록 공중 합체 안정제를 분해 (즉, poly(styrene)-b-poly(ethylene glycol), PS1.6 k-b-말뚝5 k) 폴리머 솔루션 단계 1.2.1에서 대략 동일한 볼륨에 10 mg/mL에서 THF에.
      참고: 다른 용 매 사용할 수 있습니다, 토론 섹션에 자세히 설명 하는 제약 조건에 따라.
    4. 해산 때까지 소용돌이 믹서 혼합 폴리머 솔루션. 필요한 경우, 고체 해산에 도움을 1-2 분 쥡니다 목욕에 솔루션을 배치 합니다.
      참고: 폴리머 micellar 형태로 수 없습니다. 동적 산란 (DL) 새로운 스트림 구성이이 조건을 충족 하는지 여부를 확인 하는 유용한 도구 수 있습니다.
    5. 1.5 mL 원심 분리기 관으로 5 mg/mL 비타민 E와 안정제 (50% 비타민 E 로드)의 비타민 E 솔루션의 첫 번째 pipetting 0.25 mL에 의해 포함 된 용 매 입력된 스트림을 만듭니다. 그런 다음 동일한 관으로 폴리머 솔루션의 0.25 mL를 플라스틱.
      참고: 실행 당 0.5 mL 보다 큰 볼륨은 다른 주사기 크기 가능. 10 mL 입력된 볼륨 위에 주사기 펌프를 사용 하 여 실용적입니다.
    6. 필요에 따라 5-10 미에 대 한와 동 믹서에 잘 혼합, 원심 CIJ 실행 사이의 재현성 향상 모자에 붙어 어떤 액체를 복구 하려면 5-10 s 1000 x g에 튜브.
    7. Antisolvent 스트림으로 두 번째 1.5 mL 원심 분리기 관으로 이온된 수의 0.525 mL를 플라스틱.
      참고: 그것은 용 매 스트림 결코 antisolvent 존재 하지 않고 혼합 챔버를 입력 하면 초과 antisolvent을 좋습니다. 경우에 따라 용 매/antisolvent 혼합물에 있는 소금 가용성 제한 하지 버퍼링 된 수성 시스템을 사용할 수 있습니다.
    8. 냉각 목욕으로 20 mL 섬광 유리병 또는 다른 적합 한 컨테이너에 이온된 수의 4 mL를 플라스틱. 장소는 유리병에 작은 자석 저 어 바.
      참고: 냉각 목욕 볼륨15,17에 의해 최종 용 콘텐츠 10%를 낮추어 숙성 하는 오 스 트 발트를 줄일 수 있습니다. 이 주소 프로세스 제약 조건에 조정 될 수 있고 직접 입력된 스트림 볼륨 조정 될 수 있습니다.
  3. FNP CIJ 믹서를 사용 하 여 NPs를 생성 합니다.
    1. 위치 열기는 증기 두건에서 저 어 접시에 청소 CIJ 믹서 아래 목욕 유리병을 끄다. 실용적인 구성 아래 유리병 CIJ 믹서와 유리병에 감독 콘센트 튜브를 지원 하기 위해 50 mL 테스트 튜브 랙 블록을 사용 합니다. 방향을 그림 1A 를 참조 하십시오.
    2. 시작은 냉각 목욕을 통해 감동 자석 볶음 바 약 75%에서 최대 속도.
    3. 블런트 팁 바늘으로 장착 되어 폴 리 프로필 렌 1 mL 주사기를 사용 하 여, antisolvent 튜브에서 전체 볼륨을 그립니다.
      참고: 호환성 문제를 피하기 위해 고무 O-ring 물개를 포함 하는 주사기를 사용 하지 마십시오. 더 큰 입구 볼륨에 대 한 적절 한 크기의 luer 잠금 주사기를 사용 합니다. 주사기 콘센트 주사기 축에 중심으로 해야 한다 또는 그것은 안정 될 것입니다 하지 우울증 동안.
    4. 조심 스럽게 주사기에서 모든 기포를 제거 하 고 무딘 팁 바늘, sharps 용기에 폐기를 제거 합니다.
    5. 스트림 그냥 주사기 오프닝에 온다 그래야 플런저를 프라임. CIJ 입구 피팅 중 하나에 주사기를 연결 합니다.
    6. 솔벤트 솔루션에 대 한 1.3.3-1.3.5 단계를 반복 합니다.
    7. 급속 하 게, 매끄럽고 균일 하 게 개인 취향에 따라 plungers의 꼭대기에는 손, 손, 또는 하나의 엄지손가락의 공을 배치 하 여 동시에 주사기를 누릅니다. 냉각 목욕 유리병에 폐수를 수집 합니다.
      참고: 0.5 mL 미만 0.5 우울 해야 입력 s.
    8. CIJ 믹서와 여전히 첨부 된 주사기와따로 설정 합니다. 저 어 바 제거 하 고 지금 포함 된 코어-쉘 입자 구조 (그림 1C) NP 분산 유리병 뚜껑.
    9. 폐기물 솔루션 컨테이너에는 믹서를 누른 주사기를 제거 합니다. 막히는 볼륨 (약 0.25 mL) 다음 밖으로 빠져나갈 것 이다. 사용 된 주사기 폐기 하십시오 고 FNP 재판 전에 청소 단계 1.1을 반복 합니다.
      참고:이 샘플 균일성 저하 됩니다 NPs 들어 있는 유리병에 빈을 잡고 최대 볼륨을 허용 하지 않습니다.
  4. 분석 및 NP 분산의 사후 처리를 수행 합니다.
    1. DL을 사용 하 여 NP 크기 특성, 플라스틱 플라스틱 베트로 NP 분산의 100 μ를 900 μ 냉각 목욕 용 매 (예를들면, 물)를 추가 합니다.
      참고: 작은 볼륨 낮은 볼륨 큐 벳을 위해 사용할 수 있습니다. 10 희석은 일반적으로 충분 합니다.
    2. 아래로 pipetting 또는 가벼운 흔들어 잘 혼합. 샘플 분석 악기 관련 지침을 따릅니다.
      참고: 대체 특성화 기법 같은 제타 잠재력 분석 또는 전자 현미경으로 밖으로 운반할 수 있습니다 필요 합니다. NP 분산 데이터를 처리할 응용 프로그램에 의해 규정 고 토론 섹션에서 검토 될 수 있습니다.

2. 캡슐화 CIJ 믹서를 사용 하 여 거꾸로 NPs에 친수성 화합물의

  1. 용 매, antisolvent, 준비 하 고 증기 두건에서 솔루션을 끄다.
    1. 단계 1.1, THF와 두 번째 린스 완료 용 매를 청소 및 단계 1.1.6에서에서 메모에 준수 DMSO를 사용 하 여에서 설명 하는 청소 및 준비 절차를 완료 합니다.
    2. 친수성 화합물을 분해 (즉, 포도 당 동등한 (DE) 4-7, 평균 분자량의와 maltodextrin (MD) = 3,275 g/mol, "3 k MD") FNP 원하는 수를 완료 하는 데 충분 한 볼륨에 10 mg/mL에서 DMSO에서 실행 됩니다.
      참고: 다른 용 매 사용할 수 있습니다, 토론 섹션에 설명 된 제약 조건을 따릅니다.
    3. Maltodextrin 솔루션 해산 때까지 소용돌이 믹서 믹스. 필요한 경우, 고체 해산에 도움을 1-2 분 쥡니다 목욕에 솔루션을 배치 합니다.
    4. 블록 공중 합체 안정제를 만듭니다 (즉, poly(styrene)-b-폴 리 (아크릴 산), PS5 k-b-PAA4.8 k) 재고 단계 2.1.2 폴리머 솔루션에서 대략 동일한 볼륨에서 11.1 mg/mL에서 THF에 솔루션 .
      참고: 다른 용 제, 안정제 농도, 사용할 수 있습니다. DMSO는 대신 THF 용 매로 쉽게 사용할 수 있습니다.
    5. 해산 때까지 소용돌이 믹서 혼합 폴리머 솔루션. 필요한 경우, 고체 해산에 도움을 1-2 분 쥡니다 목욕에 솔루션을 배치 합니다.
      참고: 폴리머 입력 micellar 형태로 수 없습니다. DL는 새로운 스트림 구성이이 조건을 충족 하는지 여부를 확인 하기 위해 사용할 수 있습니다.
    6. 다음 순서로 1.5 mL 원심 분리기 튜브에서를 결합 하 여 용 매 스트림 입력 (0.5 mL) 준비: 3 k MD 솔루션, 폴리머 솔루션, 및 0.025 이온된 물 0.225 mL의 0.250 mL.
      참고:이 스트림의 함량 NP 크기와 증가할수록에 강한 충격이 있다. 일반적으로 2.5-10 vol % 범위20에서 작동 하는 좋습니다. 범위의 높은 끝에 더 큰 분자량 화합물의 캡슐화를 도울 수 있다.
    7. 5-10에 대 한와 동 믹서에 잘 섞는다.
    8. 필요에 따라 원심 CIJ 실행 사이의 재현성 향상 모자에 붙어 어떤 액체를 복구 하려면 5-10 s 1000 x g에 관.
    9. (CaCl2) 염화 칼슘이 수화물 25.0 mg/mL에서 메탄올에의 crosslinker 솔루션을 준비 합니다.
      참고:는 crosslinker 추가 됩니다 1:1 전 비에 PAA 블록에서 산 성 그룹. 다른 crosslinker를 사용 하는 경우 또는 다른 PAA 블록 크기 또는 폴리머 농도 사용된20,21일 경우는 농도 적절히 조정.
    10. Microcentrifuge 튜브에 antisolvent 스트림 pipetting 0.5 mL의 클로 프롬 및 crosslinker 솔루션 (총 0.55 mL)의 0.05 mL에 의해 준비.
      참고: 다른 허용 antisolvents 블록 공중 합체의 선택에 의해 결정 됩니다 및 일반적으로 dichloromethane 또는 아세톤을 포함. crosslinker 대신 crosslink 형성20있도록 NP 분산의 추가 노화와 냉각 목욕에 추가할 수 있습니다.
    11. 5-10에 대 한와 동 믹서에 잘 섞는다.
    12. 필요에 따라 원심 CIJ 실행 사이의 재현성 향상 모자에 붙어 어떤 액체를 복구 하려면 5-10 s 1000 x g에 관.
    13. 냉각 목욕을 형성 하기 위하여 20 mL 섬광 유리병에 (즉, 클로 프롬) antisolvent의 4 mL를 추가 합니다. 장소는 유리병에 작은 자석 저 어 바.
      참고: 주소 프로세스 제약 조건에는이 볼륨을 조정할 수 있다.
  2. 1.3 단계에서 설명한 대로 NP 형성에 대 한 프로토콜을 완료 합니다.
  3. 분석 및 NP 분산의 사후 처리를 수행 합니다.
    1. DL을 사용 하 여 NP 크기 특성, 플라스틱 유리 베트로 NP 분산의 100 μ를 900 μ 냉각 목욕에 사용 되는 용 매를 추가 합니다.
    2. 믹스 잘 아래로 pipetting 또는 베트의 빛 교. 샘플 분석 소프트웨어 지침을 따릅니다.
      참고: NPs의 가교 수 질적 부과 DL DL 희석제20DMSO 또는 dimethylformamide (DMF) 같은 좋은 용 매를 사용 하 여. 안정적으로 가교 된 입자는 입자 크기에 최소한의 변경으로 용 매에는 자기 상관 함수를 전시할 것 이다. 저조한 가교 된 입자는 팽창 하 고 약한 자기 상관 함수 및 산란 강도21.
    3. 필요에 따라 암모니아 이온 complexation 고 가교 입자 코어에서 강화 등 자료를 추가 합니다.
      1. Gravimetrically 수산화 암모늄 솔루션 (일반적으로, 30 wt % 암모니아)를 사용 하 여 메탄올에 암모니아의 3.48 mg/mL 해결책을 준비. 감동과 dropwise 50 μ (즉, 산 성 그룹 중합체에 관하여 0.6 등가물)를 추가 합니다.
        참고: 어느 농도 변화 하 여 원하는 경우 해당 하는 조정 될 수 있다 또는 볼륨 추가25.
      2. 필요에 따라 발생 하는 가교에 대 한 가벼운 교 반으로 30 분 이상 나이.
    4. 프로세스 생산 미 또는 코팅된 NPs 문학19,,2021에 설명 된 대로 NP 분산.

3.는 μMIVM을 사용 하 여 거꾸로 NPs에서 Ovalbumin 캡슐화

  1. 용 매 및 antisolvent 솔루션을 준비 합니다.
    1. 이온된 수 ("OVA")에 ovalbumin의 50 mg/mL 해결책을 준비 합니다.
    2. 1.5 mL 원심 분리기 튜브에서 솔루션의 0.75 mL diluting 75 μ OVA 솔루션의 볼륨에 의해 10% 물 포함 된 DMSO에 OVA의 5 mg/mL 해결책을 생성 하는 DMSO의 0.675 mL로 하 여 준비 합니다. 잘 혼합 하 고 간략하게 설명한 원심.
      참고: 물 효과 관한 단계 2.1.6 참조. 이전 섹션에서 위로 또는 아래로 적합된 소재 요구 솔루션 볼륨을 확장할 수 있습니다.
    3. 블록 공중 합체 안정제를 용 해 하 여 솔루션 B를 준비 (즉, poly(styrene)-b-폴 리 (아크릴 산), PS5 k-b-PAA4.8 k) 6 mg/mL에서 DMSO에. 잘 혼합 하 고 필요한 경우 해산을 sonicate. 1.5 mL 원심 분리기 관으로 0.75 mL를 플라스틱.
    4. 1.5 mL 원심 분리기 튜브로 THF (솔루션 C)의 0.75 mL 플라스틱
    5. 클로 프롬 (솔루션 D)의 1.85 mL 유리 섬광 유리병에 플라스틱.
    6. 메탄올에 염화 칼슘이 수화물 crosslinker 솔루션 60.0 mg/mL를 준비 합니다. 와 동 믹서를 사용 하 여 혼합.
    7. 4.17 mg/mL 2.3.4 단계에서 설명한 대로 메탄올에 암모니아 솔루션을 준비 합니다.
    8. 냉각 목욕으로 15 mL 원심 분리기 튜브를 클로 프롬의 5.25 mL를 추가 합니다.
  2. 믹서 어셈블리를 준비 하 고 서.
    1. 형상 디스크, 최고 디스크, 스 패너 렌치와 O-ring 아래쪽 수신기를 수집 합니다. 구성 요소 및 믹서 스탠드 용어 회로도 그림 2 를 참조 하십시오.
      참고: 추가 정보 (제 1 항) 및 문학22MIVM 건설에 세부 정보를 찾을 수 있습니다. CAD 파일 추가 정보 로 사용할 수 있습니다.
    2. 그것은 잘 맞는 고 마모 또는 손상의 흔적은 홈에 o-링을 놓습니다.
      참고: 정상 작동 착용 또는 용 매 부 O-링을 이어질 것입니다. O-링 연장 또는 변형 나타나면, 그것을 사용 하기 전에 하룻밤 건조 공기를 허용 합니다. 모양을 하룻밤 복구할 수 없습니다 하는 경우는 오 링의 처분. 이것은 소모품 부분으로 큰 재고를 유지.
    3. 조심 스럽게 혼합 디스크 구멍 상위 디스크에 못 하 고 함께 밀어. O-링 두 조각 플러시 앉아 확인 하 여 난민 될 하지 않습니다 확인 합니다.
    4. 두 가지를 반전 하 고 수동으로 아래쪽 수신기와 함께 그들을 조립. 그것은 디스크의 완전 한 강화 방해 하지 않습니다 있도록 콘센트 배관 피팅 느슨하게 되어 있는지 확인 합니다.
      참고: 어셈블리, 동안 스레딩 잡는 다 신중 하 게 분해 하 고 적용 하는 경우는 음식 또는 약-등급 안티-점유 마모를 방지 하기 위해 스레딩.
    5. 수동 강화 후 최고 디스크 나무 못을 스 패너 렌치를 적합 하 고 석판 어셈블리를 조입니다. 다음 혼합 기하학의 맨 아래 면에 대 한 단단히 앉고 있도록 콘센트 배관 피팅 조입니다. 최고의 디스크에 주사기 피팅 아늑한 인지 확인 합니다.
    6. 아웃렛 튜브 지원 플레이트 아래 확장 되도록 조립된 믹서 믹서 스탠드에 놓습니다. 작업 공간 왜곡이 일시 중단 되도록 모바일 접시를 지원 합니다.
    7. 필요한 경우, 기계 정지 맞춤을 확인 하려면 먼저 빈 유리 주사기를 연결 믹서 후미.
      참고: 체적 flowrates 주사기 같은 선형 속도로 동시에 우울 이후 다른 배럴 직경의 주사기를 사용 하 여 변화 된다. 초기 및 최종 수직 높이 모든 주사기에 대 한 동일 해야 하 고 플런저 샤프트22에 도청 세트 나사를 사용 하 여 조정할 수 있습니다. 기계 정지 유리 주사기에 과도 한 손상을 발생 하지 않습니다 확인 합니다.
      1. 필요한 경우, 낮은 그래서 모바일 판 기계 정지에 온다. 이 격판덮개는 또한 ( 그림 2에서 보이는) 것과 같이 빈 주사기를 연결 하기 전에 즉시 휴식을 온다 있도록 정렬 됩니다 있는지 확인 합니다.
      2. 필요한 경우 필요한 경우, 기계 정지 및 위치 변경를 풉니다. 유리 주사기를 제거 하 고 모바일 플레이트 방식의 재설정.
        참고: 플라스틱 주사기와 함께 작동, 기계적 중지 필요 하지 않습니다.
    8. 유출 수집 콘센트 배관 아래 오픈 냉각 목욕을 놓습니다.
    9. 무딘 팁 바늘을 사용 하 여 1 mL 가스 꽉 주사기로 솔루션을 그립니다. 모든 기포를 제거 하 고 처분 바늘의. 프라임 솔루션 주사기 luer 피팅의 끝을. 솔루션 B와 C에 대 한이 과정을 반복
    10. 무딘 팁 바늘을 사용 하 여 2.5 mL 가스 꽉 주사기로 솔루션 D를 그립니다. 모든 기포를 제거 하 고 처분 바늘의. 프라임 솔루션 주사기 luer 피팅의 끝을.
      초기 주사기 플런저 하이츠 같은 참고: 이러한 볼륨 선택 되었습니다. 볼륨 변경 되 면 그들은 여전히이 높이 요구 사항을 충족 해야 합니다.
    11. 알파벳 순서로 시계 방향으로 방식 믹서에 4 개의 주사기 조립. 그림 1B 최종 모양 및 주사기 방향 회로도 참조 하십시오.
      참고: 없는 주사기 높이 크게 다른 다른 확인 하 고 필요에 따라 문제를 해결.
  3. 믹서 작업 및 청소를 수행 합니다.
    1. 그립 모바일 판의 양쪽에 베어링 하우징. 이것이 기계 중지에 대 한 핀치 위험 때문에 하우징 아래쪽 얼굴에 손가락을 배치 하지 마십시오. 겨우 주사기 감동 하지만 균등 하 게 휴식을 천천히 모바일 판 낮은.
    2. 꾸준히 그리고 매끄럽게 우울 플레이트, 작업을 완료 하는 것을 작정 인 약 0.5-1에 대 한 s 스트림 볼륨22.
      1. 제거 하 고 이제 NP 분산을 포함 하는 냉각 목욕 튜브 캡.
    3. 여전히 연결 된 주사기와 믹서 고 폐기물 컨테이너 위에. 컨테이너에 드레인을 잡고 최대 볼륨을 수 있도록 주사기를 제거 합니다. 거꾸로 믹서 어셈블리를 누른 스 패너 렌치를 사용 하 여 믹서를 분해 합니다.
    4. 스프레이 용기를 사용 하 여 용 매 (예를 들어, 아세톤)의 몇 밀리 리터와 콘센트 튜브를 헹 구 고 건조 한 공기 또는 질소.
    5. (예를 들어, 이온을 제거 된 물 이나 DMSO) 좋은 용 매와 혼합 기하학 린스를 아세톤 스프레이 병에서 몇 밀리 리터를 사용 하 여 다음 린스 합니다. 건조 한 공기 또는 질소 스트림.
    6. 이온된 수의 흐름에 o-링을 헹 구 고 건조 되 리.
    7. 최고의 디스크까지 시각적으로 깨끗 한 용 병을 사용 하 여 아세톤의 몇 밀리 리터를 철저 하 게 린스. 건조 한 공기 또는 질소 스트림 표면 및 주사기 피팅.
    8. 용 병에서 좋은 용 매 (예를 들어, 이온을 제거 된 물 또는 아세톤)의 몇 밀리 리터와 함께 각 주사기를 씻어. 아세톤의 몇 밀리 리터의 최종 린스를 적용 하 고 사용 전에 건조 한 공기.
  4. 후 처리 및 분석을 수행 합니다.
    1. 약 75%에서 교 반 하면서 dropwise 염화 칼슘이 수화물 crosslinker 솔루션의 50 μ 추가 최대 속도.
    2. 75% 최대 속도로 교 반 하면서 dropwise 암모니아 솔루션의 50 μ를 추가 합니다. 적어도 30 분에 대 한 나 이입니다.
    3. 2.3.1, 2.3.2 단계에 설명 된 대로 NP 크기를 특징.
    4. 프로세스 생산 미 또는 코팅된 NPs 문학19,,2021에 설명 된 대로 NP 분산.

4입니다. 배합 스케일-업에 대 한 수정

  1. 1, 2, 또는 원하는 구성에 필요한 제제 크기에 대 한 충분 한 볼륨에는 3 단계에서 설명한 대로 용 매 및 antisolvent 솔루션을 준비 합니다.
  2. 필요에 따라 필요한 경우, 청소 하 고 소독 NP 형성 하기 전에 적합 한 프로토콜을 사용 하는 장소에 믹서.
    참고: CIP 100, (중립 pH)에 물, CIP 200, (중립 pH), 수 물과 적당 한 용 매 순차 린스는 과거에 고용 되었다. 또한, 살 균 필터 여과 의해 최종 입자 크기 살 균을 방해 하는 경우에는 믹서의 후미에 첨부할 수 있습니다.
  3. 적당 한 볼륨의 가스 꽉 주사기에는 솔루션을 로드 하 고 끝에 장착 하는 루어 어댑터와 소계 (PTFE) 튜브를 연결 합니다. 수동으로 튜브의 끝을 솔루션 프라임.
    1. 주사기 펌프에 주사기를 로드 하 고는 CIJ 또는 필요에 따라 MIVM에 믹서 후미에 주사기를 연결 합니다.
      참고: 또는, 유량 컨트롤러 사용할 수 있습니다 실험실 또는 파일럿 규모에서 주사기 펌프 보다 더 큰 볼륨 기능을 제공. 성공적인 작업에는 꾸준한 흐름 및 충분 한 압력 강하, 가압된 혈관 흐름 측정 콘센트에 대규모 생산을 위한 가장 적절 한 선택은 필요 합니다.
  4. 콘센트 배관 아래, 필요한 경우 충분 한 양의 냉각 목욕을 포함 하는 컬렉션 그릇을 놓습니다.
  5. 수동으로 달성과 일치 하도록 체적 유량을 설정 (예를 들어, 스트림 당 30-60 mL/min에 대 한).
    참고: 경우에 CIJ에 사용 하 여, 펌프 유량 해야만 됩니다. 경우에 MIVM를 사용 하 여 다른 후미 다른 흐름 율을 가질 수 있습니다.
  6. 동시에 펌프를 시작 합니다. 폐수의 약 5-10 mL 작은 유리병 (이것은 "시동 볼륨") 폐기물 수집 그리고 냉각 목욕에서 수집 시작.
  7. 특성화 고 위의 해당 공식 섹션에서 설명 된 대로 처리 합니다.

Representative Results

FNP와 NP 공식의 급속 한 고 작은 양의 재료 (1-10 mg)의 순서를 요구 한다. 안정, 명확 하 고 또는 가볍게 젖 NP 분산 FNP 프로토콜 캡슐화 비타민 E (1 단계) 등 소수 성 화합물을 발생 합니다. 동적 산란 (DL) 입자 크기를 특성화 하는 강력한 수단을 제공 합니다. 그림 3에서 보듯이 과정 재현 방식에서 낮은 증가할수록 함께 NPs를 생성 합니다. 전형적인 증가할수록 인덱스 (PDI)는 0.20, 보다 나타내는 비교적 단 분산 인구. PDI 자기 상관 함수에서 가져온 고 자주 악기 소프트웨어에 구현 됩니다. 그것은 순간, 두 번째의 비율 값 0.1의 단 분산 입자26일반적으로 얻어진 다. 4 비타민 E/PS에 대 한-b-말뚝 배합 복제 보고, 값은 0.12 ± 0.02와 평균 직경은 107 ± 7 nm. 그림 3에 일반적인 "불발" 주사기의 고르지 못한 어느 우울증 또는 느린 우울증 속도 보고 됩니다. 증가할수록 영향을 받는, 아니었지만 크기가 약간 큰 (135 nm). 이 샘플을 포함 하 여 입자 크기에 대 한 새로운 통계는 113 ± 14 nm. 불발 챔버는 단일 스트림 종류만을 포함 하는 시간의 기간에 결과. 전체 스트림을 동일한 과정 역사와 상대 볼륨 믹서 내에서 유기와 수성 스트림의 경험 중요 하다. 안정제, 없이 보이는 집계 불투명 솔루션 생산 됩니다. 이 샘플에 대 한 DL 자기 상관 함수 비 모노 토 닉 이며 원활 하 게, 그림 3 인세트 에서처럼 부패 하지 않습니다.

FNP에 의해 입자 크기 제어 그림 4에 설명 어디에 핵심 소재-poly(styrene)이 경우-및 PS-1.8 k b의 상대적 양의 변화-49-152 nm에서 배열 했다 입자 크기 귀착되 었 다 못 안정제. 이러한 입자 크기 THF 스트림을 포함 하는 코어의 총 질량 농도 안정제 20 mg/mL의 25%, 50%, 또는 질량의 75%가 poly(styrene) 중 핵 물자 생성 했다. 나노 입자의 증가할수록 0.15 미만 항상 했다. FNP에 의해 생산 입자 크기에 대 한 매개 변수 효과의 광범위 한 토론은 문학10에서 찾을 수 있습니다. 로드 용 볼륨 상수를 코어와 안정제 재고 솔루션의 상대 볼륨을 변화 하 여 조정 될 수 있습니다. 마찬가지로, 총 질량 농도 10mg/mL 이외의 값에 재고 솔루션을 준비 하 여 다양 한 될 수 있습니다. 특정 조건에서 DL27여 빈 micelle 인구를 관찰 하는 것이 가능 하다. 이 측정 된 입자 크기 분포를 확대 이외에 어떤 해로운 효과 없습니다. 크기와 비슷한 때,이 하나의 넓은 피크 보다는 두 개의 별도 봉우리로 매니 페스트 수 있습니다.

동일한 CIJ 믹서로 exemplified 프로토콜의 2 단계에서 iFNP에 의해 친수성 화합물을 캡슐화 하기 위해 사용할 수 있습니다. 보고 된 배합에서 생산 하는 입자는 약 65 nm 0.08의 낮은 증가할수록. 크기 분포는 그림 5A (점선)에서 볼 수 있습니다. 그림 5B와 같이 입자 안정성에 PAA carboxylic 산 성 잔류물 DL 분석 DMSO, 등 강한 용 제에 의해 설명 된다 가교의 효과. 잘-가교 된 입자의 자기 상관 함수를 시작 한다 1과 드롭 값 근처 급격히 0 입자 크기 (실선)와 관련 된 특성에. 입자를 광범위 하 게 팽창 또는 분해 가교 화와 최소한의 상관 신호 (점선) 표시. IFNP에 대 한 실패 한 실험 FNP 위의 설명 된 대로 비슷한 방법으로 매니 페스트. 보이는 집계를 볼 수 있습니다 또는 가난한 DL 상관 함수 모양 관찰 될 수 있습니다. 두 개 이상의 입구 스트림 시스템 제약 가용성 또는 화학 호환성 등으로 인해 필요한 경우 FNP 또는 iFNP는 MIVM은 사용할 수 있습니다. 자사의 믹서 스탠드 MIVM (μMIVM)의 소규모 버전은 그림 2에 표시 됩니다. CIJ, 것과 같이 소수 성 또는 친수성 화합물22를 캡슐화 하는 것이 믹서를 사용할 수 있습니다. 3 단계에서는 친수성 단백질의, OVA, iFNP에 의해 캡슐화에 대 한 프로토콜 설명 했다. 입자 크기 분포는 그림 5A (실선)에 표시 됩니다. 크기는 약 125 0.16의 PDI nm. 더 큰 스케일에서 주사기 펌프 작업에 대 한 일반적인 프로토콜은 4 단계에서 제공 됩니다.

Figure 1
그림 1: 믹서 부품 및 내부 흐름 패턴 설계도. (A) 좁은 impinging 제트기 (CIJ) 믹서 연결 된 주사기와 냉각 목욕 위에 배치 됩니다. 안 사진은 냉각 목욕 유리병과 저 어 접시에 볶음 바가 있습니다. 혼합 기 챔버의 중앙에 충돌 하는 두 개의 스트림을 후미를 보여주는 확장 된 보기에서 묘사 된다. (B) 다중 입구와 동 믹서 (μMIVM) 유리 주사기로 표시 하 고 냉각 목욕 위에 서 서에 위치. 모바일 판 및 기계 중지 그림에서 잘립니다 되었습니다. 확장 된 보기 소용돌이 약 실 및 입구 채널 개요로 표시합니다. (C) A FNP 제작한 코어-쉘 NPs의 도식 적인 표현입니다. 빨간 분야 대표 블루 축소 된 폴리머 블록으로 결합 하 여 치료, NP 코어 구성. NPs에 입체 안정화 부여 브러시 층을 형성 하는 노란색 폴리머 블록 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: μMIVM 용어 및 어셈블리에 대 한 구성 요소. ΜMIVM은 4 개의 주사기의 균일 한 우울증 수 있도록 믹서 스탠드를 필요 합니다. 이 경우에, 주사기 플런저 높이 수 있어야 합니다 모든 일관 된 혼합 되도록 유니폼. 그것은 또는 주사기 펌프를 사용 하 여 운영 될 수 있습니다. 레이블이 지정 된 구성 요소와 믹서 스탠드는 그림의 왼쪽에 표시 됩니다. 오른쪽에 혼합 형상 디스크에 o-링을 분해 믹서가입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 입자 비타민 E의 코어를 포함 하는 고분자 나노 입자의 크기 및 PS-b안정-던지다. 동적 산란 (DL) NP 직경 분포를 나타내는 강도 가중치 크기 배포판을 제공 합니다. 곡선 각 재판 triplicate 분석의 평균 이며, 동일한 최대 피크 높이 생산 rescaled. 4 복제 (실선) 방법의 높은 재현성을 나타냅니다 (표준 편차 = 7 nm). 또한 포함 된 느린 주사기 속도 또는 큰 입자 직경에는 두 개의 주사기의 고르지 못한 우울증 등 대표적인 불발 (파선)입니다. NP 크기는 불발 등의 표준 편차는 14 nm. (삽입) PS-b없이-말뚝 안정제, 큰 마이크론 규모 집계 (또는 방울, 비타민 E 같은 오일의 경우) 형성 된다. 안정제 (점선) 없이 실행의 DL 자기 상관 함수는 대표적인 상관 나노 복제 (실선)에서 함께 표시 됩니다. 자기 상관 함수는 polydisperse 인구를 나타내는 컨트롤 샘플에 대 한 특성 계획의 수를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: 입자 크기 제어 핵심 소재 안정제의 상대적 비율 변화 통해 FNP. PS-bpoly(styrene) 코어와 3 개의 공식의 강도 가중치 크기 배포판 안정-말뚝 표시 됩니다. THF에 총 질량 농도 20 mg/mL 이었고는 antisolvent은 물. 공식은은 CIJ 믹서에 준비 했다. 중 핵 물자의 구성 하는 질량의 분수 범례에 표시 됩니다. 예를 들어 25% 코어 샘플 포함 5 mg/mL poly(styrene) 및 15 mg/mL PS-b-말뚝. 25% (실선), 50% (파선), 및 75% (혼합된 대시 선) 코어 선적에 대 한 평균 크기 했다 49 nm, 96, 및 152 nm, 각각. 모든 PDI 값 0.15 미만 했다입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5: CIJ 믹서 또는 μMIVM에서 거꾸로 NPs의. (A) DL 커브는 각 배합에 대 한 triplicate 분석의 평균. 파선 실선은 μMIVM에서 만든 OVA 입자의 크기 분포는 CIJ 믹서에서 만든 3 k MD 입자의 크기 분포를 나타냅니다. (B) 가교의 강도 희석제로 DMSO를 사용 하 여 DL에 의해 평가 될 수 있다. DL 자기 상관 함수는 초기 상관 값을 통해 가교의 힘과 0의 값으로 깨끗 한 전환의 관찰을 나타냅니다. 파선 약한 초기 신호 및 광범위 한 부패 시간을 보여주는 아무 crosslinker와 입자의 자기 상관 함수를 보여 줍니다. 실선 강한 초기 신호 및 정의 부패 날짜 표시줄 표시 (이 경우 tetraethylenepentamine)에 강한 crosslinker의 추가 후에 상관을 묘사 한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 6
그림 6:과 포화, 물 유기 용 매 상대 혼합 비율의 기능으로 서 S. (○) boscalid, 살충제, 및 (■) 펩 티 드 B, 모델 7 잔류물 펩 티 드에 대 한 가장 높은 달성과 포화의 (A) 비교. 유기 스트림 230 mg/mL 및 펩 티 드 B 그들의 포화 농도 200 mg/mL의 농도에서 boscalid를 포함 되어 있습니다. 각 활성 제약 성분 (API)에 따라 최대과 포화 있다 / 용 매 시스템. (B) 유기 스트림의 boscalid 농도 20-fold 감소 하는 때는 포화 및 nanoprecipitation 달성 조건 제한 된다. 이 수치는 Elsevier9에서 허가로 증 쇄. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Discussion

캡슐화 프로토콜의 1 단계에서 비타민 E 같은 소수 성 화합물의 광범위 하 게 설명된9,,1428되었습니다. 상대적으로 단 분산 입자 혼합 시간 규모 집계 및 입자의 성장에 대 한 시간 규모 보다 짧기 때문에 생산 됩니다. 특히, 혼합된 용 매/antisolvent 솔루션 빠르게 된다 균질, nucleation 균일 하 게 발생할 수 있습니다. 어셈블리가 입자 표면에 블록 공중 합체의 입자 성장5중단 입체 안정화를 제공 합니다. 챔버 (기류)에 시간을 혼합에 CIJ에는 MIVM 입구 유량의 함수 이기 때문에 입자 크기는 기본적으로 일정13난 류 혼합, 전환 후 발생 하는 유입 속도가 있다. 이 프로세스에 추가 견고성 일부 일괄 처리를 일괄 제공 입구 flowrate (즉, 주사기 우울증 속도)에서 최종 NP 크기에 큰 영향 없이 용납 될 수로 그림 3에서 본. 불발 예제 처럼 느린 또는 고르지 못한 유입 속도 더 큰 입자 또는 더 polydisperse 배포판, 발생할 수 있습니다. FNP 또한 역 플래시 NanoPrecipitation에 의해 나노 입자의 친수성 화합물을 캡슐화 하기 위해 확장 되었습니다. 이러한 나노 입자 수를 거꾸로 다음 미 만들거나 물 분산 나노25만들려고 말뚝 코팅 하는 데 사용할. 기본 어셈블리 원칙 그대로, 입자 코어 가교의 복잡성입니다. 이 수성 환경에서 입자의 안정화를 위해. 이오니아 상호 작용 기본19의 추가 통해 pH 조정에 의해 승진 될 수 있지만 일반적으로, 1:1 전 비 polyacid 블록에 비해 충분있지 않습니다. 이 프로토콜에서 거꾸로 양식 NPs에만 첫 번째 프로세스 단계 설명 하고있다.

빠른 혼합 뿐만 아니라 FNP 또는 iFNP에 의해 성공적인 배합 인스턴스 여러 조건이 만난된9,14수로 제한 됩니다. 첫째, 모든 입력 스트림 혼합할 수 있는 수 있어야 합니다. 유화 액 NPs를 생산 하기 위해 사용 되었다, FNP 믹서에서 균일 한 솔루션 단계를 요구 한다. 둘째, 핵심 구성 해야 합니다 (CIJ, 볼륨에 의해 50/50 혼합물)에 대 한 믹서에 용 매 조건에서 거의 녹는 빠른 nucleation 운전. 그렇지 않으면, 상당 부분 unencapsulated 유지 됩니다 또는 antisolvent와 더 희석 후 침전 됩니다. MIVM 주소 핵심 소재 용 해도 한계에 믹싱 챔버에 높은 antisolvent 콘텐츠를 사용할 수 있습니다. 그것은 종종 프로세스 디자인9가이드 용 매 조성의 함수로 가용성 데이터에서과 포화 곡선을 생성 하는 데 유용. 그림 6 두 화합물에 대 한 대표적인 곡선을 보여준다. 혼합 챔버 조건에서 낮은 포화는 MIVM를 사용 하 여 일반적으로 다른 구성에서 장점. 높은 포화 보다는 핵심 구성 요소의 nucleation 입자 성장 하지만 코어 재료의 조립 시간에 불일치와 안정기 치료의 큰 집계 될 수 있습니다. D'Addio 및 Prud'homme 세부 사항9에서 이러한과 포화 곡선의 응용 프로그램을 검토 했습니다. 마지막으로, BCP는 분자로 용 매의 흐름에 녹아 야 한다 그리고 antisolvent 스트림 한 블록에 대 한 선택 되어야 합니다. BCP amphiphilic 두 solvophobic 입자 입체 안정성을 얻으며 solvated 블록 및 입자 표면에 안정제를 축소 된 블록에서 추진력을 제공 하기 위해 충분히 되어야 합니다. 그들은 이러한 제약 조건을 충족으로 프로토콜에 기술 된 용 매를 사용할 수 있습니다.

수동 주사기 작업 연습 심사 중 성공률을 높일 수 있습니다. 위에서 설명 했 듯이, 균질, 난 류 혼합 조건에 전환 위에 작업 흐름 속도 있는 작은 변이 과정28용납 됩니다 의미 합니다. 규모-최대 더욱 이익에서 펌프 구동, 컴퓨터 제어 흐름 결과 일관성 재현할 수 유입 흐름 율 때문에. 입자의 사후 처리 하는 동안 언제 든 지 검사 또는 DL 분석 부수적 먼지나 입자 불안정으로 인해 될 수 있는 큰의 존재를 나타낼 수 있습니다. 필요한 경우, 스트림의 적절 한 필터 기 공 크기와 필터링 수 있습니다. 집계의 부재, 우리 것으로 나타났습니다 덜 보다 5% 질량 공칭 필터 크기 입자 크기 분포 보다 크면 못 코팅 된 나노 입자를 필터링 할 때 일반적으로 손실 됩니다. 집계, 필터링 과정에서 대량 손실의 실험적인 결심은 필요 합니다. 대량 손실의 정량화는 두 가지 방법 중 하나로 수행할 수 있습니다. 총 고체 질량 주어진된 볼륨에 의해 결정 될 수 열 분석 여과 전후 변경의 범위를 식별 하기 위해 ( 추가 정보 섹션 2 참조). 또는 입자 복구 (예를 들어, 동결에은 의해) 될 수 있다 하 고 좋은 용 매에 용 해. 중 핵 물자의 농도 다음 직접 측정할 수 있습니다 자외선 보이는 분 광 광도 법 또는 크로마토그래피 등 적절 한 기술에 의해.

FNP에 대 한 잔여 10 vol % 유기 용 매 (예를 들어, THF) 수성 분산에서 제거 되어야 합니다. 이것은 증발 증 류14,29, 투 석30또는 접선 교류 여과31,32에 의해 행 해질 수 있다. 각 처리 단계에 대 한 실용적인 고려 사항 제공 인용에 설명 되어 있습니다. 석에, 전형적인 막은 3.5 kDa 또는 6-8 kDa 차단, 더 큰 옵션을 사용할 수 있습니다. 이 분자량 컷오프는 용 매 제거 때 여러 목욕 변화를 사용 하 여 24 시간에 대 한 dialyzed에 대 한 충분 합니다. 접선 교류 여과 사용 하 여 관리 유도 하는 막 표면에서 농도 분극으로 인해 집계 방지로 이동 해야 합니다으로 일부 공정 개발을 수반 한다. 우리는 막 표면에서 집계 제거 시스템-종속 값, 일반적으로 2-10 vol %, 유기 용 매 성분 감소 나타났습니다. 처리 후, 나노 입자의 농도 쉽게 열 분석에 의해 결정 됩니다 ( 추가 정보 섹션 2 참조). 그것은 종종 전송 하거나 매우 안정적인 형태로 입자를 저장 하는 것이 좋습니다. 빠르게 드라이 아이스/아세톤 혼합물을 사용 하 고 다음-80 ° c.에 저장 된 수성 분산 얼 단순히 수 있다 또는 건조 분말 동결은33,34 에 의해 얻어질 수 있다 또는 스프레이 건조24. 자주는 cryoprotectant 동결 또는 건조 하는 동안 나노 집계를 줄이기 위해 추가 되어야 합니다. 설탕 (자당, 트 레 할 로스, 등), poly(ethylene glycol), 또는 cyclodextrins 수 있는 상영 효과 대 한 농도의 범위 DL35,,3637에 의해 크기를 모니터링 하 여 38. 처리 하는 동안 일반적인 NP 안정성 문제는 종종 가용성 또는 단계 분리는 낮은 에너지 상태 조건 하에서 이동성 증가 향해 재배치 결과로 코어에 관련이 있습니다. 공동 핵심 재료, 대체 안정제, 또는 수정 된 외부 솔루션 구성의 사용 안정성14,,1617,39,40을 향상 시킬 수 있습니다. 41.

위에서 설명 했 듯이는 MIVM 혼합 챔버 높은 포화를 달성 하는 데 필요한 경우에 더 높은 antisolvent 콘텐츠를 수 있도록. 그것은 또한 수 두 개 이상의 스트림에 종의 물리적 분리를 위한 용 해도 또는 반응 제약 그것을 요구 하는 경우. 예를 들어 항생제 clofazimine24의 제인 단백질 안정화 나노 입자의 형성 이다. 소수 성 clofazimine 아세톤 스트림;에 도입 제인은 60 %ethanolic 수성 스트림;에서 도입 카 제인, 제인와 단지 수성 버퍼 스트림 함께 가져 이며 4 스트림 아세톤과 에탄올을 물의 비율을 증가 하기 위하여 추가 버퍼. 두 개의 용 매 스트림을 clofazimine과 제인은 일반적인 용 매에 용 해 하지 필요 합니다. 이 프로세스 수 없습니다 2-제트 CIJ 믹서에서 수행할 수 있습니다. 이 단백질 안정화 배합 FNP BCP 안정기에 국한 되지 않습니다 보여 줍니다. 야누스 입자 안정제42 없이 생산 되어 고 저가 안정기의 범위는 구두 응용 프로그램24에 대 한 증명 되었습니다. 특히, 여기 스 같은 공중 합체 블록 공중 합체24대신 사용할 수 있습니다. 핵심 재료 기술의 숫자에 의해 더 소수 성 만들 수 있습니다. 소수 성 이온 쌍 중간 가용성43,,4445있는 화합물의 광범위를 캡슐화 하기 위해 적용 되었습니다. 매우 소수 prodrugs 되었습니다 생성 하 고 다음46캡슐. 핵 산 양이온 지질47와 complexation를 통해 캡슐화 되어 있다. 중요 한 것은, 이러한 연구 FNP 입자 표면 화학의 범위를 생산할 수 있다고 나타났습니다. 체인 끝에 대상 ligand와 수정 된 BCP의 일부를 포함 하는 더, 혼합 안정기 사용 되었습니다. 입력된 스트림 구성23,48를 반영 하는 입자 구성 이후 표면에 정밀 하 게 제어할을 ligand 콘텐츠 수 있습니다. 마찬가지로, 그것은 수는 여러 코어 구성 요소 뿐만 아니라, 통합 염료 등 무기 나노 입자3,8.

플래시 NanoPrecipitation 고분자 나노 입자는 소수 성 또는 친수성 코어의 구성 하는 확장 가능한 접근 이다. 위에 열거 하는 조건을 충족 하는 경우 일반적으로 이상 코어 물질의 95%는 캡슐화 입자에 높은 질량 분 율에. 여기에 제시 된 세 가지 예 벤치 규모, 요구 하는 자료 및 각 입구 시내에 약 0.5 mL의 몇 밀리 그램에서 실행 되었다. 정립 최적화에 대 한 입자의 빠른 심사에 대 한 수 있습니다. 스케일 업의 더 큰 일괄 처리 크기를 리드 공식 주사기 펌프 또는 유량 컨트롤러를 사용 하 여 쉽게 수행할 수 있습니다 더 이상, 프로세스 실행의 문제 이다. 대조적으로, 대량 추가 nanoprecipitation의 스케일 업 추가 시점에서 충분 한 micromixing를 유지 하 고 선박 형상49변경의 효과 대 한 회계에 문서화 난관을 직면 한다. 이것은 이후 FDA 요구50에 맞게 일관 된 방식으로 입자를 제조 하는 중요 한 주요 방 벽 이다. 마이크로 기술 또한 유니폼, 재현 가능한 나노 입자를 생산 수 있지만 밀리 그램 범위에서 생산을 활성화. 예를 들어 Karnik 외. 마약 릴리스에 대 한 0.25 mg/min의 생산 비율 공부51보고. 더 스케일 업은 일반적으로 높은 자본 비용12에서 병렬화를 수반 한다. FNP, 주사기 펌프와 믹서 후미에 연결 하는 몇 가지 피팅 600 mg/min에서 나노 입자의 1 그램을 생성 하는 간단 하다. 따라서, FNP 액세스할 수 실험실-규모 검사 도구 뿐만 아니라 변환 작업에 대 한 NP 생산 하는 확장 가능한 접근 방식을 나타냅니다.

Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

이 작품은 Optimeos 생명 과학, 국립 과학 재단 (CBET 1605816), 빌과 멜 린다 게이츠 재단 (BMGF, OPP1150755), 및 국립 과학 재단 대학원 연구 친교 (DGE-1656466)에 게 수 여에서 자금에 의해 지원 되었다 K.D.R.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Confined Impinging Jets Mixer NA NA See supplemental information for engineering drawings. Review text for new mixer validation
Luer fitting Idex Health & Science P-604 Assemble on CIJ or MIVM mixer inlet with corresponding threads
Plug fitting Idex Health & Science P-309 Assemble on CIJ mixer sides (seal access point from drilling)
Outlet fitting - CIJ Idex Health & Science P-205 Assemble with ferrule and tubing on CIJ chamber outlet
Outlet ferrule - CIJ Idex Health & Science P-200 Assemble with outlet fitting (large end flush with tubing)
Outlet tubing - CIJ Idex Health & Science 1517 Use tubing cutter for clean ends. Ensure extra tubing doesn't protrodue into mixing chamber
Tetrahydrofuran (THF) Fisher Scientific T425-4 Use stabilizer-free THF to avoid solubility limits of BHT. Peroxides may interfere in some applications.
Norm-ject syringe (3 ml) VWR 53548-017
Vitamin E (α-tocopherol) Sigma-Aldrich 90669-50G-F Store cold
poly(styrene-b-ethylene glycol), PS1.6k-b-PEG5k Polymer Source P13141-SEO Other block sizes acceptable depending on application
poly(styrene)1.8k Polymer Source P2275-S Example hydrophobic core material
Scintillation vial DWK Lifesciences 74504-20
Luer-slip plastic syringes, 1ml (100 pk) National S7510-1
Maltodextrin DE 4-7 Sigma-Aldrich 419672-100G
poly(styrene-b-acrylic acid), PS5k-b-PAA4.8k Polymer Source P5917-SAA Other block sizes acceptable depending on application
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific D159-4
Calcium chloride dihdyrate Sigma-Aldrich 223506-25G Hygroscopic.
Methanol Fisher Scientific A452-4
Ammonium Hydroxide Fisher Scientific AC423300250
Albumin from chicken egg white (Ovalbumin, OVA) Sigma-Aldrich A5503-1G
Multi-Inlet Vortex Mixer NA NA See supplemental information for engineering drawings. Review text for new mixer validation
Outlet fitting - MIVM Idex Health & Science P-942 Combination with ferrule
Outlet tubing - MIVM NA NA Fit to ferrule ID.
O-ring (MIVM) C.E. Conover MM1.5 35.50 V75 Order bulk - consumable part. Ensure solvent compatibility if using an alternative source.
Mixer stand NA NA See Markwalter & Prud'homme for design.17

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References

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고분자 나노 입자에 소수 성 및 친수성 화합물의 캡슐화에 대 한 NanoPrecipitation 플래시
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Markwalter, C. E., Pagels, R. F.,… More

Markwalter, C. E., Pagels, R. F., Wilson, B. K., Ristroph, K. D., Prud'homme, R. K. Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles. J. Vis. Exp. (143), e58757, doi:10.3791/58757 (2019).

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