Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Флэш-NanoPrecipitation для инкапсуляции гидрофобных и гидрофильных соединений в полимерных наночастиц

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58757
Automatic Translation
, , , ,
1Department of Chemical and Biological Engineering, Princeton University

Summary

Флэш-NanoPrecipitation (ППП) является масштабируемой подход для производства полимерных ядро оболочка наночастиц. Лаборатория масштабе составов для инкапсуляции гидрофобных и гидрофильных терапии описаны.

Abstract

Формулирование терапевтического комплекса в наночастиц (NPs) можно придать уникальные свойства. Для плохо водорастворимых препаратов NP формулировки можно повысить биодоступность и изменить распределение лекарств в организме. Для гидрофильные препараты как пептидов и белков инкапсуляции в NPs может также обеспечивают защиту от естественной очистки механизмов. Есть несколько методов для производства полимерных NPs, которые являются масштабируемыми. Флэш-NanoPrecipitation (ППП) — процесс, который использует инженерии смешивания геометрии производить NPs с узкими размер дистрибутивов и перестраиваемые размеры от 30 до 400 Нм. Этот протокол содержит инструкции на производство лабораторных полимерных наночастиц ядро оболочка целевого размера с помощью ППП. Протокол может быть реализован для инкапсуляции или гидрофильные гидрофобные соединений с незначительными изменениями. Метод легко могут использоваться в лаборатории в масштабе миллиграмм на экране составов. Свинец хитов непосредственно могут быть расширены грамм - и килограмм масштаба. Как непрерывный процесс масштабов включает больше смешивания время запуска процесса, а не перевод к новым судам, процесс. ЯИЭ, производимые FNP высоконагруженных с терапевтической, имеют густой стабилизирующим полимер кисти и имеют размер воспроизводимость ± 6%.

Introduction

Начиная с конца 1990-х годов наблюдается устойчивый рост числа клинических испытаний с использованием наноматериалов1,2. Растущий интерес отражает обещание наноматериалов для улучшения биодоступность гидрофобные наркотиков и обеспечения преференциального адресного внутри тела3. Полимерные наночастиц (именуемый наночастиц или NPs здесь) представляют растущую долю этого класса материалов2. Сети получил интерес, потому что они имеют весьма настраиваемых свойств, таких как размер, состав и поверхности функционализации4. При применении к администрации слаборастворимых лекарств, NPs часто имеют структуру ядро оболочка, где терапевтического инкапсулируется в ядре гидрофобных и оболочка состоит из гидрофильного полимера кисти. Простой способ для создания этой структуры занято сополимера диблок амфифильных (BCP), состоящий из разложению гидрофобные блока, который является составной частью основных частиц, и гидрофильные poly(ethylene glycol) (PEG) блок, который образует полимер кисти и придает их пространственной стабилизации4,5.

Nanoprecipitation является общий метод изготовления для полимерных наночастиц, потому что это просто и не энергии интенсивного6. В своей простейшей форме nanoprecipitation предполагает добавление пипеткой NP компонентов в среде органического растворителя, как ацетон избыточный объем перемешиваемой воды. Изменение в растворителе для разбавленных водный раствор приводит осаждения нерастворимых основной компонент. Стабилизатор собирает на этой растущей поверхности частиц, режиссер адсорбции рухнул гидрофобные блок7,8,9,10. Форма гранулометрического получается, когда растворителей и воды быстро перемешать сформировать однородный раствор. Смешивание, медленнее, чем нуклеации и Ассамблея компоненты результатов в более крупных, более населения частиц полидисперсных. Хотя легко доступны для простого теста, перемешивают пакетный подход приводит к широким изменчивость из-за смешивания непоследовательность и не поддается масштабирования6,11. Микрофлюидика стали еще одним направлением производства НП, который может выполняться непрерывно. Это средства производства был недавно рассмотрен Дин и др. 11 . Общий подход использует ламинарного потока упором для уменьшения масштаба растворителя Длина до субмикронных значения. Смешивание antisolvent происходит путем диффузии, поэтому размеры малого потока имеют решающее значение для обеспечения единообразного частиц11,12. Распараллеливанию нескольких microfluidic камер для масштабирования является проблематичным для больших производственных объемов.

Быстрое смешивание условия, которые пользу единообразных nanoprecipitation в микрофлюидика попеременно могут быть произведены в замкнутых, турбулентных потоков. Флэш-NanoPrecipitation (ППП) использует специальные смешивания геометрии для достижения этих условий при более объемных вливающихся чем возможно с микрофлюидика. Входе потоков введите смесительная камера турбулентных условиях, которые приводят к генерации вихри, чтобы растворитель/анти-solvent ламели формируют в масштабе длины диффузии11,13. Таким образом достигается равномерное перемешивание в масштабе времени, короче, чем зарождения и роста терапевтического. Замкнутые геометрии смеситель не позволяют поток обхода региона где диссипация энергии турбулентного возникает и всей системы опыта же процесс истории13. Нуклеации происходит равномерно в смесительную камеру и частиц роста доходов до приостановлено Ассамблеей BCP на поверхности9,14. Смешанный поток, содержащий стабильный частицы могут затем разбавляют дополнительные antisolvent для подавления Ostwald созревания частицы15,16,17.

Замкнутые набегающих струи (CIJ) Смеситель простой дизайн смеситель для ППП и допускает смешивания двух потоков в масштабируемой и непрерывное моды, как показано на рисунке 1A13. Мульти входе вихревой смеситель (MIVM) был разработан для включения до четырех различных поток входных данных по-прежнему обеспечивая при этом быстрое микросмешения, необходимых для формирования единой частиц, как показано на рисунке 1B18. ППП позволяет простая формулировка скрининга, которые легко могут быть переведены в коммерческих масштабах производства. Ввиду непрерывного характера процесса больших размеров партии не требуют новых судов, но скорее больше времени выполнения, благоприятных простой перевод на килограмм масштаба производства в том же поезде оборудование.

Гидрофильные соединения, такие как пептидов и белков («biologics») также может быть инкапсулирована в процесс называют обратное флэш-NanoPrecipitation (iFNP). Этот метод требует амфифильных BCP, где один блок гидрофобных и другой polyacid19. Начальный шаг предполагает быстрое смешивание этанного сульфоксида (ДМСО) поток, содержащий биологических и BCP против липофильных растворителя как дихлорметан или хлороформом. Это приводит к образованию частиц, стабилизировать с помощью кисти гидрофобные блока. Здесь такая архитектура будет называться «Перевернутый» NP. Ядро содержит polyacid, который затем ionically сшитый, используя многовалентных катиона. Это стабилизирует частиц для обработки в водной среде в виде микрочастиц или ПЭГ покрытием наночастиц методами, которые были зарегистрированы в литературе19,,2021.

Этот протокол может использоваться для производства лаборатории масштабе наночастиц полимерных ядро оболочка, инкапсулируя гидрофобные или гидрофильные соединения. Протокола подразделах инструкции по использованию обоих классов смеситель - CIJ и MIVM. Читатель должен быть в состоянии адаптировать протокол для Роман основных компонентов и герметизации генерировать наночастиц желаемого размера, используя соответствующие смеситель для потока входных данных. Ниже представлены три примера составов с помощью ППП и iFNP. Два используют CIJ смеситель и один требует15,MIVM22. Первая формулировка демонстрирует Инкапсуляция модели гидрофобные составные по ППП. Вторая формулировка демонстрирует Инкапсуляция модели гидрофильные соединения, iFNP в смесителе CIJ. Окончательная формулировка представляет собой пример белка инкапсуляции, iFNP с помощью MIVM. Протокол для этого третьего формулировка описывает использование мелких, портативных MIVM, называется «μMIVM». Смеситель дизайн меньше для скрининга упрощенную формулировку, но поведение масштабирования это хорошо понимают и смеситель является не microfluidic устройства22. В заключительном разделе протокола включает в себя некоторые заметки о масштабирования свинца составов указанных в скрининга. Эти составы предназначены для предоставления точек доступа для процесса обучения и следовательно использовать неразлагающимися поли (стирола)-на основе полимеров. Альтернативные стабилизаторы были описаны в литературе, с количеством биосовместимых коммерческие варианты доступны в14,23,24.

Protocol

1. Инкапсуляция гидрофобные соединений в полимерных NPs, используя миксер CIJ

  1. Подготовить и очистки оборудования.
    1. Закупить и проверить CIJ микшер.
      Примечание: Смотрите Дополнительную информацию в разделе 1 для строительства руководства. Файлы CAD также доступны в качестве Дополнительной информации .
    2. Перед каждым использованием убедитесь, что все фитинги на смеситель CIJ уютно и выходе трубопровода не согнуты или защемления.
    3. В Зонта приложите 5 мл luer lock шприц с 2-3 мл растворителя для каждого входного адаптера. Выберите растворителя (например, ацетон), который будет очистить любые соединения, использовавшихся в смесителе.
      Примечание: Типичный выбор, ацетон или тетрагидрофуран (THF). Только использовать полипропиленовые шприцы, чтобы избежать проблем совместимости растворителей выщелачивания. Не использовать шприцы с резиновые уплотнительное кольцо уплотнения плунжеров.
    4. Установите CIJ Ассамблеи над контейнер для отходов.
      Примечание: Колба с отверстием меньше тела CIJ работает хорошо, как это поддерживает смеситель и позволяет легко управлять шприцы.
    5. Неуклонно угнетают шприц плунжеров опорожнить через смесительную камеру на несколько секунд. Удаление шприцы.
      Примечание: Шприцы можно сохранить и повторно использоваться для нескольких раундов очистки между запусками ППП.
    6. Сухие внутренние смеситель CIJ, с помощью N2 потока. Мужчины luer адаптер на конце линии2 N является эффективным.
      Примечание: Если очистка растворителем не volatile (например, ДМСО), повторите шаги 1.1.3-1.1.5 с ацетоном или ТГФ прежде чем приступить к шаг 1.1.6. Это важно для удаления остаточного растворителя для последовательности запуска к запуску.
  2. Подготовьте растворителей и antisolvent потоков в целевой композиции.
    1. Растворите гидрофобные соединение (например, витамин Е) в нестабилизированной ТГФ выполнить требуемое количество FNP бежит на 10 мг/мл в достаточном количестве. Подготовить в перспективе чуть больше, чем необходимо.
      Примечание: Другие растворители могут использоваться в эти шаги, при условии соблюдения ограничений в разделе обсуждения. Если занято THF, стабилизатор свободный растворитель рекомендуется, потому что бутилированный гидрокситолуол имеет низкую растворимость водный. Соблюдайте осторожность во избежание перекиси накопления (включая перекиси тестирование) и имейте в виду, что низкий уровень пероксидов может помешать с определенными приложениями NP (например, обесцвечивание красок).
    2. Mix решение витамина Е на вихревой смеситель до растворения.
      Примечание: Для некоторых соединений, Ванна sonication для 1-2 мин может помочь в создание растворенных решения. Важно, что все компоненты NP молекулярно растворяются.
    3. Распустить стабилизатор сополимер блок (т.е., poly(styrene) -b- poly(ethylene glycol), PS1.6 k-b-PEG5 k) в ТГФ на 10 мг/мл в примерно такой же объем, как шаг 1.2.1 сформировать раствор полимера.
      Примечание: Другие растворители могут использоваться, ограничениями, подробно описанные в разделе обсуждения.
    4. Смешайте раствор полимера с вихревой смеситель до растворения. При необходимости, поместите решение в ванне с sonication для 1-2 мин, для оказания помощи в растворения твердых тел.
      Примечание: Полимер не может быть в форме мицеллярной среде. Динамическое рассеяние света (DLS) может быть полезным инструментом для определения того, отвечает ли новый состав потока этот критерий.
    5. Создайте растворителя входной поток, содержащий 5 мг/мл витамина Е и стабилизатор (50% витамина E погрузки), первый дозирования 0,25 мл раствора витамина Е в пластиковых пробирок 1.5 мл. После этого Пипетка 0,25 мл раствора полимера в же трубку.
      Примечание: Тома размером более 0,5 мл в перспективе осуществимы с шприц различных размеров. Выше 10 мл входного сигнала это практично использовать шприцевой насос.
    6. Смесь хорошо на вихревой смеситель для s. 5-10 при необходимости, центрифуга трубки на 1000 x g для 5-10 s, чтобы восстановить любые жидкости, застрял на ПСП, который улучшает воспроизводимость между запусками CIJ.
    7. Пипетка 0,525 мл деионизованной воды во второй пластиковых пробирок 1.5 мл как antisolvent потока.
      Примечание: Это лучше иметь избыточный antisolvent, который гарантирует, что растворителя поток никогда не входит в смесительную камеру без antisolvent настоящего. В некоторых случаях, где соль растворимость в смесь растворителя/antisolvent не ограничивая может использоваться буферизации водных систем.
    8. Пипетка 4 мл обессоленной воды в сцинтилляционные флакон 20 мл или другой подходящий контейнер как закалочная ванна. Место малых магнитных перемешать бар во флаконе.
      Примечание: Закалочная ванна уменьшает Ostwald, созревания, опустив окончательное содержание растворителя до 10%, объем15,17. Этот объем может быть скорректирован в адрес процесса ограничения и может масштабироваться непосредственно с объемом входной поток.
  3. Производят NPs, FNP, используя миксер CIJ.
    1. Расположите открытые закалочная ванна флакон ниже уборка CIJ смеситель на плите переполох в зонта. Практические конфигурации использует блок стойку 50 мл пробирку для поддержки CIJ микшер с флакона ниже и выходе трубопровода, направлены в пробирку. Смотрите Рисунок 1A для ориентации.
    2. Begin, помешивая закалочная ванна через магнитные перемешать бар около 75% Макс скорость.
    3. С помощью шприца 1 мл полипропиленовые с тупой кончик иглы, сделать полный объем из antisolvent трубки.
      Примечание: Не используйте шприцы, которые содержат резиновые уплотнительным избежать проблем совместимости. Для больших томов, входе используйте соответствующего размера luer lock шприц. Выходу шприца должна быть сосредоточена на оси шприц или он будет нестабильным во время депрессии.
    4. Осторожно удалите все пузырьки воздуха из шприца и тупым кончика иглы, утилизация Шарпс контейнер.
    5. Премьер поршень, таким образом, чтобы поток поступает только для открытия шприца. Прикрепите шприц к одному из CIJ входе фитингов.
    6. Повторите шаги 1.3.3-1.3.5 для растворителя решения.
    7. Быстро, гладко и равномерно надавите шприцы в то же время, поместив шарик руки, ладони или одного пальца на вершинах поршни в зависимости от личных предпочтений. Сбор стоков во флаконе закалочная ванна.
      Примечание: 0,5 мл ввод должен быть депрессии менее чем 0.5 s.
    8. Отложите CIJ смеситель с шприцы еще прилагается. Удалить панель перемешать и крышка флакона, которая теперь содержит NP дисперсия со структурой ядро оболочка частиц (рис. 1 c).
    9. Удерживая миксер за контейнер отходов решение и удалить шприцы. Перепускные тома (около 0,25 мл) затем слить. Утилизируйте использованные шприцы и повторите очистки шаг 1.1 до следующего FNP судебного разбирательства.
      Примечание: Не позволяют перепускные тома пустой во флакон, содержащий NPs, как это может отрицательно сказаться на однородности образца.
  4. Выполняйте анализ и пост-обработки NP дисперсии.
    1. Охарактеризовать NP размер с помощью DLS, Пипетка 100 мкл NP дисперсии в пластиковых кювет и добавить 900 мкл закалочная ванна растворителя (например, воды).
      Примечание: Меньшие объемы могут использоваться для кювет малообъемных. Как правило, достаточно десятикратного разрежения.
    2. Смесь хорошо закупорить вверх и вниз или мягкий встряхивания. Следуйте инструкциям специфичные для инструмента для анализа образца.
      Примечание: Альтернативные характеристика методы такие, как анализ потенциальных Зета или электронной микроскопии может осуществляться как требуется. Дисперсии NP может обрабатываться, как продиктовано приложения и рассмотрены в разделе обсуждения.

2. Инкапсуляция гидрофильные соединений в Перевернутый NPs, используя миксер CIJ

  1. Подготовить растворителя, antisolvent и утолить решения в зонта.
    1. Полное очистки и подготовки процедуры, описанные в шаге 1.1, с помощью ДМСО как очистка растворителем и придерживаясь записку на шаге 1.1.6 для завершения второй промыть ТГФ.
    2. Распустить гидрофильные соединения (т.е., мальтодекстрин (MD) с декстрозы эквивалент (DE) 4-7, средний молекулярный вес = 3275 г/моль, «3 k MD») в ДМСО на 10 мг/мл в достаточном объеме для выполнения желаемого числа FNP работает.
      Примечание: Другие растворители может использоваться, при условии соблюдения ограничений, изложенных в разделе обсуждения.
    3. Mix решение мальтодекстрин с вихревой смеситель до растворения. При необходимости, поместите решение в ванне с sonication для 1-2 мин, для оказания помощи в растворения твердых тел.
    4. Создание блока стабилизатора сополимер (т.е., poly(styrene) -b- поли (акриловая кислота), PS-5 k-b- ПАА4.8 k) сток решение в ТГФ на 11,1 мг/мл в примерно такой же объем, как в шаге 2.1.2 сформировать раствор полимера .
      Примечание: Другие растворители и стабилизатор концентрации могут использоваться. ДМСО может легко использоваться как растворитель вместо ТГФ.
    5. Смешайте раствор полимера с вихревой смеситель до растворения. При необходимости, поместите решение в ванне с sonication для 1-2 мин, для оказания помощи в растворения твердых тел.
      Примечание: Полимер input не может иметь в мицеллярной среде форме. DLS может использоваться для определения того, отвечает ли новый состав потока этот критерий.
    6. Подготовить растворителя поток ввода (0,5 мл), объединяя следующие, в порядке, в пластиковых пробирок 1.5 мл: 0.250 мл раствора 3 k MD 0,225 мл раствора полимера, и 0,025 мл деионизированной воды.
      Примечание: Содержание этого потока воды имеет сильное влияние на размер NP и полиизопрена. Обычно лучше всего работают в диапазоне % vol-2,5-1020. Значения на высоком конце диапазона может помочь инкапсуляции больших низкомолекулярных соединений.
    7. Смесь хорошо на вихревой смеситель для 5-10 s.
    8. При необходимости центрифуга трубки на 1000 x g для 5-10 s, чтобы восстановить любые жидкости, застрял на ПСП, который улучшает воспроизводимость между запусками CIJ.
    9. Подготовьте раствор сшивателя кальций хлористый (2CaCl) в метаноле на 25,0 мг/мл.
      Примечание: Сшивателя будут добавлены в соотношении 1:1 заряд для кислотных групп в блоке ПАА. Если используется другой сшивателя или другой ПАА блока размер или полимерные концентрация используется20,21, соответственно скорректировать концентрации.
    10. Подготовьте antisolvent поток дозирования 0,5 мл хлороформа и 0,05 мл раствора сшивателя (0,55 мл всего) в трубку microcentrifuge.
      Примечание: Другие приемлемые antisolvents диктуется выбором сополимер блок и обычно включают дихлорметан или ацетон. Сшивателя вместо этого могут быть добавлены к закалочная ванна, с дополнительной выдержке NP дисперсии для формирования crosslink20.
    11. Смесь хорошо на вихревой смеситель для 5-10 s.
    12. При необходимости центрифуга трубки на 1000 x g для 5-10 s, чтобы восстановить любые жидкости, застрял на ПСП, который улучшает воспроизводимость между запусками CIJ.
    13. Добавьте 4 мл antisolvent (то есть, хлороформ) в 20 мл флаконе сцинтилляционные сформировать закалочная ванна. Место малых магнитных перемешать бар во флаконе.
      Примечание: Этот объем может быть скорректирована в адрес процесса ограничения.
  2. Полный протокол для формирования NP, как описано в шаге 1.3.
  3. Выполняйте анализ и пост-обработки NP дисперсии.
    1. Чтобы охарактеризовать NP размер с помощью DLS, 100 мкл NP дисперсии в Кювета стеклянная Пипетка и добавить 900 мкл растворителя используется для ванны.
    2. Смесь хорошо закупорить вверх и вниз или света агитации кювет. Следуйте инструкциям программного обеспечения для анализа образца.
      Примечание: Сшивки NPs может быть качественно оценены DLS, используя хороший растворитель как ДМСО или диметилформамид (DMF) DLS разбавителя20. Частицы, которые являются стабильно высокоструктурированные представят автокорреляционной функции в растворителе с минимальными изменениями в размер частиц. Плохо высокоструктурированные частицы набухают и демонстрируют слабый автокорреляционная функция и рассеяния прочность21.
    3. При необходимости добавьте базу, таких как аммиак, диск ионных комплексообразования и укреплять сшивки в ядре частиц.
      1. При необходимости подготовьте 3.48 мг/мл раствора аммиака в метаноле, распределяемому с помощью раствора гидроксида аммония (как правило, 30 wt % аммиака). Добавьте 50 мкл (т.е., 0.6 эквиваленты в отношении кислотных групп на полимер) каплям с перемешиванием.
        Примечание: Эквиваленты можно отрегулировать при необходимости изменяя либо концентрации или объем Добавлено25.
      2. При необходимости возраст не менее 30 мин с мягким перемешиванием для сшивки происходят.
    4. Процесс NP дисперсии производить микрочастицы или покрытые NPs, как описано в литературе19,,2021.

3. Инкапсуляция овальбумина в Перевернутый NPs, используя μMIVM

  1. Подготовьте растворителей и antisolvent решения.
    1. Подготовьте раствор 50 мг/мл овальбумина в деионизированной воде («РАВНИНА»).
    2. Подготовьте 0,75 мл раствора A в 1,5 мл пластиковых пробирок путем разбавления 75 мкл раствора OVA 0,675 мл ДМСО генерировать 5 мг/мл раствора OVA в ДМСО, содержащие 10% воды по объему. Хорошо перемешайте и центрифуги кратко, как описано ранее.
      Примечание: Смотрите шаг 2.1.6 относительно водные эффекты. Как и в предыдущих разделах решение тома может масштабироваться вверх или вниз форме материальных потребностей.
    3. Приготовляют раствор B, растворяя стабилизатор сополимер блока (например, poly(styrene) -b- поли (акриловая кислота), PS-5 k-b- ПАА4.8 k) в ДМСО на 6 мг/мл. Хорошо перемешать и sonicate растворить при необходимости. Пипетка 0,75 мл в пластиковых пробирок 1.5 мл.
    4. Пипетка 0,75 мл ТГФ (решение C) в пластиковых пробирок 1.5 мл.
    5. Пипетка 1,85 мл хлороформа (решение D) во флаконе сцинтилляционные стекла.
    6. Подготовьте 60,0 мг/мл кальция хлорид дигидрат сшивателя решения в метаноле. Смешайте с помощью вихревой смеситель.
    7. Подготовьте 4.17 мг/мл раствора аммиака в метаноле, как описано в шаге 2.3.4.
    8. Добавление 5,25 мл хлороформа для пластиковых пробирок 15мл как закалочная ванна.
  2. Подготовить смеситель Ассамблеи и стоять.
    1. Соберите нижней приемник, смешивания геометрии диска, верхний диск, гаечного и уплотнительное кольцо. Смотрите Рисунок 2 для схема компонентов и терминологии стенд микшера.
      Примечание: Подробная информация о MIVM строительство можно найти в Справочной информации (раздел 1) и в литературе22. Файлы CAD также доступны в качестве Дополнительной информации .
    2. Установите уплотнительное кольцо в паз, обеспечение того, что он хорошо подходит и что нет никаких признаков повреждения или износа.
      Примечание: Нормальной эксплуатации приведет к изношенных или опухшие растворителя O-кольца. Если кольцо растягивается или деформированных, позволяют ему воздух сухой на ночь перед использованием. Если форма не восстановить всю ночь, распоряжаться уплотнительное кольцо. Держите большой запас, как это Расходные части.
    3. Аккуратно совместите смешивания отверстия диска с колышки на верхнем диске и нажмите вместе. Убедитесь, что кольцо не стали перемещенными лицами, проверяя, что две части сидеть заподлицо.
    4. Инвертировать две части и вручную собрать их с нижней приемник. Убедитесь, что выход трубы фитинг ослабил таким образом, чтобы она не мешает полной подтяжки диска.
      Примечание: Если потоков уловов во время Ассамблеи, тщательно разбирать и применить пищевой или фармацевтической класс анти захватить потоков во избежание истирания.
    5. После ручной затяжки, установить гаечного к началу диска колышки и плотно затянуть Ассамблея. Затем затяните фитинг трубки розетки таким образом, чтобы она прочно сидит против нижней грани смешивания геометрии. Убедитесь, что шприц фитинги на верхнем диске плотно.
    6. Место собранный смеситель на стенд микшер, так что выход трубы расширяет ниже опорной пластиной. Поддержка мобильных пластине таким образом, чтобы она приостановлена сторону рабочее пространство.
    7. При необходимости чтобы проверить выравнивание механического ограничителя, сначала приложите шприцы пустой стакан к отверстия смесителя.
      Примечание: Объемный вливающихся разнообразны с помощью шприцев баррель различных диаметров, поскольку шприцы депрессии одновременно же линейной скоростью. Начальный и конечный вертикальной высоты должны быть одинаковыми для всех шприцов и можно отрегулировать с помощью винты постучал в поршень вала22. Механические упоры чрезмерное повреждения стекла шприцы не допускать.
      1. При необходимости ниже пластину мобильных, так что это приходит отдохнуть на механические останавливается. Убедитесь, что они выровнены таким образом, чтобы пластины также приходит отдохнуть непосредственно перед обращением пустые шприцы (как показано на рис. 2).
      2. При необходимости ослабьте механических останавливается и репозиция, при необходимости. Удаление стекла шприцы и сброс мобильных пластины из пути.
        Примечание: Для работы с пластиковой шприцы, механические упоры не требуются.
    8. Место открытые ванны ниже трубки розетки для сбора стоков.
    9. Нарисуйте решение A в газонепроницаемый шприц 1 мл с помощью тупых кончик иглы. Удалить все пузырьки воздуха и распоряжаться иглы. Простое решение до конца шприца Луер примерки. Повторите этот процесс для решения B и C.
    10. Нарисуйте D решения в 2,5 мл газонепроницаемой шприц с помощью тупых кончик иглы. Удалить все пузырьки воздуха и распоряжаться иглы. Простое решение до конца шприца Луер примерки.
      Примечание: Эти объемы были выбраны так, что первоначальный шприц плунжерный высот одинаковы. Если объемы изменяются, они по-прежнему необходимо выполнить это требование высоты.
    11. Соберите четыре шприцы на смеситель в часовой моды в алфавитном порядке. Смотрите Рисунок 1B окончательный вид и схема ориентации шприц.
      Примечание: Проверьте, что нет шприца высота значительно отличается от других и устранять неполадки при необходимости.
  3. Выполняйте операции смеситель и очистки.
    1. Сцепление корпус подшипника по обе стороны мобильных пластины. Не место пальцев на нижней грани жилья, потому что это Пинч опасности против механического останавливается. Медленно опустите пластину мобильных, так что он отдыхает равномерно, но едва касаясь шприцы.
    2. Постепенно и плавно отпустите пластину, стремясь завершить операцию в около 0,5-1 s для этих поток22томов.
      1. Удалите и крышка закалочной ванной, которая теперь содержит NP дисперсии.
    3. Возьмите миксер с шприцы еще прилагается и удерживайте контейнер для отходов. Удаление шприцы, позволяя тома ограбление, слейте воду в контейнер. Держите смеситель Ассамблея вверх и разобрать смеситель, с использованием гаечного.
    4. С помощью пульверизатора, промойте трубы розетка с несколькими миллилитрами растворителя (например, ацетон) и сухого воздуха или азота.
    5. Промойте смешивания геометрии с хорошим растворителем (например, деионизированная вода или ДМСО) и затем промойте с помощью ацетона, используя несколько миллилитров из пульверизатора. Сухие с потоком воздуха или азота.
    6. Сполосните кольцо в потоке деионизированной воды и помарки сухой.
    7. Промывайте верхний диск тщательно с несколькими миллилитрами ацетона, используя Бутылка растворителя до визуально чистой. Сухие с потоком воздуха или азота, как поверхности, так и фитинги шприца.
    8. Промойте каждый шприц с несколькими миллилитрами хорошим растворителем (например, деионизированная вода или ацетона) от Бутылка растворителя. Применить окончательное полоскание несколько миллилитров ацетона и воздух сухой перед повторным использованием.
  4. Выполняйте после обработки и анализа.
    1. Добавьте 50 мкл раствора кальция хлорид дигидрат сшивателя прикапывают помешивая примерно 75% максимальная скорость.
    2. Добавьте 50 мкл раствора аммиака, прикапывают помешивая на 75% максимальной скорости. Возраст для по крайней мере 30 минут.
    3. Охарактеризовать NP размер, как описано в шагах 2.3.1 и 2.3.2.
    4. Процесс NP дисперсии производить микрочастицы или покрытые NPs, как описано в литературе19,,2021.

4. изменения для разработки шкалы вверх

  1. Подготовьте растворителей и antisolvent решения, как описано в шагах 1, 2 или 3 на желаемый состав и достаточный объем для размера требуемых формулировки.
  2. При необходимости при необходимости, чистить и стерилизовать смеситель на месте с помощью подходящего протокола до формирования NP.
    Примечание: В прошлом применялись последовательно полоскания CIP 100, воды (с нейтральным pH), CIP 200, вода (до нейтральной рН) и подходящего растворителя. Кроме того стерильные фильтры могут крепиться к отверстия смесителя в случаях, где размер окончательного частиц исключает стерилизации путем фильтрации.
  3. Загрузить решения в газонепроницаемый шприцы подходящего объема и прикрепить политетрафторэтилена (ПТФЭ) трубы с адаптером Луер, установлены на конце. Вручную премьер решения до конца трубы.
    1. Загрузить шприцы в шприцевой насос и прикрепить шприцы для смесителя отверстия на CIJ или MIVM, как это требуется.
      Примечание: в качестве альтернативы, регуляторы расхода может использоваться в лаборатории или пилотного масштаба для предоставления большего объема возможностей, чем шприцевой насос. Успешная операция требует устойчивый поток и достаточного перепада давления, что означает, что под давлением сосуды с измерения потока на выходе являются наиболее подходящим выбором для крупномасштабного производства.
  4. Место коллекции сосуд, содержащий закалочная ванна достаточного объема, при необходимости, под розетки труб.
  5. Установите объемные скорости потока для соответствия достигнутых вручную (например, около 30-60 мл/мин на поток).
    Примечание: При использовании CIJ, скорости потока насоса должны быть идентичны. При использовании MIVM, различные отверстия могут иметь различные расхода.
  6. Одновременно начинается насосы. Собрать около 5-10 мл жидких отходов в маленький пузырек (это «начальный объем») и затем начать сбор в ванны.
  7. Характеризуют и обрабатывать как описано в соответствующем разделе формулировка выше.

Representative Results

Скрининг NP составов с FNP быстрый и требует небольших количеств материала (порядка 1-10 мг). FNP протокол инкапсуляции гидрофобные соединения, такие как витамин Е (шаг 1) приводит к стабильной, ясно или слегка опалесцирующая NP дисперсии. Динамическое рассеяние света (DLS) предоставляет надежные средства характеризуют размер частиц. Как показано на рисунке 3, процесс производит NPs с низкой полиизопрена в воспроизводимый моды. Типичный полиизопрена индекс (PDI) меньше, чем 0,20, указанием относительно монодисперсных населения. PDI получается от автокорреляционной функции и часто реализуется в инструмент программного обеспечения. Это отношение второго до первого момента, где значения 0,1 обычно получаются для монодисперсных частиц26. Для четырех витамин Е/PS-b-PEG формулировка реплицирует сообщил, значение было 0.12 ± 0.02 и средний диаметр 107 Нм ± 7. Типичный «осечка» вследствие либо неравномерным депрессии шприцы или медленнее скорость депрессии также сообщается в рисунке 3. Полиизопрена был не влияет, но размер был немного больше (135 Нм). В этом примере, в том числе новые метрики для размера частиц являются 113 Нм ± 14. Осечка результаты в периоды времени, когда камера содержит только один поток тип. Важно, что весь поток опыта же процесс истории и относительные объемы органических и водных потоков в смеситель. Без стабилизатора непрозрачные решения с видимыми агрегатов производится. DLS автокорреляционная функция для этого образца немонотонных и гладко, как показано на рисунке 3 врезные не гниет.

Контроль размера частиц, FNP показана на рисунке 4, где различные относительные количества основного материала – poly(styrene)1.8 k в данном случае – и PS -b-PEG стабилизатор привели в размерах частиц, которые варьировались от 49-152 Нм. Эти размеры частиц были получены с ТГФ потоков, содержащих общая Массовая концентрация основных и стабилизатор 20 мг/мл, где 25%, 50% или 75% от массы был poly(styrene) основного материала. Полиизопрена наночастиц всегда был меньше, чем 0,15. Широкое обсуждение параметра воздействие на размер частиц, производимых FNP можно найти в литературе10. Загрузки могут быть настроены путем проведения постоянный объем растворителя и различной относительной объемы запасов решения основных и стабилизатор. Аналогично общая Массовая концентрация может быть изменено путем подготовки запасов решения на значения, отличные от 10 мг/мл. При определенных условиях можно наблюдать населения пустой мицеллы, DLS27. Это не любое пагубное воздействие помимо расширения измеренных гранулометрический. Когда размеры похожи, это может проявляться как один широкий пик, а не два отдельных пиков.

Же CIJ смеситель может также использоваться для инкапсуляции гидрофильные соединения iFNP, примером в шаге 2 протокола. Частицы, производимых в сообщения о разработке являются около 65 нанометр с низкой полиизопрена 0,08. Распределение размеров можно увидеть в рисунке 5А (пунктирные линии). Влияние сшивки ПАА карбоновые кислоты остатков на частицы стабильность свидетельствует анализ DLS в сильных растворителей, таких как ДМСО, как показано на рисунке 5B. Автокорреляционная функция хорошо сшитый частиц должна начать вблизи значение 1 и падение резко 0 время характерным, что связано с размер частиц (сплошная линия). Частицы, которые набухают широко или распустить не высокоструктурированные и показать минимальный автокорреляции сигнал (пунктирная линия). Для iFNP неудачных испытаний манифеста аналогичным образом, как описано для FNP выше. Видимые агрегатов может рассматриваться или бедных DLS автокорреляционная функция формы может наблюдаться. MIVM может использоваться для ППП или iFNP, когда более двух потоков входе требуются из-за ограничений системы растворимости или Химическая несовместимость. Маломасштабной версии MIVM (μMIVM) с его стенд смеситель показано на рисунке 2. Как и в случае с CIJ, этот смеситель может использоваться для инкапсуляции гидрофобных и гидрофильных соединений22. В шаге 3 протокол для инкапсуляции гидрофильных белков, OVA, по iFNP был описан. Распределение размеров частиц показано на Рисунок 5A (сплошная линия). Размер-около 125 нанометр с PDI 0,16. Общий протокол для работы насоса шприца в более широких масштабах осуществляется в шаге 4.

Figure 1
Рисунок 1: смеситель Ассамблеи и внутреннего потока шаблон схемы. (A) ограничивается набегающих струй (CIJ) смеситель с прилагаемой шприцы позиционируется выше закалочная ванна. Не изображенные являются перемешать бар закалочная ванна флакона и перемешать плиты. Смешивая геометрии изображен в развернутом виде показаны два потока отверстия, которые затрагивают в центре камеры. (B) мульти входе вихревой смеситель (μMIVM) показано с стекла шприцы и расположены на стенде над закалочной ванной. Пластину мобильных и механические упоры подрезывали от картины. Расширенное представление показывает вихревой камере и подводящих каналов схематично. (C) A схематическое представление ядро оболочка NPs, производимые ППП. Красный сфер представляют лечебный, который, в сочетании с блоком синий рухнул полимера, составляют ядро NP. Блоке желтый полимер формирует слой кистью, придавая их пространственной стабилизации в NPs. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: μMIVM терминологии и компоненты для сборки. ΜMIVM требует стенд микшер для включения единообразных депрессии четырех шприцев. В этом случае высот поршень шприца должны все быть одинаковыми для обеспечения последовательного смешивания. В качестве альтернативы он может работать с помощью шприца насосы. Стенд микшер с метками компонентов показан слева фигуры. Справа-разобранного микшер с уплотнительным кольцом в месте на диске, смешивая геометрии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: Частицы размером распределение наночастиц полимерных, содержащие ядро витамина е и стабилизировался ПС -б-PEG. Динамическое рассеяние света (DLS) обеспечивает интенсивности взвешенный размер дистрибутивов, которые показывают распределение диаметр NP. Кривые в среднем трех экземплярах анализов для каждого судебного разбирательства и были масштабированы производить идентичные максимальный пик высот. Четыре реплицирует (сплошные линии) указывают на высокую воспроизводимость метода (стандартное отклонение = 7 Нм). Также включен представитель осечка (пунктирная линия), например скорость шприц или неравномерным депрессии двух шприцы, что приводит к большой диаметр частиц. Стандартное отклонение размера NP, включая Осечка была 14 Нм. (Вставка) Без PS -b-стабилизатор PEG, образуются большие агрегаты микрон шкала (или капель, в случае нефти, как витамин Е). DLS автокорреляционная функция запуска без стабилизатора (пунктирная линия) отображается вместе с представителем автокорреляции из наночастиц репликации (сплошная линия). Автокорреляционная функция показывает ряд характерных сроков для образца элемента управления, указывающее полидисперсных населения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: Управление размером частиц, FNP через различные относительного соотношения основных материалов для стабилизатора. Распределения интенсивности взвешенный размер трех составов с poly(styrene) сердечником стабилизировалась, ПС -б-PEG изображены. Общая Массовая концентрация в ТГФ был 20 мг/мл и antisolvent была вода. Формулировки были подготовлены в смесителе CIJ. Массовая состоит из основного материала отображается в условных обозначениях. Например, 25% основной выборки содержит 5 мг/мл poly(styrene) и 15 мг/мл ПС -б-КОЛЫШЕК. Средних размеров для 25% (сплошная линия), 50% (пунктирная линия) и 75% (смешанные пунктир) нагрузок основных были 49 Нм, 96 Нм и 152 Нм, соответственно. Все значения PDI были меньше, чем 0,15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: характеристика Перевернутый ЯИЭ в CIJ смесителя или μMIVM. (A) DLS кривые являются в среднем тройные анализов для каждой разработки. Пунктирная линия показывает распределение по размерам частиц 3 k MD сделал в смеситель CIJ, в то время как сплошная линия является распределение по размерам частиц OVA, в μMIVM. (B) сила сшивки может оцениваться DLS, используя в качестве растворителя ДМСО. DLS автокорреляционная функция показывает прочность сшивки через значение первоначального автокорреляции и наблюдения чистого перехода к значение ноль. Пунктирная линия изображает автокорреляционная функция для частицы с не сшивателя, показаны слабого исходного сигнала и время широкий распада. Сплошная линия изображает автокорреляции после добавления сильного сшивателя (в данном случае, tetraethylenepentamine), который показывает сильный первоначальный сигнал и сроки определены распада. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6: Пересыщение, S, как функция относительной смешивания соотношения органического растворителя воду. (A) сравнение наивысший достижимый Пересыщение для (○) boscalid, пестицидов и (■) пептида B, семь остатки модель пептид. Органический поток содержит boscalid в концентрации 230 мг/мл и пептида B на 200 мг/мл, их концентрации насыщения. Существует максимальная Пересыщение, которое зависит от каждого активного фармацевтического вещества (API) / растворитель системы. (B) когда концентрация boscalid в потоке органических уменьшается в 20 раз, условия, на которых достигаются Пересыщение и nanoprecipitation становятся ограниченными. Эта цифра перепечатана с разрешения Elsevier9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

Инкапсуляция гидрофобные соединений, таких как витамин Е, как в шаге 1 протокола, был подробно описан в9,14,28. Относительно монодисперсных частиц производится потому, что шкала времени для смешивания короче чем шкала времени для агрегирования и роста частиц. В частности смешанного решения растворитель/antisolvent быстро становится однородной, что позволяет нуклеации происходит равномерно. Ассамблея блок-сополимера с поверхности частицы затем предоставляет их пространственной стабилизации, которая задерживает частицы рост5. Поскольку время смешивания в камере (турбулентности) является функцией скорости потока входе CIJ или MIVM, есть входной коэффициент, который возникает после перехода к турбулентного смешения, где размер частиц является по существу постоянным13. Это обеспечивает дополнительную надежность процесса как некоторые партии к партии вариации в входе расхода (то есть, скорость депрессии шприц) может быть терпимо без значительного воздействия на окончательный размер NP, как видно из рисунка 3. Медленнее или неравномерным впускной скорости может привести к более крупных частиц или более полидисперсных дистрибутивов, как например осечка. FNP также был продлен для инкапсуляции гидрофильные соединения в наночастиц противоположные Flash NanoPrecipitation. Эти Перевернутый наночастицы могут затем быть использованы для создания микрочастицы или быть покрыты PEG для создания воды дисперсных наночастиц25. Основные принципы сборки остаются теми же, хотя есть дополнительная сложность сшивки частица ядра. Это необходимо для стабилизации частицы в водной среде. В общем соотношение 1:1 заряд, по сравнению с polyacid блок является достаточным, хотя ионных взаимодействий может поощряться путем регулировки рН путем добавления базового19. В этом протоколе были описаны только первый шаг процесса в форме перевернутой NPs.

Помимо быстрого смешивания, успешной разработки FNP или iFNP ограничен для случаев, где несколько условий могут быть удовлетворены9,14. Во-первых, все поток входных данных должен быть смешивается. Хотя эмульсии были использованы для производства NPs, FNP требует единообразного решения этапа в смесителе. Во-вторых основной компонент должен быть почти нерастворимые растворителя условиями в смеситель (для CIJ, равного смеси по объему) водить быстрой кристаллизации. В противном случае значительная часть будет оставаться Неинкапсулированный или будет выпадать в осадок после дальнейшего разбавления с antisolvent. MIVM можно включить выше antisolvent содержание в смесительную камеру для устранения основной материал растворимость ограничений. Это часто полезно для создания кривых Пересыщение из данных растворимость как функции растворителя композиции для руководства процессом разработки9. Рисунок 6 показывает представитель кривые для двух соединений. Низкая Пересыщение в смесительной камеры условий заслуживает, работающих на различные композиции, обычно с помощью MIVM. Выше Пересыщение способствует нуклеации основной компонент роста частиц, но несоответствие в время Ассамблеи кернового материала и стабилизатор может привести к большой агрегатов терапевтического. Применение таких Пересыщение кривых в деталях9рассмотрели D'Addio и прудом. Наконец программа BCP должна молекулярно растворяют в растворителя поток и antisolvent потоке должна быть селективной, для одного блока. BCP должна быть достаточно амфифильных предоставлять оба solvophobic движущей силой от свернутого блока фиксированный стабилизатор на поверхности частиц и для блока сольватированного распространять их пространственной стабильность частицы. Растворители, помимо тех, которые описаны в протоколе могут использоваться до тех пор, как они отвечают эти ограничения.

Практика с ручной шприц операция может улучшить показатель успеха во время проверки. Как отмечалось выше, выше переход к однородной, турбулентного перемешивания условий означает, что небольшие изменения в скорости потока, переносится в процессе28. Масштаб до насосно приводом, с компьютерным управлением потоков приводит к еще большей прибыли в последовательности из-за скорости потока воспроизводимые входе. В любой момент во время пост-обработки частиц визуального осмотра или DLS анализ может указывать на наличие крупных агрегатов, которые могут быть из-за случайных нестабильности пыли или частиц. При необходимости, поток может фильтроваться с порами размером соответствующего фильтра. В отсутствие агрегатов, мы обнаружили, что меньше, чем 5% массы обычно теряется при фильтрации PEG-покрытием наночастиц, если размер номинальный фильтра больше чем распределение размеров частиц. При фильтрации агрегатов, экспериментальное определение массы потерянных во время процесса является необходимым. Количественное определение потери массы может осуществляться в одном из двух способов. Масса всего тела в определенный объем может определяться термогравиметрический анализ до и после фильтрации для определения степени изменения (см. раздел Дополнительная информация 2). Кроме того частицы могут быть восстановленные (например, по лиофилизации) и растворяют в хороший растворитель. Концентрация основного материала затем может измеряться непосредственно соответствующим методом УФ видимые спектрофотометрии или хроматографии.

Для ППП остаточная 10 vol % органических растворителях (например, ТГФ) должны извлекаться из водной дисперсии. Это может быть сделано путем испарений дистилляции14,29, диализ30или тангенциальном потоке фильтрации31,32. Практические соображения для каждого шага обработки описаны в условии цитирования. Для диализа типичный мембраны являются 3,5 кДа или 6-8 кДа предохранители, хотя большие варианты доступны. Это молекулярный вес среза для удаления растворителя при dialyzed за 24 часа, с использованием нескольких Ванна изменения достаточно. Использование тангенциальная фильтрация влечет за собой некоторые процесса развития, должны позаботиться о том, чтобы избежать вызывая агрегации благодаря концентрации поляризации на поверхности мембраны. Мы обнаружили, что снижение состав органических растворителей ниже значение зависит от системы, обычно 2-10 vol %, устраняет агрегирование на поверхности мембраны. После обработки, концентрация наночастиц легко определяется термогравиметрический анализ (см. раздел Дополнительная информация 2). Часто желательно для транспортировки или хранения частицы в виде очень стабильной. Водно-дисперсионной основе могут быть заморожены, просто быстро с помощью сухого льда/ацетон смесь, а затем хранятся при температуре-80 ° C. Кроме того сухие порошки могут быть получены по лиофилизации33,34 или спрей сушки24. Часто необходимо добавить криопротектора уменьшения агрегации наночастиц во время замораживания или сушки. Сахар (сахарозу, Трегалоза, и т.д.), poly(ethylene glycol) или циклодекстринов могут проверяться для эффективности в диапазоне концентраций путем наблюдения за размер DLS35,,3637, 38. Общие проблемы стабильности NP во время обработки часто связаны с растворимость или фазы разделения в результате перегруппировки к нижней энергетического состояния в условиях где увеличивается подвижность ядре. Использование совместного основных материалов, альтернативные стабилизаторов или изменение внешних раствор состава может помочь улучшить стабильность14,16,17,,3940, 41.

Как отмечалось выше, MIVM позволяет выше antisolvent содержание в смесительную камеру, когда необходимо достичь высокой Пересыщение. Это также может позволить для физической сегрегации видов на более чем двух потоков, когда реактивности или растворимость ограничения требуют. Примером является формирование наночастиц белка стабилизированный зеин антибиотик клофазимин24. Гидрофобные клофазимин вводится в поток ацетон; Зейн вводится в 60% спиртового водный поток; казеина, который комплексы с Зейн, принес в водный буфера потока, и Четвертый поток дополнительного буфера для увеличения соотношения воды ацетона и этилового спирта. Два растворителем потоки необходимы, поскольку клофазимин и Зейн не растворимы в общей растворителя. Этот процесс не может быть выполнена в двух Джет CIJ смесителя. Эта формулировка, белок стабилизированный также демонстрирует, что FNP не ограничивается BCP стабилизаторов. Janus частицы были произведены без стабилизатора42 и ряда лоу кост стабилизаторы продемонстрировали для устных заявлений24. В частности сополимеры например гидроксипропилметилцеллюлоза может использоваться вместо блок сополимеры24. Основные материалы могут быть сделаны более гидрофобных целого ряда методов. Гидрофобные Ион сопряжения был применен для инкапсуляции широкий спектр соединений, которые имеют промежуточные растворимость43,,4445. Были чрезвычайно гидрофобных prodrugs создан и затем инкапсулированные46. Нуклеиновые кислоты были инкапсулированы через комплексообразованию с катионными липиды47. Важно отметить, что эти исследования показали, что ППП может производить широкий спектр частиц поверхности химия. Кроме того, смешанные стабилизаторы, содержащий часть BCP, который был изменен с таргетинга лигандов на конце цепи были использованы. Это позволяет точный контроль над содержанием лигандов на поверхности, так как частицы состав отражает входной поток состав23,48. Аналогично можно включить несколько ключевых компонентов, включая красители и неорганических наночастиц3,8.

Флэш-NanoPrecipitation представляет собой масштабируемый подход к полимерных наночастицы состоят из гидрофобных или гидрофильного ядро. Если удовлетворены критерии, перечисленные выше, как правило более 95% от основного материала инкапсулируется в высокой массовой долей в частицы. На шкале скамьи, требующих несколько миллиграммов материала и около 0,5 мл в каждом входе потока были проведены три примера, представленные здесь. Это позволяет для быстрого скрининга частиц условий для оптимизации разработки. Масштабов свинца составов для больших размеров партии вызывает запускающий процесс дольше, который легко может быть достигнуто с помощью шприца насосов или регуляторы расхода. Напротив масштабов массового добавления nanoprecipitation сталкивается документально проблемами в поддержании достаточной микросмешения точке сложения и учета эффекта изменения геометрии судна49. Это является основным препятствием, поскольку важно производить частицы последовательным образом для удовлетворения требований FDA50. Микрофлюидика методы могут также производить единый, воспроизводимый наночастиц, но только возможность производства в диапазоне миллиграмм. Например Karnik et al. сообщили, что темпы производства 0,25 мг/мин для выпуска препарата исследования51. Дальнейшее расширение масштабов обычно влечет за собой распараллеливание на высоких капитальных затрат12. С FNP это просто производить 1 грамм наночастиц в 600 мг/мин с шприцевый насос и несколько фитинги для подключения к отверстия смесителя. Следовательно FNP представляет как инструмент скрининга доступной лаборатории масштаба, так и масштабируемый подход к производству NP для поступательной работы.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана финансирование от Optimeos естественных наук, Национальный научный фонд (CBET 1605816), Билла и Мелинды Гейтс (BMGF, OPP1150755) и национальной науки фонд исследовательских стипендий (DGE-1656466) присуждена K.D.R.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Confined Impinging Jets Mixer NA NA See supplemental information for engineering drawings. Review text for new mixer validation
Luer fitting Idex Health & Science P-604 Assemble on CIJ or MIVM mixer inlet with corresponding threads
Plug fitting Idex Health & Science P-309 Assemble on CIJ mixer sides (seal access point from drilling)
Outlet fitting - CIJ Idex Health & Science P-205 Assemble with ferrule and tubing on CIJ chamber outlet
Outlet ferrule - CIJ Idex Health & Science P-200 Assemble with outlet fitting (large end flush with tubing)
Outlet tubing - CIJ Idex Health & Science 1517 Use tubing cutter for clean ends. Ensure extra tubing doesn't protrodue into mixing chamber
Tetrahydrofuran (THF) Fisher Scientific T425-4 Use stabilizer-free THF to avoid solubility limits of BHT. Peroxides may interfere in some applications.
Norm-ject syringe (3 ml) VWR 53548-017
Vitamin E (α-tocopherol) Sigma-Aldrich 90669-50G-F Store cold
poly(styrene-b-ethylene glycol), PS1.6k-b-PEG5k Polymer Source P13141-SEO Other block sizes acceptable depending on application
poly(styrene)1.8k Polymer Source P2275-S Example hydrophobic core material
Scintillation vial DWK Lifesciences 74504-20
Luer-slip plastic syringes, 1ml (100 pk) National S7510-1
Maltodextrin DE 4-7 Sigma-Aldrich 419672-100G
poly(styrene-b-acrylic acid), PS5k-b-PAA4.8k Polymer Source P5917-SAA Other block sizes acceptable depending on application
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific D159-4
Calcium chloride dihdyrate Sigma-Aldrich 223506-25G Hygroscopic.
Methanol Fisher Scientific A452-4
Ammonium Hydroxide Fisher Scientific AC423300250
Albumin from chicken egg white (Ovalbumin, OVA) Sigma-Aldrich A5503-1G
Multi-Inlet Vortex Mixer NA NA See supplemental information for engineering drawings. Review text for new mixer validation
Outlet fitting - MIVM Idex Health & Science P-942 Combination with ferrule
Outlet tubing - MIVM NA NA Fit to ferrule ID.
O-ring (MIVM) C.E. Conover MM1.5 35.50 V75 Order bulk - consumable part. Ensure solvent compatibility if using an alternative source.
Mixer stand NA NA See Markwalter & Prud'homme for design.17

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bobo, D., Robinson, K. J., Islam, J., Thurecht, K. J., Corrie, S. R. Nanoparticle-Based Medicines: A Review of FDA-Approved Materials and Clinical Trials to Date. Pharmaceutical Research. 33 (10), 2373-2387 (2016).
  2. D'Mello, S. R., et al. The evolving landscape of drug products containing nanomaterials in the United States. Nature Nanotechnology. 12 (6), 523-529 (2017).
  3. Gindy, M. E., Prud'homme, R. K. Multifunctional nanoparticles for imaging, delivery and targeting in cancer therapy. Expert Opinion on Drug Delivery. 6 (8), 865-878 (2009).
  4. Chen, G., Roy, I., Yang, C., Prasad, P. N. Nanochemistry and Nanomedicine for Nanoparticle-based Diagnostics and Therapy. Chemical Reviews. 116 (5), 2826-2885 (2016).
  5. Johnson, B. K., Prud'homme, R. K. Mechanism for Rapid Self-Assembly of Block Copolymer Nanoparticles. Physical Review Letters. 91 (11), 118302-118302 (2003).
  6. Schubert, S., Delaney, J. J. T., Schubert, U. S. Nanoprecipitation and nanoformulation of polymers: from history to powerful possibilities beyond poly(lactic acid). Soft Matter. 7 (5), 1581-1588 (2011).
  7. Lebouille, J. G. J. L., Stepanyan, R., Slot, J. J. M., Cohen Stuart, M. A., Tuinier, R. Nanoprecipitation of polymers in a bad solvent. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. , 225-235 (2013).
  8. Akbulut, M., et al. Generic method of preparing multifunctional fluorescent nanoparticles using flash nanoPrecipitation. Advanced Functional Materials. 19 (5), 718-725 (2009).
  9. D'Addio, S. M., Prud'homme, R. K. Controlling drug nanoparticle formation by rapid precipitation. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (6), 417-426 (2011).
  10. Pagels, R. F., Edelstein, J., Tang, C., Prud'homme, R. K. Controlling and Predicting Nanoparticle Formation by Block Copolymer Directed Rapid Precipitations. Nano Letters. 18 (2), 1139-1144 (2018).
  11. Ding, S., Anton, N., Vandamme, T. F., Serra, C. A. Microfluidic nanoprecipitation systems for preparing pure drug or polymeric drug loaded nanoparticles: an overview. Expert Opinion on Drug Delivery. 13 (10), 1447-1460 (2016).
  12. Valencia, P. M., Farokhzad, O. C., Karnik, R., Langer, R. Microfluidic technologies for accelerating the clinical translation of nanoparticles. Nature Nanotechnology. 7 (10), 623-629 (2012).
  13. Johnson, B. K., Prud'homme, R. K. Chemical processing and micromixing in confined impinging jets. AIChE Journal. 49 (9), 2264-2282 (2003).
  14. Saad, W. S., Prud'homme, R. K. Principles of nanoparticle formation by flash nanoprecipitation. Nano Today. 11 (2), 212-227 (2016).
  15. Han, J., et al. A simple confined impingement jets mixer for flash nanoprecipitation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 101 (10), 4018-4023 (2012).
  16. Kumar, V., Wang, L., Riebe, M., Tung, H. H., Prud'homme, R. K. Formulation and stability of itraconazole and odanacatib nanoparticles: Governing physical parameters. Molecular Pharmaceutics. 6 (4), 1118-1124 (2009).
  17. Liu, Y., Kathan, K., Saad, W., Prud'homme, R. K. Ostwald Ripening of β -Carotene Nanoparticles. Physical Review Letters. 98 (3), 036102-036102 (2007).
  18. Liu, Y., Cheng, C., Liu, Y., Prud'homme, R. K., Fox, R. O. Mixing in a multi-inlet vortex mixer (MIVM) for flash nano-precipitation. Chemical Engineering Science. 63, 2829-2842 (2008).
  19. Pagels, R. F., Prud'homme, R. K. Polymeric nanoparticles and microparticles for the delivery of peptides, biologics, and soluble therapeutics. Journal of Controlled Release. 219, 519-535 (2015).
  20. Pagels, R. F., Prud'homme, R. K. Ch. 11. Control of Amphiphile Self-Assembling at the Molecular Level: Supra-Molecular Assemblies with Tuned Physicochemical Properties for Delivery Applications Vol. 1271 ACS Symposium Series. , American Chemical Society. 249-274 (2017).
  21. Markwalter, C. E., Prud'homme, R. K. Ch. 12. Control of Amphiphile Self-Assembling at the Molecular Level: Supra-Molecular Assemblies with Tuned Physicochemical Properties for Delivery Applications Vol. 1271 ACS Symposium Series. , American Chemical Society. 275-296 (2017).
  22. Markwalter, C. E., Prud'homme, R. K. Design of a Small-Scale Multi-Inlet Vortex Mixer for Scalable Nanoparticle Production and Application to the Encapsulation of Biologics by Inverse Flash NanoPrecipitation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 107 (9), 2465-2471 (2018).
  23. Gindy, M. E., Ji, S., Hoye, T. R., Panagiotopoulos, A. Z., Prud'Homme, R. K. Preparation of poly(ethylene glycol) protected nanoparticles with variable bioconjugate ligand density. Biomacromolecules. 9 (10), 2705-2711 (2008).
  24. Zhang, Y., et al. Design and Solidification of Fast-Releasing Clofazimine Nanoparticles for Treatment of Cryptosporidiosis. Molecular Pharmaceutics. 14 (10), 3480-3488 (2017).
  25. Pagels, R. F. Polymeric Nanoparticles and Microparticles for the Delivery of Hydrophobic and Hydrophilic Therapeutics. , Princeton University. Doctor of Philosophy thesis (2018).
  26. Frisken, B. J. Revisiting the method of cumulants for the analysis of dynamic light-scattering data. Applied Optics. 40 (24), 4087-4091 (2001).
  27. Budijono, S. J., Russ, B., Saad, W., Adamson, D. H., Prud'homme, R. K. Block copolymer surface coverage on nanoparticles. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 360 (1-3), 105-110 (2010).
  28. Johnson, B. K., Prud'homme, R. K. Flash NanoPrecipitation of Organic Actives and Block Copolymers using a Confined Impinging Jets Mixer. Australia Journal of Chemistry. 56, 1021-1024 (2003).
  29. Kumar, V., Prud'homme, R. K. Nanoparticle stability: Processing pathways for solvent removal. Chemical Engineering Science. 64 (6), 1358-1361 (2009).
  30. Shi, L., Shan, J., Ju, Y., Aikens, P., Prud'homme, R. K. Nanoparticles as delivery vehicles for sunscreen agents. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. , 122-129 (2012).
  31. Dalwadi, G., Benson, H. A. E., Chen, Y. Comparison of Diafiltration and Tangential Flow Filtration for Purification of Nanoparticle Suspensions. Pharmaceutical Research. 22 (12), 2152-2162 (2005).
  32. Pansare, V. J., Tien, D., Thoniyot, P., Prud'homme, R. K. Ultrafiltration of nanoparticle colloids. Journal of Membrane Science. 538, 41-49 (2017).
  33. D'Addio, S. M., et al. Novel Method for Concentrating and Drying Polymeric Nanoparticles: Hydrogen Bonding Coacervate Precipitation. Molecular Pharmaceutics. 7 (2), 557-564 (2010).
  34. Abdelwahed, W., Degobert, G., Stainmesse, S., Fessi, H. Freeze-drying of nanoparticles: Formulation, process and storage considerations. Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (15), 1688-1713 (2006).
  35. Correa, S., et al. Highly Scalable, Closed-Loop Synthesis of Drug-Loaded, Layer-by-Layer Nanoparticles. Advanced Functional Materials. 26 (7), 991-1003 (2016).
  36. Figueroa, C. Engineering Nanoparticles for Pharmaceutical Applications: Formulation and Freeze-drying Techniques. , Princeton University. Doctor of Philosophy thesis (2014).
  37. Harada, A., Li, J., Kamachi, M. Preparation and properties of inclusion complexes of polyethylene glycol with alpha-cyclodextrin. Macromolecules. 26 (21), 5698-5703 (1993).
  38. Troiano, G., Song, Y. -H., Zale, S., Wright, J., Van Geen Hoven, C. Stable Formulations for Lyophilizing Therapeutic Particles. United States patent. , (2013).
  39. Kumar, V., Adamson, D. H., Prud'homme, R. K. Fluorescent polymeric nanoparticles: Aggregation and phase behavior of pyrene and amphotericin B molecules in nanoparticle cores. Small. 6 (24), 2907-2914 (2010).
  40. Budijono, S. J., et al. Synthesis of stable block-copolymer-protected NaYF4:Yb3+, Er3+up-converting phosphor nanoparticles. Chemistry of Materials. 22 (2), 311-318 (2010).
  41. Chen, T., et al. Protected peptide nanoparticles: Experiments and brownian dynamics simulations of the energetics of assembly. Nano Letters. 9 (6), 2218-2222 (2009).
  42. Sosa, C., et al. Soft Multifaced and Patchy Colloids by Constrained Volume Self-Assembly. Macromolecules. 49 (9), 3580-3585 (2016).
  43. Pinkerton, N. M., et al. Formation of stable nanocarriers by in situ ion pairing during block-copolymer-directed rapid precipitation. Molecular Pharmaceutics. 10 (1), 319-328 (2013).
  44. Lu, H. D., Rummaneethorn, P., Ristroph, K. D., Prud'homme, R. K. Hydrophobic Ion Pairing of Peptide Antibiotics for Processing into Controlled Release Nanocarrier Formulations. Molecular Pharmaceutics. 15 (1), 216-225 (2018).
  45. Lu, H. D., et al. Encapsulation of OZ439 into Nanoparticles for Supersaturated Drug Release in Oral Malaria Therapy. ACS Infectious Diseases. 4 (6), 970-979 (2018).
  46. Ansell, S. M., et al. Modulating the Therapeutic Activity of Nanoparticle Delivered Paclitaxel by Manipulating the Hydrophobicity of Prodrug Conjugates. Journal of Medicinal Chemistry. 51 (11), 3288-3296 (2008).
  47. Gindy, M. E., et al. Mechanism of macromolecular structure evolution in self-assembled lipid nanoparticles for siRNA delivery. Langmuir. 30 (16), 4613-4622 (2014).
  48. D'Addio, S. M., et al. Optimization of cell receptor-specific targeting through multivalent surface decoration of polymeric nanocarriers. Journal of Controlled Release. 168 (1), 41-49 (2013).
  49. Perry's Chemical Engineers' Handbook. , McGraw-Hill. 19-20 (2007).
  50. Torrice, M. Does nanomedicine have a delivery problem? ACS Central Science. 2 (7), 434-437 (2016).
  51. Karnik, R., et al. Microfluidic Platform for Controlled Synthesis of Polymeric Nanoparticles. Nano Letters. 8 (9), 2906-2912 (2008).

Tags

Биоинженерии выпуск 143 наночастиц микросмешения блок-сополимер доставки лекарств пептид белка процесс наращивания
Флэш-NanoPrecipitation для инкапсуляции гидрофобных и гидрофильных соединений в полимерных наночастиц
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Markwalter, C. E., Pagels, R. F.,… More

Markwalter, C. E., Pagels, R. F., Wilson, B. K., Ristroph, K. D., Prud'homme, R. K. Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles. J. Vis. Exp. (143), e58757, doi:10.3791/58757 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter